ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

Immunology and Infection

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Summary

一次セルトリ細胞は精巣免疫特権、炎症または感染の間シグナル伝達、およびそれらの免疫防御特性の利用を研究するために必要とされます。ここでは、高度に精製された一次セルトリ細胞およびラットの精巣から管周囲の細胞を単離するための酵素ベースのプロトコルを記述します。

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Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

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Abstract

分化した精子が最初思春期の時に表示されるので、精巣は、特に雄性配偶子に、独自の方法で免疫系に挑戦 - 十年以上全身性免疫寛容の確立後。精子形成細胞は、免疫系によって非自己として見ることができるタンパク質の数を表します。精巣は、その後、一方ではこれらのネオ抗原に対する寛容を確立することができるが、それでも一方、感染症や腫瘍の発生から自身を守ることができなければなりません。したがって、精巣は、有害な炎症性免疫応答を惹起することなく、外来抗原を容認し、体内のいくつかの免疫特権サイトの一つです。セルトリ細胞は精巣のこの免疫特権環境の維持のために重要な役割を果たし、また、外国の環境でcotransplanted細胞の生存を延長します。したがって、一次セルトリ細胞は、電子することはできません精巣の免疫特権を研究するための重要なツールですasily確立された細胞株または他の細胞モデルに置き換えられました。必要に応じて管周囲の細胞 - - ラットの精巣から一日以内にここでは、セルトリ細胞の単離のために詳細かつ包括的なプロトコルを提示します。

Introduction

精巣は、すなわち 、アンドロゲンを男性の配偶子と性ホルモンを産生します。臓器は、二つの区画で構成されています。総精巣容積1の約10〜12%に相当する間質コンパートメントでは、ステロイドはライディッヒ細胞内で起こります。筒状の区画は、精巣容積1の60〜80%に相当し、生殖細胞と体細胞の2種類含まれています-細管周囲細胞とセルトリ細胞を。精巣は、それぞれ1-3高い複雑な精細管を含む、250-300小葉に結合組織隔壁によって分割されます。これらの細管は、基底膜、コラーゲンのシート、及び管周囲細胞( 図1A)の周層によって囲まれています。

胚上皮は、基底膜の腔側に位置しています。セルトリ細胞は、内腔への基底膜からの全胚上皮にまたがる大規模な細長い細胞です。彼らは強くあるのatt基底膜に痛んだし、間質から胚上皮を吸蔵および血液精巣関門を表す基底外側組織し、タイトジャンクショ​​ンを介して連続セルラーシートを形成。セルトリ細胞は、顕著な細胞質突起及び生殖細胞の種特異的であるが、一定数との緊密な形態学的および機能的な接触に入るためにそれらを有効に波及効果を持っています。二倍体胚性幹細胞は増殖し、精原細胞に分化します。

減数分裂の間に私短命の四倍体精母細胞が減数分裂IIの間に4半数体精子細胞へのさらなる発展が生成されます。それらは細胞のネットを形成するように、すべての生殖細胞質ブリッジによって相互接続されています。精子細胞の成熟の間の主なイベントは、精子と呼ばれるプロセスにおいて、残留体を形成し、細胞質の大部分の押出成形です。残留体はセルトリ細胞によって貪食されます。後期精子細胞は、その後に放出されます管状の内腔とさらに成熟のために精巣上体へ輸送。セルトリ細胞と生殖細胞が相互に地形的および機能的に精子形成を調整するように見えます。

小さ ​​な精巣片を培養し、細胞型顕微鏡2により同定したとき、個々の精巣の細胞型の調製は、ほぼ一世紀前に始まりました。先の細いピンセットを用いて白膜を開いた後の尿細管を注意深く解剖することにより、筒状の間質コンパートメント3を分離するために、後に可能でした。 1975年にウェールズとウィーブは、間質組織と外管周囲細胞層4を除去するためのパンクレアチン処理を付着するの細管を解放するためにコラゲナーゼ処理を導入しました。早期から(古い20日前後)若い未熟ラットの精子形成がまだ始まっていないので、セルトリ細胞は、管状細胞集団の大部分を含んでいる使用されていました。この年齢ラットセルトでOLIの細胞は分裂をやめ、および隣接セル間のタイトジャンクション血液精巣関門が5確立されるように形成します。

ウェールズとウィーブDorringtonのの独立は、トリプシンの組み合わせを導入し、同年6に出版されたsoybeenトリプシン阻害剤及びコラゲナーゼ処理が続くデオキシ。両グループは、また、約70%のセルトリ細胞を含むめっき均一な細胞懸濁液を生成するために、(それぞれ、シリンジ針またはパスツールピペットを介して繰り返し消化管状フラグメントを描く)機械的な力を用います。培養3日後に、血清を含まない培地を使用して、セルトリ細胞の割合は約90%に増加します。これは主に、生殖細胞を汚染の死に起因する可能性があります。残留管周囲細胞(のPTC)が、しかし、しっかりとそれらの細胞外マトリックスを介して結合したまま。 PTCではなく、セルトリ細胞を産生することが知られていますPTCを用いて汚染を推定するためのマーカータンパク質として働くことができるフィブロネクチン。従って、タンら。追加のヒアルロニダーゼ処理は、セルトリ細胞画分7の純度を向上させるかもしれないと推論しました。実際、それらは、さらなる処置を比較して、血清含有培地を精製したセルトリ細胞を培養するために使用される場合に特に明白となる、約20倍のPTCによる汚染を減少させることができたことを示す可能性があります。その後から桐らの改良された手順に。支配的なプロトコルとなり、広範囲のフィールド8( 図1B)内の他の主要なグループで使用されていました。

コラゲナーゼ処理中のPTCの大部分が放出され、セルトリ細胞と平行に単離することができます。 PTCを激しく増殖し、卵胞刺激ホルモン(FSH)に応答しないのに対し、セルトリ細胞は、もはや有糸分裂を受け、特徴的な形態学的変化によってFSHに反応しませんおよびサイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)濃度9の増加。非常に類似した酵素消化プロトコルは人10、マウス11、12、シベリアンハムスター13またはヤク14のような他の動物からの一次セルトリ細胞の単離のために使用することができます。生殖細胞を低張性ショックを汚染大量の除去のための単離手順15の端部に用いることができます。成体ラットは、16精巣からこれはまた、セルトリ細胞の効率的な単離を可能にします。濃縮されたセルトリ細胞懸濁液は、 チョウセンアサガオ朝鮮朝顔アグルチニン17で被覆されたレクチン皿上懸濁液をプレーティングすることにより生殖細胞から分離することができます。唯一のセルトリ細胞といくつかの残留のPTCは、レクチンプレートに付着します。

主にラットからの一次セ​​ルトリ細胞培養物は、ホルモンに対する応答性を調査またはマウスのセルトリ細胞リチウムのような細胞株を確立するために最初に使用されていますTM4 18ね。この細胞株は、今日まで、百以上の研究で検討されています。翻訳アプローチではセルトリ細胞は、全身性の免疫抑制19せずに長期移植片生存のための異種のまたは同種異系膵島の同時移植のように共培養細胞や組織の免疫保護のために利用されてきました。体細胞、生殖細胞(セルトリ細胞-生殖細胞)20相互作用21 -単離されたセルトリ細胞は、上皮間葉(PTCCセルトリ細胞)を研究するため、共培養実験に使用されてきました。最近、一次セルトリ細胞は、Toll様受容体の発現と炎症性サイトカインの分泌、ならびに非病原性および尿路病原性大腸菌による感染後のサイトカインの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを調査するために使用されています大腸菌 22。他の最近の研究は、精巣の免疫Pを研究するためのセルトリ細胞を使用していましたrivilege 23およびテストステロン前処理は、LPS誘導性の炎症応答24を抑制することを実証しました。

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Protocol

1.動物倫理に関する声明

ここで説明する実験は、地方自治体として、Regierungspräsidiumギーセン、ドイツのガイドラインに従って行い、実験目的のためのケアと動物の使用のための実践のドイツ語コード(許可なしに確認された:GI 20/23 Nrの31 / 2012)。

メディア、酵素溶液と動物の作製

  1. 100ミリリットルのエタノール中のヨウ素の1グラムを溶解することにより、1%ヨウ素アルコールを準備します。
  2. 2×500 mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水7.5 mlのD-グルコース(は100g / L)、5 mlの100×ペニシリン/ストレプトマイシンストック溶液(15 mg / mlでDとそれぞれ補充カルシウムなし(PBS)2+およびMg 2+調製 - グルコース、50 U / mlのペニシリンおよび50μg/ mlのストレプトマイシン最終)。
  3. 500ミリリットルロズウェルパーク記念研究所(RPMI)5ミリリットル100×ペニシリン/ストレプトマイシンストック溶液(50 U / mlのペニシリンおよび50μg/ mlのストレプトマイシンフィン付き1640 1xのサプリメントアル)。
  4. 9.9ミリリットルのPBSにI(1mg / mlのDNアーゼI)トリプシンDNアーゼIの25 mgのトリプシンを添加することにより、溶液(2.5 mg / mlでトリプシンおよび10μg/ mlのDNアーゼI)および0.1ミリリットルのDNaseを準備します。
  5. 溶液(10mg / ml)阻害剤トリプシン5 mlのPBS中の50 mgのトリプシン阻害剤を溶解します。トリプシン阻害剤B溶液10 mlのPBS(2.5 mg / mlで)25 mgのトリプシン阻害剤を溶解します。
  6. コラゲナーゼヒアルロニダーゼ-デオキシリボヌクレアーゼI(DNアーゼI)ソリューションについて(1mg / mlの最終)10 mgのコラゲナーゼA、10mgのヒアルロニダーゼ(1 mgの/ ml最終)および0.1ミリリットルのDNaseを溶解I(1mg / mlのDNアーゼI)( 10 mlのPBSでの最終10μg/ mlの)。
  7. 9.9 mlのPBSに10mgのヒアルロニダーゼ(1ミリグラム/ ml最終)および0.1 mlのDNアーゼI溶液(1mg / ml)(10μgの最終/ ml)を添加することによって、ヒアルロニダーゼ、DNアーゼI溶液を調製します。
  8. 彼らはセルトリ細胞の単離の日に19日齢になるように、時間にウィスターラットを注文。
    注:記載されているプロトコルは、10匹のラットのために設計されていますが、5の最小値と20匹のラットの最大のために改変することができます。全ての溶液の体積は、それに応じて調整しなければなりません。
  9. 100ミリリットルのイソプロパノール中に0.35グラムオイルレッドOを溶解させることによりオイルレッドOストック溶液を準備します。 O / Nを炒め、1年まで室温で0.2μmのとストアを介してフィルタリングします。
  10. 水4mlで6 mlのオイルレッドOストック溶液を混合することにより、オイルレッドO染色溶液を調製する(3:2)。 0.2ミクロンを通して10-20分フィルタ後。次の2時間以内に使用してください。
  11. 穏やかに攪拌しながら1×PBS 80ml中に4gのパラホルムアルデヒド粉末(PFA)を添加することにより、換気フード中の4%(w / v)のホルムアルデヒド溶液を調製します。熱に〜60°Cは、1 M NaOHを1ミリリットルを追加し、パラホルムアルデヒドが溶解するまで攪拌し続けます。 1 M HClおよび1×PBSで100ミリリットルの容量でpHを7.4に調整し、この溶液を室温まで冷却してみましょう。溶液(0.45μm)を濾過し、数ヶ月のために-20℃でアリコートで新鮮なまたはストアを使用しています。
    注:重合ホルムアルデヒド(PFA)は、水中のモノマーホルムアルデヒドに解重合します。このプロセスは適度な加熱とわずかにアルカリ性のpHによって触媒。たてのすべての酵素溶液を準備し、フィルタが使用する日に(0.2μM)、それらを滅菌します。酵素の異なるメーカーは材料/機器 表を参照)を使用する場合、慎重にその濃度/アクティビティを調整します。
    以下のプロトコルでは、「ピペット」は血清学的ピペットの略です。

精細管の調製

  1. 10雄WistarラットをCO 2を用いデシケーター毎分チャンバ容積の少なくとも20%を置換流量一つずつ麻酔。フットパッドを絞ることによって停止し、テスト麻酔呼吸するまで待ってから、何も反応がない場合は頸椎脱臼により各ラットを安楽死させます。流水の下で頸静脈および頸動脈(頸動脈鞘)を切片によって血液を排出します。 70%エタノールで拭いて腹部を消毒。
  2. 使用する鉗子は、腹部のムーから肌を持ち上げますクルは、胸骨(図2A)に恥骨結合から延びている楕円形の皮膚ローブを切り出して、それが胸の上に上向きにフラップ。次に、腹部の筋肉をつかむと、胸骨に恥骨結合から内側切開を行います。
    1. 骨盤下部から精巣をプッシュするために、上向きに骨盤から親指で腹部を絞ります。さらに睾丸を引き上げるための鉗子で精巣上体脂肪パッド(図2B)を選んでください。白膜はそのまま残し、精索(図2B)を切断し、50ミリリットルコニカルチューブ(図2C)に20ミリリットルのPBSにすべての精巣を集めます。
  3. すべての精巣を収集した後、エタノール中の1%(w / v)のヨウ素の等量(20ml)に添加することにより、それらを消毒します。二回チューブを反転し、直ちに上清をデカント。迅速に25ミリリットルのPBSそれぞれ(図2D)で2回精巣を洗います。
  4. 含まれているペトリ皿に精巣を転送15ミリリットルをるPBS(図2E)。 、一方の端に鉗子により強固精巣をつかんで反対側の端に白膜に小さな切開を行い、掻き取りツールとして、閉じたはさみの刃を使用して細管を絞り出します。
    注:細管はまだ均質な酵素消化(図2F)を有効にするために、溶液中に延び、わずか数尿細管でコンパクトな睾丸状の束を形成すべきです。
  5. 10ミリリットルトリプシンのDNase I溶液を含む100ミリリットルのスクリューキャップボトルに脱カプセル精巣を転送します。 32°C(120振動/分)で振とう水浴中で消化を行います。 4分後には、細管の分散のために肉眼で細管を評価します。細管は、溶液中に分散させるために開始すると、すぐに消化を停止します。必要に応じて、最大2分間のインキュベーションを続けます。
  6. ダウン3-4時間を徹底的にピペッティングすることにより溶液を混合トリプシン阻害剤溶液Aの5ミリリットルを追加することにより、トリプシン消化を停止し、10mLのピ​​ペットを用いて、50mlのコニカルチューブに移します。
  7. インキュベーションの5分後、細管は、単位重力によって沈降、慎重にステップ3.6から10mLのピ​​ペットを用いて上清を除去し、完全にトリプシン消化を停止するために、トリプシン阻害剤B溶液10mlを加える観察します。 2-3回ピペッティングにより細管を再懸濁します。
  8. 夾雑間質細胞を除去するために25ミリリットルのPBSそれぞれに細管を9回洗います。 25ミリリットルのピペットを用いて、各洗浄中の細管を再懸濁し、それらを10分間単位重力によって解決することができます。常にPBS、再懸濁し、上清の除去をピペットで同じ25ミリリットルピペットを使用しています。

管周囲細胞(のPTC)の4削除/隔離

  1. 100ミリリットルのスクリューキャップボトルにすべての細管を転送し、コラゲナーゼヒアルロニダーゼ、DNアーゼI 溶液図3A)を追加します。 (120振動/分)32℃の振とう水浴中で10分間、消化を行います。
  2. ピペットでスライドガラス上に1滴の懸濁液とすぐに100倍の倍率で、ルーチン細胞培養用倒立光学顕微鏡下で細管を確認してください。消化が進んでいない場合には、十分な(顕微鏡検査に必要な時間をカウントされません)追加の2分間のインキュベーションを継続します。
    注:このステップの間、すべての細管の長さが短く取得し、尿細管エッジは粗い(図3B及びC)になる必 ​​要があります。粗いエッジは、管周囲細胞を放出するための指標です。
  3. ステップ3.8から25ミリリットルのピペットを用いて50mlコニカルチューブに消化細管でサスペンションを転送します。 10ミリリットルのPBSで100ミリリットルのボトルを洗浄し、円錐管に細管に追加します。消化された細管を10分間単位重力によって沈降し、上清を注意深く吸引し、PTCをを含む、再び25ミリリットルピペットを使用して、新しいコニカルチューブにそれを転送することができます。最後の数ミリリットルの吸引のためのオードで5ミリリットルピペットを使用細管のいずれかのキャリーオーバーを防止するには、r。
  4. 収集細管上清20 mlのRPMI 10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を補充した1640培地を追加ブレークを使用せずに室温で10分間、300×gで混合し、遠心分離。
  5. 注意深く上清をデカントし、10%の熱不活性化FBSおよび各媒体​​16 mlを含む5 T75フラスコ上のシード各4mlを補った20ミリリットルRPMI 1640培地中でペレット生産税額控除を再懸濁します。 5%CO 2雰囲気下(図4A)で37℃でインキュベートします。
  6. 培養3 日目でのPTCをトリプシン処理し、それらを1分割:10%の熱不活化FBSを補充した16ミリリットルRPMI 1640培地を含むT75フラスコに2をそれぞれ(収率10フラスコ完全に)(図4B)。 5%CO 2雰囲気中、37℃でのインキュベーションを続けます。
  7. 培養5 日目に再び生産税額控除をトリプシン処理し、実験に応じて、6ウェルまたは24ウェルプレート上にプレート(プレート当たり1 T75フラスコ)。実験は、6日目に行うことができます。

セルトリ細胞の5単離(SCS)

  1. 25ミリリットルのピペットを用いて、徹底的にPBS 25mlにステップ4.3から定住細管を再懸濁し、それらを12分間単位重力によって解決することができます。ピペッティングPBS、尿細管および上清の除去の再懸濁のために同じ25ミリリットルピペットを使用してください。洗浄を3回(計4回の洗浄)を繰り返します。
  2. 最後の洗浄後ヒアルロニダーゼ、DNアーゼI溶液を含む別の100ミリリットルのスクリューキャップボトルに消化された細管を転送します。 32°C(120振動/分)で振とう水浴中で消化を行います。
  3. ステップ4.2で説明したように5分後、100倍の倍率で光学顕微鏡検査によって再び細管を確認してください。
    注意:ショート細管、管状の凝集体及び放出された細胞が見えるはずです(図3D)。
    1. 筒状凝集体は10分間沈降許可する、と私たちに上清を吸引25ミリリットルピペットをる。洗浄液を25mlのPBS、各洗浄工程(図3E)、10分間の沈降時間を用いて4回集約します。
  4. RPMI 1640培地20mlを追加し、20ミリリットルの注射器に取り付けられた18 Gの針を介してサスペンションを10回渡します。気泡を避けてください。
    注:針を通して内外にサスペンションを引っ張るが、1パスとして考えられています。流体力学的剪断による細胞の破壊および均質化が凝集してしまう傾向がある細胞の調製における標準的な技術です。小内径の皮下注射針を介して、細胞の通過は、それらの機能特性25に影響を与えることはほとんどありません。 図5C及びDは、培養4日目に精製されたセルトリ細胞の正常な超微細構造を示しています。
    1. ピペットでスライドガラス上に1滴の懸濁液と迅速AGG場合10倍の倍率で、ルーチン細胞培養用倒立光学顕微鏡下で細管をチェックregatesはすべて(図3F)に分散されています。ろ液中の純粋な単一細胞懸濁液を得るために、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過します。
  5. ブレークを使用せずに室温で10分間、200×gでステップ5.4のろ液を遠心分離します。注意深く25mLのピペットを用いて上清を吸引、、40mlのRPMI 1640培地(無血清)中のセルトリ細胞を再懸濁します。
  6. トリパンブルー染色100μlと100μlの細胞懸濁液を混合し、ノイバウアー改善されたチャンバーを用いて細胞を数えます。計数結果に応じて、3×10 6細胞/ mlに細胞濃度を調整します。シード6ウェルプレートにウェル当たり1ミリリットル(= 1日目)。オイルレッドO染色(ステップ6)が計画されている場合はセルトリ細胞を播種する前に、1つまたは少数のウェルにカバースリップを置きます。
    注:チューブは簡単に細胞アリコートをピペットで取られる前に、毎回振とうすべきであるように、懸濁液中のセルトリ細胞はすぐに落ち着きます。 4日目までは、彼らはしっかりとATT基層にACH。
  7. 4日目(図4C)に浮遊または付着性生殖細胞を除去するためにPBS(図4D)で分離されたセルトリ細胞(ステップ5.6)をめっきするために使用される6ウェルプレートの各ウェルを洗浄します。 、培地を吸引除去し、各ウェルにPBS 1〜2mlのを追加し、激しくなく、PBSをこぼすことなくテーブルの上に水平に6ウェルプレートを振ります。 (図4E)の洗浄を3回繰り返し、5日目と6で同じ洗浄手順を実行します。
    注:日に4セルトリ細胞がしっかりと取り付けられており、倒立光学顕微鏡(図4C)の下でのパターンのような石畳を示しています。実験は、以降7日目から実行することができます。
    1. 浮遊、付着生殖細胞の除去のため(ステップ5.7のための代替)は3日、6ウェルプレートに播種した後、低張性ショックを行います。培地を除去し、冷蔵庫から直接撮影した20 mMトリスpHが7.5の1ミリリットルを追加します。 90〜120秒後ではなく、トリス緩衝液を吸引後で。 PBSで2回細胞を洗浄し、RPMI 1640培地(無血清)の2ミリリットルを追加します。必要に応じて、次の日に実験を行います。
      注:低張性ショックの長い期間は、より多くの生殖細胞を除去することができるであるが、よりセルトリ細胞も同様に迷子になります。最初のPBS洗浄は、任意のセルトリ細胞を移動させないために迅速しかし、注意して行うべきです。直接低張処理後に、異なるサイズの多数の空胞は、位相差顕微鏡により細胞質で観察することができます。液胞は低張処理後数時間以内に消えます。

6.オイルレッドO染色

  1. RTですべての手順を実行します。 7日目に洗浄セルトリ細胞はPBSで2回カバースリップ(ステップ5.6)上で増殖させ、PBS中の10%ホルマリンで固定し。 10分後、新鮮な溶液とホルマリンを交換し、さらに60分間固定を継続します。
    注:すべてのソリューションは、カバースリップとウェル(複数可)に加え、次のステップの前に吸引されます。 吸引し、ホルマリンは、水で二回細胞を洗浄し、60%イソプロパノールを追加します。 5分後、数分間空気乾燥に細胞を可能にします。
  2. ウェルごとに1 mlのオイルレッドO染色溶液を加え、10分間インキュベートします。吸引液、および水で即座に4回細胞を洗浄し、グリセロールPBSにカバースリップをマウントし(9:1)。ルーチン光学顕微鏡(図4F)で明視野画像を撮影します。

7.免疫蛍光染色

  1. (ステップ5.5から)洗浄のPTC(ステップ4.5から)またはセルトリ細胞を2回PBSでカバースリップ上で増殖させ、室温で10分間、4%PFAで固定し。
  2. 室温で1時間、PBS中5%BSAとインキュベートします。 BSA-PBS溶液を捨て、新鮮なBSA-PBSの(のPTC用)アクチン(平滑筋)を含む溶液またはビメンチン(セルトリ細胞)一次抗体(希釈1:100両抗体用)を追加し、4°CO / Nでインキュベートします。
    注:一次抗体のBSAブロックとのインキュベーションは、非特異的結合。
  3. ウォッシュカバーをPBS-0.1%のTween 20で5分間、3回スリップし、緑色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体(希釈1:1,000)でインキュベート暗所で1時間、室温で。
  4. ウォッシュカバーをPBS-0.1%のTween 20で5分間、3回スリップし、DAPI封入剤でそれらをマウントします。

8.超微細構造解析

  1. PBSとを6cmの細胞培養プレート上で増殖させた(工程5.6からの)洗浄セルトリ細胞と67 mMのカコジル酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド、2.5%パラホルムアルデヒド及び0.05%ピクリン酸の混合物中で4℃で2時間のためにそれらを固定します(伊藤とカルノフスキー26に従ってpHは7.4)。
  2. 50 mMのマレイン酸緩衝液(pH 5)に溶解した0.3%酢酸ウラニルでO / Nインキュベートし、1%四酸化オスミウム中で後固定を行います。標準的な手順に従って、メディアを埋め込むに埋め込むサンプル。 、薄い部分をカットクエン酸鉛でそれらを対比し、電子顕微鏡で調べます。

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Representative Results

説明する手順では、10ラットの精巣から約12×10 7セルトリ細胞の単離を可能にします。 6〜7 6ウェルプレートは、7日目の実験のために利用可能であることをトリプシンDNアーゼI消化がセルトリ細胞の単離中に最も重要なステップになるように3×10 6細胞を6ウェルプレートにウェル当たり播種します。この時点での消化が遠く前進された場合に、生殖細胞の割合/セルトリ細胞は不均衡最後まで増加します。文化の日3-6中には、慎重にできるだけ離れ限り多くの緩く非接着または付着した生殖細胞を洗浄することが重要です。 4日間の広範囲の洗浄の代わりとして、生殖細胞は、3日目27に低張処理により除去することができる。この方法の利点は、セルトリ細胞特異的機能は、潜在的に優れているように、セルトリ細胞培養の時間は最小限に維持されることです文化の持続期間後よりも保持していました。

(図5B)によって実証されるように> 95%です。管周囲細胞は強い増殖能を有するため、セルトリ細胞培養物は、血清の非存在下で行われなければなりません。その画分が血清7の非存在下で1%以下であることが期待できるのに対し、10%の血清のPTCの存在下での培養の6日後にすべての細胞の約20%を構成するであろう。トリパンブルー染色により判断されるように、事実上すべての単離したセルトリ細胞が生存している(図示せず)。可能であれば実験はこの日の周りに行われるべきであるように、培養7日目の周りに分離されたセルトリ細胞は、少なくとも、生殖細胞及び管周囲細胞図4)で汚染されています。良好な再現性のためには、実験を繰り返すことが重要です文化の同じ日に、常にです。トランスフェクションは、計画されている場合、それらは4日目または5で実行されるべきであり、細胞抽出物は、5日目または6で行われるべきです。

少なくとも2週間にわたって無血清条件でセルトリ細胞は、FSHに応答するとFSH処理時よりアンドロゲン結合タンパク質、プラスミノーゲン活性化因子およびトランスフェリンを生成します。長い培養には管周囲細胞や血清のフィーダー層が必要です。 4週間後、培養物は劣化し、そして細胞を基層7から切り離します。

文化の6日目に最もセルトリ細胞は脂肪滴を取得しています。細胞の大部分では、単一の大きな液胞は(図5Cおよび5D)が形成されています。中性脂質含有量を容易にオイルレッドO 染色図4F)によって可視化することができます。

セルトリセル画に加えて、 LS除去のPTCは、(図4A および4B)ならびに培養することができます。 10精巣からのPTCは、培養の2日後にコンフルエント層を形成することが期待できる5 T75フラスコをもたらします。単離されたセルトリ細胞のように新鮮に単離されたのPTCを大幅継代によって除去することができる生殖細胞によって汚染されています。 10フラスコを分離した後、5日目にコンフルエントされるように、標準的なトリプシン処理によって2:フラスコを1に分割されています。孤立のPTCの純度は> 95%であり、α平滑筋アクチンの免疫標識(図5A)を用いて確認することができます。この日以降からのPTCは、実験のために使用することができます。一つのフラスコを約1 6ウェルプレートのために十分であり、ウェルは、次の日にコンフルエントされるべきです。細胞は何回も継代することができるが、実験では、細胞が再現可能な方法で動作することを確実にするために、同じ通路で必ず実行する必要があります。

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図1. 手順の精巣およびワークフローの形態。(A)は、隣接する間質組織との精細管のセクタが概略的に示されています。精細管は、基底膜(BM)および筋様管周囲細胞(PTC)の周層によって囲まれています。胚上皮は、基底膜の腔側に位置しています。全胚上皮にわたるセルトリ細胞(SC)は、強くBMに取り付けられ、血液精巣関門(BTB)を表す基底配置閉塞接合部を介して接続されています。彼らの不規則な核(N)は、1つ以上の亀裂のようなくぼみを示し、核小体が含まれています。生殖細胞(GC)は、その開発のすべての段階でのSCと密接に接触しています。尿細管間の隙間のコンパートメントは、ライディッヒ細胞(LC)およびマクロファージなどの免疫細胞(MΦ)ならびに血管(BV)が含まれています。フィギュアFijakとMeinhardt 28から適応。 (B)手順のワークフロー。色分けは(A)のようである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
Wistarラットから 2 精巣を摘出し、デカプセル化されている。(A)本文中に記載されているように腹腔を縦切開を介して開かれます。アスタリスク(*)はepidydimal脂肪パッドを示しています。 (B)精巣を20mlのPBSを含む50mlコニカルチューブに回収精索及び(C)を切断することによって除去されます。すべての精巣が収集されている場合、それらは1%エタノール(w / v)のヨウ素を20mlに消毒されています。ヨウ素を除去するために、それらを迅速に25mlで2回洗浄しPBSそれぞれ。 (D)は、第一のPBS洗浄後睾丸。本文中に記載されているように(E)睾丸は(右側)ペトリ皿に転送され、精細管は、(左に)閉じたはさみの刃によって開かれた白膜から絞り出されています。 (F)カプセル化を解除した精巣はまだ単一の細管が突出したコンパクト睾丸状の塊を形成する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
セルトリ細胞の 図3. 単離 (A)PBS細管とトリプシンのDNase I消化及び洗浄9x系による間質細胞を除去した後は、動員となり、きれいに見えます。コラゲナーゼヒアルロニダーゼのDNase I処理管周囲細胞中に(B)外層および生殖細胞からのsが解放されます。細管を短縮し、ラフな外観を得る取得します。 PBSで4倍を洗浄した後(C)管状断片。 (D)ヒアルロニダーゼ-DNアーゼI処理リリース残留管周囲細胞ならびに生殖細胞。細管はさらに短く取得、および管状の凝集体が形成されます。 (E)管状をPBSで4倍を洗浄した後に集約します。 (F)シングルセルトリ細胞を18G針を通して凝集体10Xを通過させることによって製造されます。 (F)におけるスケール(AE)のバー= 200μmで、= 50μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4.管周囲細胞の培養(AB)とセルトリ細胞(CF)とcontaminatの除去る生殖細胞。(A)ステップ4.5からの再懸濁のPTCはすぐに播種し、翌日に撮影しました。生殖細胞と3日目の汚染に分割した後、(B)が低減されます。 4日目セルトリ細胞で(C)は 、典型的な敷石状のパターンを示しています。フローティングおよび付着生殖細胞は、PBSで洗浄する前に表示されます。 (D)PBSで3回洗浄した後同一ウェル。汚染生殖細胞の数が減少します。 PBSで3回洗浄は、事実上すべての生殖細胞が除去された文化の6日目、5日目と6(E)で繰り返されます。セルトリ細胞は、ユニークな探して細胞層を形成しており、ほとんどの細胞は、単一の大きな液胞を取得しています。 (F)オイルレッドO染色は、これらの小胞は、主に中性脂質を含む脂質小滴であることを示しています。 (F)(AD)= 200でμmであり、(E)= 50μm単位と中のスケールバーは25μmで=。.jpgの「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5. 免疫蛍光染色ビメンチン抗体(B)とアクチン(平滑筋)抗体(A)を用いて精製し、一次管周囲細胞およびセルトリ細胞の染色。いいえ混入細胞は、ビューの両方のフィールドに表示されません。 (A)及び(B)中のスケールバーは10μmで=。培養4日後(C)及び(D)セルトリ細胞の電子顕微鏡写真。 (C) 図4Cに見られるような敷石状のパターンにつながる隣接するセル(矢頭)の密接な接触に注意してください。単一の脂肪滴(L)は、各細胞の細胞質で観察されます。 (D)最も豊富な細胞小器官ミトコンドリア(M)およびゴルジ装置(G)で ​​す。核(N)は核小体(NC)が含まれ、典型的な亀裂のようなインデントを示しています。スケール(C)= 1μm単位のバーとにおける(D)=0.25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、ギーセンMeinhardtラボでの一次セルトリ細胞の単離を確立する上で非常に有用だったグイド・バーホーベンとルードDeboel、ルーヴェンを、感謝したいと思います。モニカFijak、ギーセンは、図1Aとアドバイスで彼女の助けのために認められています。研究は、国際研究大学院大学JLUギーセン(ドイツ)/モナッシュ大学(メルボルン、オーストラリア)GRK 1871(SB)の助成金BH 93 / 1-1(SB)および資金調達を通じてドイツ学術協会によってサポートされていました。サポートはまた、「MännlicheInfertilitätバイInfektion&Entzündung」(MIBIE)と呼ばれるプログラム「ランデス-攻勢ツアEn​​twicklung Wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz」(LOEWE)内ヘッセン州の助成金から入手しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized
Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 
Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)
Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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