علاج الفئران SCA1 مع للذوبان في الماء المركبات لغير وجه التحديد زيادة وظيفة الميتوكوندريا

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا هاما في عملية الشيخوخة والأمراض العصبية بما في ذلك عدة الرنح النخاعي المخيخي وراثية وغيرها من اضطرابات الحركة تميزت الضمور التدريجي من المخيخ. والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم ضعف الميتوكوندريا في مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) وتقييم فعالية استهداف الدوائية التنفس الأيض عن طريق مركب حمض السكسينيك للذوبان في الماء لإبطاء تطور المرض. هذا النهج هو الذي ينطبق على أمراض المخيخ الأخرى، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة من العلاجات للذوبان في الماء.

يستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لكشف وتحديد التغيرات المرتبطة المرض في وظيفة الميتوكوندريا. مع الدليل الجيني الوراثي (بيانات غير منشورة) والأدلة البروتين من ضعف الميتوكوندريا في نموذج SCA1 الماوس، نحن تقييم فعالية العلاج مع ذوبان في الماء الأيض الداعم الصورةحمض uccinic عن طريق إذابة هذا المركب مباشرة في مياه الشرب المنزلية القفص. قدرة المخدرات لتمرير حاجز الدم في الدماغ يمكن استخلاصه باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). فعالية هذه المركبات يمكن أن يكون من الممكن اختبارها باستخدام نماذج سلوكية متعددة بما في ذلك rotarod تسريع والتوازن اختبار شعاع وتحليل البصمة. سلامة Cytoarchitectural من المخيخ يمكن تقييم باستخدام المقايسات المناعي التي تكشف عن نوى الخلايا العصبية والتشعبات الخلية العصبية وسوما. وهذه الأساليب هي أساليب قوية لتحديد الخلل الميتوكوندريا وفعالية العلاج مع مركبات قابلة للذوبان في الماء في أمراض الاعصاب المخيخ.

Introduction

الميتوكوندريا هي المنتجين الرئيسيين للالأدينوساين ثلاثي (ATP)، وهو أنزيم أساسي للطاقة الخلوية، مع غالبية ATP الميتوكوندريا تنتج من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) باستخدام سلسلة نقل الإلكترون. الدماغ، نظرا لمطالب الأيض عالية واعتمادها على الفسفرة التأكسدية لتوفير الطاقة النشاط العصبي، هو عرضة للضعف الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، يتم تشغيل ضعف الميتوكوندريا أثناء عملية الشيخوخة 1 والمتورطين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية 4. وبالتالي، فإنه يترتب على ذلك أن الميتوكوندريا هي الأهداف العلاجية جذابة للالتنكس العصبي.

في هذا البروتوكول، الذي اعتمدناه استخدام مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) بأنه مرض الاعصاب نموذجي لدراسة الميتوكوندرياضعف لتر وتطوير علاجات تستهدف الميتوكوندريا. ويتسبب SCA1 عن طفرة polyglutamine (polyQ) تكرار التوسع في الجين المنتج ataxin-1 الذي يؤدي التنكس التدريجي للخلايا العصبية العصبية في المخيخ والخلايا العصبية من مناطق أخرى من الدماغ. خط المعدلة وراثيا الماوس المستخدمة هنا (تسمى الماوس SCA1)، الذي يعبر عن ataxin-1 التحوير-polyQ متحولة تحت سيطرة أحد المروجين محددة العصبية خلية، يسمح لتحليل المستهدفة من عنصر العصبية خلية من SCA1 5. الفئران SCA1 تخضع تدريجيا انحطاط الخلايا العصبية وتطوير مشية اانتظامية 6.

اختلال وظيفي معقد الميتوكوندريا والتي تستهدف الميتوكوندريا العلاج فعالية يمكن تقييمها مع بطارية من المقايسات الجزيئية والسلوكية. يتم قياس الخلل معقدة الميتوكوندريا خارج الجسم الحي بواسطة فحوصات التنفس التي تكشف عن استهلاك الأوكسجين تغير في أنسجة دماغ في حالةوجود ركائز سلسلة نقل الإلكترون ومثبطات 7. سبق استخدامها فحوصات التنفس مع الأنسجة permeabilized، العزلات الميتوكوندريا، والنسيج كله 7 و 8 و 9. أنها تسمح للتقييم المباشر وظيفة الميتوكوندريا على عكس طرق جمع البيانات المورفولوجية مثل المجهر الإلكتروني النافذ أو تلطيخ المناعي. استخدام النسيج كله بدلا من الميتوكوندريا معزولة يمنع اختيار منحازة الميتوكوندريا الصحية التي قد تحدث أثناء عملية عزل 7. عندما تكييفها وفقا لبروتوكول كما هو موضح، وفحص التنفس هو طريقة قيمة للكشف عن ضعف الميتوكوندريا في الحالات المرضية العصبية للدماغ.

المنشطات غير محددة من عملية التمثيل الغذائي يمكن أن تستخدم للاستدلال ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الامراض العصبيةه والمساعدة في تطوير علاجات جديدة. كلها قد أظهرت كيرسيتين، أنزيم Q10 والكرياتين لتحسين علم الأمراض العصبية التنكسية في المرضى وفي النماذج الحيوانية من مرض الاعصاب 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. هنا نقدم منشط الأيض الرواية، وحمض السكسينيك، لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية. للتأكد من أن المنشط هو عبور حاجز الدم في الدماغ، كان يعمل HPLC للكشف عن تسليمها إلى الأنسجة العصبية في الفئران التي عولجت 17.

لتقييم الآثار العلاجية من المياه المستهدفة عملية الأيض المركبات القابلة للذوبان مثل حمض السكسينيك، وبطارية من النماذج السلوكية والدراسات immunopathological يمكن استخدامها. دووتستخدم البريد إلى عجز في التنسيق الحركي وجدت في أمراض المخيخ الاعصاب، البصمة المدرج الفحص، شعاع الفحص وتسريع الدورية فحص قضيب للكشف عن إنقاذ علم الأمراض السلوكية 6 و 18 و 19. وتستكمل هذه الإجراءات مع تقييم immunopathological من التهندس الخلوي للدماغ من خلال تقييم سمك طبقة الجزيئية (كما هو موضح العصبية خلية شجيري طول الشجرة) والعصبية تعداد خلايا سوما ضمن فصيص محددة من الأنسجة المخيخ 6 و 20 و 21. هنا نقدم عدة طرق عصبية مرضية والسلوكية للكشف وعلاج ضعف الميتوكوندريا مع المركبات القابلة للذوبان المياه المستهدفة عملية الأيض.

