마우스의 소설 미세 수술 이소성 모델, 욕실 공산권 가슴 벽, 흉선, 및 심장 이식

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Oh, B., Furtmüller, G. J., Sosin, M., Fryer, M. L., Gottlieb, L. J., Christy, M. R., Brandacher, G., Dorafshar, A. H. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. (107), e53442, doi:10.3791/53442 (2016).

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Abstract

Protocol

모든 수술 절차는 존스 홉킨스 대학과 미국 농무부와 보건 서비스에 대한 요구 사항을 준수 완료했다. 이 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회를 다음과 제도적 검토 보드 (프로토콜 번호 M013M490) 가이드 라인을 승인했다. 최종 생존 데이터는 후술하는 수술 절차에 대해 기록 하였다. 모두 기증자와받는 사람 동물 0.1 밀리그램에서 부 프레 노르 핀을 사용하여 선제 마취를 수신 / kg SC 일시간 수술 전에 수신자 동물 프레 노르 핀에 이식 한 후 동일한 용량으로 투여 다시 첫 번째 48 시간 동안 필요에 따라 다시 투여한다 수술 후.

1. 기증자 동종 이식 복구

주 : 수신자 마취 시간을 최소화하기 위해 이전보다받는 이식 이식 40 분의 공여 부분을 시작하고 동시에 종료 시간 또는 약간 귀를 용이받는 사람 준비 대 Lier의 종료 시간.

