Isolamento delle cellule di Sertoli e peritubulari cellule da Rat testicoli

Immunology and Infection

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Summary

pile Sertoli sono necessari per lo studio testicolo-immunitario privilegio, trasduzione del segnale durante l'infiammazione o infezione, e l'utilizzo delle loro proprietà immunoprotettivi. Qui si descrive un protocollo a base di enzimi per l'isolamento delle cellule di Sertoli primaria altamente purificate e cellule peritubulari da testicoli di ratto.

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Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

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Abstract

Il testicolo, ed in particolare il gamete maschile, sfida il sistema immunitario in modo unico perché differenziato spermatozoi appaiono prima al momento della pubertà - più di dieci anni dopo l'istituzione della tolleranza immunitaria sistemica. cellule spermatogeniche esprimono un certo numero di proteine ​​che possono essere visti come non-self dal sistema immunitario. Testicolo deve quindi essere in grado di stabilire tolleranza a questi neo-antigeni da un lato ma comunque in grado di proteggersi dalle infezioni e sviluppo tumorale dall'altro. Pertanto il testicolo è uno dei pochi siti privilegiati immunitarie del corpo che tollerano antigeni estranei senza evocare una risposta immunitaria infiammatoria dannosa. cellule di Sertoli svolgono un ruolo chiave per il mantenimento di questo ambiente privilegiato immunitario del testicolo e anche prolungare la sopravvivenza delle cellule cotransplanted in un ambiente straniero. Pertanto cellule di Sertoli primarie sono uno strumento importante per lo studio del privilegio immunitario del testicolo che non può essere postaasily sostituito da linee cellulari stabilizzate o altri modelli cellulari. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l'isolamento delle cellule di Sertoli - e le cellule peritubulari se lo si desidera - da testicoli di ratto in un solo giorno.

Introduction

Testicoli producono gameti maschili e ormoni sessuali, cioè, gli androgeni. L'organo è composto di due compartimenti. Nel vano interstiziale, che rappresenta circa il 10-12% del volume testicolare totale 1, steroidogenesi avviene all'interno delle cellule di Leydig. Il vano tubolare rappresenta circa il 60-80% del volume testicolare 1 e contiene le cellule germinali e due tipi di cellule somatiche - cellule peritubulari e cellule di Sertoli. Il testicolo è diviso da setti di tessuto connettivo in 250-300 lobuli, ciascuna contenente 1-3 altamente contorte tubuli seminiferi. Questi tubuli sono racchiusi da una membrana basale, un foglio di collagene, e uno strato circonferenziale di cellule peritubulari (Figura 1A).

L'epitelio germinale si trova sul lato luminale della membrana basale. cellule di Sertoli sono grandi cellule allungate che si estendono su tutta la epitelio germinale dalla membrana basale al lume. Sono fortemente attdoleva alla membrana basale e formare un foglio cellulare continuo attraverso basolaterale giunzioni strette organizzati che occlude l'epitelio germinale dall'interstizio e rappresenta la barriera emato-testicolare. cellule di Sertoli hanno proiezioni citoplasmatici di primo piano e ramificazioni che permettono loro di entrare in contatto morfologica e funzionale stretto con un numero di specie-specifica, ma costante di cellule germinali. Le cellule staminali germinali diploidi proliferano e si differenziano in spermatogoni.

Durante la meiosi I breve durata spermatociti tetraploide sono generate che si sviluppano ulteriormente in quattro spermatidi aploidi durante la meiosi II. Tutte le cellule germinali sono interconnesse da ponti citoplasmatici in modo da formare una rete cellulare. L'evento principale durante la maturazione di spermatidi è l'estrusione di gran parte del citoplasma, formando corpi residui, in un processo chiamato spermiogenesi. corpi residui vengono fagocitati dalle cellule del Sertoli. spermatidi tardivi vengono poi rilasciati inlume tubulare e trasportati nelle epididimo di ulteriore maturazione. cellule di Sertoli e le cellule germinali sembrano coordinare reciprocamente spermatogenesi topograficamente e funzionale.

Preparazione dei singoli tipi di cellule testicolari iniziata quasi un secolo fa, quando piccoli pezzi testicolari sono state coltivate e tipi di cellule identificate al microscopio 2. Con un'attenta dissezione dei tubuli dopo l'apertura della tunica albuginea con pinze punta fine è stato poi possibile separare tubolare e compartimenti interstiziali 3. Nel 1975 Welsh e Wiebe introdotto un trattamento collagenasi per liberare i tubuli di aderire tessuto interstiziale e un trattamento pancreatina per la rimozione dello strato di cellule peritubulare esterna 4. Fin dall'inizio ratti giovani immaturi (circa 20 giorni) erano stati utilizzati in cui le cellule di Sertoli comprendono una grande frazione della popolazione delle cellule tubulari, perché la spermatogenesi non è ancora iniziato. A questo ratto Sert etàcellule oli cessano di dividersi, e giunzioni strette tra le cellule vicine formano in modo che la barriera emato-testicolare è stabilito 5.