نحن نستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لتحليل ضعف الميتوكوندريا في تران SCA1الماوس sgenic. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن أعراض المرض وعلم الأمراض وتحسن من الميتوكوندريا حمض معززة السكسينيك للذوبان في الماء، مما يزيد من تورط ضعف الميتوكوندريا في تطور المرض SCA1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية IACUC في كلية سكيدمور للعمل مع الفئران.

1. المعاملة مع المركبات للذوبان في الماء

  1. حل حمض السكسينيك إلى تركيز 0.75 ملغ / مل في مياه الشرب القفص. لاحظ أن أي مركب للذوبان في الماء من الفائدة في التركيز المطلوب يمكن أن تكون بديلا في هذه المرحلة. يحرك الحل للتأكد من أن المركب يذوب تماما.
  2. بعد الفئران تصل إلى سن المرجوة من العلاج، واستبدال مياه الشرب المنزلية قفص من المجموعة شرط المعاملة مع الحل في الخطوة 1.1.
  3. قياس وزن كل من العلاج والسيطرة زجاجات المياه جماعة يوميا لضمان أن كلا من المعالجة والسيطرة على الفئران وشرب نفس الكمية من المياه. استخدام هذه القياسات لحساب مجموع جرعة الدواء في قفص. مواصلة العلاج في كافة مراحل التجربة ومراقبة الوزن زجاجة.

2. تحليل البصمة

  1. وضع المدرج على الأرض أوعلى طاولة في غرفة المحصورة. تعيين المدرج في زاوية بزيادة طفيفة نحو مربع المنزل واصطف مع الفراش ومكافأة الغذائية (مثل الحبوب السكرية). خط طول المدرج مع ورقة بيضاء. السماح للموضوع حتى يتأقلم في مربع المنزل لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة موضوع من مربع المنزل وطلاء قدميه الخلفيتين اليسار واليمين، على التوالي، مع الطلاء المستندة إلى الماء الأزرق والأحمر غير سامة. وسوف تستخدم طباعة الطلاء لحساب المخرجات المتعددة القياسات السلوكية.
  3. ضع هذا الموضوع في بداية المدرج والسماح موضوع سيرا على الأقدام إلى المربع المنزل. مرة واحدة وصلت موضوع مربع المنزل، وأغلق الباب فخ، والسماح للموضوع للبقاء ضمن مربع المنزل لمدة دقيقة واحدة قبل أن يعود إلى قفص المنزل المعني. تنظيف مربع المدرج ومنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الفراش، ومكافأة الغذائية، والورق المدرج في الموضوع التالي.
  4. تحديد عدد من الخطوات، عرض البوابة، زاوية الخطوة، وعدد من الأدوار التي اتخذتحسب الموضوع وفقا للأساليب التحليلية التي سبق وصفها 6. يتم تعريف محاكمة بصمة نجاح كحد أدنى من 5 أقدام متتابعة في هذا الموضوع الذي يسير نحو المربع الهدف دون الدوران في المكان أو توقف.

3. تحليل الشعاع

  1. إعداد جهاز شعاع وفقا للمواصفات عبر شريط الموصوفة سابقا 6 مع 6 الحزم التالية: شعاع 1 = مستطيل، عرض 28 مم؛ شعاع 2 = الجولة 28 ملم قطر. شعاع 3 = مستطيل، عرض 12 مم؛ شعاع 4 = الجولة، مم 12؛ شعاع 5 = مستطيل، عرض 6 مم؛ شعاع 6 = الجولة، مم 6. في نهاية واحدة من الحزم، وإنشاء صندوق منزل مظلمة مع الطعام مكافأة.
  2. لتدريب المواضيع المدرجة على شعاع، تجميع الجهاز مع شعاع 3. وضع بلطف الموضوع على نهاية شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح الموضوع إلى السير عبر. يسمح لكل موضوع ما يصل الى ثلاث محاكمات 2 دقيقة لتحقيق مسيرته الناجحة، الذي يعرف بأنه عبور شعاع ودخول المربع الوطن في غضون 2 دقيقة. في بين التجارب، والسماح للبقية الموضوع في المربع المنزل لمدة 2 دقيقة. بين الموضوعات، تنظيف مربع شعاع والمنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا للموضوع القادم.
  3. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة في اليوم لمدة اليومين المقبلين مما أدى إلى ما مجموعه 3 أيام تدريبية متسلسلة. اليوم اختبار، يوم 4، يجب أن تتبع بالتسلسل أيام التدريب.
  4. لاختبار المواد في يوم 4، أولا تجميع الجهاز مع شعاع 1 و إعداد مربع المنزل كما هو موضح في الخطوة 3.1. وضع كاميرا فيديو أمام الجهاز والتحقق من أن الجهاز شعاع الكامل يمكن التقاط صور واضحة في الفيديو. بدء التسجيل ووضع موضوعك الأول على شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح لتصل إلى 3 محاولات 2 دقيقة لإكمال محاكمة بنجاح. في بين التجارب، والسماح تخضع لبقية لمدة 2 دقيقة في المربع المنزل.
  5. مواصلة اختبار الموضوع على كل من الحزم ستة في الترتيب العددي،يسمح هذا الموضوع للراحة لمدة 2 دقيقة في مربع المنزل قبل البدء في شعاع المقبل. بين الموضوعات، تنظيف كل شعاع ومربع المنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا لكل موضوع.
    1. شريط فيديو كل محاكمة وتسجيل عدد من التجارب الناجحة في الموضوع في شعاع كما يلي: "1" يشير إلى أن موضوع ناجحة في المحاكمة الأولى، "2" تشير كان موضوع ناجحة في المحاكمة الثانية، "3" يشير إلى أن هذا الموضوع النجاح في المحاكمة الثالثة والأخيرة، و"4" يشير إلى أن هذا الموضوع لم يكن ناجحا في أي من التجارب الثلاث.
  6. استخدام تسجيلات الفيديو من footslips المحاكمات التدبير الهدافين الذين أعمى لظروف تجريبية من هذا الموضوع. تحديد footslip كما مؤخر القدم التي هي في إطلالة مباشرة على غمس الكاميرا دون خط الوسط النظري عبر طول شعاع. متوسط ​​درجات footslip من الهدافين متعددة.
  7. تحليل عدد من لياليالمحاكمات uccessful وعدد من البيانات footslips، حساب المتوسط ​​والخطأ المعياري في كل الوراثي وحالة تجريبية الفوج. إجراء في اتجاه واحد أنوفا ومقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لتحديد ما إذا كان هناك تأثير للعلاج وراثي على عدد من التجارب الناجحة وعدد من footslips.