  1. 절차는 표준 멸균 미세 수술기구 및 멸균 장갑을 사용합니다. 우리 연구실은 미세 수술기구의 오토 클레이브 멸균을 사용합니다.
  2. 4 % 이소 플루 란으로 유도 기화기를 사용 도너 마우스 (수컷)을 마취. 사용 외상성 기계 가위는 자궁 경부, 흉부에서 머리와 복부를 제거합니다. 앙와위에서 동물을 놓고 코 콘을 통해 1 ~ 2 %에 이소 플루 란을 유지한다. 주기적으로 발가락 핀치 철수 반사를 평가하여 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취를 확인합니다.
  3. 피부 절개에 앞서, 널리 멸균 면봉을 사용하여, 이소 프로필 알코올이어서 방부제 포비돈 요오드를 적용하여 동작을 준비한다.
  4. 자궁과 복부 피부에서 가위로 표면 가로 피부 절개로 시작합니다. 양측 midaxillary 라인을 따라 모두 절개를 연결합니다.
  5. 미세 수술 집게를 사용하여6-0 실크 봉합사와 가위 외부 경정맥을 식별 결찰 및 분할 양측 자궁 지역을 해부하다. 그런 다음 사용하는 전기 소는 양자, 내부 경정맥과 경동맥을 노출 흉쇄 근육을 나눕니다. 왼쪽면과 일괄 방식으로 경동맥 내부 경정맥 오른쪽 양면에서 6-0 실크 봉합사를 전달합니다.
    참고 : 그들은 묶여 단계 1.9 이후에 구분됩니다.
  6. 급격히 자궁 지역의 나머지 첨부 파일을 무료로 가위를 사용하여, 기관에 전방에 위치한 스트랩 근육과 관련된 느슨한 유륜 조직을 나눕니다.
  7. 양극성 전기 소와 날카로운 해부를 사용하여 쇄골 하 혈관 결찰 (6-0 실크 봉합사)를 노출하고 근위 분할 pectoralis 주요 근육과 쇄골을 나눕니다.
  8. 다음, 부드럽게 잡고 동물의 성기를 철회. 음경의 배부 함께 음경의 배부 정맥을 시각화 및 소독이소 프로필 알코올과 지역. 30 G 바늘을 사용하여, 정맥 등의 정맥을 통해 헤파린의 30,000 단위를 주입하고 성기가 다시 원래의 위치로 반동 할 수 있습니다. 주변 조직에 헤파린 솔루션의 일부 누수가 발생할 수 있습니다.
  9. 경동맥과 경정맥 주위의 이전 배치 대량의 관계를 이용하여, 양자, 결찰 및 구조를 나눕니다.
  10. 다음 사용 가위는 가로 intrabdominal 절개를합니다. infrahepatic 하대 정맥을 노출하고 infrahepatic 하대 정맥에 감기 유로 콜린스 심정지 용액 2 ㎖를 주입하는 장을 절개. 전에 다음 단계로 진행에 간 변색과 심장 박동의 정지를 시각화하여 적절한 주사를 확인합니다.
    참고 : 유로 콜린스 솔루션은, 우리의 실험실에서 제조 된 특정 시약 및 장비의 표를 참조한다.
  11. 사용 가위는 양자 diaph를 통해 흉부 공동 액세스노출 된 복부에서 ragmatic 절개. 늑간 근육과 갈비뼈를 통해 cephalad 절개를 확장 할 수 있습니다. 동시에 가슴 벽을 따라 내부 흉부 혈관의 보존을 보장하면서 심장, 흉선, 큰 혈관을 노출 가슴 벽을 반영한다.
  12. 감기 유로 콜린스 심정지 액 4 mL로 suprahepatic 하대 정맥 주입한다.
  13. 대동맥의 루트를 확인하고 하행 대동맥에 원심 추적. 급격하게 하행 대동맥 (최대 길이 보존)를 잘라.
  14. 폐 트렁크를 확인하고 (최대 길이 보존)의 분기점에 바로 인접 나눕니다. 냉간 유로 콜린스 심정지 용액 2 ㎖를 사용하여, 폐동맥의 루멘으로 부드러운 플라스틱 카테터 팁을 배치하여 폐동맥 심장 플러시.
  15. 6-0 실크 봉합, 결찰을 사용하고, 폐 혈관의 합류를 하대 정맥을 분할하고, 양자 간 상대 정맥의 액세서리 분기합니다. 그런 다음 상승그리고기도를 입력하지 않도록주의 주요 줄기 기관지와 기관에 따라 첨부 파일에서 심장 cephalad을 해부하다. 날카로운 양극성 전기 소를 사용하여 가슴 벽, 흉선, 심장이 완전히 기증자 마우스에서 해방 해부.
  16. 마지막으로, 흉골 및 측면 costae 함께 가위를 사용하여 작은 크기로 이식 가슴 벽 생체 트림주의 내흉 혈관 (그림 1A)을 방해하지. 재관류 다음과 출혈을 최소화하기 위해, osteomusculocutaneous 흉골의 경계를 따라 바이폴라 electrocauterization를 사용합니다.
  17. 받는 사람이 삽입을 위해 준비되어 있지 않은 경우 유로 콜린스 솔루션을 초기 (4 섭씨) 10 ㎖의 동종 이식을 놓습니다. 수신자가 삽입을위한 준비한다면, 바로받는 수술 분야에 동종 이식을 전송합니다.

2.받는 사람 준비

참고 :받는 사람 마취 시간을 최소화하기 위해,별도의 수술 역에서 전에 기증자 이식 수확의 완료까지 약 40 분을받는 준비를 시작합니다.

