Hur att studera Basement Membrane styvhet som en Biophysical Trigger vid prostatacancer och andra åldersrelaterade sjukdomar eller metabola sjukdomar

Cancer Research
 

Summary

Här förklarar vi ett protokoll för att modellera den biofysiska mikro där tvärbindning och ökad styvhet av basalmembranet (BM) som induceras av avancerade glykation slutprodukter (AGE) har patologisk relevans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att studera biofysiska mikro relaterade till ökad tjocklek och styvhet basalmembranet (BM) under åldersrelaterade sjukdomar och ämnesomsättningssjukdomar (t.ex. cancer, diabetes, mikrovaskulär sjukdom, retinopati, nefropati och neuropati) . Utgångspunkten för modellen är icke-enzymatisk tvärbindning av rekonstituerad BM (rbM) matrisen genom behandling med glykolaldehyd (GLA) att främja avancerade glykation slutprodukt (AGE) generation via Maillard-reaktionen. Exempel på laboratorietekniker som kan användas för att bekräfta AGE generation, icke-enzymatisk tvärbindning och ökad styvhet i GLA behandlade rbM beskrivs. Dessa innefattar framställning av nativt rbM (behandlade med fosfatbuffrad saltlösning, PBS) och stel rbM (behandlade med GLA) för bestämning av: dess AGE halt genom fotometrisk analys och immunofluorescerande mikroskopi, dess icke-enzymatisk tvärbindning genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores (SDS PAGE) samt konfokalmikroskopi, och dess ökade styvhet med användning reometri. Det förfarande som beskrivs här kan användas för att öka styvheten (elasticitetsmodul, E) av rbM upp till 3,2-faldig, i överensstämmelse med mätningar som gjorts på friska kontra sjuk mänsklig prostatavävnad. För att återskapa den biofysiska mikro i samband med åldrande och sjuka prostatakörteln tre typer prostatacell infördes på inhemska rbM och stel rbM: RWPE-1, prostata epitelceller (PEC) som härrör från en normal prostatakörteln; BPH-1, PEC härrör från en prostatakörteln påverkas av godartad prostataförstoring (BPH); och PC3, metastaserande celler härledda från en sekundär bentumör härrör från prostatacancer. Flera parametrar kan mätas, inklusive storlek, form och invasiva egenskaper hos 3D glandulära acini bildas av RWPE-1 och BPH-1 på nativt kontra styv rbM, och medelcelllängd, migratory hastigheten och varaktigheten av cellrörelse av 3D spherOID bildas av PC3-celler under samma betingelser. Cellsignalvägar och subcellulära lokalisering av proteiner kan också utvärderas.