4. تسريع Rotarod

  1. تأقلم المواضيع إلى دقيقة غرفة فحص 10 قبل بدء المحاكمة. خلال هذه الفترة التأقلم، وإعداد جهاز rotarod، وتنظيف كل حارة من الجهاز مع 30٪ من الإيثانول.
  2. فتح البرنامج rotarod ويحدد بداية الإعدادات إلى 4 دورة في الدقيقة، وإعدادات تسارع إلى 5 إعدادات دقيقة والسرعة النهائية إلى 40 دورة في الدقيقة. توفر هذه الإعدادات في تسارع مستمر 4-40 دورة في الدقيقة على مدى فترة من 5 دقائق. يمكن أن تبقى الفئران على rotarod في 40 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق إضافية إلى ما بعد فترة تسارع لطول المدى الأقصى لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد التأقلم، والموضوعات مكان سn إلى rotarod في الممرات التابعة لها، فيما قضيب يدور في 4 دورة في الدقيقة. مرة واحدة كل المواضيع التي هي في الممرات الخاصة بهم، بدء المحاكمة الأولى. تسجيل الكمون في الانخفاض باستخدام برنامج الصك؛ جهاز توقيت الثانوي يمكن استخدامها على سبيل الاحتياط.
  4. بعد إتمام المحاكمة، والسماح لكل مادة للراحة في الخزانات حارة كل منها لمدة عشر دقائق قبل المحاكمة المقبلة لمنع التعب.
  5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 ليصبح المجموع أربعة المحاكمات.
  6. كرر الخطوات من 4،3-4،5 ليصبح المجموع أربعة أيام متتالية، مواصلة العلاج طوال فترة المحاكمة. عند الانتهاء، تحديد الكمون لتسقط من على قضيب الدورية لكل محاكمة في موضوع (6).

5. مخيخي استخراج والتثبيت

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق الخنق ثاني أكسيد الكربون وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المؤسسية. وضع الموضوع في غرفة غاز ثاني أكسيد الكربون، وإطلاق ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. راقبالحيوان في جميع الأوقات خلال الخطوة القتل الرحيم ولا تترك الحيوان غير المراقب.
  2. مرة واحدة لم يعد التنفس وتظهر المواضيع لا الإحساس بالألم المتبقية ضغط القدم الخلفية، وإزالة موضوع من الغرفة وجعل شق خط الوسط متفوقة من خلال الأنسجة الطلائية من منتصف الجمجمة caudally إلى قاعدة الجمجمة من خلال الأنسجة الطلائية.
  3. باستخدام مقص تشريح، وقطع الجمجمة من القاعدة في الحبل الشوكي من خلال الدرز السهمي إلى bregma. قطع أفقيا من خلال كل الدرز الإكليلي قبل سحب قبالة أمامي، والجداري الجداريين العظام باستخدام ملقط حادة.
  4. استخدام الملقط حادة لقطع جانبي العظم لالمخيخ. استخدام ملقط لفصل المخيخ من أكيمات والدماغ وقذف عن باقي الأنسجة. فصل المخيخ في نصفي الكرة اليمين واليسار مع ملقط.
  5. المكان على الفور المخيخ الأيمن في النيتروجين السائل لانقاذ لHPLC آناتحلل والمخيخ اليسرى في قبل المبردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لتثبيت الأنسجة. حصاد أي نوع من الأنسجة الأخرى ذات الاهتمام قبل قطع الشريان الأورطي والتخلص من الجثة وفقا لقواعد IACUC المؤسسية.
    تنبيه: PFA هو شديدة السمية، قابلة للاشتعال، وتآكل.
  6. أربع وعشرين ساعة بعد القلع، وغسل الأنسجة الثابتة في PFA (4٪ في برنامج تلفزيوني) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (ثلاث مرات، 5 دقيقة / غسيل) قبل وضع الأنسجة في 30٪ سكروز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

