Isolement des cellules de Sertoli et péritubulaire cellules de rat Testicules

Immunology and Infection

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Summary

les cellules de Sertoli primaire sont nécessaires pour étudier privilège des testicules-immune, la transduction du signal lors d'une inflammation ou une infection, et l'utilisation de leurs propriétés immunoprotection. Nous décrivons ici un protocole à base d'enzymes pour l'isolement des cellules de Sertoli primaires hautement purifiées et les cellules péritubulaires de testicules de rat.

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Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

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Abstract

Le testicule, et en particulier le gamète mâle, remet en question le système immunitaire d'une manière unique, car le sperme différenciés apparaissent d'abord au moment de la puberté - plus de dix ans après la création de la tolérance immunitaire systémique. cellules spermatogènes expriment un certain nombre de protéines qui peuvent être considérées comme non-soi par le système immunitaire. Le testicule doit alors être en mesure d'établir la tolérance à ces néo-antigènes d'une part, mais encore être en mesure de se protéger contre les infections et le développement de tumeurs, d'autre part. Par conséquent, le testicule est l'un des quelques sites privilégiés immunitaire dans le corps qui tolèrent des antigènes étrangers sans évoquer une réponse immunitaire inflammatoire préjudiciable. les cellules de Sertoli jouent un rôle clé pour le maintien de cet environnement privilégié immunitaire du testicule et prolongent également la survie des cellules cotransplanted dans un environnement étranger. Donc les cellules de Sertoli primaires sont un outil important pour étudier le privilège immunitaire du testicule qui ne peut être easily remplacés par des lignées cellulaires établies ou d'autres modèles cellulaires. Nous présentons ici un protocole détaillé et complet pour l'isolement des cellules de Sertoli - et les cellules péri-tubulaires si on le souhaite - de testicules de rats en un seul jour.

Introduction

Testicules produisent des gamètes mâles et les hormones sexuelles, à savoir, les androgènes. L'organe est composé de deux compartiments. Dans le compartiment interstitiel, qui représente environ 10-12% du volume testiculaire totale 1, stéroïdogenèse a lieu dans les cellules de Leydig. Le compartiment tubulaire représente environ 60 à 80% du volume des testicules 1 et contient des cellules germinatives et les deux types de cellules somatiques - cellules de Sertoli et des cellules péritubulaires. Le testicule est divisé par des cloisons de tissu conjonctif en 250-300 lobules, contenant chacun 1-3 tubes séminifères hautement complexe. Ces tubes sont entourés par une membrane basale, une feuille de collagène et une couche circonférentielle de cellules péritubulaires (Figure 1A).

L'épithélium germinatif est situé sur la face luminale de la membrane basale. Les cellules de Sertoli sont de grandes cellules allongées qui couvrent l'ensemble épithélium germinatif de la membrane basale à la lumière. Ils sont fortement attfaisait mal à la membrane basale et former une feuille cellulaire continue à travers les jonctions serrées qui obture organisés basolatérale de l'épithélium germinatif de l'interstitium et représente la barrière hémato-testiculaire. les cellules de Sertoli ont des projections et des ramifications qui leur permettent d'entrer en contact morphologique et fonctionnelle étroite avec un nombre spécifique de l'espèce, mais constante, des cellules germinales cytoplasmiques éminents. cellules souches germinales diploïdes prolifèrent et se différencient en spermatogonies.

Au cours de la méiose I courte durée spermatocytes tétraploïdes sont générés qui développent en quatre spermatides haploïdes pendant la méiose II. Toutes les cellules germinales sont reliés entre eux par des ponts cytoplasmiques de sorte qu'ils forment un réseau cellulaire. Le principal événement pendant la maturation des spermatides est l'extrusion d'une grande partie du cytoplasme, formant corps résiduels, dans un processus appelé spermiogenèse. corps résiduels sont phagocytés par les cellules de Sertoli. spermatides tardifs sont ensuite libérés dansla lumière tubulaire et transportés dans l'épididyme en outre pour la maturation. Les cellules de Sertoli et les cellules germinales apparaissent à coordonner mutuellement spermatogenèse topographiquement et fonctionnellement.

Préparation de types de cellules testiculaires individuels a commencé il y a presque un siècle, lorsque de petits morceaux testiculaires ont été cultivées et types de cellules identifiées par microscopie 2. Par dissection minutieuse des tubules après l'ouverture de la tunique albuginée aide d'une pince à pointe fine, il a été plus tard possible de séparer tubulaire et compartiments interstitiels 3. En 1975, Welsh et Wiebe introduit un traitement à la collagénase afin de libérer les tubes d'adhérer tissu interstitiel et un traitement de pancréatine pour l'enlèvement de la couche de cellules péri-tubulaire externe 4. Dès le début de jeunes rats immatures (environ 20 jours old) avaient été utilisées dans laquelle les cellules de Sertoli comprennent une fraction importante de la population des cellules tubulaires parce spermatogenèse n'a pas encore commencé. A ce Sert de rat d'âgeoli cellules cessent de se diviser et de jonctions serrées entre les cellules voisines afin de former la barrière hémato-testiculaire est établi 5.

