एक समानांतर खंडों प्रवाह स्तंभ ट्यूनिंग और मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम

1School of Science and Health, University of Western Sydney
Chemistry

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Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

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Abstract

Introduction

सक्रिय फ्लो प्रौद्योगिकी कॉलम

सक्रिय प्रवाह प्रौद्योगिकी (पीछे) क्रोमैटोग्राफी कॉलम हाल ही में प्रवाह विविधता 1-6 से जुड़े विभाजन में अक्षमता पर काबू पाने के लिए विकसित किए गए हैं और यह भी मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए सक्षम है। यह विशेष रूप से संचार हम विस्तार से समानांतर के परिचालन की प्रक्रिया मल्टिप्लेक्स पता लगाने के साथ प्रवाह (पीएसएफ) स्तंभ खंडों। पीएसएफ स्तंभ की कुंजी कार्यात्मक लाभ कर रहे हैं: (1) स्तंभ बिस्तर के रेडियल मध्य क्षेत्र से प्रवाह, (2) एक का पता लगाने के द्वारा कार्रवाई की जानी चाहिए कि मोबाइल चरण की मात्रा प्रवाह के परिधीय या दीवार क्षेत्र से अलग है स्रोत कम हो जाता है, और (3) का पता लगाने के सूत्रों प्रत्येक पता लगाने की प्रक्रिया भर में पता लगाने में देरी instilling, या बाद में एक के बाद स्तंभ प्रवाह धारा 7.8 के बंटवारे की जरूरत महसूस बिना नमूना जानकारी विस्तार करने के लिए मल्टिप्लेक्स जा सकता है। एक सक्षम बनाता है कि पीएसएफ स्तंभ के डिजाइन में प्रमुख विशेषतामल्टिप्लेक्स का पता लगाने के dvantage उपन्यास आउटलेट फिटिंग और मिलाना विधानसभा है। एक एक पारंपरिक स्तंभ की तुलना पिछाड़ी स्तंभ की एक तस्वीर है चित्रा। यह बंटवारे की प्रक्रिया के बाद स्तंभ प्रवाह धारा बंटवारे के रूप में ही नहीं है समानांतर खंडों प्रवाह कॉलम का उपयोग कर प्राप्त समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक के बाद स्तंभ प्रवाह धारा में (यानी, अक्षीय रूप से), जिससे प्रत्येक प्रवाह धारा कार्यकुशलता और संवेदनशीलता के लिए सम्मान के साथ बराबर है उतना ही नमूना है पूंछ के हाथ पैरों के लिए अग्रणी धार से पूरे नमूना बैंड विभाजित; संवेदनशीलता की भयावहता जिससे नंबर विभाजन से बांटा जा रहा है। पीएसएफ में, हालांकि, विभाजन प्रक्रिया के नमूने बैंड त्रिज्यात, नहीं अक्षीय। जैसे, केंद्रीय बंदरगाह नमूने शिखर सुप्रीम - चोटी का सबसे केंद्रित क्षेत्र। शिखर फैलाना पीछा क्षेत्र से पतला नहीं है के रूप में इस प्रकार, यहाँ संवेदनशीलता सबसे अधिक है। परिधीय बंदरगाहों से eluting नमूना Centra में के रूप में कुशल नहीं हैबैंड बल्कि अक्षीय रूप से, त्रिज्यात जांचा जाता है के बाद से एल क्षेत्र है, लेकिन, शिखर की चौड़ाई, यानी, अक्षीय दिशा में एक के बाद स्तंभ विभाजन शिखर बांटता है कि एक नमूना प्रक्रिया के लिए मामले की जाएगी से संकरा है। इसलिए एक एकाग्रता निर्भर डिटेक्टर के साथ संवेदनशीलता कम नहीं है।

पीएसएफ कॉलम में, आउटलेट फिटिंग एकाधिक बाहर निकलें बंदरगाहों शामिल हैं और फिटिंग यह अंत के अंदर पर एक कुंडलाकार मिलाना वहाँ रखे है। आउटलेट मिलाना चैनलों के बाहरी रेडियल भाग परिधीय या दीवार क्षेत्र आउटलेट प्रवाह बंदरगाहों के माध्यम से स्तंभ के बाहर प्रवाह, जबकि इस कुंडलाकार मिलाना चैनलों के भीतरी भाग, रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह के माध्यम से स्तंभ के बाहर प्रवाह। आउटलेट मिलाना के भीतरी और बाहरी भागों इन प्रवाह क्षेत्रों 2 के बीच पार प्रवाह को रोकता है कि एक अभेद्य अवरोध से अलग हो रहे हैं। इस डिजाइन का एक परिणाम के रूप में स्तंभ बिस्तर के माध्यम से केंद्रीय रेडियल प्रवाह धारा दीवार क्षेत्र प्रवाह आईएनएस से अलग किया जाता हैस्तंभ आईडीई। इन दोनों क्षेत्रों से प्रवाह के रिश्तेदार भाग ऐसी जुदाई दक्षता या संवेदनशीलता का पता लगाने के रूप में स्तंभ प्रौद्योगिकी के विभिन्न कार्यात्मक पहलुओं का अनुकूलन करने के लिए दबाव प्रबंधन के माध्यम से लगभग किसी भी वांछित अनुपात को अलग किया जा सकता है। संक्षेप में, इस डिजाइन को प्रभावी ढंग से एक संकरा आंतरिक व्यास वाले, बड़े प्रारूप स्तंभ एक 'वर्चुअल' कॉलम के भीतर स्थापित करता है, और स्तंभ बिस्तर विविधता और दीवार प्रभाव 9,10 पर काबू पाने के लिए एक सच्चे दीवार-कम स्तंभ के रूप में इसलिए स्तंभ कार्य करता है।