6. الباثولوجيا المناعية الفحص

  1. إرفاق أنابيب من مشراح ثقيلة لصنبور المغسلة ومربع التحكم في درجة الحرارة. استخدم مربع التحكم في درجة الحرارة لتبريد المرحلة مشراح إلى -25 درجة مئوية. ضبط قرص سمك باجتزاء إلى 50 ميكرون.
    ملاحظة: إذا كان الطلب على مشراح زلاجة لا تصل إلى 50 ميكرون، تعيين الطلب إلى إعداد أرق ومضاعفة سمك من خلال التحول الإعداد وفقا لذلك (على سبيل المثال تعيين دالاتحاد العالمي للتعليم إلى 10 ميكرون وتحويل خمس مرات قبل باجتزاء لسمك ما مجموعه 50 ميكرون).
  2. ربت جزء بحجم الدايم من الأمثل درجة الحرارة قطع (OTC) حل على خشبة المسرح. قبل تجمد OTC، واستخدام الملقط لوضع نصف الكرة الأرضية بحيث سطح قطع منتصف السهمي هو وجهه لأسفل على طبقة OTC. العمل بسرعة، وتوجيه بلطف الأنسجة مع ملقط بحيث يتم أشار غيض الوحشي من نصف الكرة نحو النصل، متفوقة على خشبة المسرح. السماح للOTC لتجميد تماما.
    1. العمل في الطبقات، يضيف إضافية OTC حول الأنسجة السماح للOTC لتجميد تماما قبل إضافة الطبقة التالية. إضافة طبقة رقيقة من OTC على أعلى من الأنسجة والتجميد.
  3. قسم الأنسجة، توزيع متساو وزن الجسم على شفرة القطع في حين باجتزاء. جمع المقاطع باستخدام الفرشاة الفنان الجميلة والمكان إلى لوحة جيدا وصفت بشكل مناسب يحتوي على برنامج تلفزيوني 1X. بين أقسام، إعادة تعيين سمك القطع علىالزلاجة الطلب مشراح، إذا لزم الأمر، إلى 50 ميكرون.
  4. استبدال برنامج تلفزيوني في كل بئر من لوحة جيدا مع محلول اليوريا [0.01 م اليوريا في برنامج تلفزيوني] ووضع لوحة على الجليد. عندما تصبح جاهزة، وإزالة لوحة من الجليد ويغلي المقاطع في محلول اليوريا ثلاث مرات لمدة 15 ثانية في كل مرة لكشف الحواتم لimmunolabeling. هذه الخطوة يمكن أن يتحقق بسهولة عن طريق وضع لوحة على كتلة التدفئة المقرر أن درجة حرارة الغليان. بين كل خطوة المغلي، تبرد لوحة تحتوي على أقسام الأنسجة على الجليد.
    ملاحظة: إذا كان أداء اليوريا، ومنع، الأجسام المضادة الأولية، الضد الثانوية والخطوات دابي في لوحة 96-جيدا، استخدم 100 مجلدا ميكرولتر طوال الوقت. إذا تم استخدام بئر مختلفة الحجم، وضبط كميات كاشف وفقا لذلك. بدلا من كتلة التدفئة وميكروويف يمكن أن تستخدم لغلي عينات الأنسجة في اليوريا. عينات الميكروويف على ارتفاع الطاقة وضع لمدة ثلاثة 15 ثانية فترات.
  5. غليان ما بعد، وغسل أقسام ثلاث مرات، في كل مرة إزالة الحل الحالي ليحل محل الحلمع 1X برنامج تلفزيوني وتهييج لمدة 10 دقيقة.
  6. أقسام كتلة مع حل حمار مصل (3٪ الحمار العادي المصل، 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) التي يحتضنها الأنسجة في مصل الدم لمدة ساعة واحدة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل المصل حمار.
  7. أقسام التسمية مع 0.2 ميكروغرام / مل مكافحة calbindin و 1: 2000 لمكافحة ataxin-1 الأجسام المضادة (11NQ) 16 في محلول المصل حمار واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة مع الإثارة لطيف.
  8. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل احتضان المقاطع في الضد الثانوية المناسب (1: 500 اليكسا فلور-488 المضادة للماعز و 1: الأجسام المضادة 500 اليكسا فلور-594 المضادة للأرنب مخففة في حل المصل حمار) في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة مع الإثارة لطيف.
  9. غسل أقسام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل نوى وسم الخلية مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindol) محلول مخفف إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. يجب أن لا يتجاوز دابي حضانة عشر دقائق. إزالة محلولن ويغسل مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5.
  10. جبل الأنسجة على 2٪ الشرائح المغلفة الجيلاتين مع تصاعد المتوسطة للحد من photobleaching من. ساترة وختم بطلاء الأظافر.
  11. مع المجهر متحد البؤر تحديد الشق الأساسي من المخيخ تحت ضوء brightfield. مع هدف 10X UIS2 والمسح الضوئي وبالتتابع تثير دابي، AlexaFluor-488 و AlexaFluor-594 القنوات باستخدام ليزر ديود 405 نانومتر، وهو 488 نانومتر ليزر غاز الأرجون و559 نانومتر ليزر ديود، على التوالي، بالتعاون مع DM488 / 559 نانومتر مزدوج اللون شعاع الخائن. فصل وجمع الضوء المنبعث باستخدام SDM490 وSDM560 مقسم الأشعة ومرشح BA575-675 ممر الموجة، على التوالي.
    1. لكل قناة، بناء ض المكدس داخل الشق الأساسي مع ض = 20 ميكرون وخطوة = 0.1 ميكرون. استخدام البرمجيات مرحلة ما بعد المعالجة المقدمة مع المجهر متحد البؤر لإضافة في علامة حجم الصورة النهائية.
      ملاحظة: ليزر البديلة والفلاتر وfluorophores يمكن أن تكون بديلا يقوم على availabiliتاي. إذا AlexaFluor-488 أو AlexaFluor-594 كشف ضعيف، والغاليوم فوسفيد (GaAsP) ذات حساسية عالية للكشف ويمكن استخدام لتعزيز إشارة إذا كانت متوفرة.