Indépendant de Welsh et Wiebe Dorrington et al. Introduit une combinaison de la trypsine et deoxyribonuclease suivie par l'inhibiteur de la trypsine soybeen et le traitement de la collagénase qui a été publié dans la même année 6. Les deux groupes ont également utilisé la force mécanique (étirage des fragments digérés tubulaires à plusieurs reprises à travers une aiguille de seringue ou une pipette Pasteur, respectivement) afin de produire une suspension de cellules homogène pour électrodéposition qui contient environ 70% de cellules de Sertoli. Après 3 jours de culture, en utilisant un milieu exempt de sérum, le pourcentage de cellules de Sertoli augmente à environ 90%. Cela pourrait être en grande partie attribuée à la mort de contaminer les cellules germinales. cellules péri-tubulaires résiduelles (PTC), cependant, restent fermement attachés via leur matrice extracellulaire. PTC, mais pas les cellules de Sertoli, sont connus pour produirela fibronectine qui peut servir en tant que protéine marqueur pour estimer la contamination par PTC. Par conséquent, Tung et al. raisonnement selon lequel un traitement par la hyaluronidase pourrait supplémentaire d'améliorer la pureté de la fraction des cellules de Sertoli 7. En effet, ils ont pu montrer que un traitement supplémentaire était en mesure de réduire la contamination par PTC environ 20 fois, ce qui devient particulièrement évident quand en comparaison d'un milieu contenant du sérum est utilisé pour cultiver des cellules de Sertoli purifiés. Dès lors la procédure améliorée de Tung et al. est devenu le protocole en vigueur et a été largement utilisé par les autres grands groupes dans le domaine de 8 (figure 1B).

Au cours du traitement par la collagénase la majorité des PTC sont libérés et peuvent être isolés en parallèle à des cellules de Sertoli. Tandis que les CTP prolifèrent vigoureusement et ne répondent pas à l'hormone folliculo-stimulante (FSH), les cellules de Sertoli ne subissent pas plus la mitose et de répondre à la FSH par des changements morphologiques caractéristiqueset une augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) Concentration 9. Protocoles très similaires de digestion enzymatique peuvent être utilisés pour l'isolement des cellules de Sertoli primaires des autres animaux comme l'homme 10, souris 11,12, hamster sibérien 13 ou 14 yak. Pour l'élimination de grandes quantités de contaminer les cellules germinales un choc hypotonique peut être utilisé à la fin de la procédure d'isolement 15. Ceci permet également l'isolement efficace des cellules de Sertoli de rat adulte 16 testicules. Une suspension de cellules de Sertoli enrichi peut également être séparée à partir de cellules germinales en étalant la suspension sur des boîtes revêtues de lectine agglutinine Datura stramonium 17. Seules les cellules de Sertoli et quelques PTC résiduels adhèrent aux plaques de lectine.

des cultures de cellules de Sertoli primaires, principalement du rat, ont été utilisées initialement pour étudier la réactivité aux hormones ou d'établir des lignées cellulaires telles que la cellule de Sertoli de souris line TM4 18. Cette lignée cellulaire a été étudié dans plus d'une centaine d'études jusqu'à aujourd'hui. Dans une approche translationnelle cellules de Sertoli ont été utilisés pour les immuno-protection des cellules et des tissus comme dans la co-transplantation d'îlots pancréatiques xénogreffes ou allogéniques pour la survie du greffon à long terme co-cultivées sans immunosuppression systémique 19. Les cellules de Sertoli isolées ont également été utilisés dans des expériences de co-culture pour étudier épithéliale-mésenchymateuses (cellules de Sertoli - CFC) et les cellules somatiques de germe (cellules de Sertoli - cellules germinales) Interactions 20, 21. Les cellules de Sertoli récemment primaires ont été utilisés pour étudier l'expression des récepteurs de type Toll et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires ainsi que les cascades de transduction du signal conduisant à l'expression des cytokines après une infection par non pathogène et uropathogènes E. 22 coli. D'autres études récentes ont utilisé des cellules de Sertoli pour étudier p immunitaire testiculaire23 rivilege et montré que la testostérone pré-traitement supprime la réponse inflammatoire induite par LPS 24.