Protocol

1. Induktion av BM Stelhet inducerad av GLA behandling (icke-enzymatisk Tvärbindning)

  1. Tina en frusen ampull av BM matris (10 ml) genom att inkubera vid 4 ° C (stående på is i ett kallt rum eller kylskåp) tills innehållet i flaskan har blivit flytande (8-16 h).
    Varning: Om ett kallt rum / kylskåpet inte används, täcka hela flaskan med is. Detta kommer att förhindra stamlösningen av BM från att stelna.
  2. För framtida experiment och för att undvika upprepade frysupptiningscykler, förbereda 25 x 0,4 ml alikvoter från varje ny 10 ml injektionsflaska med BM matris. Förvara flaskor vid -80 ° C tills utgångsdatum som anges av tillverkaren. När det behövs, tina ampuller vid 4 ° C som står på is under 2 h.
  3. Förbered en jämn yta av is. Placera en 8-brunnars kammarobjektglas på toppen av is för att hålla en temperatur på 4 ° C under beläggningsförfarandet. Tina en flaska med BM matris vid 4 ° C.
    Obs: En 0,4 ml injektionsflaska med BM matrisen är tillräcklig för att coat en hel 1 x 8 brunnar kammare bild. Håll flaskan täckt av is vid hantering för att förhindra att BM matrisen stelnar.
  4. Skär av dispenseringsänden av en 200 mikroliter pipettspets med sax. Kyl trubbig 200 mikroliter pipettspets till 4 ° C och placera den på en 200 pl kapacitet pipettering stöd. Ta upp 40 pl den kalla BM matrislösning i pipettspetsen och överföra den i en brunn på den kylda 8 brunnar kammarglas.
    Notera: 40 fil BM lösning är tillräckligt för att täcka en yta på 0,8 cm 2. Hålla pipettspetsar kylda under beläggningsförfarandet för att undvika stelning av BM-lösning. Inte införa luftbubblor i BM matrislösning och se brunnen jämnt belagda utan bildning av en synlig menisk vid kanterna.
  5. Upprepa steg 1,4 beroende på antalet brunnar och kammare krävs.
  6. Efter beläggning, placera 8-brunnars kammarobjektglas vid 37 ° C under 30 min för att främja polymerisationav BM. Stäng inkubatordörren mycket noggrant för att undvika oönskade störningar av vätskan rbM. Inte överstiga 30 min inkubationstid för att undvika uttorkning av rbM gel.
    Obs: Den resulterande gelén är den naturliga beredda BM (rbM). Den 37 ° C inkubationssteg kräver inte 5% CO2. Men för enkelhets skull utföra detta steg i en vävnadsodlingsinkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 (med befuktning).
  7. Förbered 50 mM glykolaldehyd (GLA) utspädd i 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,8). Sterilisera lösningen genom att passera den genom ett 0,22 mikron sprutfilter med användning av en 50 ml spruta.
    1. För en tvärbindningsreaktion i en slutlig volym av 250 | il av 50 mM GLA, tillsätt 25 | il av 0,5 M natriumcyanoborhydrid eller 2,5 M aminoguanidin till 125 | il av 100 mM GLA (2x stock) och 100 | il av 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,8 ). Sterilisera stamlösningarna genom att passera dem genom en 0,22 mikron sprutfilter med användning av en 50 ml spruta.
      Varning: Hantera natriumcyanoborhydrid klädd i en labbrock, handskar, ansiktsmask och andningsskydd när du arbetar i ett dragskåp.
  8. Tillsätt 250 pl av GLA lösning för att täcka den polymeriserade rbM gel och inkubera vid 37 ° C under 6 h för att framställa en halvstyv rbM gel eller 14 h för att framställa en styv rbM gel.
    Obs: Volymen av GLA sätts måste täcka polymeriserade rbM gel och bör anpassas därefter. Om olika GLA inkubationstider används bör RBM geler analyseras för att avgöra den utfällbara ökningen rbM styvhet (se steg 2,4).
    1. Bered en negativ kontroll genom att inkubera en nativ rbM gel i 250 pl steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 14 h vid 37 ° C.
    2. Förbereda ytterligare två kontroller där bildningen av Schiff-bas eller Amadori-addukt omlagring under tvärbindningsreaktionen inhiberas, genom tillsats av 50 mM natriumcyanoborhydrid eller 250 mM aminoguanidin.
  9. Förbereda en M glycin eThyl ester (GEE) utspädd i PBS. Sterilisera lösningen genom att passera den genom ett 0,22 mikron sprutfilter med användning av en 50 ml spruta.
  10. Efter den angivna inkubationstiden, försiktigt bort GLA lösning av de tvärbundna RBM geler, GLA lösning innehållande inhibitorer från kontroll RBM geler och PBS från kontroll nativa RBM geler. Tillsätt 250 pl av GEE lösning på alla de RBM geler och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
    Obs: Detta steg släcker tvärbindningsreaktionen.
  11. Tvätta alla RBM geler 10 gånger i 500 l PBS för att avlägsna alla spår av GLA och GEE. Inkubera RBM gelerna över natten vid 37 ° C i 400 | il av PBS för att förhindra deras uttorkning.
    1. Analysera RBM geler för AGE ackumulation, icke-enzymatisk tvärbindande och viskoelastiska egenskaper (steg 2.1-2.4). För Rheometric analys av deras viskoelastiska egenskaper förbereda RBM geler i kloningsringar (steg 2,4).
    2. För cellodling, skölj RBM geler 2 gånger med 500 pl kultur migdia innan sådd cellerna (steg 5 och 6). Utför tvättar försiktigt utan pipettspetsen vidrör gelytan.