7. تحديد مقدار الجزيئية طبقة سمك والعصبية أرقام الخليوي

  1. باستخدام يماغيج، فتح صورة ض المكدس من الشق الأساسي الملون وتقسيم كل صورة إلى قنواتها الأحمر والأزرق والأخضر عن طريق اختيار 'صورة' من شريط القوائم، "اللون" من علامة التبويب صورة و"قنوات سبليت" من اللون علامة التبويب.
  2. إنشاء Z إسقاط الحد الأقصى من كل قناة أن تم تقسيم. عندما تكون الصورة قناة الفائدة مفتوحة، اختر 'صورة' من شريط القوائم، "أقسام" من علامة التبويب صورة و "Z-مشروع" من علامة التبويب "أقسام". ضمن "المشروع Z 'القائمة الأوامر، حدد" ماكس Z توقع' وانقر على 'حسنا'. كرر لكل قناة.
  3. فتح المساعد عداد خلية عن طريق اختيار 'الإضافات' من عشرالبريد شريط القوائم، "تحليل" من علامة التبويب الإضافات و"خلية مكافحة" من علامة التبويب تحليل.
    ملاحظة: يماغيج ويماغيج عداد خلية المساعد يمكن تحميلها على المواقع الواردة في جدول المواد والمعدات.
  4. تحديد عدد الخلايا العصبية عن طريق عد نوى المسمى ataxin-1-التي تقع على طول محدد مسبقا 200 ميكرون امتداد الأمامية والخلفية أطوال الشق الأساسي. استخدام الخريطة عتبة عن طريق تحديد "صورة" من شريط القوائم، "ضبط" من علامة التبويب صورة و "عتبة" من علامة التبويب ضبط لعمل خريطة عتبة قناة الفائدة (أحمر في حالة نوى ataxin-1 المسمى ).
    1. اختيار مجموعة بكسل التي يمكن تطبيع جميع أنحاء الكمي (31-225 بكسل على سبيل المثال). تجاهل الضجيج من الصور عن طريق التحقق من مربع "الخلفية المظلمة" في إطار عتبة. إشارة الصورة يمكن أن تكون معكوسة لسهولة الفرز.
  5. تحديد الجزيئي thic طبقةkness يمكن في القناة الخضراء باستخدام "قنوات سبليت" وأداة "عتبة خريطة 'كما في خطوات 7.1 و 7.2. باستخدام علامة الحجم على كل صورة كدليل، وقياس عشوائيا ثلاثة أطوال طبقة الجزيئية داخل كل اثنين المعينة 200 ميكرون تمتد من كل صورة الشق الأولية. إجراء قياسات من نهاية القريبة من شجيري جذع العصبية في قاعدة سوما العصبية إلى نهاية البعيدة للجذع شجيري العصبية.
  6. سجل العصبية عدد الخلايا والجزيئات سمك طبقة وسائل زائد أو ناقص الخطأ المعياري. أداء في اتجاه واحد أنوفا مع مقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لاختبار تأثير ظروف العلاج أو التركيب الوراثي على عدد من الخلايا وطول الشجرة شجيري.

8. تحليل HPLC من مخيخي السكسينك حمض تركيزات ما بعد العلاج

  1. إعداد نموذج لتحليل
    1. تزن كل حصاد نصف الكرة المخيخية الأيمن قبلاستخدام في تحليل HPLC. تخطر على نصفين نصف الكرة الغربي في وقت واحد في الخالط dounce قبل المبردة وإضافة 0.5 مل من 75:25 (من حيث الحجم) المياه: الحل الميثانول إلى كل شوط المتجانس 17.
    2. باستخدام الخالط ضيق قبل المبردة، وكسر صارخ يصل الأنسجة مع 5 ضربات dounce. تواصل اللحم المفروم ناعما كل عينة الأنسجة مع الخالط أوسع، تطبيق 20 السكتات الدماغية dounce.
    3. نقل الخليط إلى ما قبل المبردة أنبوب microcentrifuge. بعد كل عينة، وشطف الخالط مع 0.5 مل من الماء المثلج: حل الميثانول وإضافة إلى شطف أنبوب microcentrifuge.
    4. عينات جناسة أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية وجمع طاف في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
    5. تصفية طاف من خلال وحدة تصفية الطرد المركزي يضم مع فلتر السليلوز مجدد من 10 كيلو دالتون (كيلو دالتون) الاسمي الجزيئي الحد الوزن. إذا لم يكن قيد التشغيل على الفور تحليل HPLC، مخزن تصفية العينات في -80 °C.
  2. HPLC الأجهزة والشروط
    1. إرفاق العمود اللوني الاستبعاد أيون بطول لا يقل عن 30 سم وحجم الجسيمات من 7 ميكرون إلى الكروماتوجرافي السائل عالي الأداء.
    2. إعداد وديغا وجود كمية كافية من 1 العازلة خلات ملي تعديلها لدرجة الحموضة من 5.
    3. تعيين HPLC مع سرعة الطور المتحرك من 0.8mL / دقيقة. إذا كنت تستخدم جهاز كشف الأشعة فوق البنفسجية تجاه، حدد الطول الموجي للكشف من 224 نانومتر. مرات شطف نموذجية للحامض السكسينيك في ظل هذه الظروف ما بين 10 و 12 دقيقة.
  3. تشغيل ومعايير ونماذج تحليل
    1. إعداد مجموعة من المعايير في المرحلة عازلة خلات المحمولة مع تركيز حمض السكسينيك بين 0 و 250 جزء في المليون.
    2. تشغيل كل معيار وإعداد منحنى المعايرة باستخدام الذروة منطقة يقاس من كل شوط.
    3. مرة واحدة يتم الحصول على منحنى معيار دقيق، تشغيل عينات معدة مسبقا المخفف في المخزن خلات.لمزيد من الدقة في القياس، وعينات يمكن ارتفعت مع تركيزات معروفة من حمض السكسينيك التي تم مخففة في الطور المتحرك. تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ.
    4. تحليل الاستشرابية HPLC لتحديد تركيز حمض السكسينيك من العينات باستخدام منحنى المعايرة وبعد ذلك ضرب من قبل حجم العينة وقسمة كتلة العينة الأصلية.

9. السابق تحليل فيفو من مخيخي الميتوكوندريا وظائف عن طريق وحدة تحكم كهربائي الأوكسجين