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Protocol

Déclaration 1. éthique animale

Expériences décrites ici ont été réalisés selon les directives de la Regierungspräsidium Giessen, en Allemagne, en tant qu'autorité locale et confirment le Code allemand de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins expérimentales (Permission pas:. GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Préparation des médias, solutions enzymatiques et animaux

  1. Préparer une% d'alcool d'iode en dissolvant 1 g d'iode dans 100 ml d'éthanol.
  2. Préparer 2x 500 ml de phosphate Dulbecco saline tamponnée (PBS) sans Ca 2+ et Mg 2+ complété chacun avec 7,5 ml de D-glucose (100 g / L) et 5 ml 100x pénicilline / streptomycine solution mère (15 mg / ml D -glucose, 50 U / ml de pénicilline et 50 ug / ml de streptomycine final).
  3. Supplément 1x 500 ml Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 milieu avec 5 ml 100x pénicilline / streptomycine solution mère (50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine final).
  4. Préparer une solution de trypsine I-DNase (2,5 mg / ml de trypsine et 10 pg / ml de DNase I) en ajoutant 25 mg de trypsine et 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) à 9,9 ml de PBS.
  5. Dissoudre inhibiteur de la trypsine à 50 mg dans 5 ml de PBS pour la trypsine inhibiteur Une solution (10 mg / ml). Dissoudre inhibiteur de la trypsine de 25 mg dans 10 ml de PBS pour la solution de trypsine inhibiteur de B (2,5 mg / ml).
  6. D'une solution de collagénase-hyaluronidase, la désoxyribonucléase I (DNase I) dissoudre 10 mg de collagénase (1 mg / ml final), 10 mg de hyaluronidase (1 mg / ml final) et 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) ( 10 pg / ml final) dans 10 ml de PBS.
  7. Préparer une solution de hyaluronidase I-DNase en ajoutant 10 mg de hyaluronidase (1 mg / ml final) et 0,1 ml de solution de DNase I (1 mg / ml) (10 pg / ml final) à 9,9 ml de PBS.
  8. Commander des rats Wistar à temps pour qu'elles soient 19 jours d'âge, le jour de l'isolement des cellules de Sertoli.
    Remarque: Le protocole décrit est conçu pour 10 rats, mais peut être modifié pendant un minimum de 5 et un maximum de 20 rats.Les volumes de toutes les solutions doivent être ajustés en conséquence.
  9. Préparer la solution mère Oil Red O en dissolvant 0,35 g Oil Red O dans 100 ml d'isopropanol. Incorporer O / N, filtrer à travers 0,2 um et stocker à température ambiante pendant jusqu'à un an.
  10. Préparer la solution de coloration Oil Red O en mélangeant 6 ml de solution Oil Red O avec 4 ml d'eau (3: 2). Après 10 à 20 min à travers le filtre de 0,2 um. Utiliser dans les 2 heures suivantes.
  11. Préparer une 4% (p / v) de solution de formaldehyde dans une hotte ventilée par addition de 4 g de la poudre de paraformaldehyde (PFA) à 80 ml de 1 x PBS en agitant doucement. Chauffer à ~ 60 ° C, ajouter 1 ml de 1 M NaOH et continuez de remuer jusqu'à ce que le paraformaldéhyde est dissous. Laisser la solution refroidir à TA, ajuster le pH à 7,4 avec du HCl 1 M et le volume à 100 ml avec PBS 1x. Filtrer la solution (0,45 um) et utiliser fraîche ou un magasin à -20 ° C pendant plusieurs mois.
    Remarque: polymérisé formaldéhyde (PFA) dépolymérise au formaldéhyde monomère dans l'eau. Ce processus estcatalysée par un chauffage modéré et à un pH légèrement alcalin. Préparer toutes les solutions d'enzyme fraîchement et stériliser par filtration (0,2 uM) eux le jour de l'utilisation. Si un autre fabricant pour une enzyme (voir Supports / Equipement Table) est utilisé, ajuster soigneusement sa concentration / activité.
    Dans le protocole suivant un "pipette" signifie une pipette sérologique.