  1. 표준 멸균 미세 수술기구 및 절차에 대한 멸균 장갑의 별도의 세트를 사용합니다.
  2. 4 %에서 이소 플루 란 유도 기화기를 사용하여 (남성 또는 여성)받는 사람 마우스를 마취. 외상성 기계 가위를 사용하면 오른쪽 자궁 경부와​​ 흉부 지역에서 머리를 제거합니다.
  3. 부정사 위치와 각도 오른쪽 상지 약간 하방 머리와 우측 상지 사이에 110도 각도를 형성 마우스를 놓습니다. 코 콘을 통해 1 ~ 2 %의 이소 플루 란에 마취를 유지한다.
  4. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 마우스 눈에 석유 안과 연고를 놓습니다. 피부 절개에 앞서, 이소 프로필 알콜 널리이어서 방부제 포비돈 요오드를 사용하여 수술 부위를 준비한다.
  5. 가위를 사용하면, 오른쪽 열등한 BOR 따라 중간 선에서 피부 절개를하악의 데르 오른쪽 흉부 지역 infero-측면 절개를 확장 할 수 있습니다. 미세 혈관 집게로 무딘 절개를 사용하여, 부드러운 조직과 외막에서 원주 자유로운 선박에 의해 외부 경정맥을 동원. 전기 소를 사용하여 모든 지점을 분할하고, 동종 이식을위한 여유 공간에 날카로운 해부 및 전기 소를 사용하여 악하선의 오른쪽 엽을 제거합니다.
  6. 커프를 통해 에버트하기 위해 외부 경정맥의 충분한 길이를 확인하고 6-0 실크 봉합사를 사용하여 정 맥 외부 경정맥을 결찰. 미리 절단 폴리이 미드 커프의 루멘을 통해 정맥을 삽입하고 장소에 용기 즉석 복잡한 문제를 해결하기 위해 불독 미세 혈관 클램프를 사용합니다. 그런 다음 근위 에버트 커프를 통해, 외부 경정맥을 분할하고, 10-0 나일론 봉합사와 장소에 고정, 가위를 사용하여. (그림 1B)
  7. 경동맥을 노출 양극성 전기 소와 오른쪽 흉쇄 근육을 나눈다. 원주 폭도자궁 경부 영역 내에서 말단 가장 포인트로 cephalad 동맥을 ilize. 이것은 부드러운 조직과 주변의 외막을 제거하기 위해 집게로 선박의 무딘 절개를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
  8. 6-0 실크 봉합사를 이용하여 결찰 및 경동맥을 나눈다. 미리 절단 폴리이 미드 커프의 루멘을 통해 동맥을 전달하고 가능한 한 흉부 입구에 가까운 불독 미세 혈관 클램프와 장소에 고정합니다. 부드럽게 에버트 커프 이상, 미세 수술 확장기를 이용하여 혈관을 팽창, 말단 혈관을 나누고 10-0 나일론 봉합사 제자리에 고정합니다. (그림 1B)
    주 : 특정 미세 수술 확장기는 특정 시약 및 장비의 표에 설명되어 있습니다.

3. 동종 이식 삽입 된

  1. 거꾸로 및 경사 위치에받는 사람 자궁 지역 내 동종 이식을 배치하는 표준 멸균 계측 및 멸균 장갑을 유지한다.
  2. 이어서, 상기 도너 하강 AOR 배치받는 사람의 동맥 커프 구조를 통해 TIC 루멘과 10-0 나일론 봉합사 (그림 1C 및 1D)와 장소를에 고정합니다.
  3. 기증자 폐동맥과받는 사람 마우스 (그림 1C 및 1D)의 everted 외부 경정맥 즉석 구조 사이의 단계 3.2에서와 같은 문합을 패션.
  4. 먼저 정맥 미세 혈관 클램프 (외부 경정맥 클램프)를 제거하고 동맥 클램프 (경동맥 클램프)를 놓습니다. 동맥 재관류 동안 어떤 출혈을 해결하기 위해 동종의 전체를 검사한다. 출혈이 가시화되면, 혈액 손실을 최소화하고 바이폴라 전기 소를 이용하여 출혈의 원인을 완화 동맥 클램프를 다시 적용.
  5. 이식을 검사하고 지혈을 보장합니다. 해제하고 완전히 동맥 미세 혈관 클램프를 제거합니다. 심장 챔버의 급격한 부피 팽창으로 즉시 알 수있을 것이다 재관류의 흔적을 표시하는 마음을 관찰하고, B 기다립니다0.5 분 이내에 시작하는 식사. 마음을 축축 따뜻한 식염수 (35 ° 섭씨)를 사용합니다.
  6. 문합에 어떠한 꼬임이나 긴장감을 유발하지 않도록 해부학 적 위치로 흉벽 드레이프. 6-0 연속 나일론 봉합사 (그림 1E)를 사용하는 수술 상처의 피부를 닫습니다.