2. Kvantifiering av icke-enzymatiska Tvärbindning och styvhet rbM behandlad med GLA

  1. fotometrisk analys
    1. Mäta AGE ackumulation på GLA-behandlade och kontroll RBM geler med användning av fotometrisk analys för att fastställa omfattningen av Maillard-reaktionen.
      1. Efter steg 1,11, ta bort PBS från RBM-geler i de 8-brunnar kammare diabilder och tillsätt 250 | il iskall dubbeldestillerat vatten. Inkubera vid 4 ° C under 16-24 timmar för att säkerställa att matrisen är helt flytande.
        Obs: RBM peptider i denna lösning innehåller åldrar med auto-fluorescerande egenskaper.
      2. Överföra den kondenserade BM lösningen till ett 1,5 ml rör och mäta den fluorescerande emissionen av lösningen med användning av en spektrofotometer (excitationsvåglängd = 370 nm; emissionsvåglängd = 440 nm).
  2. SDS-PAGE-analys av cyanbromid Peptider
    1. Lösa de GLA-behandlade och kontroll RBM geler på en polyakrylamidgel för att bekräfta att GLA har inducerat tvärbindning och bildningen av makrofibrer.
      1. Centrifugera den kondenserade BM lösning uppsamlas vid steg 2.1.1.2 vid 10.000 xg under 5 min vid rumstemperatur.
      2. Bered en förrådslösning innehållande 2 g / ml cyanogenbromid utspädd i acetonitril.
        Varning: Hantera alltid cyanbromid i ett dragskåp iklädd en labbrock, handskar, ansiktsmask och respirator.
      3. Avlägsna supernatanten, återsuspendera BM gel-pelleten i 500 | il 20 mg / ml cyanogenbromid + 70% vol / vol myrsyra och inkubera över natten vid RT.
      4. Använd en 1 ml engångsspruta för att överföra suspenderades BM gel pelleten i en dialyskassett med en molekylvikt avskuren 3,5 kDa.
      5. Dränka in kassetten i en 500 ml glasbägare innehållande 500 ml dubbeldestillerat vatten och en magnetisk omrörarstav.Placera denna på en magnetomrörare och dialysera över natten (16 h) vid 4 ° C (i ett kallt rum) för att avlägsna alla spår av cyanogenbromid och myrsyra.
      6. Använda en 1 ml engångsspruta för att överföra den dialyserade BM lösning från kassetten in i ett 1,5 ml rör.
      7. Analysera 25 pl av varje BM provet på en 12% volym / volym polyakrylamidgel 10,11. Efter SDS-PAGE, utföra silverfärgning av polyakrylamidgelen 12 för att visualisera det elektroforetiska mönstret av cyanbromid-matris peptider 13.
  3. Immunofluorescerande mikroskopi Analys
    1. Utför immunofluorescerande färgning av GLA behandlas och styra RBM geler med anti-AGE / pentosidin, anti-kollagen IV och anti-laminin-antikroppar följt av konfokalmikroskopi att visualisera ackumulerade tiden och kollagen IV / laminin fiber strukturella omorganiseringar i det tvärbundna rbM gelar 13.
      Obs: Använd alltid en tillräcklig volym för att täcka lockandere rbM gel under inkubationer och tvättar utan att röra rbM yta med pipettspetsen. För information om att analysera 3D acini kulturer genom immunofluorescens se referens 6 och konfokalmikroskopi av 3D-acini se 14 referens.
      1. Tvätt GLA ​​behandlade och kontroll RBM geler med 8-brunnar kammare diabilder 2 gånger med 300 ul av PBS + (PBS innehållande 0,1 mM CaCl2 och 0,5 mM MgCl2) under 5 min vid RT.
      2. Avlägsna PBS + tillsätt sedan 300 | il av 4% vikt / volym paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS + för att täcka varje rbM gel. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur för att fixera RBM komponenterna.
      3. Ta bort 4% vikt / volym PFA lösning. Lägg lägga 300 pl 75 mM NH4CI + 0,5 mM MgCl2-lösning och inkubera under 5 min vid RT (repetera 5x) för att släcka fixering.
      4. Förbered Immunofluorescens buffert (IF-buffert) genom att göra följande lösning i sterilt vatten: 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN3, 0,1% vikt / volym bovint serumalbumin, 0,5% volym / volym polyetylenglykol tert-oktylfenyl eter och 0,05% volym / volym polyetylenglykol sorbitanmonolaurat.
      5. Förbereda IF blockerande buffert genom att komplettera IF-buffert med 20% volym / volym getserum.
      6. Avlägsna härdning lösning och tillsätt 300 pl IF blockerande buffert till RBM geler för att förhindra ospecifika reaktioner. Inkubera 2 timmar vid RT på en skakande plattform.
      7. Avlägsna IF blockerande buffert och inkubera RBM geler för 16 h vid 4 ° C med 300 ul av primär antikropp utspädd i IF blockeringsbuffert (1: 500 mus-anti-pentosidin mAb; 1/250 kanin anti-kollagen IV pAb; 1 / 250 kanin anti-laminin A / C pAb).
        Notera: Inkuberingar under längre tid än 20 timmar vid 4 ° C kan GÖRA FLYTANDE RBM.
      8. Ta bort den primära antikroppen och tvätta 3 gånger (10 min vardera) med 300 ul av IF-buffert vid rumstemperatur på en skakande plattform.
      9. Avlägsna IF-buffert ochTillsätt 300 | il av den sekundära antikroppen (get-anti-kanin eller anti-mus-IgG [H + L]) konjugerade med en fluorokrom utspätt 1: 500 i IF blockeringsbuffert. Inkubera i 2 h vid RT på en skakande plattform.
      10. Avlägsna den sekundära antikroppen och inkubera i 300 pl av IF-buffert under 10 min vid rumstemperatur. Avlägsna IF-buffert och tvätta 3 x 10 min i 300 pl PBS + vid rumstemperatur.
      11. Fix och släcka en andra gång, såsom beskrivits ovan (steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3).
      12. Montera färgade RBM geler i monterings media och analysera bildningen av täta buntar av stora komponenter med epifluorescent eller konfokalmikroskopi.
        Obs: För mer information om att analysera 3D acini kulturer genom immunofluorescens se referens 6 och epifluorescent och konfokalmikroskopi av 3D acini se 14 referens.
  4. reologisk analys
    1. Utför Rheometric analys av GLA behandlas och styra RBM geler för att mäta deras viscoelasticity (styvhet).
      1. Inrättat RBM geler som är 1 mm tjocka i en cirkulär form med en diameter på 8 mm. För att göra detta, placera en kloningsring (8 mm diameter) i en brunn på en 24-brunnars odlingsplatta och lägga BM matrislösning som framställts såsom beskrivits i steg 1,3-1,6.
        Obs: För korrekt rekapitulation av RBM geler som används för experiment, RBM geler förberedda för Rheometric analys måste ha samma yta och tjocklek som RBM geler som upp i åtta brunnar kammare. RBM geler analyseras i figur 3 var 1 mm tjocka och 8 mm i diameter.
      2. Behandla RBM geler som inrättats i kloningsringar med PBS, GLA under 6 timmar och GLA för 14 timmar såsom beskrivits ovan (steg 1,8 till 1,11).
      3. Mäta elasticitetsmodulen (E) av de åtta mm diameter RBM-geler på en reometer med en 8 mm parallella plattor tandade geometri, över ett område av 1-3% töjning vid en svängning fast frekvens av 1 Hz och temperatur på 21 ° C. För ytterligare information omRheometric analys av ECM geler se referenser se referens 13,15,16.
        Obs! E bestäms från den resulterande lagrings skjuvmodul (G ') genom användning av följande ekvation E = 2 * G' * (1 + v), där v är Poissons tal av 0,5, såsom beskrives i referens 13,15 , 16.