3. Préparation de séminifères tubules

  1. Anesthésier 10 rats mâles Wistar une par une dans un dessiccateur en utilisant CO 2 et une vitesse d'écoulement qui déplace au moins 20% du volume de la chambre par minute. Attendez jusqu'à ce que les arrêts respiratoires, l'anesthésie de test en pressant un pad de pied, et s'il n'y a pas de réaction euthanasier chaque rat par dislocation cervicale. Drainer le sang en sectionnant la veine jugulaire et l'artère carotide (de carotica vagin) sous l'eau courante. Désinfecter l'abdomen en essuyant avec 70% d'éthanol.
  2. Aide de pinces soulever la peau du mus abdominalecles et découper un lobe de la peau de forme ovale qui se prolonge à partir de la symphyse pubienne du sternum (figure 2A) et le rabat vers le haut sur ​​la poitrine. Ensuite, prenez les muscles abdominaux et faire une incision médiane de la symphyse pubienne au sternum.
    1. Presser l'abdomen avec les pouces de bassin vers le haut pour pousser les testicules hors du bassin inférieur. Choisissez le coussinet adipeux de l'épididyme (figure 2B) avec des pinces pour arracher les testicules plus loin. Couper le cordon spermatique (figure 2B), ce qui laisse l'albuginée intacte, et de recueillir tous les testicules dans 20 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml (figure 2C).
  3. Après avoir recueilli toutes les testicules, les désinfecter par addition d'un volume égal (20 ml) de 1% (p / v) d'iode dans l'éthanol. Retourner le tube deux fois et décanter le surnageant immédiatement. Laver rapidement les testicules deux fois avec 25 ml de PBS chacun (figure 2D).
  4. Transférer les testicules à une boîte de Pétri contenanttion 15 ml de PBS (figure 2E). Saisir chaque testicule fermement par pince à une extrémité, faire une petite incision dans la tunique albuginée à l'extrémité opposée, et presser les tubules utilisant des lames de ciseaux fermés comme un outil de raclage.
    Remarque: Les tubes doivent encore former un faisceau en forme de testicule-compact avec seulement quelques tubules se prolongeant dans la solution afin de permettre une digestion enzymatique homogène (figure 2F).
  5. Transférer les testicules de-encapsulé dans un flacon de 100 ml à bouchon à vis contenant 10 ml de trypsine-DNase I solution. Effectuer la digestion dans un bain d'eau agité à 32 ° C (120 oscillations / min). Après 4 min évaluer les tubules à l'œil nu pour la dispersion des tubules. Une fois tubules commencent à se disperser dans la solution, arrêter immédiatement la digestion. Si nécessaire, continuer incubation jusqu'à 2 min.
  6. Arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 5 ml de solution d'inhibiteur de la trypsine A. Bien mélanger la solution par aspiration et refoulement 3-4 foiss en utilisant une pipette de 10 ml et la transfère dans un tube conique de 50 ml.
  7. Après 5 min d'incubation observent les tubules se déposent à l'unité gravité, retirez délicatement le surnageant en utilisant le pipette de 10 ml de l'étape 3.6 et ajouter 10 ml de solution d'inhibiteur de trypsine de B afin d'arrêter totalement digestion par la trypsine. Remettre en suspension les tubules par aspiration et refoulement 2-3 fois.
  8. Afin d'éliminer la contamination cellules interstitielles lavent les tubules 9 fois avec 25 ml de PBS chacun. Remettre en suspension tubules dans chaque lavage en utilisant une pipette de 25 ml et de leur permettre de régler par unité gravité pendant 10 min. Utilisez toujours le même pipette de 25 ml pour le pipetage de PBS, la remise en suspension et le retrait du surnageant.

4. Enlèvement / Isolement des cellules péri-tubulaires (PTC)

  1. Transférer tous les tubules de 100 ml à bouchon à vis bouteille et ajouter la solution I collagénase-hyaluronidase-DNase (figure 3A). Effectuer la digestion pendant 10 minutes dans un bain d'eau agité à 32 ° C (120 oscillations / min).
  2. Pipette une goutte de la suspension sur une lame de verre et de vérifier rapidement les tubules sous un microscope optique inversé pour la culture cellulaire de routine à 100x de grossissement. Si la digestion est pas suffisamment avancé continuera d'incubation supplémentaire de 2 min (ne pas compter le temps nécessaire pour le contrôle microscopique).
    Remarque: Au cours de cette étape tous les tubules se raccourcir en longueur et tubules bords devrait devenir rugueuse (figure 3B et C). aspérités sont une indication de la libération de cellules péri-tubulaires.
  3. Transférer la suspension avec tubules digérés dans un tube conique de 50 ml en utilisant la pipette de 25 ml de l'étape 3.8. Laver le flacon de 100 ml avec 10 ml de PBS et l'ajouter aux tubules dans le tube conique. Laisser les tubules digérés de régler par unité gravité pendant 10 minutes, et soigneusement aspirer le surnageant, contenant les PTC, en utilisant à nouveau la pipette de 25 ml, et le transférer dans un nouveau tube conique. Pour l'aspiration de ces derniers millilitres utiliser une pipette de 5 ml in order pour éviter tout report des tubules.
  4. Ajouter 20 ml du milieu RPMI 1640 complété avec du sérum inactivé à la chaleur 10% fœtal bovin (FBS) aux surnageants des tubules recueillies, mélanger et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante sans utiliser la pause.
  5. Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension les granulés PTC dans 20 ml du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS inactivé par la chaleur et les semences 4 ml à chaque fois sur cinq flacons T75 contenant 16 ml de milieu de chaque. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère (Figure 4A).
  6. Sur le 3 ème jour de culture trypsiniser les PTC et les diviser 1: 2 sur flacons T75 contenant 16 ml du milieu RPMI 1640 complété avec 10% inactivé par la chaleur FBS chacune (les rendements 10 flacons au total) (figure 4B). Continuer l'incubation à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère.
  7. Au 5ème jour de culture trypsiniser nouveau les PTC et les plaque sur des plaques à 6 puits ou à 24 puits en fonction de l'expérience(Un flacon T75 par plaque). Des expériences peuvent être effectuées sur 6 jours.

5. Isolement des cellules de Sertoli (SC)

  1. Remettre en suspension les tubes installés à fond provenant de l'étape 4.3 dans 25 ml de PBS en utilisant une pipette de 25 ml et leur permettre de se déposer par gravité unitaire pendant 12 min. Utilisez la même pipette de 25 ml pour le pipetage PBS, remise en suspension des tubules et l'élimination des surnageants. Répétez le lavage 3 fois (4 lavages au total).
  2. Après le transfert du dernier lavage, les tubules digérés à l'autre de 100 ml à bouchon à vis bouteille contenant la solution de hyaluronidase-DNase I. Effectuer la digestion dans un bain d'eau agité à 32 ° C (120 oscillations / min).
  3. Après 5 min vérifier les tubules nouveau par examen au microscope optique au grossissement 100X comme décrit dans l'étape 4.2.
    Remarque: Courts tubules, des agrégats tubulaires et cellules libérées doivent être visibles (Figure 3D).
    1. Laisser les agrégats tubulaires se contenter de 10 min, et aspirer le surnageant nousing une pipette de 25 ml. Agrégats lavage 4 fois avec 25 ml de PBS et un temps de sédimentation de 10 minutes pour chaque étape de lavage (figure 3E).
  4. Ajouter 20 ml de milieu RPMI 1640 et de passer la suspension 10 fois à travers une aiguille de 18 G montée sur une seringue de 20 ml. Éviter les bulles d'air.
    Remarque: Tirer la suspension avant et arrière à travers l'aiguille est considéré comme un seul passage. Le broyage et l'homogénéisation des cellules par cisaillement hydrodynamique est une technique standard dans la préparation de cellules qui tendent à se regrouper. Le passage des cellules à travers une aiguille hypodermique de petit diamètre interne est peu susceptible d'avoir un impact sur ​​leurs propriétés fonctionnelles 25. Figure 5C et D montre l'ultrastructure normale des cellules de Sertoli purifiés au jour 4 de la culture.
    1. Pipette une goutte de la suspension sur une lame de verre et de vérifier les tubules sous un microscope optique inversé pour la culture cellulaire de routine à un grossissement 10X si l'agg rapidementregates sont tous dispersés (figure 3F). Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 70 pm afin d'obtenir une suspension cellulaire unique pur dans le filtrat.
  5. Centrifuger le filtrat de l'étape 5.4 à 200 g pendant 10 min à température ambiante sans utiliser la pause. aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pipette de 25 ml, et de remettre en suspension les cellules de Sertoli de 40 ml du milieu RPMI 1640 (sans sérum).
  6. Mélanger 100 suspension cellulaire ul avec 100 pi de bleu Trypan de maquillage et de compter les cellules avec une amélioration de Neubauer. Ajuster la concentration cellulaire à 3 x 10 6 cellules / ml en fonction du résultat de comptage. Seed 1 ml par puits sur une plaque à 6 puits (= jour 1). Si une coloration Oil Red O (étape 6) est prévu de mettre une lamelle en une seule ou quelques puits avant l'ensemencement des cellules de Sertoli.
    Remarque: les cellules de Sertoli en suspension se déposent rapidement, de sorte que le tube doit être agité brièvement à chaque fois devant une aliquote de cellules est pris avec la pipette. Jusqu'au jour 4 ils fermement attach le substrat.
  7. Afin d'éliminer flottantes ou adhérentes des cellules germinales au jour 4 (figure 4C) laver chaque puits des plaques de 6 puits utilisés pour le placage isolées cellules de Sertoli (étape 5.6) avec du PBS (Figure 4D). Aspirer le moyen, ajouter 1-2 ml de PBS à chaque puits et secouer les plaques de 6 puits à l'horizontale sur une table vigoureusement mais sans renverser PBS. Répétez le lavage 3 fois et effectuer la même opération de lavage au jour 5 et 6 (figure 4E).
    Remarque: Le jour 4 cellules de Sertoli ont solidement attachées et montrer un pavé comme le modèle sous le microscope optique inversé (figure 4C). Les expériences peuvent être effectuées à partir de 7 jours à compter.
    1. (Alternative pour l'étape 5.7) Pour l'élimination de flotter et de cellules germinales adhérents effectuent un choc hypotonique 3 jours après l'ensemencement sur des plaques à 6 puits. Retirez le moyen et ajouter 1 ml de 20 mM Tris pH 7,5 prises directement du réfrigérateur. Aspirer le tampon Tris après 90 à 120 secondes, mais pasplus tard. Laver les cellules deux fois avec du PBS, et ajouter 2 ml de milieu RPMI 1640 (sans sérum). Éventuellement, réaliser des expériences le lendemain.
      Remarque: Plus la durée du choc hypotonique sont les cellules plus de germes peuvent être éliminés mais les cellules de Sertoli plus se perdre ainsi. Le premier lavage PBS devrait être effectué rapidement mais avec précaution afin de ne pas déplacer les cellules de Sertoli. Directement après traitement hypotonique de nombreuses vacuoles de différentes tailles peuvent être observés dans le cytoplasme par microscopie à contraste de phase. Vacuoles disparaissent en quelques heures après le traitement hypotonique.

