प्रोटीन Bioconjugates के संश्लेषण
1School of Chemistry, The Australian Centre for Nanomedicine and the ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, The University of New South Wales

Chemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल का विवरण एक सिस्टीन एक maleimide के लिए प्रोटीन युक्त, अभिकर्मक शुद्धि, प्रतिक्रिया की स्थिति, bioconjugate शुद्धि और bioconjugate लक्षण वर्णन शामिल करने की bioconjugation के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम।

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Mason, A. F., Thordarson, P. Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry. J. Vis. Exp. (113), e54157, doi:10.3791/54157 (2016).

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Abstract

Introduction

Bioconjugation covalently इस तरह के एक डाई, दवा या एक बहुलक के रूप में एक साथ या एक सिंथेटिक अणु के साथ एक बायोमोलिक्यूल लिंक करना पड़ता है। प्रोटीन bioconjugation तरीकों अब बड़े पैमाने पर फ्लोरोसेंट रंजक लेबलिंग 1,2 से लेकर आवेदन के साथ कई रसायन विज्ञान, जीव विज्ञान और नैनो अनुसंधान समूहों में किया जाता है, प्रोटीन का बना (एंटीबॉडी) 3 (एंटीबॉडी दवा conjugates - एडीसी) -prodrugs प्रोटीन dimers 4,5 के संश्लेषण , स्वयं कोडांतरण प्रोटीन बहुलक संकर 6.7 nanomedicine 8 और प्रणालियों के रसायन शास्त्र 9 में इस्तेमाल करने के लिए के माध्यम से।

रसायन विज्ञान की विशिष्टता bioconjugation के लिए इस्तेमाल किया, जबकि हमेशा महत्वपूर्ण नहीं, सबसे कार्यात्मक प्रोटीन bioconjugates के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है ताकि के रूप में लक्ष्य प्रोटीन की सक्रिय साइट के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए। आदर्श bioconjugation प्रतिक्रिया सहित कई मानदंडों को पूरा करने की जरूरत है: ब्याज की प्रोटीन पर दुर्लभ या अद्वितीय साइटों मैं) को लक्षित है,ii) इस लक्ष्य की दिशा में चयनात्मक होना, iii) गैर denaturing शर्तों के तहत आगे बढ़ना खुलासा प्रोटीन से बचने के लिए और चतुर्थ) हो उच्च उपज के रूप में लक्ष्य प्रोटीन आम तौर पर उप-millimolar एकाग्रता में ही उपलब्ध है। Maleimide - सिस्टीन माइकल इसके अलावा इन सभी मानदंडों को पूरा करने के करीब आता है, और उस के कारण लंबे समय तक bioconjugate रसायन विज्ञान में 10 के क्षेत्र में एक विशेष दर्जा नहीं ली है। इसका कारण यह है i) कई प्रोटीन उनकी सतह पर केवल एक सिस्टीन अवशेषों से युक्त आनुवंशिक रूप से वहाँ इंजीनियर हो सकता है, द्वितीय) सही पीएच पर प्रतिक्रिया सिस्टीन के प्रति अत्यधिक चयनात्मक है, iii) यह जलीय बफ़र्स में सुचारू रूप से आगे बढ़ता है और iv) यह बहुत तेज है कुछ मामलों में 11 5000 एम -1 सेकंड -1 से अधिक होने की सूचना दी सिस्टीन युक्त प्रोटीन के लिए maleimides के दूसरे क्रम दर लगातार साथ। परंतु ब्याज की प्रोटीन कार्बनिक की एक छोटी सी (≈ 5-10%) राशि को सहन कर सकते सह विलायक 12, लगभग किसी भी maleimide-क्रियाशील डाई, पीओlymer, सतह से या किसी अन्य प्रोटीन प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, maleimides iodoacetamides, जो अधिक ऊंचा पीएच पर अन्य nucleophiles के साथ प्रतिक्रिया से ग्रस्त हैं की तुलना में प्रोटीन पर cysteines के लिए और अधिक विशिष्ट हैं; और डाइसल्फ़ाइड आधारित conjugations जो अम्लीय पीएच पर रखा जाना डाइसल्फ़ाइड विनिमय 13 को रोकने की जरूरत की तुलना में अधिक स्थिर है।

यहाँ हम एक प्रोटीन एक आरयू (द्वितीय) आधारित क्रोमोफोर और एक उदाहरण के रूप में redox प्रोटीन साइटोक्रोम के बीच प्रतिक्रिया का उपयोग कर एक एकल सिस्टीन अवशेषों से युक्त करने के लिए maleimide-क्रियाशील अणुओं के विकार के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इस प्रोटोकॉल अधिकांश अन्य एक सुलभ सतह सिस्टीन अवशेषों और इसी maleimide-क्रियाशील लक्ष्य युक्त प्रोटीन के लिए समान रूप से लागू होता है, यह एक और प्रोटीन, एक फ्लोरोसेंट डाई, एक क्रोमोफोर या एक सिंथेटिक बहुलक हो।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल एक प्रोटीन डाई bioconjugate के संश्लेषण के लिए के रूप में चित्र 1 में दिखाया बनाया गया है जहां लागू झिल्ली प्रोटीन के साथ सहायता के लिए यह प्रोटीन मुक्त सतह सिस्टीन युक्त के साथ एक maleimide की प्रतिक्रिया के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है नोटों के साथ डाला। bioconjugates, प्रोटीन बहुलक bioconjugates, और सिंथेटिक प्रोटीन डिमर (प्रोटीन, प्रोटीन) bioconjugates। इस विशेष मामले में, प्रोटीन आईएसओ 1 साइटोक्रोम एक सतह सिस्टीन प्रतिक्रिया करने के लिए उपलब्ध अवशेषों जो एक अति विशिष्ट लेबलिंग घटित करने के लिए अनुमति देता है। ब्याज की एक प्रोटीन कई सिस्टीन अवशेषों है, तो एक ही प्रोटोकॉल लागू होता है, विशिष्टता और उत्पाद एकरूपता के नुकसान के साथ यद्यपि। रसायन विज्ञान को निशाना बनाने की सतह लाइसिन अवशेषों, एन -hydroxysuccinimidyl एस्टर या आइसोथियोसाइनेट का उपयोग करते हुए, एक सरल तरीका हो सकता है, अगर विशिष्टता की आवश्यकता नहीं है।