पीएसएफ स्तंभों का प्रमुख लाभ स्तंभ दक्षता, का पता लगाने के स्रोत (एस) और मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम के लिए विलायक प्रसंस्करण के न्यूनतम में सुधार कर रहे हैं। हालांकि, एक जोड़ा लाभ किसी भी बैंड का पीछा करने और अग्रिम क्षेत्रों समग्र क्षालन से हटा रहे हैं के बाद से क्षालन या पता लगाने में घुला हुआ पदार्थ प्रोफाइल है कि अन्यथा एक ही एस के लिए मनाया जाएगा तुलना में एक उच्च एकाग्रता में मौजूद हैनियोजित विभाजन अनुपात के आधार पर, एक पारंपरिक स्तंभ पर इंजेक्शन और एकाग्रता लोड olute। एक परिणाम के रूप में अक्सर पीएसएफ कॉलम 2 पर आयोजित विभाजन के लिए संकेत तीव्रता में लाभ देखते मनाया जाता है। वास्तव में, विभाजन अनुपात चार बाहर निकलने के बंदरगाहों में से प्रत्येक से प्रवाह से बाहर निकालता है की 25%, अल्ट्रा वायलेट (यूवी) का पता लगाने का उपयोग कर मनाया जाता है कि संकेत तीव्रता एक पारंपरिक का उपयोग करते हुए स्पष्ट रूप में ठीक उसी संकेत तीव्रता व्यावहारिक रूप से पता चलता है कि इस तरह से समायोजित किया जाता है तो मोबाइल चरण के पूरे (100%) 7 का विश्लेषण किया जाता है, जहां स्तंभ। इसके अलावा, केंद्रीय और दीवार प्रवाह क्षेत्रों के बीच आउटलेट अनुपात के ठीक ट्यूनिंग स्तंभ दक्षता अनुकूलित किया जाना अनुमति देता है। (1) प्रवाह की दर, (2) विभाजन अनुपात, और (3) घुला हुआ पदार्थ प्रतिधारण कारक: स्तंभ दक्षता में लाभ इन दक्षता लाभ एक तीन कारकों का कार्य कर रहे हैं के बाद से, एक ही मूल्य के लिए कहा नहीं जा सकता है पिछाड़ी कॉलम का उपयोग कर मनाया । फिर भी, दक्षता में लाभ कनव की तुलनाentional कॉलम लगभग हमेशा मनाया जाता है, और कभी कभी इन लाभ सैद्धांतिक प्लेटों 1,2 की संख्या में 100% से अधिक कर रहे हैं। धुन करने की क्षमता के विभाजन अनुपात विश्लेषक प्रभावी ढंग से 'वर्चुअल' कॉलम के व्यास से तैयार करने की अनुमति देता है, और यह पता लगाने की प्रक्रिया के संबंध में एक महत्वपूर्ण कारक है। विभाजन अनुपात रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाह से eluting मोबाइल चरण का 21% है जब उदाहरण के लिए, एक आभासी 2.1 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) स्तंभ एक भौतिक 4.6 मिमी आईडी स्तंभ से स्थापित है। इन शर्तों के तहत, आभासी 2.1 मिमी आईडी स्तंभ एक प्रवाह की दर पर निर्भर करता है, पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ से अधिक से अधिक 70% अधिक से अधिक हो सकता है कि दक्षता, और घुला हुआ पदार्थ प्रतिधारण कारक 10 के साथ करता है।

मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि वर्तमान पीएसएफ स्तंभ डिजाइन एक 4-बंदरगाह फिटिंग आउटलेट को शामिल किया गया है, लेकिन स्तंभ के साथ लगाया जा सकता है एक 2-बंदरगाह अंत ढाले भी, तथापि, यह पता लगाने के लिए टी की सीमाकेवल दो डिटेक्टरों ओ। कि चार डिटेक्टरों मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए दायरा व्यापक बनाने 4 पोर्ट आउटलेट पीएसएफ स्तंभ के लिए एक साथ मिलकर किया जा सकता सिवाय इन स्तंभों के बुनियादी आपरेशन, हालांकि, एक ही है। एक तरफ पूर्व और बाद स्तंभ संयोजी ट्यूबिंग से, केवल अतिरिक्त आवश्यकताओं को एक पीएसएफ स्तंभ परिधीय आउटलेट बंदरगाहों से जोड़ा जा सकता है कि ट्यूबिंग, और प्रत्येक ट्यूब के माध्यम से गुजर मोबाइल चरण की मात्रा को मापा जा सकता है जिसके द्वारा एक साधन है संचालित करने के लिए, आम तौर पर एक बड़े पैमाने पर माप या एक बड़ा माप सकते हैं या तो। ट्यूनिंग की आसानी के लिए, सभी आउटलेट प्रवाह ट्यूबिंग का आंतरिक व्यास ही होना चाहिए। परिधीय और रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाहों के बीच प्रवाह अनुपात तो बस ढाले परिधीय आउटलेट, या रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह पर ट्यूबिंग पद डिटेक्टर की लंबाई पर स्थित ट्यूबिंग की लंबाई को बदलने से, दबाव प्रबंधन के उपयोग के माध्यम से विविध है।