4. 수술 후 케어

  1. 유체 교체를 위해 즉시 수술 후 0.3 ml의 생리 식염수를 복강 액 덩어리를 관리.
  2. 그리고 피하 각각 통증과 감염 예방을 위해 프레 노르 핀 (를 0.1 mg / kg)와 enrofloxacin (5 ㎎ / ㎏)을 주입.
  3. 마취에서 각성 할 때까지 가열 램프 아래에있는 동물을 놓고 흉골 드러 누움로 돌아갑니다. 복구하는 동안, 적절한 동종 이식 관류을 보장 동종 이식의 피 브릴 하트 비트를 시각화하기 위해 목을 검사합니다.
  4. 일단 깨어 누운 위치에, 다른 마우스의 회사없이 별도의 케이지 (마우스를 반환)는 음식과 임의 량의 물을 수신 할 수있는. 때문에 우측 상지의 임시 약간의 제한적인 움직임, 새장 바닥에 젤라틴 음식 소스를 둡니다.
  5. 수술 후 1 시간 동안받는 마우스를 관찰 한 다음이 음식과 물을 임의로을받을 수 있으며, 활동과 영양 섭취에 대한 첫 24 시간 동안 하루에 세 번 검사하는 케이지 시설로 돌아갑니다. 처음 72 시간 동안 필요에 따라 하루에 두 번 피하 통증과 고통과 부 프레 노르 핀 (를 0.1 mg / kg)와 재 투여의 징후 마우스를 모니터링합니다. 매일 그 후 동물을 검사하고 매주을 단다.
  6. 어떤 마우스는 고통, 고통의 흔적을 표시하거나 사료 섭취량이 감소하면 수의학 직원에게 문의하십시오. 초기 안락사를 고려 (우리의 프로토콜에서 안락사 기술은 자궁 경부 전위 다음, 7 분 동안 이산화탄소 과다 복용을 사용).
  7. 동종 이식 심장 박동의 정지는 S로 마우스를하라는​​ 특정 엔드 포인트로 정의된다acrificed.

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Representative Results

동계 C57BL가 / 6 이식 장기의 생존을 달성했다. 동종 이식 (도 1)의 설계는 동물 생존 관점 지속적인 동종 이식 생존을 평가하는 능력에서 성공적인 것으로 판명되었다. 이것은 가능한 액티브 지속 동종 육모 나머지 상부 피부를 통해 입증하고, 하트 비트는 시각화 및 손가락 촉진 평가 될 수 있었다. 생존 데이터는 동계 이식 된 쥐 그림 2에 표시됩니다. 평균 생존 시간은 초과 1백9일이었다. 생존 데이터에 기초하여, 동종 이식의 기술적 특징은 흉벽, 흉선, 심장 전체를 관류하도록 설계되는 것을 추정하는 것이 합리적이다. 또한, 장기 생존 동계 동물의 능력이 상기 마우스 모델뿐만 아니라 가능하지만 복제 할 수 있음을 지원한다. 이 개념 증명 블록 가슴 벽, 흉선, 심장 이식 EN은 일의 유효성을 검사전자 쥐 모델은 고체 장기 및 혈관 복합 동종 이식을 결합 연구에.

그림 1
1. 수술 중 사진을 그림. (A) 흉벽, 흉선, 심장 동종 이식이 성공적으로 회복 손질 및 후방 측면에서 생체 가시화된다. 양측 내흉 혈관. (B)받는 외부 경정맥 (화살표) 및 경동맥 (화살촉)이 혈관 문합을 준비 폴리이 미드 수갑을 통해 고정 everted 있습니다. 보존 (C) 동종 이식 혈관 문합이 완료됩니다. 화살표는 기증자 폐동맥과받는 외부 경정맥 정맥 사이의 문합을 보여줍니다. 화살촉은 기증자 하행 대동맥과받는 사람 경동맥 사이의 문합을 보여줍니다. 별표는 흉선을 식별하고 반영 가슴 벽 overl 가시화흉선을 잉. (D) 높은 배율은 미세 혈관 즉석 문합을 보여줍니다. (E) 전체 이식 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 욕실 블록 흉벽, 흉선, 심장 동종 이식 생존 EN 동계 C57BL / 6 마우스의 블록 가슴 벽, 흉선, 심장 이식 실험의 카플란 - 마이어 생존 곡선 (N = 3;. 평균 생존 기간이었다 이상 (109) 일). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