आकृति 1
Bioconjugation रिएक्शन योजना। एक उदाहरण के मामले में, एक प्रकाश कटाई के रूप में, दयाता आधारित एंटीना अणु साइटोक्रोम ग के लिए दयाता आधारित एंटीना अणु पर एक लटकन maleimide और एक उजागर सिस्टीन अवशेषों के माइकल इसके माध्यम से संलग्न किया जाएगा (CYS102) प्रोटीन पर। CYT सी सतह के लाल क्षेत्र हीम समूह इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. साइटोक्रोम की शुद्धि

नोट: यह कदम सभी प्रोटीन के लिए लागू नहीं है। हालांकि, यह पता चला है कि एक प्रोटीन एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से प्राप्त अन्य अवांछित प्रोटीन isoforms जो आगे की शुद्धि के 13 से हटा दिया जाना चाहिए सकता शामिल कर सकते हैं महत्वपूर्ण है।

  1. करने के लिए ultrapure पानी का 1 एल में (w = 120 ग्राम मोल -1 एम) सोडियम dihydrogen फॉस्फेट की 2.4 ग्राम भंग जनसंपर्कजिसमें 20 मिमी नः 2 4 पीओ एक बफर समाधान epare। 7 पीएच 1 एम NaOH के साथ पीएच को समायोजित करें।
    नोट: फॉस्फेट इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बफ़र्स एक दैनिक आधार पर हौसले से तैयार किया जाना चाहिए, और एक 0.2 माइक्रोन सेल्यूलोज झिल्ली फिल्टर का उपयोग करने से पहले के माध्यम से छाना।
  2. एक 20 मिमी नः 2 पीओ 4 और 1 एम NaCl बफर बनाने के लिए 20 मिमी नः 2 4 पीओ बफर के 500 मिलीलीटर में सोडियम क्लोराइड की 29.22 ग्राम (एम डब्ल्यू = 58.44 छ मोल -1) भंग। यह कदम 1.6) में शुद्धि के लिए क्षालन बफर है।
  3. पीएच 7 20 मिमी फॉस्फेट बफर के 6 मिलीलीटर में lyophilized साइटोक्रोम (CYT ग) की 12.0 मिलीग्राम भंग।
  4. अलग से एक 1 एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए ultrapure पानी की 95.3 μl में dithiothreitol की 14.7 मिलीग्राम (डीटीटी, एम डब्ल्यू = 154.25 जी / मोल) भंग।
    नोट: डीटीटी शेयर समाधान, हौसले से तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि इस अभिकर्मक जलीय घोल में ऑक्सीडेटिव छोड़ना की संभावना है।
  5. रंजette प्रोटीन समाधान में 1 एम डीटीटी समाधान के 60 μl CYT सी कम करने के लिए। समाधान के रंग मिश्रण पर प्रकाश लाल करने के लिए गहरे लाल रंग से बदल जाएगा।
  6. किसी भी chromatographic मीडिया पर इंजेक्शन लगाने से पहले एक 0.22 माइक्रोन से कम प्रोटीन बाध्यकारी PVDF सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कम प्रोटीन समाधान फ़िल्टर।
  7. इंजेक्शन पाश और एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) साधन की यूवी विज़ डिटेक्टर के बीच एक 3.3 मिलीलीटर मजबूत कटियन विनिमय स्तंभ संलग्न।
  8. ultrapure पानी के 3 स्तंभ की मात्रा, 20 मिमी पीएच 7 फॉस्फेट बफर के 3 स्तंभ संस्करणों के द्वारा पीछा के साथ स्तंभ संतुलित करना, 1 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर का उपयोग कर।
  9. लोड इंजेक्शन पाश में कम कच्चे तेल CYT सी के 1 मिलीलीटर, और 328 से एक ढाल विधि शुरू - 450 मिमी NaCl, 5 स्तंभ की मात्रा अधिक है। यूवी विज़ डिटेक्टर के 280 एनएम और 410 एनएम चैनलों पर नजर रखने, और सबसे बड़ी चोटी इकट्ठा।
  10. elute करने के लिए आईएसओ-2 cytochrom 1 2 के लिए M स्तंभ मात्रा में नमक एकाग्रता में वृद्धिई सी, और बाद स्तंभ प्लावित कर दिया गया है, स्तंभ फॉस्फेट बफर 20 मिमी के 2 कॉलम संस्करणों के साथ अगले कच्चे विभाज्य इंजेक्शन लगाने से पहले फिर से संतुलित करना।
  11. दोहराएँ कदम 1.9-1.10 जब तक सभी क्रूड प्रोटीन शुद्ध किया गया है।
  12. आईएसओ 1 युक्त भिन्न पूल और एक 3.5 केडीए आणविक वजन cutoff (MWCO) स्पिन फिल्टर का उपयोग और 3000 x जी centrifuging उन्हें ध्यान केंद्रित।
  13. 3.5 केडीए MWCO डायलिसिस कैसेट में केंद्रित प्रोटीन लोड और पानी के 2 में परिवर्तन के साथ ultrapure पानी में रात भर के खिलाफ dialyze।
  14. 10 μl लेने के ultrapure पानी के साथ 100 μl करने के लिए इसे गिराए, और एक absorbance स्पेक्ट्रम लेने के द्वारा शुद्ध, केंद्रित प्रोटीन समाधान की एकाग्रता का निर्धारण। , 100 μl क्वार्ट्ज क्युवेट प्रोटीन absorbance के स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एक कम मात्रा का प्रयोग करें। 100 सुक्ष्ममापी - आमतौर पर, undiluted प्रोटीन एकाग्रता 50 के आदेश पर है।
    1. Concentratio यों तो CYT की विशेषता 410 एनएम चोटी का प्रयोग करेंn 97.6 सेमी -1 मिमी -1 की एक दाढ़ निगलने को मूल्य के साथ बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग:
      एक = ε × × सी ι
      जहां एक absorbance है, ε दाढ़ निगलने, सी एम एम में एकाग्रता है, और ι सेमी 13 में क्युवेट के पथ की लंबाई है।
  15. इस बिंदु पर, 1 मिलीलीटर aliquots में प्रोटीन को विभाजित और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखने के लिए जब तक वे जरूरत है। CYT जमे हुए किया जा सकता है और संरचना या समारोह की हानि के बिना thawed, लेकिन दोहराने चक्र प्रोटीन denature करने के लिए शुरू हो जाएगा।
    नोट: प्रोटीन विभिन्न डिग्री की ठंड सहन। उदाहरण के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 5.9 जम नहीं किया जाना चाहिए, बजाय एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत।