  1. إنشاء كلارك من نوع الكهربائي باستخدام نظام متاح تجاريا من خلال تطبيق أول قطرة من كلوريد البوتاسيوم (50٪ بوكل ث / ت) حل على المهبط البلاتين، وقطع 1.5 سم 2 قطعة من التبغ التجاري المتداول الورق ووضع بلطف ورقة على الكاثود البلاتين.
    1. تغطية الكاثود والأنود المحيطة بها مع 2.5 سم 2 قطعة من تترافلوروإيثيلين (PTFE) ورقة وتأمين سنججلي كلا membranes مع الحلقات، والتأكد من عدم وجود طيات أو فقاعات داخل الأغشية. بالتنقيط 50٪ بوكل حل في المحيط أيضا.
  2. تأمين القطب ولم يضف الى غرفة الفحص وملء مع المياه المشبعة الهواء. حرارة الغرفة إلى 30 درجة مئوية، إضافة بقضيب 0.8 سم إلى حل ويحرك في 70 دورة في الدقيقة باستخدام أداة البرمجيات. معايرة الغرفة من خلال إنشاء صفر الأكسجين. للقيام بذلك، متسلسل إضافة بضع بلورات من الحد dithionite كيل الصوديوم إلى الحل.
    1. وبمجرد تحقيق المعايرة، وغسل غرفة واحدة مع 70٪ من الإيثانول، ثم يغسل ست مرات مع الماء منزوع الأيونات قبل السماح للغرفة حتى يتأقلم في 1.5 مل من العازلة التنفس (5 ملي MgCl 2 و 60 ملي بوكل، 100 ملي مانيتول، 10 ملم KH 2 PO 0.5 مم نا 2 EDTA، 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]) 7.
      ملاحظة: كل آثار ثنائي ثيونيت الصوديوم يجب إزالتها تماما خلال خطوات غسل قبل محاولة قياستركيزات الأكسجين أثناء التجارب التنفس.
  3. التجانس بلطف نصفي المخيخ وزنه في 0.5 مل من العازلة جناسة (0.25 M السكروز، 0.5 ملي EDTA، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]). نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة والحفاظ على برود حتى بداية الفحص.
  4. إضافة جناسة إلى غرفة، وبلغ حجم النهائي من 2 مل. Permeabilize جناسة المخيخ عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من ديجيتونين أو سابونين (5 ملغ / مل). تسمح الأنسجة المتجانس لاحتضان لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: ديجيتونين وسابونين سامة، ويجب أن تبقى حضانة مرات إلى أدنى حد ممكن.
  5. لبدء تسجيل استهلاك الأكسجين، وتحديد وظيفة الميتوكوندريا من خلال تفعيل وتثبيط سلسلة الفسفرة التأكسدية باستخدام ركائز ومثبطات، على التوالي (3 تسجيلات دقيقة لكل الركيزة).
    1. إضافة ركائز باستخدام الحقن النظيفة على النحو التالي: 10 ميكرولتر 2 M الغلوتامات [التركيز النهائي (FC) 0.01 م]،5 ميكرولتر 0.8 M مالات [FC 2 مم]، 20 ميكرولتر 0.5 M أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) [FC 5 ملي]، 1 ميكرولتر 1 ملم روتنون [FC 0.5 ميكرومتر]، 20 ميكرولتر 1M حمض السكسينيك [10 ملي]، 1 ميكرولتر 5 ملي أنتيمايسين إيه [FC 2.5 ميكرومتر]، 1 ميكرولتر 0.8 M أسكوربات [FC 0.4 ملي]، و 5 ميكرولتر 0.2 M ميثيل-ص-phenylenediamine (TMPD). [FC 0.5 ملي] عند إضافة ركائز إلى الغرفة يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في النظام.
      ملاحظة: معلومات مفصلة عن تأثير وظيفي الناجمة عن كل ركيزة والمانع الموضح في بروتوكول نشرت سابقا 7. قد تحتاج إلى أن تتولد لتحديد تركيزات الأمثل من ركائز ومثبطات في الأعمال التحضيرية / الأنسجة / الأنواع لم تدرس سابقا منحنيات الاستجابة للجرعة الفردية. وبالمثل، يمكن أن يكون الأمثل بروتوكول للميول فطرية التمثيل الغذائي في الأنسجة / الأنواع التي تجري دراستها، مثل تفضيلات الركيزة.
  6. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات، بلطفspirate في الخليط دماغ وتنظيف الغرفة مع الايثانول والماء منزوع الأيونات. يمكن تشغيل مرة واحدة نظيفة، إضافية عينات جناسة المخيخ دون معايرة إضافية لطالما يبقى الغشاء PTFE سليمة. بعد الانتهاء النهائي، القطب نظيفة مع الماء منزوع الأيونات والايثانول ومخزن مع هلام السيليكا أو المجففة.
    ملاحظة: بين يعمل في نفس اليوم، وملء الغرفة مع الماء منزوع الأيونات ضمان أن الغشاء لا تجف.
  7. باستخدام ورقة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الصك، تصدير 40 دقيقة من البيانات التنفس ابتداء دقيقتين نشر الركيزة بالإضافة إلى برنامج جدول بيانات.
  8. حساب معدل التنفس في الركيزة أو مثبط. تطبيع البيانات عن طريق تقسيم التنفس الإجمالي في معدل التنفس أثناء الركيزة بالإضافة أسكوربات-TMPD.
    ملاحظة: معدل التنفس يمكن زيادة طبيعية لمحتوى البروتين في الأنسجة التي قد يكون مرغوبا فيه وخاصة في التجارب التنكس العصبيالتي قد تختلف محتويات الأنسجة. للقيام بذلك، حجز 50 ميكرولتر من جناسة العينة (من الخطوة 9.3) لاستخدامها في فحص البروتين القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من خلال استهداف الدوائية الميتوكوندريا المخيخ مع حمض السكسينيك ونحن قادرون على منع ضعف الميتوكوندريا في نموذج الفأر من SCA1 مرض الاعصاب المخيخ. تم حل المانحة الإلكترون الكنسي نازعة سكسينات، حمض السكسينيك، في مياه الشرب المنزلية قفص من الفئران SCA1 لمدة شهر واحد، مع بداية تقييم السلوكية خلال الأسبوع الثاني من العلاج والتقييم عصبية مرضية بعد العلاج (الشكل 1A). علاج حمض السكسينيك 22 يحسن أداء الفئران SCA1 مقاسا فحص البصمة، شعاع الفحص وتسريع فحص rotarod. التحسينات السلوكية الكشف يشير إلى تعزيز التنسيق الحركي والحركية تعلم (الشكل 1B-D).

تم العثور على إنقاذ الأداء السلوكي في الحفل مع الحفاظ على قيرالأنسجة bellar (الشكل 2). علاج حمض السكسينيك الحفاظ بشكل كبير أجسام الخلايا العصبية وزيادة سمك طبقة الجزيئية (يدل على العصبية خلية شجيري تمديد الشجرة) في الشق الأساسي المخيخ في الفئران SCA1 المعالجة مقارنة مع الفئران غير المعالجة SCA1. الخلية العصبية طول شجيري والعصبية التهم خلايا الجسم توفر تدابير قوية من التهندس الخلوي المخيخ العام 5.