포함 동종 이식의 면역 학적 조사에 고려하지만, 급성 및 만성 거부, 직접 및 간접 항원 제시받는 사람 과민성, 또는 혼합 키 메리 즘의 유도 메커니즘에 한정되지 않는다 현상의 다수가있다. (19) 동물 모델이되고있다 이식 면역학의 연구를위한 황금 표준 및 마우스 모델은 대중적으로 인해 상대적으로 낮은 수의학과 주택 수요를 감소 비용, 형질 전환 유전자 녹아웃 마우스의 가용성, 상업적으로 이용 가능한 단일 클론 항체, 및 복제의 용이성에 구현된다. 지금까지 여러 심장 이식 모델은 고체 장기 이식을 연구하기 위해 설계되었습니다. 19,22-27을 마찬가지로, 마우스 모델의 과다는 혈관 복합 동종 이식을 연구하기 위해 개발되었다. (28) 그러나, 결합 고체 장기 및 혈관 복합 동종 이식의 연구를 , 제한및 기술은 아직 마우스에 설립되어야한다. 여기에 제시된 EN 블록 가슴 벽, 흉선, 심장 이식 쥐 모델은 효과와 결합 된 고체 기관 및 혈관 복합 동종 이식의 면역 학적 메커니즘을 연구하는 신뢰성과 복제 도구입니다.

더 이식 분야의 발전을 위해 새로운 치료 방법을 통해 동종 이식 생존과 면역 억제의 최소화를 연장의 약속은 추구해야합니다. 하나의 이러한 접근은 어떤 경우 키메라가 유지되지 않는 경우에도, 면역 억제없이 도너 특정 공차로 이어질 수 혼합 키메라 (수신자에서 공여자 조혈 세포의 부분 생착)의 유도를 통해이다. 29,30 골수 수혈 / 고체 기관 (31) 또는 혈관 복합 allotransplanation의 (32, 33)와 짝을 이식은 중요한 도전 포즈 광범위한 전처리가 필요합니다. 혈관 골수,혈관 이식 복합 구조체의 S 부분은,이 문제를 회피 할 수있다. 혈관 골수 이식은 보존 도너 미세 환경 내에서 공여자 골수 세포의 중단되지 않은 전송을 허용하고, 내성 및 면역 요건의 감소 유도에 단독 셀룰러 골수 이식에 우수하다고 생각된다. 34-36를 또한 혼입 혈관 골수 이식과 흉선 조직의 궁극적으로 유도 및 키메라의 유지에지지 역할을 공여체 유래의 T 세포의 키메라를 증가시키는 것으로 하였다. 개념화 재단 된 동종 이식 생존을 연장 및 면역 억제를 최소화 2,9- 전술 전략 결합 된 고체 기관, 흉선, 그리고 혈관 복합 동종 이식 마우스 모델.

블록 가슴 벽, 흉선, 심장 이식 EN 이소성 여러의 융합 그의torical 동물 모델. 마우스의 비 봉합 커프를 사용하여 이소성 자궁 심장 이식이 잘 설립과 이소성 복부 미세 혈관 심장 이식보다 기술적으로 까다로운 것으로 간주되고있다. 19 사실, 커프 기술은 여러 다른 동물 이식 모델에서 구현되었습니다. 37-44 이소성를 쥐의 흉골 이식은 산티아고 등의 알에 의해 1999 년에 도입되었다. 혈관 골수 이식을 연구하는 다른 방법으로. (1) 그들은 수술 후 하루에 면역 억제의 중단 다음과 같은 장기 주변 키메라, 관용, 그리고 생존을 보여줄 수 있었다 (30) 1 Bozkurt 등은. 이후 흉선과 가슴 벽의 osteomyocutaneous 부분의 전체 범위를 통합하기 위해 2013 년 쥐 모델을 개발했다. 이는이 모델은 여러 측면에서 우리의 모델이 상이 함을 주목하여야한다. 여기에는 (1) 자신의 모델은 어떤 고체없는 것으로기관은, (2) 기존의 미세 수술 기법을 사용하여 쥐에 완료되고, (3) 기증자 수확하는 동안 내부 흉부 혈관의 결찰, (4) 경동맥 및 외부 경정맥과를 통해 일방적, 하나의 작은 꽃자루의 구현 (5 사타구니 지역에 동종 이식의) 이식. 2 그럼에도 불구하고, 그들의 모델은 혼자 혈관 골수 이식에 비해 기증자 원산지 흉선은 키메라의 확대뿐만 아니라 키메라 유지 보수뿐만 아니라 중요한 역할을한다는 것을 입증 할 수 있었다. (2) 흉선과 마음의 공동 이식의 후속 돼지 모델. 각 동물 모델의 10, 11 장점을 심장 이식 생존에 우수한 효과를 보여 주었다, 그러나 생체 내 연구에 기계적인 부족이 결합 된 고체 기관, 흉선, 그리고 혈관에 관한 복합 동종 이식이 모델을 설계하기 위해 그룹을 자극했다.

경험 전이 새로운 모델을 ecuting 더 나은 동물의 생존을 달성하기 위해 수정을 제정하기 위해 팀을 필요로하는 특정 수업을 나타냈다. 이 모델은 궁극적으로 3-4 이상의 시간도 연장 차가운 허혈 시간으로 수술과 마취 시간을 연장 한 운영자와 시도되었습니다. 동물 절차의 종료 다음 깨어하지 않을 것입니다. 두 팀 접근 방식의 구현은 90 분으로 총 수술과 마취 시간을 잘라. 이것은 60받는 사람 마우스의 분 마취 시간, 0-10 분 동종 차가운 허혈 시간을 반영합니다. 동종 이식 재관류 동안 마우스가 즉시 요정 수술에서의 생존을 제한 할 수 있습니다 출혈에 영향을 받기 쉽다. 우리는 출혈의 가능성 소스에 대한 동종 이식 전직 생체의 세심한 검사뿐만 아니라 동종 재관류 동안 불독 미세 혈관 클램프의 부드러운 릴리스를 옹호. 반사 된 위치에 동종 이식을 배치하여 그것의 특정 사이트를 식별하는 것이 더 쉽습니다출혈. 더욱이, 이러한 그라프 트 삽입 위치는 혈관의 대부분이 인체 공학적 꼬임 용기 꼬임의 위험을 최소화 육성. 마지막으로, 회복의 첫 번째 48 시간으로, 운동의받는 사람 마우스의 우측 상지의 범위는 음식과 물을 얻기 위해 새장 등반에 관하여 방해 할 수있다. 따라서, 우리는 영양 섭취를 용이하게하기 위해 새장을 따라 젤라틴 영양 소스의 위치를​​ 권장합니다. 일반적으로 수술 후 3 일에 의해, 운동의 전체 범위는 우측 상지 내에 반환됩니다.

미세에서의 기술에 대한 필요성, 두 개의 동시 현미경의 가용성 및 두 팀 방식의 요구 사항을 포함하는이 모델에 제한이 있기는하지만, 그럼에도 불구하고 그것은 관련된 기계적인 면역 학적 연구를 수행하기위한 성공적인 접근 것으로 나타났다 결합 된 고체 기관 및 혈관 복합 동종 이식. 보다 넓은 응용은 또한 신규 immun 개발에 기여할 수있다osuppressive 프로토콜, 급성 및 만성 거부 반응의 공부 역학, 잠재적 인 전략의 구현은 유도와 키메라를 유지하고, 동종 이식 생존을 연장합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euro-Collins Solution The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml.
Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture Ethilon MWI 72667 6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G) Vention Medical 141-0043 http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G) Vention Medical 141-0027 http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter Terumo SR*OX2419CA 24G x 3/4" 
Microsurgical dilator S&T D-5a.1 Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d

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References

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