2. साइटोक्रोम Bioconjugates के संश्लेषण

  1. दयाता के 0.9 मिलीग्राम भंग (द्वितीय) bisterpyridine maleimआईडीई (आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide, 0.975 μmol, 6 समकक्ष) acetonitrile के 600 μl में।
    नोट: इस्तेमाल किया maleimide पानी में घुलनशील है, तो बजाय पानी acetonitrile में एक शेयर समाधान तैयार है। यह महत्वपूर्ण maleimide प्रतिक्रिया बफर में घुलनशील होने के लिए है। Dimethylsulfoxide, एन, एन -dimethylformamide, और acetonitrile सभी आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं adjuvants कम आणविक भार 12, अक्सर हाइड्रोफोबिक maleimide अभिकारकों के विघटन में सहायता करते हैं।
  2. 100 मिमी फॉस्फेट बफर और 100 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, एम डब्ल्यू = 292.24 जी / मोल) है, जो जब 20 मिमी पतला पीएच 7. पर है ठोस सोडियम हाइड्रोक्साइड कई ग्राम आम तौर पर जोड़े जब तक EDTA भंग कर रहा है (युक्त एक बफर समाधान तैयार ) और पीएच 7 करने के लिए समायोजित करें।
  3. (= W 286.65 जी / मोल TCEP 15, एम) ultrapure पानी के 1 मिलीलीटर में एक 10 मिमी शेयर समाधान तैयार करने के लिए Tris (2 carboxyethyl) phosphine हाइड्रोक्लोराइड के 2.87 मिलीग्राम भंग। यह कदम आयात होता हैचींटी सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन पर सिस्टीन पूरी तरह युग्मन 15 maleimide करने से पहले कम हो जाता है।
    नोट: TCEP शेयर समाधान, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए हौसले से तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि इस अभिकर्मक जलीय घोल में ऑक्सीडेटिव छोड़ना की संभावना है।
  4. एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में 100 मिमी फॉस्फेट / EDTA स्टॉक समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ ultrapure पानी की 11.4 मिलीलीटर का मिश्रण। जब प्रोटीन और maleimide शेयर समाधान के साथ आगे पतला बफर एकाग्रता 20 मिमी होना होगा।
    नोट: प्रोटीन चिह्नित किया जा रहा एक transmembrane प्रोटीन होता है, तो यह सुनिश्चित करें कि एक उपयुक्त डिटर्जेंट प्रोटीन solubilize के लिए बफर करने के लिए जोड़ा गया है। एक साबुन का प्रयोग नहीं किया जाता है तो झिल्ली प्रोटीन धीरे धीरे तेज़ कर सकता है, जो नकारात्मक प्रतिक्रिया पैदावार पर असर पड़ेगा। बाद के सभी शुद्धि चरणों में डिटर्जेंट का प्रयोग करें।
  5. फॉस्फेट बफर EDTA को शुद्ध CYT सी के 0.15 μmol (एक 50 माइक्रोन के समाधान के 3 मिलीलीटर, 1 समकक्ष) जोड़ें।
  6. TCEP शेयर solut के 7.5 μl जोड़ेआयन (0.075 μmol, 0.5 समकक्ष) प्रोटीन समाधान करने के लिए और 5 मिनट के लिए सरगर्मी छोड़ किसी भी प्रोटीन है कि सिस्टीन ऑक्सीकरण के कारण dimerized हो सकता है कम करने के लिए।
    नोट: TCEP जोड़ नहीं है ब्याज की प्रोटीन आसानी से dimerize नहीं है। गैर को कम करने की शर्तों के तहत एक प्रोटीन जेल चलाकर यह जाँच करें।
  7. आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide कम हो, CYT सी के बफर समाधान के acetonitrile समाधान के 600 μl, आरटी पर 24 घंटे के लिए अंधेरे में जोड़ें, और प्रतिक्रिया मिश्रण सरगर्मी छोड़ दें।
  8. 3.5 केडीए MWCO स्पिन फिल्टर का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण, 3000 XG पर centrifuging तक छानना स्पष्ट चलाता ताजा 20 मिमी फॉस्फेट बफर के साथ 2-3 बार दोहरा ध्यान लगाओ। शुद्धि के अगले चरण से पहले संभव के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण से ज्यादा unreacted maleimide निकालें।
    नोट: इस बिंदु पर, कच्चे bioconjugation मिश्रण, रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता अंधेरे में। यह centr से unreacted maleimide डाई दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैभंडारण से पहले डायलिसिस ifuge maleimide के रूप में धीरे धीरे और nonspecifically प्रोटीन की सतह पर लाइसिन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं।

3. साइटोक्रोम Bioconjugates की शुद्धि

  1. जिसमें 20 मिमी नः 2 पीओ 4 और 0.5 एम NaCl एक बफर समाधान तैयार करने के लिए सोडियम dihydrogen फॉस्फेट का 2.4 जी और ultrapure पानी का 1 एल में सोडियम क्लोराइड की 29.22 ग्राम भंग। यह स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) शुद्धि के लिए चल बफर है।
  2. 20 मिमी नः 2 पीओ 4 और 0.5 एम NaCl बफर के 500 मिलीलीटर में imidazole की 17 ग्राम (एम डब्ल्यू = 68.077 जी मोल -1) भंग। इस IMAC शुद्धि के लिए क्षालन बफर है।
  3. पीएच 7 1 एम NaOH या एचसीएल का उपयोग करने के लिए दोनों buffers की पीएच को समायोजित करें, और 0.22 माइक्रोन पुनर्जीवित सेलूलोज़ झिल्ली के माध्यम से उन्हें फिल्टर FPLC में उपयोग करने से पहले।
  4. खरीदे IMAC कॉलम कर्नल पर लादा किसी भी धातु आयनों के बिना भेज रहे हैं के रूप मेंUMN, ultrapure पानी के 3 मिलीलीटर, 100 मिमी निकल एसीटेट समाधान के 3 मिलीलीटर, और 6 मिलीलीटर ultrapure पानी के साथ स्तंभ धोने से एक नी 2 + आधारित शुद्धि के लिए स्तंभ तैयार करते हैं। स्तंभ तुरंत इस्तेमाल के लिए नहीं है, तो हो 20% इथेनॉल के 3 मिलीलीटर के माध्यम से धोने और बैक्टीरिया विकास को रोकने के लिए फ्रिज में स्तंभ की दुकान।
  5. एक नी 2 + इंजेक्शन पाश और यूवी विज़ डिटेक्टर के बीच FPLC करने के लिए 1 मिलीलीटर IMAC स्तंभ -loaded संलग्न।
  6. 20 मिमी फॉस्फेट के 3 स्तंभ की मात्रा, 0.5 एम NaCl बफर 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग कर के साथ स्तंभ संतुलित करना।
  7. लोड नी 2 + IMAC स्तंभ पर कच्चे तेल की प्रतिक्रिया मिश्रण (0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड) के 100 μl। बफर चलाने elute करने के लिए गैर प्रतिक्रिया व्यक्त की CYT सी के 3 स्तंभ की मात्रा, 125 मिमी से अधिक 3 स्तंभ संस्करणों के लिए 0 से एक imidazole ढाल के द्वारा पीछा के साथ स्तंभ धो दयाता bisterpyridine-साइटोक्रोम bioconjugate elute करने के लिए (आरयू (द्वितीय) -cyt ग)
  8. धो गolumn 5 स्तंभ संस्करणों के लिए 250 मिमी imidazole बफर के साथ है, तो स्तंभ 20 मिमी फॉस्फेट, 0.5 एम NaCl और दोहराने कदम 3.7 के साथ फिर से संतुलित करना है जब तक सभी कच्चे bioconjugate शुद्ध किया गया है।
  9. bioconjugate अंशों पूल और एक 3.5 केडीए MWCO स्पिन फिल्टर का उपयोग, 3000 x जी centrifuging उन्हें ध्यान केंद्रित।
  10. 3.5 केडीए MWCO डायलिसिस कैसेट में केंद्रित bioconjugate लोड और पानी के 2 में परिवर्तन के साथ ultrapure पानी में रात भर के खिलाफ dialyze।
  11. यूवी विज़ द्वारा शुद्ध, केंद्रित bioconjugate समाधान की एकाग्रता का निर्धारण, के रूप में आईएसओ 1 साइटोक्रोम ही दाढ़ निगलने मूल्य का उपयोग (97.6 मिमी -1 सेमी -1) 410 एनएम पर। 100 सुक्ष्ममापी - आमतौर पर, bioconjugate एकाग्रता 50 के आदेश पर है।
  12. 25 μl aliquots में bioconjugate फूट डालो और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखने के लिए जब तक वे जरूरत है।

4. साइटोक्रोम Bioconjugates की विशेषता

  1. रोक रखनाMALDI-TOF एमएस द्वारा bioconjugate द्रव्यमान का mination
    1. एक acetonitrile / जल / trifluoroacetic एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर में कहवे एसिड के 10 मिलीग्राम भंग (: 20: 80 0.1, वी / वी / वी)।
    2. कहवे एसिड समाधान के 5 μl के साथ केंद्रित प्रोटीन समाधान के 5 μl पतला।
    3. स्पॉट MALDI लक्ष्य थाली पर कहवे एसिड समाधान के 0.5 μl और समाधान शुष्क करने की अनुमति।
    4. स्पॉट 0.5 इस कहवे एसिड स्थान के शीर्ष पर नमूना / मैट्रिक्स समाधान μl, मौके सुखाने के लिए अनुमति देते हैं। "सैंडविच" मैट्रिक्स की परतों के बीच नमूना करने के लिए इस के शीर्ष पर नमूना मैट्रिक्स का एक और 0.5 μl जगह है, और सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
    5. प्रोटीन 16 के लिए उपयुक्त साधन सेटिंग्स का उपयोग रैखिक मोड में जन स्पेक्ट्रा मोल।
  2. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा bioconjugates की जांच
    1. तैयार प्रत्येक प्रोटीन नमूना के 10 μl premixed लिथियम dodecyl सल्फेट (एलडीएस, पीएच 8.4) बफर (4x) टी के साथ प्रोटीन के नमूने गिराए द्वारा चलाए जाOA प्रति अच्छी तरह से लगभग 20 माइक्रोग्राम के अंतिम एकाग्रता। कुओं कि शर्तों को कम करने की आवश्यकता के लिए, 500 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) एजेंट (10x) को कम करने के 1 μl जोड़ें।
    2. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर हीट नमूने हैं।
    3. premixed की 50 मिलीलीटर 1 एम एमईएस, 1 एम Tris आधार, 2% एसडीएस, 20 मिमी EDTA (7.7 पीएच) ultrapure पानी की 950 मिलीलीटर के लिए एक वाणिज्यिक स्रोत से बफर मिश्रण (20x) चल जेल में चल रहे बफर तैयार करने के लिए जोड़ें।
    4. जेल से प्लास्टिक कंघी निकालें और जेल चल रहा टैंक में जेल जगह है। जेल चल रहा बफर के साथ टैंक को भरने के लिए इतना है कि कुओं बफर के साथ कवर कर रहे हैं।
    5. लोड नमूने ध्यान से एक मिल में बना हुआ 12% बीआईएस Tris पर, 1 मिमी, 10-अच्छी तरह से जेल में लंबे समय के पिपेट युक्तियों का उपयोग लदान में सहायता करते हैं। जेल के एक मध्यम अच्छी तरह से में prestained 10 प्रोटीन आणविक वजन मार्कर (3-188 केडीए) लोड विश्लेषण सहायता करने के लिए।
    6. 35 मिनट के लिए 200 वी लगातार वोल्टेज पर जेल चला।
    7. 2 घंटे के लिए एक वाणिज्यिक Coomassie नीले रंग के समाधान के साथ जेल दाग, और ultrap से धो लें48 घंटे के लिए पानी Ure।
  3. यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा bioconjugate पवित्रता का निर्धारण
    1. आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide, आईएसओ 1 CYT सी, और आरयू (द्वितीय) -cyt सी के 5 माइक्रोन के समाधान के 120 μl तैयार करें।
    2. क्वार्ट्ज केवल ultrapure पानी युक्त क्युवेट के आधारभूत स्पेक्ट्रम उपाय, 250 एनएम से 650 एनएम के लिए।
    3. प्रत्येक घटक की स्पेक्ट्रम उपाय सुनिश्चित करने, क्युवेट rinsed और प्रत्येक माप के बीच सूख रहा है।
    4. तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में प्रत्येक घटक के absorbance साजिश है, और अगर यह निर्धारित करने के लिए एक 1 अंतिम उत्पाद के साथ शुरू सामग्री के रैखिक योग तुलना: आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide CYT सी के 1 के अनुपात में प्रतिक्रिया व्यक्त की है।

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Representative Results

Bioconjugates के संश्लेषण के तीन प्राथमिक तरीकों से इसकी पुष्टि की है: मैट्रिक्स की मदद से लेजर Desorption आयनीकरण उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF एमएस), जेल वैद्युतकणसंचलन का समय, और पराबैंगनी-दृश्य (यूवी विज़) स्पेक्ट्रोस्कोपी, के रूप में आंकड़े 2 में दिखाया गया है, 3 और 4। एक बड़े पैमाने पर वृद्धि संलग्न छोटे अणु के द्रव्यमान के लिए इसी, और एक unreacted प्रोटीन की कमी आरयू (द्वितीय) के सफल सहसंयोजक उठाना (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide CYT सी और bioconjugate के बाद शुद्धि के लिए यह दर्शाता है। शुरुआती सामग्री bioconjugate की रचना अनुमान लगाया जा सकता की 1 इसके अलावा स्पेक्ट्रम: bioconjugate की यूवी विज़ स्पेक्ट्रम उपज absorbance के साथ गणना की जा करने के लिए 410 एनएम, और एक भविष्यवाणी करने के लिए 1 स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा अनुमति देता है। उपरोक्त उदाहरण में, उपज कुछ हद तक बैच को बैच से आम तौर पर 15-27% के बीच FPLC purifica के बाद बदलता है, लेकिन यहtion 15।

इसके अलावा, शुद्धि के दौरान वर्णलेख में एक नए शिखर की उपस्थिति एक नई प्रजाति के संश्लेषण की पुष्टि करता है। यह आंकड़ा 5, जहां विभिन्न यूवी विज़ निशान के विश्लेषण से संकेत मिलता है सकते हैं या नहीं एक प्रजाति आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide घटक में उदाहरण है।

चित्र 2
चित्रा 2 प्रोटीन की MALDI-TOF जन स्पेक्ट्रा। शुद्ध आईएसओ 1 साइटोक्रोम सी (काला) और आरयू (द्वितीय) -cyt सी (लाल) की जन स्पेक्ट्रा। चोटियों है कि एक कहवे एसिड अभिवर्तन 179 दा पर दिखाई साथ आईएसओ 1 CYT सी (12,706 दा) और आरयू (द्वितीय) -cyt सी (13,559 दा) की गणना की जनता के अनुरूप मनाया जा सकता है। इस अभिवर्तन unreacted CYT सी एस में अधिक मात्रा में देखा जाता हैकहवे एसिड की α, β-असंतृप्त कार्बोनिल और उच्च ऊर्जा MALDI की शर्तों के तहत प्रोटीन से मुक्त thiol के बीच एक प्रतिक्रिया के कारण pectra। मैट्रिक्स adducts सामान्यतः MALDI-एमएस में देखा जाता है और दोनों सहसंयोजक और प्रकृति में गैर-सहसंयोजक हो सकता है। स्पेक्ट्रा आधारभूत सही, शोर फ़िल्टर, और तुलना के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन की। 12% बीआईएस Tris कम और गैर कम हो CYT सी और आरयू (द्वितीय) -cyt सी की जेल। लेन 3 पॉलीपेप्टाइड बड़े पैमाने पर प्रत्येक बैंड (केडीए) के अधिकार के लिए एनोटेट के साथ, एक पूर्व दाग प्रोटीन मानक होते हैं। एक बड़ा versio देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के एन।

चित्रा 4
चित्रा 4. यूवी विज़ प्रोटीन की स्पेक्ट्रा: आरयू के absorbance स्पेक्ट्रम (द्वितीय) -cyt सी (हरा) शुद्ध, unreacted CYT सी (लाल) और unreacted आरयू के रैखिक अलावा (नीले धराशायी) को बारीकी से मेल खाती है (द्वितीय) ( टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide (काला)। यह दर्शाता है कि bioconjugate एक 1 के होते हैं:। प्रोटीन को maleimide के 1 लगाव यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. bioconjugates की नी IMAC शुद्धि के chromatogram: IMAC आरयू (द्वितीय) -cyt शुद्धि का पता लगा। यूवी विज़ निशान: 410 एनएम सीवाई की Soret बैंड से मेल खाती हैटी सी, 280 एनएम दोनों CYT सी और आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide, और 475 एनएम दयाता (द्वितीय) परिसर के धातु करने वाली ligand चार्ज हस्तांतरण बैंड से मेल खाती है। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

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Discussion

एक bioconjugation से पहले शुरू सामग्री की शुद्धि अत्यंत महत्व का है। वाणिज्यिक पुनः संयोजक स्रोतों से प्राप्त प्रोटीन अक्सर ब्याज की प्रोटीन है, जो अलग सतह के रसायन शास्त्र और जेट हो सकता है की अन्य isoforms होते हैं। उदाहरण के लिए, वर्णित bioconjugation में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CYT दोनों आईएसओ -1 और आईएसओ 2 CYT 12,14,17 का मिश्रण होता है। आईएसओ 2 और आईएसओ 1 साइटोक्रोम के रूपों को काफी हद तक मुताबिक़ कर रहे हैं, मुख्य अंतर यह आईएसओ 1 साइटोक्रोम की सी टर्मिनस के निकट एक मुक्त सिस्टीन अवशेषों की उपस्थिति में किया जा रहा है। यहाँ उदाहरण में, शुद्धि जलीय मजबूत के साथ हासिल की है कटियन विनिमय FPLC, हालांकि, इस तरह के आयनों विनिमय, आत्मीयता, हाइड्रोफोबिक या आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के रूप में FPLC के अन्य रूपों और अधिक लागू हो सकता है। प्रोटीन भी इस चरण में कम हो जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ब्याज की प्रोटीन पर सिस्टीन अवशेषों (यहाँ साइटोक्रोम ग) फू हैlly maleimide से जुड़े लक्ष्य के साथ bioconjugation करने से पहले कम हो। इसके अलावा, यह maleimide-संलग्न छोटे अणु के साथ एक सिस्टीन प्रोटीन युक्त शुद्ध है और कहा कि maleimide भंडारण में एक प्रतिक्रिया नहीं आया है इस्तेमाल किया जा सकता है अगर पता लगाने के लिए, maleimides के रूप में प्रकाश और तापमान के प्रति संवेदनशील हैं उपयोगी है। यह जल्दी और आसानी से एक खुला maleimide upfield बदलाव होगा की प्रोटॉन, जबकि 1 एच एनएमआर द्वारा जाँच की जा सकती है के रूप में एक अक्षुण्ण maleimide की vinylic प्रोटॉन 6-6.5 पीपीएम पर एक स्वेटर रूप में दिखाई देगा; और भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक खुला maleimide की अंगूठी के साथ एक 18 दा बड़े पैमाने पर बढ़ाने के लिए इसी।

बफर चुनाव, पीएच, और जैसे डिटर्जेंट, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के रूप में adjuvants के शामिल किए जाने और एजेंटों को कम करने bioconjugation पैदावार 5,15 पर गहरा प्रभाव पड़ेगा। एक maleimide और एक thiol की एक माइकल अलावा के मामले में, पीएच घटित करने के लिए एक तेज, विशिष्ट प्रतिक्रिया के लिए 6 अभी तक 8 नीचे से ऊपर होना चाहिए। 6 पीएच नीचे, विशिष्टता के रूप में उच्च हैmaleimide किसी भी amines के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम नहीं हो जाएगा, लेकिन thiol protonated है और इस तरह माइकल अलावा एक धीमी प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी के लिए एक गरीब nucleophile है। 8 पीएच ऊपर, सतह लाइसिन अवशेषों deprotonated बनने के लिए और उपलब्ध maleimides के साथ प्रतिक्रिया, प्रोटीन को maleimide घटक के एक गैर विशिष्ट सहसंयोजक लगाव के लिए अग्रणी कर सकते हैं। फॉस्फेट बफर इस bioconjugation में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह इस पीएच रेंज में एक मजबूत बफर है और अभिकर्मकों से किसी के साथ बातचीत नहीं करता है। Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) बफर, उदाहरण के लिए, इस बफर में एमाइन समूह संभावित maleimide, जो गरीब पैदावार के लिए नेतृत्व करेंगे के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है के रूप में एक गरीब विकल्प होगा। सभी अभिकर्मकों की घुलनशीलता भी उच्च पैदावार के लिए महत्वपूर्ण है। थोड़ी मात्रा के अलावा (<10% वी / वी) कार्बनिक विलायक, गैर ध्रुवीय घटकों के विघटन में सहायता कर सकते हैं, जबकि सही पीएच और नमक एकाग्रता समाधान में प्रोटीन रखने के लिए आवश्यक हैं और 12 मुड़ा की। बड़े झिल्ली protei के लिएएनएस महत्वपूर्ण हाइड्रोफोबिक सतह के अवशेष के साथ, एक surfactant 18 precipitating से प्रोटीन को रोकने के लिए आवश्यक हो जाएगा।

अगर bioconjugation में प्रोटीन ऑक्सीकरण और dimerization होने का खतरा है, इस तरह के TCEP के रूप में एक एजेंट को कम करने के अलावा bioconjugation पैदावार 15 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। इसकी monomeric, मुक्त thiol फार्म के लिए प्रोटीन की कमी के बगल में सक्रिय thiol साइटों का एक बड़ा अनुपात maleimide द्वारा पहुँचा जा सकता है। हालांकि, इसके अलावा और stoichiometry के आदेश TCEP के रूप में उपज में एक सफल वृद्धि के लिए महत्वपूर्ण भी maleimide के साथ प्रतिक्रिया होगी। TCEP के बाद maleimide जोड़कर, TCEP पहले प्रोटीन को कम करने से भस्म हो जाएगा। प्रोटीन के लिए TCEP के आधे के बराबर है, एक ही कारण के लिए प्रयोग किया जाता है ताकि अतिरिक्त TCEP मुक्त maleimide साथ unfavorably प्रतिक्रिया के लिए उपलब्ध नहीं है। प्रोटीन के इंटीरियर पर स्ट्रक्चरल डाइसल्फ़ाइड पुलों TCEP के अलावा द्वारा प्रभावित होने की संभावना नहीं हैंया इस तरह के डीटीटी के रूप में अन्य एजेंटों को कम करने, बशर्ते कि प्रोटीन जैसे उच्च तापमान या यूरिया के एक उच्च एकाग्रता के रूप में denaturing की स्थिति में नहीं रखा है। उदाहरण के लिए, डीटीटी का एक बड़ा अतिरिक्त के अलावा से पहले FPLC को शुद्धि CYT करने के लिए प्रोटीन की मात्रा शुद्धि के बाद बरामद किया पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है। TCEP द्वारा संरचनात्मक सिस्टीन पुलों की कमी संदिग्ध है, तो यह देशी, गैर अप्राकृतिकरण परिस्थितियों में एक प्रोटीन जेल चलाने के द्वारा की पुष्टि की जा सकती है।

आरयू (द्वितीय) bisterpyridine लेबल साइटोक्रोम इस विधि में संश्लेषित नी 2 + स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी 14 के माध्यम से शुद्ध होता है। अन्य शुद्धि तरीकों जैसे एक एंटीबॉडी स्थिर चरण के रूप में इस तरह के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, आयनों / कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, और विशिष्ट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी रूप में मौजूद हैं। सामान्य तौर पर, विधि, ऊपर वर्णित के रूप में ही रहता है एकाग्रता और डायलिसिस कदम followin के साथजी chromatographic शुद्धि भंडारण के लिए एक उपयुक्त बफर करने के लिए bioconjugate उत्पाद लौटने के लिए।

अगर एक bioconjugation सफल निर्धारण करने की प्राथमिक विधि MALDI-TOF एमएस के माध्यम से है। यह देशी प्रोटीन और प्रोटीन covalently एक छोटा सा अणु, एक फर्क अक्सर कम से कम 1,000 दा के साथ लेबल के बीच मास में छोटा सा फर्क पता लगाने के लिए सबसे सही तरीका है। एक MALDI-TOF एमएस प्रयोग चलाने का सबसे कठिन हिस्सा मैट्रिक्स चुनाव और तकनीक खोलना है; हालांकि कहवे एसिड प्रोटीन और bioconjugates इस काम में इस्तेमाल के विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय, सामान्य प्रयोजन मैट्रिक्स होना पाया गया है। एक संभावित विकल्प के रूप में, sinapinic एसिड प्रोटीन का विश्लेषण के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया MALDI मैट्रिक्स है। MALDI-TOF एमएस आंकड़ों के विश्लेषण से अपेक्षाकृत सरल है। चित्रा 2 दोनों शुद्ध आईएसओ 1 CYT की खासियत MALDI-TOF एमएस स्पेक्ट्रम चलता (एम डब्ल्यू = 12706 दा) और शुद्ध आरयू (द्वितीय) -cyt सी (Mडब्ल्यू = 13559 दा), जो दोनों के निकट से गणना की आणविक जन के अनुरूप हैं। पवित्रता भी मनाया जा सकता है, unreacted स्पेक्ट्रम में एक आईएसओ 2 साइटोक्रोम ग चोटी की कमी (एम डब्ल्यू = 12532 दा) और bioconjugate स्पेक्ट्रम में एक आईएसओ 1 साइटोक्रोम ग चोटी की कमी टिप्पण। Bioconjugate जन भी जेल वैद्युतकणसंचलन उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है। 3 चित्रा, एक 12% बीआईएस Tris प्रोटीन जेल, bioconjugation के लिए सबूत के दो टुकड़े प्रदान करता है। सबसे पहले, आरयू (द्वितीय) के लिए गैर को कम करने की शर्तों के तहत एक डिमर बैंड के अभाव -cyt सी इंगित करता है अब एक मुक्त सिस्टीन है कि वहाँ, और दूसरा, bioconjugate बैंड की मामूली बदलाव ऊपर की तरफ आणविक वजन में वृद्धि करने के लिए अनुवाद। प्रोटीन जैल अमूल्य हैं और निश्चित रूप से सफल bioconjugation न केवल छोटे अणु संलग्नक के लिए, लेकिन यह भी प्रोटीन dimers 5 या प्रोटीन बहुलक bioconjugates 9 के संश्लेषण के लिए के सबूत प्रदान कर सकते हैं।

प्रोटीन के लिएऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या हीम युक्त cytochromes, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में chromophores युक्त रचना और bioconjugate की उपज का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 1: शुरुआती सामग्री स्पेक्ट्रा के 1 रेखीय इसके अलावा यह 1 करने के लिए वास्तविक bioconjugate स्पेक्ट्रम की तुलना करके के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, bioconjugate का एक काल्पनिक यूवी विज़ स्पेक्ट्रम के निर्माण की अनुमति देता है। 1 इसके अलावा स्पेक्ट्रम, रचना अनुमान लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि दो या अधिक आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimides nonspecifically प्रोटीन से जुड़ी थी, bioconjugate के 480 एनएम बैंड स्पेक्ट्रम की भविष्यवाणी की तुलना में अधिक हो जाएगा। इसके अलावा, bioconjugate की एकाग्रता 97.6 सेमी -1 मिमी -1 के 410 एनएम दाढ़ निगलने को मान का उपयोग कर अनुमानित किया जा सकता है। इसका कारण यह है आरयू (द्वितीय) (टन प्रति वर्ष) 2 -maleimide इस क्षेत्र में कम से कम absorbance है bioconjugate के लिए एक ही माना जाता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए थासिस्टीन-maleimide रसायन विज्ञान के माध्यम से टी bioconjugation कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, ब्याज की प्रोटीन एक एकल, सुलभ सिस्टीन अवशेषों, वरना प्रोटीन इंजीनियरिंग एक परिचय कराने के लिए किया जाना चाहिए होना चाहिए। दूसरे, सिस्टीन-maleimide बंधन ऐसे एल्बुमिन और प्लाज्मा अनुप्रयोगों 19 के संदर्भ में glutathione के रूप में अन्य मुक्त thiols, साथ आदान प्रदान करने की संभावना है। ऐसी विनिमय विलायक पहुंच और प्रोटीन की सतह पर स्थानीय आरोप पर अत्यधिक निर्भर है। Maleimide-thiol लिंकेज अभी भी प्लाज्मा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है, लेकिन लंबे समय तक स्थिरता मास स्पेक्ट्रोमेट्री और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर जाँच की जानी चाहिए।

इस के बावजूद, जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, redox केन्द्रों, पॉलिमर, और अन्य प्रोटीन प्रोटीन के लिए सिस्टीन-maleimide रसायन विज्ञान के माध्यम के रूप में उपन्यास अणुओं के अति विशिष्ट, उच्च उपज लगाव एक शक्तिशाली तकनीक है कि दिलचस्प macromolecular निर्माणों की एक श्रृंखला की अनुमति देता है एक होने के लिए हैccessed। रासायनिक अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटीन bioconjugates की बड़ी मात्रा करने के बाद भविष्य प्रोटीन बाध्यकारी, आत्म विधानसभा, एंजाइम कैनेटीक्स और प्रोटीन स्थानीयकरण शामिल अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि ऊपर का प्रदर्शन किया, सामग्री शुद्धि, प्रतिक्रिया माध्यम की पसंद है, और इस तरह के एजेंटों को कम करने के रूप में अनुपूरक अभिकर्मकों के अलावा शुरू करने या surfactants सभी bioconjugation पैदावार पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। शुद्धीकरण सबसे आसानी से प्रोटीन-संगत क्रोमैटोग्राफी द्वारा हासिल की है, और लक्षण MALDI-TOF एमएस, जेल वैद्युतकणसंचलन का एक संयोजन का उपयोग कर पूरा किया है, और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 71496
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71691
sodium chloride Sigma-Aldrich 73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae Sigma-Aldrich C2436
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
TSKgel SP-5PW Sigma-Aldrich Tosoh SP-5PW, 07161 3.3 ml strong cation exchange column
Amicon Ultra-15  Merck-Millipore UFC900308 3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units Thermo Scientific 66333 3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide Lab made see ref (14)
acetonitrile Sigma-Aldrich A3396
ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride  Sigma-Aldrich 93284
imidazole Sigma-Aldrich 56749
nickel acetate Sigma-Aldrich 244066
AcroSep IMAC Hypercell column Pall via VWR: 569-1008 1 ml IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter Whatman Z697958 47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter Merck-Millipore SLGV013SL syringe filters for proteins
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84426 Extremely corrosive! Use caution.
caffeic acid Sigma-Aldrich 60018 MALDI matrix
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707 extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain Thermo Scientific LC6060 Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel Thermo Scientific NP0342BOX precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925 premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0008 premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) Thermo Scientific NP0004 premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Thermo Scientific NP0002 premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS Applied Biosystems
Acta FPLC GE Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer Varian-Agilent UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser Merck-Millipore ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette Hellma 105-201-15-40 100 microliter cuvette

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References

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