تم تنفيذ HPLC على النسيج المخيخ من الفئران التي عولجت للتحقق من أن حمض السكسينيك الذائبة في الماء قفص الشرب عبرت بنجاح حاجز الدم في الدماغ والأنسجة المخيخ اخترقت. منحنى الاستجابة للجرعة متفاوتة طول فترة العلاج مزيد يدعم العلاج الإرضاع بحسب الرغبة من حمض السكسينيك كوسيلة ناجعة للوصول إلى أنسجة دماغ (أرقام 3A-B). تجارب التنفس لدينا هي مستمرة وسيتم نشر النتائج التي حققناها في بحثمخطوطة. نحن هنا نظهر أننا يمكن أن تسجل بنجاح معدل التنفس من خلال المجمعات الفسفرة التأكسدية للدماغ على إضافة متفاوتة ركائز سلسلة نقل الإلكترون ومثبطات (الشكل 3C). في نهاية المطاف، سوف نستخدم فحص التنفس لإظهار عجز الفسفرة التأكسدية في SCA1 المخيخ الماوس وعكس هذا العجز عن طريق العلاج حامض السكسينيك.

شكل 1
الشكل 1: مخطط العلاج والممثل البيانات من البصمة الفحص، شعاع الفحص وتسريع Rotarod. تم حله (A) السكسينك الحمض الموجود في مياه الشرب المنزلية قفص من الفئران SCA1 لمدة أربعة أسابيع ابتداء من الساعة 17 أسابيع من العمر. تبدأ الفئران SCA1 لعرض النمط الظاهري ترنح في 5 أسابيع من العمر. لا يصور في التخطيطي هي ثلاثة أفواج التحكم: السكسينيك الفئران wildtype المعالجة حامض، لقدالفئران SCA1 والفئران wildtype المعالجة المركبة hicle المعاملة. وأجريت الاختبارات السلوكية خلال فترة العلاج على النحو التالي: فحص البصمة خلال الأسبوع 17، شعاع الفحص خلال الأسبوع 18 وتسريع rotarod خلال الأسبوع 19. في 20 أسابيع من العمر، تم التضحية الفئران وتحصد أنسجة دماغ لفحوصات الباثولوجيا المناعية، المقايسات HPLC و فحوصات التنفس. (ب) بيانات تمثيلية من فحص البصمة تظهر wildtype مشية المعالجة المركبة (أعلى)، المعالجة المركبة SCA1 مشية (وسط) والمعالجة حمض السكسينيك مشية SCA1 (القاع). تحليل البيانات (C) شعاع تظهر تحسنا في أداء شعاع (مقاسا عدد من التجارب لمسيرته الناجحة) من الفئران SCA1 مع العلاج حمض السكسينيك. (* P <0.05). (D) السكسينك العلاج حامض تحسن كبير في تسريع أداء rotarod من SCA1 22 الفئران كما يتضح من زيادة الكمون في الانخفاض (* P <0.05). أشرطة الخطأ في مؤتمر نزع السلاح إعادةflect الخطأ المعياري للمتوسط. تم تحديد أهمية كل اتجاه واحد أنوفا ومقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الممثل بيانات من عدد الخلايا العصبية والجزيئية طبقة سمك الباثولوجيا المناعية فحوصات. (أ) ممثل النتائج من العصبية تعداد خلايا الفحص تبين تحكم المعالجة السيارة المعدلة وراثيا الشق الأساسي للدماغ (أعلى)، SCA1 المخيخ الشق الأساسي المعالجة المركبة (وسط) وSCA1 الشق الأساسي المخيخ المعالجة حمض السكسينيك (القاع) الملون ل نوى ATXN1 إيجابية (أحمر) و counterstained مع دابي (الأزرق). خطوط بيضاء تصوير 200 ميكرون مناطق الأنسجةالمخصصة لعدد الخلايا. لهذا التحليل معين، المعدلة وراثيا التحكم الماوس استخدمت على مدى التعبير عن الجينات ATXN1 غير المسببة للأمراض تحت سيطرة أحد المروجين العصبية خلية محددة بدلا من الماوس wildtype لأن ميزات التحكم المعدلة وراثيا بسهولة المستويات التي يمكن اكتشافها من العصبية ATXN1 النووية والماوس wildtype لا. لا يعرض الماوس السيطرة المعدلة وراثيا النمط الظاهري رنحي أو التنكس العصبي للدماغ. (ب) ممثل النتائج من الجزيئي فحص سماكة طبقة تظهر wildtype الشق المعالجة المركبة المخيخ الأساسية (أعلى)، SCA1 المخيخ الشق الأساسي المعالجة المركبة (وسط) وSCA1 شق المخيخ المعالجة حمض السكسينيك الأساسي (القاع) الملون لcalbindin ، وهو علامة من الخلايا العصبية (أبيض). اثنين من طبقات الخلايا للدماغ ثلاثة يمكن تصور مع calbindin. طبقة الخلايا العصبية المتوسطة (التي تتكون من أجسام الخلايا العصبية) مرئيا جنبا إلى جنب مع الطبقة الجزيئية الأبعد (تتألف من العصبية مالتشعبات ليرة لبنانية). تظهر طبقة الجزيئية في وسط الشق الأساسي بسبب طيات طبيعية من الأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: ممثل النتائج من HPLC والتنفس فحوصات. (أ) منحنى قياسي من تركيزات يعرف ما يصل إلى 250 جزء في المليون حمض السكسينيك المخفف في المخزن خلات وتآمر ضد منطقة تحت ذروة HPLC قياس. تم استخدام معادلة خط لحساب تركيز حمض السكسينيك غير معروف من عينات الأنسجة المعالجة. (ب) الممثل الاستجابة للجرعة قمم حمض السكسينيك من أنسجة دماغ الفأر التالية أوقات مختلفة من العلاج (إما 0 أو 1 أو 5 أسابيع). وفقا للشروطوصفها، حمض السكسينيك عادة مزال ما بين 10 و 12 دقيقة. (C) الممثل المدى التنفس من أنسجة دماغ المعالجة المركبة wildtype الماوس. الخط الأزرق يصور التغير في تركيز الأكسجين، خط أحمر متقطع يصور التغير في معدل التنفس وخط أحمر الصلبة يصور نسخة ممهدة من خط متقطع. D = إضافة ديجيتونين، G / M = إضافة الغلوتامات / مالات، A = إضافة ADP، R = إضافة روتينون، S = إضافة حمض السكسينيك، AA = إضافة أنتيمايسين إيه وA / T = إضافة تصاعدي / TMPD. تم إضافة كل ركائز في الأوقات هو مبين في الشكل وفي تركيزات هو موضح في البروتوكول (الخطوة 9.5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إذا تم استخدام هذه الأساليب كما هو موضح، فهي قادرة على اكتشاف وتخفيف التأكسدي بوساطة الفسفرة ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران مرض الاعصاب المخيخ. فحوصات الكيمياء الحيوية والسلوكية المشتركة هي طرق متعددة الأوجه لتحديد مدى مساهمة الميتوكوندريا إلى المخيخ علم الأمراض العصبية التنكسية. عن طريق علاج الفئران مع حمض السكسينيك لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا، ونحن قادرون على إظهار الانقاذ من العجز السلوكية للدماغ والتنكس الدماغي.