6. Oil Red O coloration

  1. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante. Le jour 7 cellules de Sertoli de lavage cultivées sur une lamelle (étape 5.6) avec du PBS deux fois et les fixer avec 10% de formol dans du PBS. Après 10 min remplacer le formol par une solution fraîche, et poursuivre la fixation pendant encore 60 minutes.
    Remarque: Toutes les solutions sont ajoutées au bien (s) avec une lamelle et aspirés avant l'étape suivante. Aspirer le formol, laver les cellules avec de l'eau deux fois et ajouter 60% d'isopropanol. Après 5 min permettent aux cellules de l'air sec pendant quelques minutes.
  2. Ajouter 1 ml de solution de coloration Oil Red O par puits et incuber pendant 10 min. Aspirer la solution et laver les cellules immédiatement 4 fois avec de l'eau et monter couvercle glisse dans le glycérol-PBS (9: 1). Prenez des images lumineuses sur le terrain avec un microscope optique de routine (figure 4F).

7. immunofluorescence

  1. Lavez PTC (de l'étape 4.5) ou des cellules de Sertoli (de l'étape 5.5) issues deux fois sur une lamelle avec du PBS et les fixer avec 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante.
  2. Incuber avec 5% de BSA dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Jeter la solution BSA-PBS et ajouter une nouvelle solution BSA-PBS contenant actine (muscle lisse) (pour PTC) ou la vimentine (pour les cellules de Sertoli) anticorps primaire (dilution 1: 100 pour les deux anticorps) et incuber à 4 ° CO / N.
    Note: L'incubation avec des blocs non spécifiques BSA liaison de l'anticorps primaire.
  3. couverture Wash glisse 3 fois pendant 5 minutes dans du PBS-Tween 20 0,1% et incuber avec un colorant vert fluorescent conjugué anticorps secondaire de chèvre anti-souris (dilution 1: 1000) à la température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité.
  4. couverture Wash glisse 3 fois pendant 5 minutes dans du PBS-Tween 20 0,1% et les monter en DAPI milieu de montage.

8. Analyse ultrastructurale

  1. Laver les cellules de Sertoli (de l'étape 5.6) pratiquées sur une 6 cm plaque de culture cellulaire avec du PBS et les fixer pendant 2 heures à 4 ° C dans un mélange de 2,5% de glutaraldéhyde, 2,5% de paraformaldehyde et d'acide picrique à 0,05% dans du tampon cacodylate mM 67 ( pH 7,4) selon Ito et Karnovsky 26.
  2. Effectuer des post-fixation dans 1% de tétroxyde d'osmium, suivi par un rapport O / N incubation dans 0,3% d'acétate d'uranyle en solution dans 50 mM de tampon maléate (pH 5). échantillons Intégrer dans l'intégration des médias selon les procédures standard. Couper lames minces, les comparer avec du citrate de plomb et d'examiner avec un microscope électronique.