Indipendente di Welsh e Wiebe Dorrington et al. Ha introdotto una combinazione di tripsina e deossiribonucleasi seguito da inibitore della tripsina e soybeen trattamento collagenasi che è stato pubblicato nello stesso anno 6. Entrambi i gruppi utilizzati anche forza meccanica (disegno frammenti digeriti tubolari volte attraverso un ago siringa o una pipetta Pasteur, rispettivamente) per produrre una sospensione omogenea per la placcatura che contiene circa il 70% di cellule di Sertoli. Dopo 3 giorni di coltura, utilizzando un mezzo che è privo di siero, la percentuale di cellule di Sertoli aumenta di circa il 90%. Questo potrebbe essere in gran parte attribuito alla morte di contaminare cellule germinali. Residui cellule peritubulari (CTP), tuttavia, rimanere saldamente attaccati tramite il loro matrice extracellulare. CTP, ma non le cellule di Sertoli, sono noti per la produzionefibronectina che può servire come una proteina marker per valutare la contaminazione con PTC. Pertanto, Tung et al. motivato che un trattamento ialuronidasi ulteriore potrebbe migliorare la purezza della frazione di cellule di Sertoli 7. In effetti si potrebbe dimostrano che un trattamento aggiuntivo è stato in grado di ridurre la contaminazione da PTC di circa 20 volte, che diventa particolarmente evidente quando in confronto un mezzo di siero contenente viene utilizzato per la coltivazione di cellule di Sertoli purificate. Da allora la procedura perfezionata di Tung et al. è diventato il protocollo prevalente ed è stato ampiamente utilizzato da altri gruppi importanti nel campo 8 (Figura 1B).

Durante il trattamento collagenasi la maggioranza dei PTC vengono rilasciati e può essere isolato in parallelo alle cellule di Sertoli. Considerando che le PTC vigorosamente proliferano e non rispondono al follicolo-stimolante (FSH), cellule di Sertoli non subiscono mitosi più e rispondere alle FSH da cambiamenti morfologici caratteristicie un aumento adenosina monofosfato ciclico (cAMP) concentrazione 9. Molto simili protocolli digestione enzimatica può essere utilizzato per l'isolamento delle cellule di Sertoli primarie da altri animali come l'uomo 10, il mouse 11,12, criceto siberiano 13 o 14 yak. Per la rimozione di grandi quantità di contaminanti cellule germinali uno shock ipotonico può essere impiegato al termine della procedura di isolamento 15. Ciò consente anche l'isolamento efficiente delle cellule di Sertoli da ratto adulto testicoli 16. Una sospensione di cellule di Sertoli arricchito può essere separato dalle cellule germinali dalla placcatura la sospensione su piatti lectina rivestiti con Datura stramonium agglutinine 17. Solo le cellule di Sertoli e un paio di PTC residui aderiscono alle piastre lectina.

colture cellulari primarie di Sertoli, soprattutto dal ratto, sono stati utilizzati inizialmente per studiare la reattività agli ormoni o la creazione di linee cellulari, come la Li cellule del mouse Sertoline TM4 18. Questa linea cellulare è stata valutata in più di un centinaio di studi fino ad oggi. In un approccio traslazionale cellule di Sertoli sono stati utilizzati per immuno-protezione delle cellule e dei tessuti, come nella co-trapianto di isole pancreatiche xeno- o allogenici per la sopravvivenza del trapianto a lungo termine co-coltura senza immunosoppressione sistemica 19. Cellule di Sertoli isolate sono stati utilizzati anche in esperimenti di co-coltura per lo studio epitelio-mesenchimale (cellule di Sertoli - PTCC) e di cellule somatiche di germi (cellule di Sertoli - cellule germinali) INTERAZIONI 20, 21. Cellule di Sertoli Recentemente primarie sono stati impiegati per studiare l'espressione dei recettori Toll-like e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, così come le cascate di trasduzione del segnale che porta a citochine espressione a seguito dell'infezione da non patogeni e uropatogeni E. coli 22. Altre indagini recenti stavano usando cellule del Sertoli per lo studio del testicolo p immunitariorivilege 23 e ha dimostrato che il testosterone pretrattamento sopprime la risposta infiammatoria LPS-indotta 24.

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Protocol

Dichiarazione 1. Animal Ethics

Gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti secondo le linee guida del Regierungspräsidium Giessen, in Germania, in qualità di autorità locale e confermano il codice tedesco di condotta per la cura e l'uso di animali a fini sperimentali (permesso. No: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Preparazione di media, soluzioni di enzimi e animali

  1. Preparare 1% di alcool iodio sciogliendo 1 g di iodio in 100 ml di etanolo.
  2. Preparare 2x 500 ml Dulbecco's tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+ integrato ciascuno con 7,5 ml di D-glucosio (100 g / L) e 5 ml 100x penicillina / streptomicina soluzione madre (15 mg / ml D -Glucosio, 50 U / ml penicillina e 50 mg / ml di streptomicina finale).
  3. Supplemento 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 5 ml di soluzione madre 100x penicillina / streptomicina (50 U / ml penicillina e 50 mg / ml di streptomicina pinnaal).
  4. Preparare una soluzione di tripsina-I DNasi (2,5 mg / ml di tripsina e 10 ug / ml DNasi I) aggiungendo 25 mg tripsina e 0,1 ml DNasi I (1 mg / ml DNasi I) a 9,9 ml di PBS.
  5. Sciogliere inibitore della tripsina 50 mg in 5 ml di PBS per tripsina inibitore Una soluzione (10 mg / ml). Sciogliere inibitore della tripsina 25 mg in 10 ml di PBS per soluzione tripsina inibitore B (2,5 mg / ml).
  6. Per una soluzione di collagenasi-ialuronidasi-Deoxyribonuclease I (DNasi I) sciogliere 10 mg collagenasi A (1 mg / ml finale), 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml finale) e 0,1 ml di DNasi I (1 mg / ml DNasi I) ( 10 ug / ml finale) in 10 ml di PBS.
  7. Preparare una soluzione di I Hyaluronidase DNasi aggiungendo 10 mg ialuronidasi (1 mg / ml finale) e 0,1 ml di soluzione di DNasi I (1 mg / ml) (10 ug / ml finale) a 9,9 ml di PBS.
  8. Order ratti Wistar in tempo in modo che siano 19 giorni dal giorno di isolamento delle cellule Sertoli.
    Nota: Il protocollo descritto è progettato per 10 ratti, ma può essere modificata per un minimo di 5 ad un massimo di 20 ratti.I volumi di tutte le soluzioni devono essere regolati di conseguenza.
  9. Preparare soluzione madre Oil Red O sciogliendo 0,35 g Oil Red O in 100 ml di isopropanolo. Stir O / N, filtrare 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente per un massimo di un anno.
  10. Preparare soluzione colorante Oil Red O mescolando 6 ml di soluzione madre Oil Red O con 4 ml di acqua (3: 2). Dopo 10-20 minuti filtro attraverso 0,2 micron. Utilizzare entro il prossimo 2 hr.
  11. Preparare un 4% (w / v) di formaldeide in una cappa ventilata aggiungendo 4 g di polvere paraformaldeide (PFA) a 80 ml di PBS 1x mescolando delicatamente. Calore a ~ 60 ° C, aggiungere 1 ml di 1 M NaOH e continuare a mescolare fino a quando la paraformaldeide si scioglie. Lasciare raffreddare la soluzione fino a RT, regolare il pH a 7,4 con 1 M HCl e il volume a 100 ml con PBS 1x. Filtrare la soluzione (0,45 micron) e utilizzare fresche o conservare in aliquote a -20 ° C per diversi mesi.
    Nota: polimerizzato formaldeide (PFA) depolimerizza a formaldeide monomerica in acqua. Questo processo ècatalizzata da moderato riscaldamento e un pH leggermente alcalino. Preparare tutte le soluzioni enzimatiche fresco e filtro sterilizzare (0,2 pM) loro il giorno di utilizzo. Se un produttore diverso per un enzima (vedi Materiali / attrezzature Table) è usato, regolare con cura la sua concentrazione / attività.
    Nel protocollo a seguito di una "pipetta" sta per una pipetta sierologica.

3. Preparazione del seminiferi tubuli

  1. Anestetizzare 10 ratti maschi Wistar uno per uno in un essiccatore con CO 2 e una portata che sposta almeno il 20% del volume della camera per minuto. Attendere fino a quando si ferma la respirazione, prova anestesia schiacciando un rilievo del piede, e se non vi è alcuna reazione eutanasia ogni ratto da dislocazione cervicale. Drenare il sangue dal sezionamento vena giugulare e carotide (carotica vagina) sotto l'acqua corrente. Disinfettare l'addome strofinando con etanolo al 70%.
  2. Uso pinze sollevare la pelle dal Mus addominaleCles e tagliare fuori una forma ovale lobo pelle che si estende dalla sinfisi pubica allo sterno (Figura 2A) e flap verso l'alto sul petto. Successivamente, afferrare i muscoli addominali e fare una incisione mediale della sinfisi pubica allo sterno.
    1. Comprimere la addome con i pollici dal bacino verso l'alto in modo da spingere i testicoli su bacino inferiore. Scegliere il cuscinetto di grasso dell'epididimo (Figura 2B) con una pinza per tirare su il testicolo ulteriormente. Tagliare il funicolo spermatico (Figura 2B), lasciando la tunica albuginea intatto, e raccogliere tutti i testicoli in 20 ml di PBS in un tubo da 50 ml (Figura 2C).
  3. Dopo aver raccolto tutti testicoli, disinfettare aggiungendo un volume uguale (20 ml) di 1% (w / v) di iodio in etanolo. Invertire il tubo per due volte e decantare immediatamente il surnatante. Lavare rapidamente i testicoli due volte con 25 ml di PBS ciascuno (Figura 2D).
  4. Trasferire i testicoli ad una capsula di Petri contieneing 15 ml di PBS (figura 2E). Afferrare ogni testis saldamente pinza ad una estremità, una piccola incisione nella tunica albuginea all'estremità opposta, e spremere tubuli con lame a forbice chiusi come strumento raschiatura.
    Nota: I tubuli devono ancora formare un compatto fascio a forma testicolo con pochi tubuli estende nella soluzione per consentire omogenea digestione enzimatica (Figura 2F).
  5. Trasferire i testicoli de-incapsulato in un flacone da 100 ml con tappo a vite contenente 10 ml di tripsina-DNasi I soluzione. Eseguire la digestione in un bagno d'acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min). Dopo 4 minuti di valutare i tubuli ad occhio nudo per la dispersione dei tubuli. Una volta tubuli cominciano a disperdersi nella soluzione, interrompere immediatamente la digestione. Se necessario, continuare l'incubazione per un massimo di 2 min.
  6. Smettere di digestione tripsina con l'aggiunta di 5 ml di soluzione di inibitore della tripsina A. Mescolare bene la soluzione pipettando su e giù 3-4 tempos utilizzando una pipetta 10 ml e trasferirlo in una provetta conica da 50 ml.
  7. Dopo 5 minuti di incubazione osservano tubuli depositano per unità gravità, rimuovere con attenzione il surnatante utilizzando la pipetta 10 ml di passaggio 3.6 e aggiungere 10 ml di soluzione di inibitore della tripsina B per fermare completamente tripsina digestione. Risospendere i tubuli pipettando su e giù per 2-3 volte.
  8. Al fine di rimuovere contaminanti cellule interstiziali lavare i tubuli 9 volte con 25 ml di PBS ciascuno. Risospendere tubuli in ogni lavaggio utilizzando una pipetta da 25 ml e permettere loro di stabilirsi per unità gravità per 10 min. Utilizzare sempre la stessa pipetta 25 ml pipettando PBS, risospensione e la rimozione del supernatante.

4. Rimozione / Isolamento di cellule peritubulari (PTC)

  1. Trasferire tutti i tubuli per una bottiglia con tappo a vite 100 ml e aggiungere la soluzione di collagenasi I-Hyaluronidase-DNasi (Figura 3A). Eseguire la digestione per 10 minuti in un bagno d'acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min).
  2. Pipettare una goccia della sospensione su un vetrino e controllare rapidamente i tubuli sotto un microscopio ottico invertito per coltura cellulare di routine a ingrandimento 100X. Se la digestione non è avanzata abbastanza continuare incubazione per altri 2 minuti (non contare il tempo necessario per il controllo microscopica).
    Nota: Durante questa fase tutti i tubuli vengono ridotti in bordi di lunghezza e tubuli dovrebbe diventare ruvida (Figura 3B e C). spigoli sono indicativi per il rilascio di cellule peritubulari.
  3. Trasferire la sospensione con tubuli digeriti ad un tubo conico da 50 ml con la pipetta 25 ml dal punto 3.8. Lavare il flacone 100 ml con 10 ml di PBS e aggiungerlo tubuli nel tubo conico. Lasciare i tubuli digeriti di stabilirsi per unità gravità per 10 minuti, e con attenzione aspirare il surnatante, contenente le PTC, utilizzando di nuovo la pipetta 25 ml e le trasferisce in un nuovo tubo conico. Per l'aspirazione degli ultimi millilitri utilizzare una pipetta da 5 ml in order per impedire qualsiasi riporto di tubuli.
  4. Aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale inattivato al calore (FBS) per i supernatanti tubulo raccolti, mescolare e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT senza utilizzare la pausa.
  5. decantare con cautela il surnatante e risospendere le PTC in pellet in 20 ml di RPMI 1640 medium supplementato con 10% FBS inattivato al calore e di semi di 4 ml ciascuno su cinque palloni T75 contenenti 16 ml di mezzo ciascuno. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera (Figura 4A).
  6. Al 3 ° giorno di coltura trypsinize i PTC e dividerli 1: 2 da fiasche T75 contenenti 16 ml RPMI 1640 supplementato con 10% FBS inattivato al calore ciascuno (resa 10 flaconi complessivamente) (Figura 4B). Continua incubazione a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
  7. Al 5 ° giorno di coltura trypsinize nuovamente i PTC e piatto su 6 pozzetti o 24 pozzetti seconda dell'esperimento(Una beuta T75 per piastra). Gli esperimenti possono essere eseguite il giorno 6.

5. L'isolamento di cellule di Sertoli (SC)

  1. Risospendere i tubuli stabiliti dal punto 4.3 a fondo in 25 ml di PBS utilizzando una pipetta da 25 ml e permettere loro di stabilirsi per unità gravità per 12 min. Utilizzare la stessa pipetta da 25 ml per la dispensazione di PBS, risospensione dei tubuli e la rimozione dei surnatanti. Ripetere il lavaggio per 3 volte (4 lavaggi in totale).
  2. Dopo l'ultimo lavaggio trasferire i tubuli digeriti per altri 100 ml vite tappo di bottiglia contenente la soluzione Hyaluronidase-DNasi I. Eseguire la digestione in un bagno d'acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min).
  3. Dopo 5 minuti controllare i tubuli di nuovo mediante ispezione al microscopio a luce ingrandimento 100X come descritto al punto 4.2.
    Nota: tubuli brevi, aggregati tubulari e le cellule rilasciati dovrebbero essere visibili (Figura 3D).
    1. Lasciare gli aggregati tubolari accontentarsi di 10 min, e aspirare il surnatante noiing una pipetta 25 ml. Lavare aggrega 4 volte con 25 ml di PBS e un tempo di sedimentazione di 10 min per ogni fase di lavaggio (Figura 3E).
  4. Aggiungere 20 ml di RPMI 1640 medium e passare la sospensione per 10 volte attraverso un ago 18 G montato su una siringa da 20 ml. Evitare di bolle d'aria.
    Nota: Tirando la sospensione in e fuori attraverso l'ago è considerato come un passaggio. L'interruzione ed omogeneizzazione delle cellule per tranciatura idrodinamico è una tecnica standard per la preparazione di cellule che tendono ad aggregarsi. Il passaggio di cellule attraverso un ago ipodermico di piccolo diametro interno è improbabile che abbia un impatto sulle loro proprietà funzionali 25. Figura 5C e D mostra la normale ultrastruttura delle cellule di Sertoli purificate il giorno 4 della cultura.
    1. Dispensare una goccia di sospensione su un vetrino e controllare i tubuli sotto un microscopio ottico invertito per coltura cellulare di routine a 10X di ingrandimento se il agg rapidamenteRegates sono tutti dispersi (Figura 3F). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 70 micron per ottenere una sospensione di cellule singole puro nel filtrato.
  5. Centrifugare il filtrato del punto 5.4 a 200 xg per 10 min a RT senza utilizzare la pausa. Con attenzione aspirare il surnatante con una pipetta 25 ml, e sospendere nuovamente le cellule di Sertoli in 40 ml RPMI 1640 medium (privo di siero).
  6. Mescolare 100 ml sospensione cellulare con 100 ml di Trypan Blue Stain e contare le cellule con una camera migliorata Neubauer. Regolare la concentrazione cellulare a 3 x 10 6 cellule / ml in base al risultato del conteggio. Seed 1 ml per bene su un 6-pozzetti (= giorno 1). Se è prevista una colorazione Oil Red O (fase 6) mettere un vetrino in uno o pochi pozzi prima della semina cellule di Sertoli.
    Nota: cellule di Sertoli in sospensione si depositano rapidamente in modo che il tubo deve essere agitato brevemente ogni volta prima di una aliquota di cellule è presa con la pipetta. Fino al giorno 4 sono fermamente attach al substrato.
  7. Al fine di rimuovere le cellule germinali galleggianti o aderenti il giorno 4 (Figura 4C) lavare i pozzetti delle piastre 6 pozzetti utilizzati per la placcatura isolate cellule di Sertoli (passo 5,6) con PBS (Figura 4D). Aspirare il terreno, aggiungere 1-2 ml di soluzione salina in ogni pozzetto e agitare le 6 pozzetti orizzontalmente su un tavolo con forza, ma senza spargimento PBS. Ripetere il lavaggio per 3 volte ed eseguire la stessa procedura di lavaggio al giorno 5 e 6 (figura 4E).
    Nota: Il giorno 4 cellule di Sertoli sono ben attaccati e mostrare un acciottolato come il modello sotto il microscopio ottico invertito (Figura 4C). Gli esperimenti possono essere eseguiti dal giorno 7 in poi.
    1. (Alternativa a passo 5.7) Per la rimozione di galleggianti e cellule germinali aderenti eseguono uno shock ipotonico 3 giorni dopo la semina su piastre da 6 pozzetti. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 ml di 20 mM Tris pH 7.5 presi direttamente fuori dal frigo. Aspirare il tampone Tris dopo 90 a 120 secondi, ma nondopo. Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere 2 ml di RPMI 1640 medium (senza siero). Facoltativamente, eseguire esperimenti il ​​giorno successivo.
      Nota: Più lunga la durata dello shock ipotonico è più cellule germinali può essere rimosso, ma i più cellule di Sertoli perdersi pure. Il primo lavaggio PBS dovrebbe essere eseguita rapidamente, ma con cura per non spostare le cellule di Sertoli. Subito dopo il trattamento ipotonico numerosi vacuoli di diverse dimensioni si possono osservare nel citoplasma al microscopio a contrasto di fase. I vacuoli scompaiono nel giro di poche ore dopo il trattamento ipotonico.

6. Oil Red O Colorazione

  1. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Il giorno cellule di Sertoli 7 lavaggio coltivate su un vetrino (passo 5,6) con PBS due volte e fissarli con formalina al 10% in PBS. Dopo 10 min sostituire formalina con soluzione fresca, e continuare fissazione per altri 60 min.
    Nota: Tutte le soluzioni vengono aggiunti al pozzo (s) con un vetrino e aspirati prima del passaggio successivo. Aspirare formalina, lavare le cellule con acqua due volte e aggiungere il 60% di isopropanolo. Dopo 5 minuti consentono alle cellule di aria secca per qualche minuto.
  2. Aggiungere 1 ml di soluzione di colorazione Oil Red O per pozzetto e incubare per 10 min. Aspirare la soluzione e lavare le cellule immediatamente 4 volte con acqua e montare copertura scivola in glicerolo-PBS (9: 1). Prendere immagini in campo chiaro con un microscopio ottico di routine (Figura 4F).

7. immunofluorescenza colorazione

  1. Lavare PTC (dal punto 4.5) o cellule del Sertoli (dal punto 5.5) coltivate su un vetrino con PBS due volte e fissarli con il 4% PFA per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Incubare con 5% BSA in PBS per 1 ora a RT. Scartare la soluzione BSA-PBS e aggiungere fresca soluzione BSA-PBS contenente actina (muscolo liscio) (per PTC) o vimentina (per le cellule di Sertoli) anticorpo primario (diluizione 1: 100 per entrambi gli anticorpi) e incubare a 4 ° CO / N.
    Nota: L'incubazione con blocchi BSA legame non specifico dell'anticorpo primario.
  3. Coperchio Wash scivola 3 volte per 5 min in PBS-0.1% Tween 20 e incubare con anticorpi di capra colorante verde fluorescente coniugato anti-topo secondario (diluizione 1: 1.000) a temperatura ambiente per 1 ora al buio.
  4. Coperchio Wash scivola 3 volte per 5 min in PBS-0.1% Tween 20 e montarle in DAPI mezzo di montaggio.

8. Analisi ultrastrutturali

  1. Lavare le cellule di Sertoli (dal punto 5.6) cresciuti su una piastra di coltura cellulare 6 centimetri con PBS e fissare per 2 ore a 4 ° C in una miscela di glutaraldeide al 2,5%, 2,5% paraformaldeide e acido picrico 0,05% in 67 mM tampone cacodilato ( pH 7.4) secondo Ito e Karnovsky 26.
  2. Eseguire post-fissazione in 1% tetrossido di osmio seguito da un / N incubazione O a 0,3% acetato di uranile sciolto in 50 mM tampone maleato (pH 5). campioni Incorpora in embedding dei media secondo le procedure standard. Tagliare sezioni sottili, li contrastano con citrato di piombo ed esaminare con un microscopio elettronico.

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Representative Results

La procedura descritta permette l'isolamento di circa 12 x 10 7 cellule del Sertoli da 10 testicoli di ratto. 3 x 10 6 cellule sono placcati per pozzetto su una piastra da 6 pozzetti in modo tale che da sei a sette 6 pozzetti sono disponibili per esperimenti sulla giorno 7. La digestione tripsina-DNasi I è la fase più critica durante l'isolamento delle cellule di Sertoli. Se la digestione, a questo punto avanza troppo lontano, il rapporto tra cellule germinali / cellule del Sertoli sarà sproporzionatamente aumenterà fino alla fine. Durante il giorno 3-6 della cultura è importante lavare accuratamente via come molti non aderente o debolmente allegate cellule germinali possibile. Come alternativa ad ampie lavaggi in 4 giorni le cellule germinali può essere rimosso mediante trattamento ipotonico il giorno 3 27. Un vantaggio di questo metodo è che il tempo di coltura cellulare Sertoli è ridotto al minimo in modo che funzioni specifiche cellule di Sertoli sono potenzialmente migliore mantenuto che dopo un prolungato periodo di coltura.

(Figura 5B). Poiché le cellule peritubulari hanno un forte potenziale proliferativo, coltura cellulare Sertoli deve essere eseguita in assenza di siero. In presenza del 10% di siero PTC costituirebbero circa il 20% di tutte le cellule dopo 6 giorni di coltura mentre la sua frazione può essere previsto per essere inferiore all'1% in assenza di siero 7. cellule di Sertoli Praticamente tutti gli isolati sono vitali come giudicato da Trypan blu colorazione (non mostrato). Intorno giorno 7 della cultura delle cellule di Sertoli isolate sono meno contaminati con le cellule germinali e le cellule peritubulari (Figura 4), ​​in modo che gli esperimenti devono essere eseguiti intorno a questo giorno, se possibile. Per una buona riproducibilità è importante ripetere esperimentos sempre lo stesso giorno di coltura. Se trasfezioni sono previsti devono essere eseguite il giorno 4 o 5, e gli estratti di cellule devono essere effettuate il giorno 5 o 6.

Nel corso di almeno due settimane in condizioni di cellule del Sertoli senza siero sono sensibili alle FSH e produrre più androgeni-binding protein, attivatore del plasminogeno e transferrina in seguito al trattamento FSH. Per la cultura è più necessario uno strato di cellule di alimentazione peritubulari o siero. Dopo quattro settimane culture si deteriorano, e le cellule si staccano dal substrato 7.

Il giorno 6 di coltura le cellule di Sertoli più hanno acquisito gocce lipidiche. Nella maggior parte delle cellule di un unico grande vacuolo è formato (Figura 5C e 5D). Il contenuto lipidico neutro può essere facilmente visualizzato con Oil Red O colorazione (Figura 4F).

Oltre a Sertoli cel ls i PTC rimossi possono essere coltivate e (Figura 4A e 4B). PTC da 10 testicoli cedere cinque palloni T75 che ci si può aspettare per formare uno strato confluente dopo 2 giorni di coltura. Come le cellule di Sertoli isolate PTC appena isolate sono contaminati da cellule germinali che possono essere in gran parte rimossi da passaging. Boccette sono divisi 1: 2 da tripsinizzazione standard in modo che 10 palloni saranno confluenti il ​​giorno 5 dopo l'isolamento. La purezza del PTC isolati è> 95% e può essere confermata utilizzando immunomarcatura actina del muscolo liscio α-(Figura 5A). Da questo giorno in poi PTC possono essere utilizzati per gli esperimenti. Un pallone è sufficiente per circa un 6-pozzetti e pozzi dovrebbero essere confluenti il ​​giorno successivo. Le celle possono essere diversi passaggi molte volte, ma gli esperimenti devono essere eseguiti sempre allo stesso passaggio per assicurarsi che le cellule si comportano in modo riproducibile.