منهجية المعروضة هنا يمكن استخدامها لاختبار مجموعة واسعة من المركبات المستهدفة عملية الأيض للذوبان في الماء لعلاج محتمل لمرض الاعصاب المخيخ. حمض السكسينيك قابل للذوبان في الماء بسهولة عند 0.75 ملغ / مل الذي يسمح للتسليم بسيطة عن طريق مياه الشرب القفص ولا يستلزم خلق الكريات الغذائية تستكمل. للذوبان في الماء الآخرينالمركبات يمكن أن تكون بديلا بسهولة في البروتوكول. في حالة استخدام المركبات المستهدفة عملية الأيض التي ليست قابلة للذوبان في الماء، ومنهجيتنا يمكن تكييفه بسهولة لتلقي العلاج مع الغذاء الكريات تستكمل 11 و 12. عند اختبار مركب جديد، فمن الأهمية بمكان أن تحقق اختراق المخيخ من المخدرات قبل بدء العلاج عن طريق التحليل HPLC أو غيرها من طريقة الكشف مناسبة.

وقد تم اختيار بطارية المقررة المرضية بسبب فعاليتها ذكرت في الكشف عن الأمراض العصبية للدماغ. التقييمات البصمة الفحص، يتم استخدام شعاع فحص وفحص rotarod على نطاق واسع من الأمراض المخيخ الاعصاب بما في ذلك SCAs المختلفة، ووفريدريك ترنح 6 و 23 و 24. هذه التقييمات سلوكية معينة ترتبط بقوة مع التنكس الدماغي. ومع ذلك، behaviora أخرىنماذج ل يمكن أن تكون بديلا أو إضافتها حسب الحاجة.

يتم استخدام العلامات على الخلايا العصبية في الفئران SCA1 مع ataxin-1 وcalbindin على نطاق واسع للكشف عن التنكس الدماغي في نماذج SCA1 20، 21. البعض أجسام الخلايا العصبية انتقائية والمناطق أنسجة يمكن استخدامها لتصور التخفيف من التنكس العصبي حسب الحاجة.

تحليل التنفس هو أداة قوية للكشف محدد من خلل وظيفي أو إصلاح داخل المجمعات الميتوكوندريا الفردية من الأنسجة للدماغ. يجب الحرص على تقليل الوقت بين حصاد الأنسجة وتشغيل الاختبار لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. أيضا، من المهم أن نلاحظ تجانس الأنسجة التي يجري تحليلها. على وجه التحديد، نسيج دماغ تتكون في معظمها من الخلايا العصبية الحبيبية التي لا تعبر عن التحوير SCA1 في نموذجنا. لذلك، خطوة حاسمة من هذاالبروتوكول هو لتحديد ما إذا كان التنفس المخيخ كله هو وسيلة فعالة للكشف عن وظيفة معقدة المؤكسدة. التغييرات التنفس في المعدلة وراثيا SCA1 المخيخ الماوس قد تكون خفية وقد تحتاج إلى زيادة عدد المواد لتحقيق نتائج ذات دلالة إحصائية.

مزيج من الأساليب السلوكية وعصبية مرضية مفصلة في هذا البروتوكول توفير تقدير واضح للمرض SCA1 ويمكن الكشف بقوة تحسن على العلاج مع مركبات قابلة للذوبان في الماء. وتكمن أهمية هذا البروتوكول هو في القدرة على التكيف واسعة لمختلف العلاجات ومجموعة متنوعة من نماذج الماوس. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من التقنيات المستخدمة في هذا البروتوكول لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو تقنيات معقدة وبالتالي فهي مناسبة لبيئة البحوث الجامعية. وسوف تستخدم التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول لتقييم درجة فعالية العلاج على حسب العمر تسليم المجمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine diphosphate Sigma Aldrich A2754 ADP
Ascorbate Sigma Aldrich A7631
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D9542 DAPI
Digitonin Sigma Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 DTT
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Glutamate Sigma Aldrich 1446600
Malate Sigma Aldrich 6994
Mannitol Sigma Aldrich M4125
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Potassium-lactobionate Bio-Sugars 69313-67-3
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saponin Sigma Aldrich 47036
Succinic Acid Sigma Aldrich S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma Aldrich T7394 TMPD
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Urea Sigma Aldrich U0631
Vectashield mounting medium Vector Labs H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody Life Technologies A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody Life Technologies A-11012
Calbindin antibody (goat) Santa Cruz C-20
Animals
Control transgenic mice Harry Orr, Ph.D. A02 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice Harry Orr, Ph.D. B05 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice The Jackson Laboratory 001800
Equipment
ESM-100L microtome ERMA Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope Olympus
Glycerol-gelatin slides FD Neuro Technologies PO101
Hamilton syringe Sigma Aldrich VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper Cole-Parmer UX-08277-15
Rotallion Rotarod PPP&G contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Software
ImageJ National Institute of Health http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ) National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) PPP&G contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software) DLL-Files.com https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35, (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82, (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17, (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27, (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20, (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22, (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66, (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109, (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41, (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832, (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28, (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20, (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10, (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95, (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13, (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19, (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8, (3), 225-235 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics