Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas

Immunology and Infection

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Summary

Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.

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Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

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Abstract

El testículo, y en particular el gameto masculino, desafía al sistema inmunológico de una manera única porque los espermatozoides diferenciados aparecen por primera vez en el momento de la pubertad - más de diez años después del establecimiento de la tolerancia inmune sistémica. espermatogénica células expresan una serie de proteínas que pueden ser vistos como no propio por el sistema inmune. El testículo debe entonces ser capaz de establecer tolerancia a estos neo-antígenos, por un lado, pero aún ser capaz de protegerse de infecciones y el desarrollo de tumores en el otro lado. Por lo tanto el testículo es uno de los pocos sitios privilegiados inmune en el cuerpo que toleran los antígenos extraños sin evocar una respuesta inmune inflamatoria perjudicial. células de Sertoli desempeñan un papel clave para el mantenimiento de este entorno privilegiado inmunitario de los testículos y también prolongan la supervivencia de las células cotransplanted en un entorno exterior. Por lo tanto, las células de Sertoli primarias son una herramienta importante para el estudio del privilegio inmune de los testículos que no puede ser correoasily reemplazado por líneas celulares establecidas o otros modelos celulares. Aquí se presenta un protocolo detallado y completo para el aislamiento de las células de Sertoli y las células peritubulares - si se desea - a partir de testículos de ratas dentro de un solo día.

Introduction

Testículos producen gametos masculinos y hormonas sexuales, es decir, los andrógenos. El órgano se compone de dos compartimientos. En el compartimiento intersticial, que representa alrededor del 10-12% del volumen total de testículo 1, la esteroidogénesis se lleva a cabo dentro de las células de Leydig. El compartimento tubular representa aproximadamente el 60-80% del volumen testicular 1 y contiene células germinales y dos tipos de células somáticas - células peritubulares y células de Sertoli. El testículo está dividido por tabiques de tejido conectivo en 250-300 lóbulos, cada uno con 1-3 túbulos seminíferos intrincadas. Estos túbulos están rodeados por una membrana basal, una hoja de colágeno, y una capa circunferencial de células peritubulares (Figura 1A).

El epitelio germinal se encuentra en el lado luminal de la membrana basal. células de Sertoli son grandes células alargadas que se extienden a todo el epitelio germinal desde la membrana basal al lumen. Son muy attdolía a la membrana basal y formar una lámina celular continua a través de las uniones estrechas organizados basolateral que ocluye el epitelio germinal del intersticio y representa la barrera sangre-testículo. Las células de Sertoli tienen proyecciones citoplasmáticas prominentes y ramificaciones que les permiten entrar en contacto morfológica y funcional apretado con un número específico de especie pero constante de células germinales. Las células madre germinales diploides proliferan y se diferencian en espermatogonias.

Durante la meiosis I de corta duración espermatocitos tetraploides son generados que se desarrollan a su vez en cuatro espermátidas haploides durante la meiosis II. Todas las células germinales están interconectadas por puentes citoplasmáticos de manera que formen una red celular. El evento principal durante la maduración de las espermátidas es la extrusión de grandes partes del citoplasma, formando cuerpos residuales, en un proceso llamado espermiogénesis. cuerpos residuales son fagocitados por las células de Sertoli. espermátidas tardías son luego liberados enla luz tubular y transportados en el epidídimo para su posterior maduración. las células de Sertoli y las células germinales aparecen para coordinar mutuamente espermatogénesis topográficamente y funcionalmente.

Preparación de tipos de células testiculares individuales comenzó hace casi un siglo, cuando pequeñas piezas testiculares fueron cultivadas y tipos de células identificados por microscopía 2. Mediante una cuidadosa disección de los túbulos después de la apertura de la túnica albugínea con unas pinzas de punta fina que era más tarde posible separar tubular y compartimentos intersticiales 3. En 1975 Welsh y Wiebe introdujo un tratamiento con colagenasa con el fin de liberar a los túbulos se adhiera tejido intersticial y un tratamiento de pancreatina para la eliminación de la capa de células peritubular exterior 4. Desde el principio ratas inmaduras jóvenes (alrededor de 20 días de edad) habían sido utilizados en el que las células de Sertoli comprenden una gran parte de la población de células tubulares debido a la espermatogénesis no ha comenzado aún. A esta edad Sert ratacélulas oli dejan de dividirse, y uniones estrechas entre las células vecinas de modo que forman la barrera sangre-testículo se establece 5.

Independiente de Gales y Wiebe Dorrington et al. Introduce una combinación de tripsina y desoxirribonucleasa seguido de inhibidor de tripsina y soybeen tratamiento con colagenasa que fue publicado en el mismo año 6. Ambos grupos también utilizan la fuerza mecánica (dibujo los fragmentos digeridos tubulares repetidamente a través de una aguja de jeringa o una pipeta Pasteur, respectivamente) con el fin de producir una suspensión celular homogénea para el chapado que contiene las células de Sertoli de aproximadamente 70%. Después de 3 días en cultivo, utilizando un medio que está libre de suero, el porcentaje de células de Sertoli aumenta a aproximadamente el 90%. Esto podría atribuirse en gran parte a la muerte de contaminación de las células germinales. células peritubulares residuales (PTCs), sin embargo, se mantienen firmemente unidos a través de su matriz extracelular. PTCs, pero no las células de Sertoli, son conocidos por producirfibronectina que puede servir como una proteína marcadora para la estimación de la contaminación con PTCs. Por lo tanto, Tung et al. razonó que un tratamiento adicional hialuronidasa puede mejorar la pureza de la fracción de células de Sertoli 7. De hecho podían muestran que un tratamiento adicional fue capaz de reducir la contaminación por los PTC aproximadamente 20 veces, lo que se hace particularmente evidente cuando en comparación un medio que contiene suero se utiliza para el cultivo de células de Sertoli purificados. A partir de entonces el procedimiento mejorado de Tung et al. se convirtió en el protocolo vigente y fue utilizado ampliamente por otros grupos importantes en el campo 8 (Figura 1B).

Durante el tratamiento de colagenasa la mayoría de los PTCs se liberan y se puede aislar en paralelo a las células de Sertoli. Mientras que los PTCs proliferan enérgicamente y no responden a la hormona estimulante del folículo (FSH), las células de Sertoli no sufren mitosis más y responden a la FSH por los cambios morfológicos característicosy un aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) concentración 9. Protocolos de digestión enzimática muy similar se pueden utilizar para el aislamiento de células de Sertoli primarios de otros animales como el hombre 10, ratón 11,12, hámster siberiano 13 o yak 14. Para la eliminación de grandes cantidades de contaminación de las células germinales de un choque hipotónico pueden emplearse en el extremo del procedimiento de aislamiento 15. Esto permite también el aislamiento eficiente de células de Sertoli del testículo de rata adulta 16. Una suspensión de células de Sertoli enriquecido también puede ser separado de las células germinales en placas la suspensión en placas revestidas con lectina aglutinina de Datura stramonium 17. Sólo las células de Sertoli y algunas PTCs residuales se adhieren a las placas de lectina.

cultivos de células primarias de Sertoli, principalmente de la rata, se han utilizado inicialmente para la investigación de la capacidad de respuesta a las hormonas o el establecimiento de líneas celulares como el li celular de ratón Sertoline TM4 18. Esta línea celular se ha investigado en más de un centenar de estudios hasta la actualidad. En un enfoque de traslación se han utilizado las células de Sertoli para inmuno-protección de las células y tejidos, como en la co-trasplante de islotes pancreáticos xeno o alogénicos para la supervivencia del injerto a largo plazo co-cultivadas sin inmunosupresión sistémica 19. Las células de Sertoli aisladas también se han utilizado en los experimentos de co-cultivo para el estudio de epitelio-mesenquimal (células de Sertoli - PTCC) y de células somáticas de gérmenes (células de Sertoli - células germinales) las interacciones 20, 21. Se han empleado células de Sertoli Recientemente primarias para la investigación de la expresión de receptores de tipo Toll y la secreción de citocinas proinflamatorias, así como las cascadas de transducción de señales que conduce a la expresión de citoquinas después de la infección con E. no patógeno y uropathogenic coli 22. Otras investigaciones recientes estaban usando células de Sertoli para estudiar testicular p inmunerivilege 23 y demostró que la testosterona pre-tratamiento suprime la respuesta inflamatoria inducida por LPS-24.

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Protocol

1. Declaración de Ética Animal

Los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Regierungspräsidium Giessen, Alemania, como la autoridad local y confirman a la Ley alemana de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines experimentales (Permiso. No: 20/23 GI Nr A 31 / 2012).

2. Preparación de los medios de comunicación, soluciones de enzimas y Animales

  1. Preparar 1% de alcohol de yodo mediante la disolución de 1 g de yodo en 100 ml de etanol.
  2. Preparar 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (PBS) sin Ca2 + y Mg2 + suplementado cada uno con 7,5 ml de D-glucosa (100 g / L) y 5 ml 100x penicilina / estreptomicina solución madre (15 mg / ml D -glucosa, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina final).
  3. Suplemento 1 x 500 ml Parque Memorial Instituto Roswell (RPMI) 1640 con 5 ml 100x penicilina / estreptomicina solución madre (50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina aletaAlabama).
  4. Preparar una solución de tripsina-DNasa I (2,5 mg / ml de tripsina y 10 mg / ml de ADNasa I) mediante la adición de 25 mg de tripsina y 0,1 ml de DNasa I (1 mg / ml de ADNasa I) a 9,9 ml de PBS.
  5. Disolver 50 mg de inhibidor de tripsina en 5 ml de PBS para la tripsina inhibidor de una solución (10 mg / ml). Disolver 25 mg de inhibidor de tripsina en 10 ml de PBS para solución de tripsina inhibidor B (2,5 mg / ml).
  6. Para una solución de colagenasa-hialuronidasa-desoxirribonucleasa I (ADNasa I) disolver 10 mg de colagenasa A (1 mg / ml final), 10 mg de hialuronidasa (1 mg / ml final) y 0,1 ml de DNasa I (1 mg / ml de ADNasa I) ( 10 g / FINAL ml) en 10 ml de PBS.
  7. Preparar una solución de hialuronidasa de DNasa I mediante la adición de 10 mg de hialuronidasa (1 mg / ml final) y 0,1 ml de solución de DNasa I (1 mg / ml) (10 mg / ml final) a 9,9 ml de PBS.
  8. Ordenar ratas Wistar en el tiempo de manera que sean 19 días de edad el día del aislamiento de células de Sertoli.
    Nota: El protocolo descrito está diseñado para 10 ratas, pero puede ser modificado por un mínimo de 5 y un máximo de 20 ratas.Los volúmenes de todas las soluciones tienen que ajustarse en consecuencia.
  9. Preparar Oil Red O solución madre disolviendo 0,35 g Oil Red O en 100 ml de isopropanol. Stir S / N, filtrar a través de 0,2 micras y se almacena a temperatura ambiente durante un máximo de un año.
  10. Preparar la solución de tinción con Oil Red O mediante la mezcla de 6 ml Oil Red O solución madre con 4 ml de agua (3: 2). Después de 10 a 20 min a través de filtro de 0,2 micras. Usar dentro de los siguientes 2 horas.
  11. Preparar un 4% (w / v) de solución de formaldehído en una campana ventilada mediante la adición de 4 g de polvo de paraformaldehído (PFA) a 80 ml de 1x PBS mientras se agitaba suavemente. Calentar a ~ 60 ° C, añadir 1 ml de NaOH 1 M y continuar revolviendo hasta que se disuelva el paraformaldehído. Deje que la solución se enfríe hasta la temperatura ambiente, ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M y el volumen a 100 ml con PBS 1x. Filtrar la solución (0,45 m) y utilizar fresca o almacenar en alícuotas a -20 ° C durante varios meses.
    Nota: polimerizado formaldehído (PFA) depolymerizes al formaldehído monómero en agua. Este proceso escatalizada por calentamiento moderado y un pH ligeramente alcalino. Preparar todas las soluciones de enzima recién y esterilizar por filtración (0,2 M) en el día de uso. Si un fabricante diferente para una enzima (véase Materiales / Equipos de la tabla) se utiliza, ajustar cuidadosamente su concentración / actividad.
    En el siguiente protocolo un "pipeta" se refiere a una pipeta serológica.

3. Preparación de los túbulos seminíferos

  1. Anestesie 10 ratas Wistar macho de uno en uno en un desecador usando CO 2 y una velocidad de flujo que desplaza al menos 20% del volumen de la cámara por minuto. Espere hasta que la respiración se detiene, la anestesia prueba apretando una almohadilla de la pata, y si no hay reacción eutanasia a cada rata por dislocación cervical. Drenar la sangre seccionando la vena yugular y la arteria carótida (carotica vagina) con agua corriente. Desinfectar el abdomen frotando con un 70% de etanol.
  2. Utilizando unas pinzas levantar la piel de la mus abdominalculos y recorten un lóbulo de la piel de forma ovalada que se extiende desde la sínfisis del pubis hasta el esternón (Figura 2A) y la solapa hacia arriba sobre el pecho. A continuación, apoderarse de los músculos abdominales y hacer una incisión medial de la sínfisis del pubis hasta el esternón.
    1. Aprieta el abdomen con los pulgares de la pelvis hacia arriba con el fin de empujar los testículos fuera de la pelvis inferior. Recoger la almohadilla de grasa del epidídimo (Figura 2B) con unas pinzas para tirar del testículo más. Cortar el cordón espermático (Figura 2B), dejando la túnica albugínea intacta, y recoger todos los testículos en 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml (Figura 2C).
  3. Después de recoger todos los testículos, desinfectarlos mediante la adición de un volumen igual (20 ml) de 1% de yodo en etanol (v / w). Invierta el tubo dos veces y se decanta el sobrenadante inmediatamente. Lavar rápidamente los testículos dos veces con 25 ml de PBS cada uno (Figura 2D).
  4. La transferencia de los testículos para una placa de Petri contieneing 15 ml de PBS (Figura 2E). Sujete firmemente cada testículo por una pinza en un extremo, hacer una pequeña incisión en la túnica albugínea en el extremo opuesto, y exprimir los túbulos utilizando hojas de las tijeras cerradas como una herramienta de raspado.
    Nota: Los túbulos todavía deben formar un haz compacto en forma de testículo-con sólo unos pocos túbulos que se extiende en la solución con el fin de permitir la digestión enzimática homogénea (Figura 2F).
  5. La transferencia de los testículos de-encapsulada a una botella de 100 ml con tapón de rosca que contiene 10 ml de solución de tripsina-DNasa I. Realizar la digestión en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min). Después de 4 minutos evalúan los túbulos con el ojo desnudo para la dispersión de los túbulos. Una vez túbulos comienzan a dispersarse en la solución, detener la digestión inmediatamente. Si es necesario, continuar la incubación durante hasta 2 min.
  6. Deja de digestión con tripsina mediante la adición de 5 ml de solución de inhibidor de tripsina A. Mezclar la solución con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 vezs utilizando una pipeta de 10 ml y la transfiere a un tubo cónico de 50 ml.
  7. Después de 5 min de incubación observan los túbulos se asientan por unidad de gravedad, retirar con cuidado el sobrenadante mediante el uso de la pipeta 10 ml de la etapa 3.6 y añadir 10 ml de solución de inhibidor de tripsina de B con el fin de detener completamente la digestión con tripsina. Resuspender los túbulos pipeteando arriba y abajo 2-3 veces.
  8. Con el fin de eliminar la contaminación de células intersticiales lavan los túbulos 9 veces con 25 ml de PBS cada una. Resuspender túbulos en cada lavado utilizando una pipeta de 25 ml y dejar que se asienten por unidad de gravedad durante 10 minutos. Siempre use la misma pipeta 25 ml para pipetear PBS, la resuspensión y eliminación del sobrenadante.

4. Remoción / Aislamiento de células peritubulares (PTC)

  1. Transferir todos los túbulos a una botella con tapón de rosca de 100 ml y añadir la solución de colagenasa-hialuronidasa-DNasa I (Figura 3A). Realizar la digestión de 10 min en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min).
  2. Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de vidrio y comprobar rápidamente los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina a un aumento de 100x. Si la digestión no es lo suficientemente avanzada continuar la incubación durante 2 minutos adicionales (no cuente el tiempo necesario para la verificación microscópica).
    Nota: Durante este paso todos los túbulos quedan acortados en longitud y túbulo bordes deben llegar a ser áspero (Figura 3B y C). Los bordes ásperos son indicativos para la liberación de células peritubulares.
  3. Transferir la suspensión con los túbulos digeridos a un tubo cónico de 50 ml usando la pipeta 25 ml de la etapa 3.8. Se lava la botella de 100 ml con 10 ml de PBS y añadirlo a los túbulos en el tubo cónico. Permitir que los túbulos digeridos se asienten por gravedad unidad durante 10 min, y con cuidado aspirar el sobrenadante, que contiene los PTCs, usando la pipeta 25 ml de nuevo, y la transfiere a un nuevo tubo cónico. Para la aspiración de los últimos mililitros utilizar una pipeta de 5 ml en el ordeR Para evitar cualquier arrastre de los túbulos.
  4. Añadir 20 ml de medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS) a los sobrenadantes recogidos de los túbulos, mezclar y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA sin usar la pausa.
  5. decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender los PTCs sedimentadas en 20 ml de RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y las semillas 4 ml cada uno en cinco matraces T75 que contienen 16 ml de medio cada uno. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 (Figura 4A).
  6. En el 3er día de la cultura trypsinize los PTC y los dividieron 1: 2 en matraces T75 que contenían 16 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% cada uno (rendimiento 10 frascos por completo) (Figura 4B). Continuar la incubación a 37 ° C en 5% de CO2.
  7. En el 5º día de cultivo trypsinize los PTCs una y otra placa ellas en placas de 6 pocillos o de 24 pocillos, dependiendo del experimento(Un frasco T75 por placa). Los experimentos se pueden realizar en el día 6.

5. Aislamiento de células de Sertoli (SCS)

  1. Volver a suspender los túbulos asentado desde el paso 4.3 a fondo en 25 ml de PBS utilizando una pipeta de 25 ml y dejar que se asienten por unidad de gravedad durante 12 minutos. Utilice la misma pipeta de 25 ml de PBS para el pipeteado, la resuspensión de los túbulos y la eliminación de los sobrenadantes. Repita el lavado 3 veces (4 lavados en total).
  2. Después del último lavado transferir los túbulos digeridos con otros 100 ml frasco que contiene la solución de hialuronidasa-DNasa I-tapón de rosca. Realizar la digestión en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min).
  3. Después de 5 min comprobar los túbulos de nuevo mediante inspección al microscopio óptico con un aumento de 100X como se describe en el paso 4.2.
    Nota: Los túbulos cortos, agregados tubulares y células liberadas deben ser visibles (Figura 3D).
    1. Permitir que los agregados tubulares se asientan durante 10 minutos, y aspirar el sobrenadante nosotrosing una pipeta de 25 ml. Lavar los agregados de 4 veces utilizando 25 ml de PBS y un tiempo de sedimentación de 10 min para cada etapa de lavado (Figura 3E).
  4. Añadir 20 ml de medio RPMI 1640 y pasar la suspensión 10 veces a través de una aguja de 18 G montado en una jeringa de 20 ml. Evitar las burbujas de aire.
    Nota: Al tirar de la suspensión de entrada y salida a través de la aguja se considera como una sola pasada. La interrupción y la homogeneización de las células por cizallamiento hidrodinámico es una técnica estándar en la preparación de células que tienden a agregarse. El paso de células a través de una aguja hipodérmica de pequeña diámetro interior es poco probable que tenga un impacto en sus propiedades funcionales 25. La figura 5C y D muestra la ultraestructura normal de las células de Sertoli purificó en día 4 de cultivo.
    1. Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de cristal y controlar los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina a un aumento de 10X si el agg rápidamenteregates están dispersas (Figura 3F). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras con el fin de obtener una suspensión de células individuales puro en el filtrado.
  5. Se centrifuga el filtrado de paso de 5,4 a 200 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente sin necesidad de utilizar la pausa. aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una pipeta de 25 ml, y resuspender las células de Sertoli en 40 ml de medio RPMI 1640 (sin suero).
  6. Mezclar 100 l de suspensión celular con 100 l de azul de tripano de maquillaje y contar las células con una cámara de Neubauer mejorada. Ajustar la concentración de células a 3 x 10 6 células / ml de acuerdo con el resultado del recuento. Semilla de 1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos (= día 1). Si se planea una tinción con Oil Red O (paso 6) poner una hoja de cubierta en uno o unos pocos pozos antes de la siembra de células de Sertoli.
    Nota: las células de Sertoli en suspensión se depositan rápidamente de modo que el tubo se debe agitar brevemente cada vez antes de una parte alícuota de células se toma con la pipeta. Hasta el día 4 que firmemente attACH al sustrato.
  7. Con el fin de eliminar las células germinales que flotan o adherentes en el día 4 (Figura 4C) lavar cada pocillo de las placas de 6 pocillos utilizados para el recubrimiento de las células de Sertoli aisladas (paso 5.6) con PBS (Figura 4D). Aspirar el medio, añadir 1-2 ml de PBS a cada pocillo y agitar las placas de 6 pocillos horizontalmente sobre una mesa con vigor, pero sin derramar PBS. Repita el lavado 3 veces y llevar a cabo el mismo procedimiento de lavado en el día 5 y 6 (Figura 4E).
    Nota: En el día 4 células de Sertoli se hayan fijado firmemente y mostrar un adoquín como patrón bajo el microscopio de luz invertida (Figura 4C). Los experimentos se pueden realizar desde el día 7 en adelante.
    1. (Alternativa para el paso 5.7) Para la eliminación de las células germinales flotante y adherentes realizan un choque hipotónico 3 días después de la siembra en placas de 6 pocillos. Retirar el medio y añadir 1 ml de 20 mM Tris pH 7,5 tomadas directamente de la nevera. Aspirar el tampón Tris después de 90 a 120 seg pero noluego. Lavar las células dos veces con PBS, y añadir 2 ml de medio RPMI 1640 (sin suero). Opcionalmente, realizar experimentos al día siguiente.
      Nota: La mayor es la duración del choque hipotónico es las células germinales más se pueden eliminar pero los más células de Sertoli se perdió también. El primero de lavado PBS se debe realizar rápidamente, pero con cuidado a fin de no desplazar las células de Sertoli. Directamente después de tratamiento hipotónico numerosas vacuolas de diferentes tamaños pueden ser observados en el citoplasma por microscopía de contraste de fase. Vacuolas desaparecen a las pocas horas después del tratamiento hipotónico.

6. Oil Red O tinción

  1. Realizar todos los pasos a TA. En el día 7 de células de Sertoli de lavado cultivan en una hoja de cubierta (paso 5.6) con PBS dos veces y fijarlas con formalina al 10% en PBS. Después de 10 min reemplazar formalina con solución fresca, y continuar la fijación durante otros 60 min.
    Nota: Todas las soluciones se añaden a la bien (s) con una hoja de cubierta y aspiraron antes del siguiente paso. Aspirar formalina, lavar las células con agua dos veces y añadir un 60% de isopropanol. Después de 5 min permitir que las células se sequen al aire durante unos minutos.
  2. Añadir 1 ml Oil Red O tinción solución por pocillo y se incuba durante 10 min. Aspirar la solución, y lavar las células inmediatamente 4 veces con agua y montar la cubierta se desliza en glicerol-PBS (9: 1). Tomar imágenes de campo claro con un microscopio óptico de rutina (Figura 4F).

7. La tinción de inmunofluorescencia

  1. Lavar PTCs (del paso 4.5) o células de Sertoli (del paso 5,5) cultivadas en un cubreobjetos con PBS dos veces y fijarlas con 4% PFA durante 10 min a RT.
  2. Incubar con 5% de BSA en PBS durante 1 hora a RT. Desechar la solución de BSA-PBS y añadir nueva solución de BSA-PBS que contiene actina (músculo liso) (para los PTC) o vimentina (para células de Sertoli) anticuerpo primario (dilución 1: 100 para ambos anticuerpos) y se incuba a 4 ° CO / N.
    Nota: La incubación con BSA bloques de la unión no específica del anticuerpo primario.
  3. la cubierta se desliza Wash 3 veces durante 5 minutos en PBS-0,1% de Tween 20 y se incuba con un tinte verde fluorescente conjugado de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (dilución 1: 1000) a TA durante 1 h en la oscuridad.
  4. la cubierta se desliza Wash 3 veces durante 5 minutos en PBS-0,1% de Tween 20 y montarlos en DAPI medio de montaje.

8. Análisis ultraestructural

  1. Lavar las células de Sertoli (del paso 5,6) cultivadas en una placa de cultivo celular de 6 cm con PBS y fijarlos durante 2 horas a 4 ° C en una mezcla de 2,5% de glutaraldehído, 2,5% de paraformaldehído y ácido pícrico al 0,05% en tampón de cacodilato 67 mM ( pH 7,4) de acuerdo con Ito y Karnovsky 26.
  2. Realizar post-fijación en tetróxido de osmio al 1% seguido de un / N incubación O en acetato de uranilo al 0,3% disuelto en 50 mM de tampón de maleato (pH 5). muestras incrustar en la incorporación de los medios de comunicación de acuerdo con procedimientos estándar. Los cortes de secciones delgadas, contrastarlas con citrato de plomo y examinar con un microscopio electrónico.

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Representative Results

El procedimiento descrito permite el aislamiento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de 10 testículos de ratas. 3 x 10 6 células se colocan por pocillo en una placa de 6 pocillos de manera que entre seis y siete placas de 6 pocillos están disponibles para los experimentos en el día 7. La digestión con tripsina-DNasa I es el paso más crítico durante el aislamiento de células de Sertoli. Si la digestión en este punto está avanzando demasiado lejos, la proporción de células germinales / células de Sertoli será desproporcionadamente aumentar hasta el final. Durante los días 3-6 de la cultura es importante lavar cuidadosamente a medida que muchos no adherente o ligeramente unidas las células germinales como sea posible. Como alternativa a extensos lavados más de 4 días las células germinales pueden ser eliminados por tratamiento hipotónico en días 3 27. Una ventaja de este método es que el tiempo de cultivo de células de Sertoli se mantiene a un mínimo de modo que las funciones específicas de las células de Sertoli son potencialmente mejor retenido que después de un período prolongado de cultivo.

(Figura 5B). Dado que las células peritubulares tienen un gran potencial proliferativo, cultivo de células de Sertoli tiene que ser realizado en ausencia de suero. En presencia de 10% de suero PTCs constituirían aproximadamente 20% de todas las células después de 6 días de cultivo mientras que su fracción se puede esperar que estar por debajo de 1% en ausencia de suero 7. células de Sertoli Virtualmente todos los aislados son viables como se juzga por tinción con azul tripán (no mostrados). Alrededor del día 7 de cultivo, las células de Sertoli aisladas son menos contaminados con células germinales y las células peritubulares (Figura 4), ​​por lo que los experimentos deben realizarse en torno a este día si es posible. Para una buena reproducibilidad es importante repetir experimentoSiempre es el mismo día de la cultura. Si se planifican transfecciones que deben llevarse a cabo en el día 4 o 5, y los extractos celulares se deben hacer en el día 5 o 6.

Durante al menos dos semanas en las células de Sertoli condiciones libres de suero son sensibles a la FSH y producir más proteína de unión de andrógenos, activador del plasminógeno y transferrina al tratamiento con FSH. Para el cultivo ya se requiere una capa de alimentación de células peritubulares o suero. Después de cuatro semanas culturas se deterioran, y las células se desprenden del sustrato 7.

En el día 6 de cultivo de células de Sertoli más han adquirido las gotas de lípidos. En la mayoría de las células una sola gran vacuola ha formado (Figura 5C y 5D). El contenido de lípidos neutros puede ser fácilmente visualizado por tinción con Oil Red O (Figura 4F).

Además de Sertoli cel ls los PTCs eliminados se pueden cultivar también (Figura 4A y 4B). PTCs de 10 testículos dió cinco matraces T75 que se pueden esperar para formar una capa confluente después de 2 días de cultivo. Como las células de Sertoli aisladas PTCs recién aisladas están contaminados por células germinales que se pueden eliminar en gran medida por pases. Los matraces se dividieron 1: 2 por tripsinización estándar de modo que 10 frascos serán confluentes en el día 5 después del aislamiento. La pureza de los PTC aisladas es> 95% y se puede confirmar mediante inmunomarcaje actina de músculo liso α-(Figura 5A). A partir de este día en adelante PTC se pueden utilizar para los experimentos. Un matraz es suficiente para una placa de 6 pocillos, aproximadamente, y los pocillos se debe confluente el día siguiente. Las células pueden ser pasados ​​muchas veces, pero los experimentos deben realizarse siempre en el mismo paso a fin de asegurarse de que las células se comportan de una manera reproducible.

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Figura 1. Morfología de los testículos y el flujo de trabajo del procedimiento. (A) Un sector de un túbulo seminífero con el tejido intersticial adyacente se muestra esquemáticamente. túbulos seminíferos están rodeados por una membrana basal (BM) y una capa circunferencial de células peritubulares mioides (PTC). El epitelio germinal se encuentra en el lado luminal de la membrana basal. células de Sertoli (SC), que cubre todo el epitelio germinal están fuertemente unidos a la BM y interconectados a través de basolateral posicionado uniones de oclusión que representan la barrera sangre-testículo (BTB). Su núcleo irregular (N) muestra una o más muescas fisuras similar y contiene un nucléolo. Las células germinales (GC) están en contacto íntimo con los SC en todas las etapas de su desarrollo. El compartimiento intersticial entre los túbulos contiene células de Leydig (LC) y las células inmunes, tales como macrófagos (MΦ), así como los vasos sanguíneos (BV). Figuraadaptado de Fijak y Meinhardt 28. (B) de flujo de trabajo del procedimiento; código de colores es como en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Los testículos de ratas Wistar se escinden y decapsulated. (A) La cavidad peritoneal se abre a través de una incisión longitudinal como se describe en el texto. Un asterisco (*) indica la almohadilla de grasa epidydimal. (B) Los testículos son eliminados mediante el corte del cordón espermático y (C) recogida en un tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de PBS. Cuando todos los testículos se han recogido que se desinfectan en 20 ml de 1% (w / v) de yodo en etanol. Para la eliminación del yodo que desaparecen rápidamente dos veces con 25 mlPBS cada una. (D) Los testículos después del primer lavado PBS. (E) Los testículos son transferidos a una placa de Petri (a la derecha), y los túbulos seminíferos se aprietan hacia fuera de la túnica albugínea abierto por medio de cuchillas de la tijera cerradas (a la izquierda) como se describe en el texto. (F) Los testículos Decapsulated todavía forman una masa en forma de testículo-compacto con túbulos individuales que sobresale. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Aislamiento de células de Sertoli. (A) Después de la eliminación de las células intersticiales por la tripsina de DNasa I 9x de digestión y el lavado con PBS túbulos convertirse movilizada y un aspecto limpio. (B) durante el tratamiento de colagenasa-hialuronidasa de DNasa I peritubular células de las células de la capa germinal externa y se liberan. Los túbulos quedan acortados y obtener un aspecto rugoso. (C) fragmentos tubulares Después de lavar 4 veces con PBS. Comunicados de tratamiento (D) hialuronidasa de DNasa I células peritubulares residuales, así como células germinales. Túbulos consiguen acortar aún más, y forman agregados tubulares. (E) tubular agregados después de lavar 4 veces con PBS. Células (F) Individual de Sertoli se producen haciendo pasar los agregados 10x través de una aguja 18G. Las barras de escala en (AE) = 200 m, en (F) = 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Cultivo de células peritubulares (AB) y células de Sertoli (CF) y la eliminación de contaminat ing células germinales. (A) PTCs resuspendidas de la etapa 4.5 se sembraron inmediatamente y se fotografiaron el día siguiente. (B) Después de dividir el día 3 contaminación con células germinales se reduce. (C) En el día 4 células de Sertoli muestran un patrón típico de adoquines similar. Flotantes y se adhieren las células germinales son visibles antes de lavar con PBS. (D) El mismo pozo después de lavar 3 veces con PBS. El número de células germinales contaminantes se reduce. Lavar tres veces con PBS se repite en días 5 y 6. (E) En el día 6 de cultivo se han eliminado prácticamente todas las células germinales. Las células de Sertoli han formado una capa de células de mirada única, y la mayoría de las células han adquirido una única vacuola grande. (F) Aceite O tinción roja muestra que estas vacuolas son las gotas de lípidos que contienen lípidos neutros en gran medida. Las barras de escala en (AD) = 200 m, en (E) = 50 micras y en (F) = 25 micras..jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 5
Figura 5. La tinción de inmunofluorescencia. La tinción de las células peritubulares primarias purificadas con la actina (músculo liso) anticuerpo (A) y de Sertoli células con anticuerpo vimentina (B). No hay células contaminantes son visibles en ambos campos de visión. La barra de escala en (A) y (B) = 10 micras. (C) y (D) de microscopía electrónica imágenes de células de Sertoli después de 4 días en cultivo. (C) Nota el estrecho contacto de las células adyacentes (puntas de flecha) que conduce al patrón de adoquines similar como se ve en la Figura 4C. Una gotita de lípidos única (L) se observa en el citoplasma de cada célula. (D) orgánulos más abundantes son las mitocondrias (M) y el aparato de Golgi (G).El núcleo (N) contiene un nucléolo (Nc) y muestra la típica sangría fisura similar. La barra de escala en (C) = 1 micras y en (D) = 0,25 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Guido Verhoeven y Ludo Deboel, Lovaina, que eran extremadamente útil para establecer el aislamiento de las células de Sertoli primarias en el laboratorio Meinhardt en Giessen. Monika Fijak, Giessen, es reconocido por su ayuda en la figura 1A y asesoramiento. Los estudios fueron apoyados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través BH subvención 93 / 1-1 (SB) y la financiación de la Investigación de Graduados de la universidad de Giessen JLU Internacional (Alemania) / Universidad de Monash (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). El apoyo también se obtuvo de una subvención del Estado de Hessen, dentro del programa "Landes-ofensivo zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) llamado "männliche Infertilität bei Infektion y Entzündung" (MIBIE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized
Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 
Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)
Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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