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Figura 1. Morfologia del testicolo e flusso della procedura. (A) Un settore di un tubulo seminifero con tessuto interstiziale adiacente viene mostrato schematicamente. tubuli seminiferi sono racchiusi da una membrana basale (BM) e uno strato circonferenziale di cellule peritubulari myoid (PTC). L'epitelio germinale si trova sul lato luminale della membrana basale. cellule del Sertoli (SC), che coprono l'intero epitelio germinale sono fortemente attaccati alla BM e interconnessi tramite basolaterale posizionato svincoli otturatori che rappresentano la barriera emato-testicolare (BTB). Il loro nucleo irregolare (N) mostra una o più rientranze fessura-like e contiene un nucleolo. Le cellule germinali (GC) sono in contatto intimo con SCs in tutte le fasi del loro sviluppo. Il compartimento interstiziale tra i tubuli contiene cellule di Leydig (LC) e cellule immunitarie quali macrofagi (MΦ) e vasi sanguigni (BV). figuraadattato da Fijak e Meinhardt 28. (B) del flusso di lavoro della procedura; codifica dei colori è come in (A). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. I testicoli di ratti Wistar sono rimossi e decapsulated. (A) La cavità peritoneale è aperto attraverso una incisione longitudinale, come descritto nel testo. Un asterisco (*) indica il cuscinetto adiposo epidydimal. (B) I testicoli sono rimossi tagliando funicolo spermatico e (C) raccolti in una provetta conica da 50 ml contenente 20 ml di PBS. Quando tutti i testicoli sono stati raccolti vengono disinfettati in 20 ml di 1% (w / v) di iodio in etanolo. Per la rimozione dello iodio sono rapidamente lavate due volte con 25 mlPBS ciascuno. (D) I testicoli dopo primo lavaggio PBS. (E) I testicoli sono trasferiti ad una piastra di Petri (a destra), e tubuli seminiferi vengano espulsi tunica albuginea aperto mediante lame delle forbici chiuse (a sinistra), come descritto nel testo. (F) I testicoli decapsulate ancora formano una massa a forma di testicoli compatta con singoli tubuli sporgenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Isolamento di cellule di Sertoli. (A) Dopo la rimozione delle cellule interstiziali di tripsina-DNase I digestione e lavaggio 9x con tubuli PBS mobilitarsi e aspetto pulito. (B) Durante il trattamento collagenasi-ialuronidasi-DNasi I peritubulari cellulares dalle cellule germinali e strato esterno vengono rilasciati. I tubuli vengono accorciate e ottenere un aspetto ruvido. (C) i frammenti tubolari dopo 4x di lavaggio con PBS. Trattamento stampa (D) Hyaluronidase-DNase I cellule peritubulari residue così come cellule germinali. Tubuli vengono ulteriormente ridotti, e aggregati tubulari formano. (E) tubolare aggregati dopo il lavaggio 4x con PBS. Cellule (F) Singolo Sertoli sono prodotti facendo passare gli aggregati 10x attraverso un ago 18G. Barre di scala a (AE) = 200 micron, a (F) = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. coltura di cellule peritubulari (AB) e Sertoli cellule (CF) e la rimozione di contaminat ing cellule germinali. (A) PTC risospese dal punto 4.5 sono state seminate immediatamente e fotografati il giorno successivo. (B) Dopo aver diviso il giorno 3 di contaminazione con le cellule germinali si riduce. (C) Il giorno 4 cellule di Sertoli mostrano un andamento tipico acciottolato-like. Galleggianti e aderenti cellule germinali sono visibili prima di lavare con PBS. (D) La stessa bene dopo il lavaggio 3x con PBS. Il numero di cellule germinali contaminanti è ridotta. Lavare tre volte con PBS si ripete il giorno 5 e 6. (E) Il giorno 6 della cultura sono stati rimossi praticamente tutte le cellule germinali. cellule di Sertoli hanno formato uno strato di cellule cercando unica, e la maggior parte delle cellule hanno acquisito un unico grande vacuolo. (F) Olio O colorazione rossa indica che questi vacuoli sono gocce lipidiche contenenti lipidi in gran parte neutrale. Barre di scala a (AD) = 200 micron, a (E) = 50 micron e in (F) = 25 micron..jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Immunofluorescenza. La colorazione delle cellule peritubulari primarie purificate con l'actina (muscolo liscio) anticorpo (A) e di Sertoli cellule con l'anticorpo vimentina (B). Non ci sono cellule contaminanti sono visibili entrambi i campi di vista. bar Scale in (A) e (B) = 10 micron. (C) e (D) Electron immagini microscopiche di cellule di Sertoli dopo 4 giorni di coltura. (C) Nota lo stretto contatto di celle adiacenti (frecce) che porta al modello ciottoli simile, come mostrato nella figura 4C. Una singola gocciolina lipidica (L) viene osservato nel citoplasma di ciascuna cella. (D) più abbondanti organelli sono i mitocondri (M) e l'apparato di Golgi (G).Il nucleo (N) contiene un nucleolo (Nc) e mostra il tipico rientro fessura-like. Barra della scala in (C) = 1 micron e (D) = 0,25 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, che erano estremamente utile per stabilire l'isolamento delle cellule di Sertoli primarie in laboratorio Meinhardt a Giessen. Monika Fijak, Gießen, è riconosciuto per il suo aiuto con la figura 1A e consigli. Gli studi sono stati sostenuti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft attraverso concessione BH 93 / 1-1 (SB) e il finanziamento della ricerca internazionale laureato JLU Giessen (Germania) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Il sostegno è stato ottenuto anche da un contributo dello Stato di Hessen nell'ambito del programma "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) chiamato "männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized
Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 
Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)
Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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