मल्टिप्लेक्स जांच पीएसएफ स्तंभों का उपयोग

पीएसएफ स्तंभों का एक महत्वपूर्ण लाभ आउटलेट बाहर निकलने के बंदरगाहों में से प्रत्येक इस प्रकार मल्टिप्लेक्स पता लगाने में सक्षम है, एक का पता लगाने के स्रोत को सीधे जोड़ा जा सकता है। एक अच्छी तरह से डिजाइन प्रणाली का पता लगाने में मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के साथ एक एकल विश्लेषण नमूना भीतर घटकों की प्रकृति के संबंध में पर्याप्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात है, विनाशकारी और गैर विनाशकारी परीक्षण पता लगाने में देरी के बिना, वास्तव में एक ही समय में आयोजित किया जा सकता है। इस घटक यूवी और / या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का पता लगाने के हिमायती 7,11 साथ elute करने के लिए मनाया के साथ DPPH अभिकर्मक का उपयोग कर उदाहरण के लिए, विरोधी oxidants के लिए, का परम असाइनमेंट की अनुमति देता है। इसलिए, चार स्वतंत्र डिटेक्टरों चार आउटलेट बंदरगाहों में से किसी के माध्यम से प्रत्येक डिटेक्टर के लिए निर्देशित प्रवाह की उचित भागों के साथ एक साथ संचालित किया जा सकता है। इन बंदरगाहों के माध्यम से प्रवाह आसानी से डिटेक्टरों के किसी भी पहुँच रहा घुला हुआ पदार्थ की मात्रा को समायोजित किया जा सकता चूंकि अनुरूप समायोजित किया जा सकता हैदी डिटेक्टर स्रोत की संवेदनशीलता। यह सबसे कुशल घुला हुआ पलायन रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह के माध्यम से मनाया जाता है, तथापि, कि ध्यान दिया जाना चाहिए। परिधीय बंदरगाहों में से प्रत्येक एक बंदरगाह के माध्यम से 25% करने के लिए सेट करते हैं, केवल थोड़ा कम कुशल एक पारंपरिक स्तंभ से है जो बराबर जुदाई दक्षता, प्रदान करते हैं। जैसे, यह मात्रात्मक डिटेक्टर रेडियल केंद्रीय बाहर निकलने के बंदरगाह से नमूना विश्लेषण करने के लिए सेट किया जा है कि महत्वपूर्ण है।

बहुसंकेतन का पता लगाने के उद्देश्य के लिए एक पीएसएफ स्तंभ की स्थापना करते हैं, कुशल और उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को प्राप्त करने के लिए किए जाने की जरूरत है कि विचारों में से एक नंबर रहे हैं; कि एक बंदरगाह के लिए ट्यूब आयाम है, चुनाव डिटेक्टर और प्रवाह समायोजन का एक प्रकार के लिए जो बंदरगाह की।

प्रत्येक बंदरगाह के लिए ट्यूब आयाम

क्रोमैटोग्राफी में पोस्ट स्तंभ ट्यूबिंग की लंबाई जुदाई की दक्षता और प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। बड़े डीईएडिटेक्टर के लिए स्तंभ आउटलेट से लंबे या विस्तृत आईडी ट्यूबिंग का एक परिणाम के रूप में डी-मात्रा दक्षता, संकल्प और संवेदनशीलता का नुकसान में परिणाम होगा। बहुसंकेतन का लाभ प्रदान whilst कुशल जुदाई प्रदान करने में अधिकतम क्षमता प्राप्त करने के लिए पीएसएफ स्तंभ की स्थापना इस प्रकार, जब उचित ट्यूबिंग आयाम उपयोग किया जाना चाहिए।

डिटेक्टर के लिए पोर्ट

चित्रा 2 मल्टिप्लेक्स का पता लगाने (अल्ट्रा वायलेट-दिखाई (यू विज़), मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) और 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) का पता लगाने) का एक उदाहरण सेटअप का एक उदाहरण है। उदाहरण केंद्रीय बंदरगाह DPPH जबकि, एमएस डिटेक्टर से जुड़ा हुआ है और यूवी विज़ डिटेक्टरों परिधीय बंदरगाहों से जुड़े होते हैं दर्शाता है। एमएस तीन के सबसे संवेदनशील डिटेक्टर है के बाद से, केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह से निर्देशित किया गया यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह। DPPH पता लगाने के रूप presenc को चयनात्मक हैएंटीऑक्सीडेंट की ई, और यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह, कम से कम संवेदनशील और बैंड विस्तार करने के लिए सबसे सहिष्णु एक परिधीय बंदरगाह से निर्देशित किया गया था। यूवी विज़ एक माध्यमिक 'सामान्य' डिटेक्टर था, इसलिए एक दूसरे परिधीय बंदरगाह से निर्देशित किया गया यह डिटेक्टर के लिए प्रवाह।