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Representative Results

Le procédé décrit permet l'isolement d'environ 12 x 10 7 cellules de Sertoli de 10 testicules de rat. 3 x 10 6 cellules par puits sont ensemencées sur une plaque à 6 puits de telle sorte que six à sept plaques à 6 puits sont disponibles pour expériences sur jour 7. La digestion de trypsine-DNase I est l'étape la plus critique lors de l'isolement des cellules de Sertoli. Si la digestion à ce stade avance trop loin, le rapport des cellules germinales / cellules de Sertoli sera disproportionnée augmenter jusqu'à la fin. Pendant les jours 3-6 de la culture, il est important de se laver soigneusement éloigner autant de non-adhérente ou faiblement fixées cellules germinales que possible. En tant qu'alternative à larges lavages pendant 4 jours cellules germinales peuvent être éliminés par un traitement hypotonique au jour 3 27. Un avantage de cette méthode est que le temps de culture des cellules de Sertoli est maintenue à un minimum, de sorte que les fonctions spécifiques des cellules de Sertoli sont potentiellement meilleur retenu qu'après une longue période de culture.

(Figure 5B). Parce que les cellules péritubulaires ont un fort potentiel de prolifération, la culture des cellules de Sertoli doit être effectuée en l'absence de sérum. En présence de 10% de sérum PTC constitueraient environ 20% de toutes les cellules au bout de 6 jours de culture tandis que la fraction peut être devrait être inférieure à 1% en l'absence de sérum 7. Les cellules de Sertoli pratiquement tous isolés sont viables à en juger par la coloration au bleu Trypan (non représenté). Autour du jour 7 de la culture les cellules de Sertoli isolées sont moins contaminés par les cellules germinales et les cellules péri-tubulaires (figure 4), de sorte que les expériences doivent être réalisées autour de cette journée si possible. Pour une bonne reproductibilité, il est important de répéter l'expérienceest toujours le même jour de la culture. Si transfections sont prévus, ils doivent être effectués le jour 4 ou 5, et des extraits de cellules devraient être faits au jour 5 ou 6.

Sur au moins deux semaines dans des conditions cellules de Sertoli sans sérum sont sensibles à la FSH et de produire plus androgène-binding protein, activateur du plasminogène et de la transferrine par traitement FSH. Pour la culture est plus une couche nourricière de cellules péri-tubulaires ou du sérum est nécessaire. Après quatre semaines cultures se détériorent, et les cellules se détachent de la substrat 7.

Au jour 6 de culture des cellules de Sertoli ont acquis plus gouttelettes lipidiques. Dans la majorité des cellules d'une seule grande vacuole est formée (figure 5C et 5D). La teneur en lipide neutre peut être facilement visualisé par coloration Oil Red O (figure 4F).

En plus de Sertoli cel ls les PTC supprimés peuvent être cultivées ainsi (figure 4A et 4B). PTC de 10 testicules donné cinq flacons T75 qui peuvent être attendus pour former une couche confluente au bout de 2 jours de culture. Comme les cellules de Sertoli isolées PTC fraîchement isolés sont contaminées par des cellules germinales qui peuvent être largement éliminés par passage. Les flacons sont divisées 1: 2 par trypsinisation standard, de sorte que 10 flacons seront confluentes de 5 jours après l'isolement. Pureté de PTC isolés est> 95% et peut être confirmée par immunomarquage de l'actine musculaire lisse α-(figure 5A). Partir de ce jour PTC peuvent être utilisés pour les expériences. Un flacon est suffisant pour environ une plaque à 6 puits, et les puits doit être confluente le jour suivant. Les cellules peuvent être passées à plusieurs reprises, mais les expériences doivent être réalisées toujours dans le même passage, afin de faire en sorte que les cellules se comportent d'une manière reproductible.

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Figure 1. Morphologie du testicule et le flux de la procédure (A). Un secteur d'un tubule séminifère avec le tissu interstitiel adjacent est représenté schématiquement. tubules séminifères sont entourés par une membrane basale (BM) et une couche circonférentielle de cellules péritubulaires (PTC) myoïdes. L'épithélium germinatif est situé sur la face luminale de la membrane basale. Les cellules de Sertoli (SC), couvrant l'ensemble de l'épithélium germinal sont fortement attachés à la BM et reliés entre eux par basolatéral positionné jonctions d'occlusion représentant la barrière hémato-testiculaire (BTB). Leur noyau irrégulier (N) montre un ou plusieurs indentations comme des fissures et contient un nucléole. Les cellules germinales (GC) sont en contact intime avec SC à tous les stades de leur développement. Le compartiment interstitiel entre les tubes contenant les cellules de Leydig (LC) et des cellules immunitaires telles que les macrophages (MΦ) ainsi que les vaisseaux sanguins (BV). Figureadapté de Fijak Meinhardt et 28. (B) Flux de travail de la procédure; codage couleur est comme dans (A). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les testicules de rats Wistar sont excisés et décapsulés. (A) La cavité peritoneale est ouverte par une incision longitudinale de la manière décrite dans le texte. Un astérisque (*) indique que le coussinet adipeux epidydimal. (B) Les testicules sont enlevées par découpage du cordon spermatique et (C) ont été recueillies dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de PBS. Lorsque toutes les testicules ont été prélevés, ils sont désinfectés dans 20 ml de 1% (p / v) d'iode dans l'éthanol. Pour l'élimination de l'iode ils sont rapidement lavées deux fois avec 25 mlChaque PBS. (D) testicules après le premier lavage PBS. (E) Les testicules sont transférés dans une boîte de Pétri (à droite), et les tubules séminifères sont pressées hors de l'albuginée ouvert au moyen de lames de ciseaux fermés (à gauche), comme décrit dans le texte. (F) Les testicules decapsulated forment encore une masse en forme de testicule-compact avec tubules simples saillie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. L'isolement des cellules de Sertoli. (A) Après élimination des cellules interstitielles par la trypsine-DNase I digestion et de lavage 9x avec tubules PBS se mobiliser et l'air propre. (B) Au cours du traitement de la collagénase-hyaluronidase-DNase I péritubulaire cellules à partir des cellules germinales et des couches extérieures sont libérés. Les tubules se raccourcir et d'obtenir un aspect rugueux. (C) des fragments tubulaires après le lavage 4x avec PBS. Traitement (D) hyaluronidase-DNase I communiqués de cellules péri-tubulaires résiduelles ainsi que les cellules germinales. Tubules se réduire encore plus, et les agrégats tubulaires forment. (E) tubulaire agrège après lavage 4x avec PBS. Cellules (F) à l'unité de Sertoli sont produites par le passage des agrégats 10x à travers une aiguille de 18G. Les barres d'échelle dans (AE) = 200 um, en (F) = 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Culture de cellules péri-tubulaires (AB) et de Sertoli cellules (FC) et l'élimination des contaminat ING cellules germinales. (A) PTC remises en suspension de l'étape 4.5 ont été ensemencées immédiatement et photographié le lendemain. (B) Après avoir éliminé le jour 3 contamination par des cellules germinales est réduite. (C) Le jour 4 cellules de Sertoli montrent un motif de pavés comme typique. cellules germinales flottantes et adhérentes sont visibles avant de le laver avec du PBS. (D) Le même bien après le lavage 3x avec PBS. Le nombre de cellules germinales contaminants est réduite. Laver trois fois avec du PBS est répétée au jour 5 et 6. (E) Au jour 6 de la culture pratiquement toutes les cellules germinales ont été supprimés. les cellules de Sertoli ont formé une couche unique de cellulaire à la recherche, et la plupart des cellules ont acquis une seule grande vacuole. (F) Oil Red O coloration montre que ces vacuoles sont des gouttelettes lipidiques contenant des lipides largement neutres. Les barres d'échelle dans (AD) = 200 um, en (E) = 50 um et en (f) = 25 um..jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. La coloration par immunofluorescence. La coloration des cellules péritubulaires primaires purifiées avec l'actine (muscle lisse) anticorps (A) et de Sertoli cellules avec un anticorps de la vimentine (B). Pas de cellules contaminantes sont visibles dans les deux champs de vision. La barre d'échelle dans (A) et (B) = 10 um. (C) et (D) Electron images microscopiques de cellules de Sertoli après 4 jours de culture. (C) Notez le contact étroit de cellules adjacentes (pointes de flèche) qui mène à la structure pavée-like comme on le voit sur ​​la figure 4C. Une gouttelette lipidique unique (G) est observée dans le cytoplasme de chaque cellule. (D) des organites les plus abondantes sont les mitochondries (M) et l'appareil de Golgi (G).Le noyau (N) contient un nucléole (Nc) et montre l'empreinte de fissure comme typique. La barre d'échelle dans (C) = 1 um et (D) = 0,25 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Guido Verhoeven et Ludo Deboel, Louvain, qui a été extrêmement utile dans l'établissement de l'isolement des cellules de Sertoli primaires dans le laboratoire Meinhardt à Giessen. Monika Fijak, Gießen, est reconnu pour son aide à la figure 1A et des conseils. Des études ont été pris en charge par la Deutsche Forschungsgemeinschaft travers subvention BH 93 / 1-1 (SB) et le financement du College Graduate Research JLU Gießen International (Allemagne) / Université Monash (Melbourne, Australie) GRK 1871 (SB). Un soutien a également obtenu à partir d'une subvention de l'État de Hesse dans le programme "Landes-offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) appelé "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized
Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 
Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)
Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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