प्रवाह समायोजन

उचित ट्यूबिंग डिटेक्टर के लिए एक बंदरगाह से जुड़ी किया गया है, डिटेक्टरों में से प्रत्येक से बाहर निकलने के प्रवाह के लिए आवश्यक राशि को समायोजित किया जा सकता है। प्रत्येक डिटेक्टर से बाहर निकलने के प्रवाह की मात्रा को मापने के लिए एक आसान तरीका है समय का एक दिया अवधि में प्रत्येक बंदरगाह के माध्यम से elutes कि मोबाइल चरण की राशि वजन करने के लिए है। प्रतिशत के प्रवाह को इस प्रकार निर्धारित किया जा सकता है, और प्रवाह अनुपात को छोटा या तदनुसार पसंद का डिटेक्टरों की आवश्यकताओं के अनुरूप डिटेक्टरों पर आउटलेट लाइन से जुड़ी ट्यूबिंग लंबी या तो द्वारा समायोजित किया जा सकता है। विभिन्न डिटेक्टरों के उदाहरण के लिए, प्रवाह सेल, प्रवाह की अलग अलग आवश्यकताओं हैएक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर (FLD) दर सीमित प्रवाह नहीं है, लेकिन देखभाल प्रवाह सेल की अधिक दबाव से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। इसलिए FLD के माध्यम से प्रवाह के नियंत्रण आमतौर पर अन्य डिटेक्टरों भर में दबाव ड्रॉप और प्रवाह के शेष तो FLD से होकर गुजरता है समायोजन करके प्राप्त कर ली है। वितरित किया जाता है कि प्रवाह की मात्रा के प्रति संवेदनशील है कि एक डिटेक्टर एमएस है। आम तौर पर, वर्तमान उच्च अंत मास स्पेक्ट्रोमीटर आसानी से चारों ओर 1 से 1.5 मिलीग्राम / मध्यम जलीय मोबाइल चरण की न्यूनतम प्रक्रिया कर सकते हैं। इस प्रवाह की दर से ऊपर, स्रोत की बाढ़ एमएस निष्क्रिय कर सकता है। हालांकि, ज्यादातर मास स्पेक्ट्रोमीटर में संवेदनशीलता का पता लगाने के निचले प्रवाह दरों का उपयोग करके लाभ हुआ है; इसलिए पीएसएफ प्रवाह बंटवारे क्षमताओं एमएस का पता लगाने से जुड़े अनुप्रयोगों के लिए अत्यंत उपयोगी होते हैं। उच्च स्तंभ बड़ा प्रवाह दरों लेकिन एमएस डिटेक्टर के लिए ले जाया कम मात्रा भार के साथ, उपयोग किया जा सकता है। एमएस डिटेक्टर के लिए प्रवाह की ट्यूनिंग, तथापि, करने से पहले दबाव ड्रॉप का समायोजन करके किया जाना चाहिएएमएस डिटेक्टर, बजाय पद एमएस। दबाव आसानी से अनुचित मृत मात्रा जोड़ने के बिना समायोजित किया जा सकता के रूप में यहाँ, संकीर्ण बोर ट्यूबिंग (0.1 मिमी आईडी) का उपयोग करते हैं, बहुत उपयोगी है।

डिटेक्टर के प्रकार पर विभाजन अनुपात के समायोजन के आधार पर पूर्व या बाद या तो डिटेक्टर किया जा सकता है। ऐसे यूवी विज़ प्रयोग किया जाता है के रूप में एक गैर विनाशकारी डिटेक्टर, प्रवाह प्रतिशत मापा और पोस्ट डिटेक्टर देखते जाएगी। एक भी विनाशकारी डिटेक्टर की स्थापना मल्टीप्लेक्स में प्रयोग किया जाता है, तो प्रवाह प्रतिशत वापस अन्य बंदरगाह प्रवाह प्रतिशत करने के लिए सम्मान के साथ की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है। एक अभिकर्मक आधारित डिटेक्टर ऐसे DPPH के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, प्रवाह प्रतिशत अभिकर्मक के अलावा बिना पद डिटेक्टर मापा जाता है; दो या दो से अधिक विनाशकारी डिटेक्टरों का इस्तेमाल किया जाता है, तो प्रवाह अनुपात पूर्व डिटेक्टर मापा जाता है। डिटेक्शन अतिरिक्त उपकरण, ऐसे DPPH पड़ सकता है जो सिस्टम, प्रवाह को बदल सकता है कि अतिरिक्त प्रणाली दबाव होगाप्रतिशत एक बार पहचान प्रणाली से जुड़ी। इसलिए, सावधानी से विचार करने के लिए एक विनाशकारी डिटेक्टर की व्यवस्था के दबाव, प्रवाह प्रतिशत का समायोजन जब पूर्व डिटेक्टर के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। चाहे वे किसी भी बंदरगाहों में से किसी के माध्यम से निर्धारित किया जाता है कि प्रवाह अनुपात की, मात्रात्मक जानकारी उचित मानकीकरण के माध्यम से प्राप्त किया जाना चाहिए। प्रवाह अनुपात निर्धारित कर रहे हैं, हालांकि, वे मजबूत कर रहे हैं, और वे भी ढाल क्षालन शर्तों 7 के तहत बदल नहीं है,

इस पांडुलिपि के साथ विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल पता लगाने के एक मल्टिप्लेक्स मोड में एक पीएसएफ स्तंभ कामकाज का उपयोग करें और धुन के लिए कैसे दिखाने का इरादा है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए कई डिटेक्टरों के साथ मिलकर एक एचपीएलसी प्रणाली पर एक पीएसएफ स्तंभ का उपयोग करने के बारे में निर्देश शामिल हैं। प्रोटोकॉल पाठक संभालने क्रोमैटोग्राफी और विभिन्न एचपीएलसी पता लगाने के तरीकों में बुनियादी ज्ञान और अनुभव है लिखा गया है।

सावधानी: (मेथनॉल के लिए, यानी एमएसडीएस) उपयोग करने से पहले सभी सामग्री और अभिकर्मकों के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) को देखें। सॉल्वैंट्स और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) eluent निपटने जब सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग किया जाता है। एचपीएलसी, विश्लेषणात्मक संतुलन और डिटेक्टर इंस्ट्रूमेंटेशन इंजीनियरिंग नियंत्रण के उचित उपयोग सुनिश्चित करने, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूरी लंबाई पैंट, और बंद पैर के जूते) का उपयोग किया जाता है।

एचपीएलसी साधन 1. सेटअप

  1. लिन के लिए ultrapure पानी (जैसे, 100% मिल्ली क्यू पानी) के साथ एचपीएलसी साधन तैयारई एक और मोबाइल चरण के रूप में लाइन बी के लिए 100% मेथनॉल और निर्माता की आवश्यकता के अनुसार पंप शुद्ध करना। इस्तेमाल किया डिटेक्टरों में से एक एमएस है, तो यह यहाँ है, के रूप में, दोनों मोबाइल चरणों ए और बी के लिए 0.1% फार्मिक एसिड जोड़ने
  2. डिटेक्टर और स्तंभ के बीच मृत मात्रा कम करने के लिए इतनी के रूप में चित्रा 2 में सचित्र के रूप एचपीएलसी भूमिका निभाई घटकों और डिटेक्टरों की स्थापना की। यह कॉलम के सापेक्ष डिटेक्टरों की सुविधाजनक प्लेसमेंट की आवश्यकता है। एचपीएलसी सिस्टम विन्यास में लचीलापन वांछनीय है।

यूवी विज़ और एमएस डिटेक्टरों 2. सेटअप

  1. ब्याज का नमूना (जैसे, 280 एनएम) पर निर्भर वांछित तरंग दैर्ध्य के यूवी विज़ डिटेक्टर सेट करें।
  2. पूर्ण स्कैन पहचान पद्धति का उपयोग करते हुए कुल आयन गणना (घरेलू) के विश्लेषण के लिए सकारात्मक मोड में एमएस डिटेक्टर सेट करें। इसके अलावा तदनुसार निम्नलिखित एमएस मापदंडों को समायोजित: vaporizer तापमान 500 60 इकाइयों की दर, सहायक गैस के प्रवाह पर सेट डिग्री सेल्सियस, केशिका तापमान 350 डिग्री सेल्सियस, म्यान गैस40 और 5 इकाइयों में गैस का प्रवाह, और स्प्रे वोल्टेज 3.5 केवी झाडू। ये सेटिंग्स नमूना विश्लेषण किया जा रहा है पर निर्भर विशिष्ट उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के लिए बाद में समायोजित किया जा सकता है।

DPPH प्रणाली डिटेक्टर की 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl कट्टरपंथी (DPPH •) अभिकर्मक सेटअप की 3. तैयारी

  1. DPPH के 25 मिलीग्राम वजन और एक बड़ा फ्लास्क में मेथनॉल के 250 मिलीलीटर में भंग।
  2. DPPH अभिकर्मक को फार्मिक एसिड के 250 μl जोड़ें। प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के लिए पन्नी में कुप्पी कवर।
  3. 10 मिनट के लिए DPPH अभिकर्मक युक्त कुप्पी Sonicate।
  4. निर्माता की आवश्यकता के अनुसार तैयार DPPH अभिकर्मक के साथ DPPH पंप पर्ज।
  5. एक टी-पीस के प्रवेश करने के लिए पंप लाइन संलग्न करके चित्रा 2 के अनुसार DPPH प्रणाली की स्थापना की।
  6. वें करने के लिए एक 100 μl प्रतिक्रिया का तार संलग्नटी-पीस के ई आउटलेट और डिटेक्टर की प्रतिक्रिया कुंडली के दूसरे छोर देते हैं।
  7. और एक स्तंभ हीटर में प्रतिक्रिया का तार डिब्बे में बंद 60 डिग्री सेल्सियस के लिए स्तंभ हीटर तापमान निर्धारित किया है।
  8. 520 एनएम के लिए DPPH यूवी विज़ डिटेक्टर सेट करें।

पीएसएफ कॉलम 4. सेटअप

  1. एचपीएलसी साधन के लिए पीएसएफ स्तंभ के प्रवेश कनेक्ट करें।
  2. 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग कर, एमएस डिटेक्टर के लिए केंद्रीय पोर्ट से कनेक्ट करें।
  3. 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग यूवी विज़ डिटेक्टर के लिए एक परिधीय पोर्ट से कनेक्ट करें।
  4. 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी लंबाई का उपयोग कर DPPH पहचान प्रणाली की टी-टुकड़े करने के लिए एक और परिधीय पोर्ट से कनेक्ट करें।
  5. एक स्तंभ डाट का उपयोग कर अप्रयुक्त परिधीय बंदरगाह ब्लॉक।
  6. 1 मिलीलीटर मिनट के लिए एचपीएलसी पंप के प्रवाह की दर लाओ -1 100% रेखा B में - 100% मेथनॉल (0.1% फार्मिक एसिड)।
  7. 100% मेथनॉल मोबाइल पीएच के साथ स्तंभ संतुलित करनाएक 4.6 मिमी आईडी x 250 मिमी लंबाई स्तंभ के लिए 20 मिनट के लिए एएसई। इस बार उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं अन्य स्तंभों के आयामों के अनुसार बढ़ाया है।

5. मल्टिप्लेक्स जांच के लिए पीएसएफ कॉलम ट्यूनिंग

  1. कम से कम दो खाली संग्रह वाहिकाओं एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग (DPPH डिटेक्टर के लिए यूवी विज़ डिटेक्टर और एक से जुड़ा बंदरगाह के लिए एक) की बड़े पैमाने पर मापने।
  2. दो अलग-अलग, पूर्व तौला संग्रह वाहिकाओं (5.1) में यूवी विज़ और DPPH बंदरगाहों से मोबाइल चरण ले लीजिए। संग्रह के लिए समय की अवधि के रिकॉर्ड। प्रत्येक पोत में विलायक के कम से कम 500 मिलीग्राम ले लीजिए।
  3. संग्रह वाहिकाओं वजन और मोबाइल चरण के द्रव्यमान का निर्धारण। 0.791 ग्राम मिलीलीटर -1 मेथनॉल के घनत्व को देखते हुए, एक बंदरगाह से एकत्र मोबाइल चरण की मात्रा का निर्धारण।
  4. अंतर से, वह यह है कि नाममात्र पंप सेट प्रवाह की दर शून्य से DPPH के माध्यम से प्रवाह दर और यूवी विज़ detectoआर प्रवाह बंदरगाहों, एमएस डिटेक्टर लिए प्रवाह दर को निर्धारित करते हैं। कुल प्रवाह का एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक प्रवाह अनुपात व्यक्त करते हैं।
    नोट: आदर्श रूप में, प्रवाह प्रतिशत हैं: एमएस कुल प्रवाह की दर के 18% है, यूवी विज़ 22% करने के लिए, DPPH डिटेक्टर 60% करने के लिए।
  5. यदि नहीं, तो यूवी विज़ डिटेक्टर पर वापस दबाव बदलकर प्रवाह प्रतिशत समायोजित। यूवी विज़ के लिए प्रवाह बहुत अधिक है, तो उदाहरण के लिए, यूवी विज़ डिटेक्टर के आउटलेट के लिए 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी खंड जोड़ जोड़कर अनुपात में कमी। फिर 5.5 करने के लिए कदम 5.1 दोहराएँ।

6. अंतिम सेटअप शर्तें

  1. DPPH डिटेक्टर से जुड़ा आउटलेट बंदरगाह बाहर निकलने एक ही प्रवाह दर को DPPH अभिकर्मक पंप के प्रवाह की दर निर्धारित किया है।
    नोट: यूवी विज़ के साथ मल्टिप्लेक्स पीएसएफ स्तंभ, DPPH और एमएस अब विश्लेषण के लिए तैयार है।

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Representative Results

एक मल्टिप्लेक्स एचपीएलसी विश्लेषण पीएसएफ मोड (चित्रा 1) में एक पिछाड़ी स्तंभ का उपयोग किया जाता है और चित्रा 2 में सचित्र के रूप में स्थापित किया गया था। इस प्रकार की स्थापना एक कॉफी नमूना कुल में यूवी विज़, DPPH और एमएस का उपयोग कर एक साथ विश्लेषण किया जा करने की अनुमति दी आयन गणना (घरेलू) मोड। चित्रा 3 में सचित्र के रूप chromatograms एक साथ दर्ज किए गए थे, के बाद से अवधारण समय के संरेखण पर आधारित घरेलू प्रतिक्रियाएं - DPPH करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की है कि कॉफी के नमूने के यौगिकों तो आसानी से यूवी विज़ और एमएस करने के लिए मिलान किया जा सकता है। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया एमएस-टिक डिटेक्टर से देखा था, जहां चोटी के आणविक जन DPPH चोटियों की अवधारण समय सारणी। 1 सूचियों दर्ज की गई है, और यूवी विज़ और / या एमएस में इस तरह की चोटियों की प्रतिक्रिया थी इस प्रकार आणविक जन प्रदान की डिटेक्टर, जो। वायुसेना के लिए अनुमति दी अलग पहचान प्रक्रियाओं के बीच चोटियों मिलान में आसानीएक जटिल नमूने के लिए स्क्रीनिंग और लक्षण के एएसटी और अधिक कुशल फार्म, जैसे कॉफी।

आकृति 1
चित्रा 1. एक पारंपरिक स्तंभ की तुलना में सक्रिय फ्लो प्रौद्योगिकी स्तंभ की एक छवि। पिछाड़ी स्तंभ एक नमूना बैंड के रेडियल पार अनुभाग भर में चोटी के नमूने को सक्षम करने कुंडलाकार मिलाना कि घरों में एक चार बंदरगाह आउटलेट फिटिंग के साथ फिट है। देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्र 2
DPPH •, यूवी विज़ और एमएस डिटेक्टरों के साथ एक पीएसएफ स्तंभ का उपयोग चित्रा 2. एक मल्टिप्लेक्स एचपीएलसी व्यवस्था का एक उदाहरण चित्रण,। प्रत्येक detecto आर एक अलग आउटलेट बंदरगाह से जुड़ा हुआ है। इस मामले में एमएस मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाता है और रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह से नमूना एकत्र करने के लिए निर्धारित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. DPPH •, यूवी विज़ और एमएस डिटेक्टरों के साथ एक पीएसएफ स्तंभ का उपयोग कर एक मल्टिप्लेक्स HPLC प्रणाली के माध्यम से विश्लेषण एक कॉफी नमूने की chromatograms,: 520 एनएम (क) DPPH, (ख) यूवी विज़ 280 एनएम, (ग ) एमएस - घरेलू। प्रत्येक डिटेक्टर का पता लगाने के समय में पूरी तरह से संयोग है, तो कोई ऑफसेट समायोजन प्रत्येक डिटेक्टर के बीच मृत समय के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आवश्यक है।arget = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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कॉफी DPPH पीक प्रतिक्रिया और जनसंचार
DPPH पीक अवधारण समय DPPH यूवी विज़ एमएस - घरेलू रिस्पांस सामूहिक
(न्यूनतम) प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया
1 6.74 हाँ हाँ हाँ 123.84
2 </ टीडी> 7.54 हाँ हाँ हाँ 125.83
3 8.94 हाँ नहीं नहीं -
4 10.05 हाँ नहीं हाँ 135.83
5 13.15 हाँ नहीं नहीं -
6 1,622 हाँ नहीं नहीं -
7 18.14 हाँ हाँ हाँ 126.82
8 19.4 हाँ हाँ हाँ 162.81
9 20.46 हाँ हाँ हाँ 187.89
10 24.71 हाँ हाँ हाँ 162.81
11 26.27 हाँ हाँ हाँ 162.8
12 26.97 हाँ हाँ हाँ 194.87
13 31.84 हाँ हाँ हाँ 162.8
14 32.02 हाँ हाँ हाँ 162.78
15 32.56 हाँ हाँ हाँ 176.82
16 33.94 हाँ हाँ हाँ 176.83
17 41.26 हाँ हाँ नहीं -
18 42.72 हाँ नहीं हाँ 284.93
19 46.07 हाँ हाँ हाँ 190.83
20 49.21 हाँ हाँ हाँ 162.75

तालिका एक। टिक - रोंग> पता चला DPPH यूवी विज़ और एमएस के जवाब चोटियों।

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Discussion

इस अध्ययन के लक्षण और मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए एक समानांतर खंडों प्रवाह (पीएसएफ) स्तंभ को रोजगार के साथ HPLC का उपयोग कॉफी की रूपरेखा शामिल है। पीएसएफ स्तंभों का उपयोग मल्टिप्लेक्स एचपीएलसी यह पारंपरिक बहु का पता लगाने प्रक्रियाओं का उपयोग कर लेता है समय का एक अंश के भीतर अणु-विशिष्ट जानकारी का एक बड़ा डिग्री प्राप्त करने whilst के नमूने के डेटा जटिलता को कम करने से कुंजी रासायनिक संस्थाओं के लक्षण वर्णन और पहचान सक्षम बनाता है। पीएसएफ स्तंभ मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए एक मंच की अनुमति देता है, लेकिन न केवल भी अतिरिक्त मृत मात्रा और ट्यूबिंग के बिना दोनों विनाशकारी और गैर विनाशकारी डिटेक्टरों का संयोजन,। DPPH •, यूवी विज़ और एमएस (घरेलू) एस्प्रेसो कॉफी के विश्लेषण के लिए मल्टिप्लेक्स थे।

एक 4-बंदरगाह पीएसएफ स्तंभ तीन अलग-अलग डिटेक्टरों का उपयोग कॉफी का मल्टिप्लेक्स के विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। पीएसएफ स्तंभ आउटलेट के केंद्रीय बंदरगाह thre के एमएस डिटेक्टर और दो से जुड़ा थाई परिधीय बंदरगाहों एक DPPH पहचान प्रणाली या एक यूवी विज़ डिटेक्टर या तो से जुड़े थे। तीसरे उपलब्ध परिधीय बंदरगाह का इस्तेमाल किया है और इसलिए एक स्तंभ डाट के साथ अवरुद्ध नहीं था, लेकिन इस नमूने के संग्रह के लिए प्रयोग किया जाता है, या किसी अन्य डिटेक्टर के लिए किया जा सकता था। इस मल्टिप्लेक्स सेट अप की ट्यूनिंग प्रक्रिया विभाजन प्रवाह की माप यूवी विज़ और DPPH पता लगाने प्रणालियों के लिए पोस्ट-डिटेक्टर हुई जहां डिटेक्टर, के लिए विशिष्ट था। एमएस एक विनाशकारी डिटेक्टर है, प्रवाह प्रतिशत अंतर (कुल नाममात्र प्रवाह घटा अन्य आउटलेट बंदरगाहों से प्रवाह) द्वारा निर्धारित किया गया था।

इस अध्ययन में, DPPH अभिकर्मक के साथ कॉफी विश्लेषण भी यूवी विज़ और एमएस डिटेक्टरों में एक प्रतिक्रिया से पता चला है 13 है, जिनमें से 20 अच्छी तरह से हल चोटियों में हुई। 3 प्रत्येक डिटेक्टर से प्राप्त chromatograms तुलना चित्रा। प्रत्येक के भीतर ही क्रोमेटोग्राफिक प्रोफ़ाइल है कि चार क्षेत्रों रहे हैंलाल बक्से ने संकेत दिया वर्णलेख। विस यूवी और एमएस इन यौगिकों के लिए बहुत कम प्रतिक्रिया से पता चला है जहां इन बक्सों में, DPPH डिटेक्टर से एक मजबूत प्रतिक्रिया नहीं थी। DPPH अभिकर्मक को जवाब दिया कि चार घटकों यूवी विज़ या एमएस डिटेक्टरों द्वारा या तो पता लगाया है और DPPH अभिकर्मक को जवाब दिया कि घटकों के तीन सब पर कोई यूवी विज़ या एमएस प्रतिक्रिया दी नहीं थे। एमएस करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की है कि घटकों के आणविक जन तालिका 1 में दर्ज की गई हैं। 10 मिनट पर eluted कि घटक एक मजबूत DPPH प्रतिक्रिया थी, यूवी विज़ डिटेक्टर से कोई जवाब नहीं और एमएस डिटेक्टर से केवल एक बहुत छोटा प्रतिक्रिया के साथ ।

पीएसएफ मोड में एक पिछाड़ी स्तंभ के युग्मन की परवाह किए बिना एचपीएलसी डिटेक्टर की सभी आवश्यकताओं का पता लगाने के इस जटिल samp का एक इंजेक्शन और जुदाई में एक साथ चला गया, जहां मल्टिप्लेक्स मोड, में कई डिटेक्टरों को चलाने के लिए अवसर दे दियाLe। पिछाड़ी स्तंभ प्रत्येक पता लगाने के मोड के बीच घटकों के काम में विस्तृत नमूना जानकारी और पूर्ण विश्वसनीयता उपज बहुसंकेतन का पता लगाने की प्रक्रिया के लिए अवसर प्रदान करने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है की बहु बंदरगाह फिटिंग डिजाइन खत्म होता है। पीएसएफ कॉलम के साथ मल्टिप्लेक्स का पता लगाने नमूना जानकारी, एक भी डिटेक्टर के लिए आवश्यक रन समय के भीतर एक साथ संचालित तीन डिटेक्टरों की एक बड़ी राशि प्रदान की है। प्रत्येक पता लगाने के मोड के भीतर चोटियों की अवधारण समय की सटीक मैच संभव था। इस्तेमाल किया डिटेक्टरों की दो विनाशकारी डिटेक्टरों थे।

एक पीएसएफ स्तंभ की बहुसंकेतन क्षमताओं, तथापि उपलब्ध एचपीएलसी भूमिका निभाई घटकों और पता लगाने के उपकरण द्वारा सीमित है। तकनीक कई तरीकों का पता लगाने और पता लगाने की एक विशिष्ट विधा के लिए आवश्यक Add-ons, यानी, पंप, प्रतिक्रिया कॉयल, हीटर आदि एक पीएसएफ स्तंभ का उपयोग बहुसंकेतन का पता लगाने के प्राथमिक लाभ रिडक्शियो है की आवश्यकता हैn द्वारा विश्लेषण के समय में पता लगाने के लिए प्रत्येक एकल मोड के लिए विश्लेषण के बीच नमूना परिवर्तनशीलता जो कम से कम चार गुना (4 डिटेक्टरों का इस्तेमाल किया जाता है), पर निर्भर है। इसके अलावा, दूसरे के लिए एक डिटेक्टर से पता चला नमूना भीतर घटक रिश्तों को बताए दूर सरल, और प्रत्येक डिटेक्टर अलग से कार्यरत थे तुलना में अगर कम त्रुटि की संभावना है। यह अक्सर जटिल नमूनों के विश्लेषण में एक समस्या है, जो घटक असाइनमेंट में बेमेल से बचा जाता है।

यहां यह जुदाई दक्षता इसलिए, शिखर टेलिंग प्रभाव कम कर रहे हैं और मात्रा का ठहराव इस प्रकार सबसे सटीक है, सबसे ज्यादा है कि जब से मात्रा का ठहराव रेडियल केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह पर स्थित डिटेक्टर के आधार पर किया जाना चाहिए दोहराना के लिए महत्वपूर्ण है। प्रवाह विभाजन विश्लेषण के माध्यम से मजबूत होना दिखाया गया है, लेकिन फिर भी, यह नियमित रूप से मानकीकरण बनाए रखने के लिए अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास है। इसलिए किसी भी मात्रात्मक काम में यह रूप में उपयुक्त मानकों को चलाने के लिए महत्वपूर्ण है। एक डिटेक्टर शुद्ध किया जाता हैLy नमूना घटक के दृश्य चित्रण के माध्यम से नमूना जटिलता को समझने का एक साधन के रूप में, मात्रा का ठहराव यहां एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया का पता लगाने के प्रोटोकॉल के लिए मामला है, आवश्यकता नहीं जा सकता।

हम यहाँ ट्रिपल का पता लगाने, यूवी, एमएस और एंटीऑक्सीडेंट उत्तरदायी पता लगाने का एक उदाहरण का प्रदर्शन किया है। पिछाड़ी स्तंभों का उपयोग मल्टिप्लेक्स का पता लगाने प्रणालियों एक विश्लेषकों बहुआयामी नमूना जानकारी की आवश्यकता है, जहां लगभग किसी भी स्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है और यह कई का पता लगाने प्रोटोकॉल शामिल है। बहुत आसान बनाने और नमूना अभिलक्षण की प्रक्रिया को गति देगा पिछाड़ी कॉलम का उपयोग करना।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

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References

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