3. Kultur och hantering av Normal PEC linjen, RWPE-1

  1. Växa RWPE-1-celler i keratinocyt serumfritt media (KSFM) kompletterat med 5 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 50 | j, g / ml bovint hypofysextrakt (BPE) och 50 U / ml penicillin med 50 | j, g / ml streptomycin ( slutföra KSFM).
    OBS: För att undvika induktion av epitel till mesenkymala gör (EMT) -liknande övergången inte utsätta RWPE-1 celler till serum. Tillåt fullständig KSFM att nå rumstemperatur under 30 minuter efter avlägsnande från förvaring vid 4 ° C och inte varmt i en 37 ° C vattenbad, eftersom detta kommer att inaktivera EGF och BPE.
  2. Aspirera komplettKSFM från ett sammanflytande 10 cm 2 tallrik RWPE-1-celler, skölj med 5 ml förvärmda PBS och tillsätt 5 ml av 0,05% v / v trypsin se till att alla celler är täckta med lösningen.
    1. Placera cellerna i en vävnadsodlingsinkubator inställd vid standardförhållanden av 37 ° C och 5% CO2 (med befuktning) för 5 till 10 min. Kontrollera omfattningen av trypsinering efter fem minuter och knacka försiktigt odlingsplattan för att lossa cellerna.
      Obs: RWPE-1 celler inte tål långa perioder av trypsinering så det rekommenderas inte att hantera mer än två plattor samtidigt. Det är också viktigt att skilja alla celler från plattan för att undvika klonal selektion.
  3. När alla RWPE-1-celler har disassocieras, tillsätt 5 ml varm PBS innehållande 2% volym / volym fetalt kalvserum (FCS) för att släcka trypsinet. pipettera försiktigt upp och ned för att bryta upp cellaggregat innan överföring av cellerna till ett centrifugrör.
  4. Centrifugera disassocierade cellerna vid 125-150 xg under 5 min vid 25 ° C, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten av celler i 5 ml komplett KSFM tills en suspension av enskilda celler erhålls.
  5. Överföring 1 ml av återsuspenderas celler i ett nytt rör och till 9 ml komplett KSFM att propagera cellerna vid en 1: 5 passage utspädning för efterföljande experimentell användning. Räkna resten av cellerna med hjälp av en hemocytometer för att inrätta acini (se avsnitt 5.1).
    Obs: Inte kultur RWPE-1 celler för mer än 10 passager sedan efter långa perioder av kultur de inte bildar acini med rätt arkitektur.
  6. Ändra odlingsmedia varje 48 timmar för att säkerställa att EGF och BPE förblir aktiva.
    Obs: Inkludera detta medium förändring för någon av de behandlingar som sträcker sig utanför 48 timmar.

4. Kultur och Hantering av BPH Cell Line, BPH-1

  1. Kultur BPH-1-celler i RPMI 1640-medium kompletterat med 5% volym / volym FCS, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin. värmaodlingsmedia, PBS och 0,25% vikt / vol trypsin-0,53 M EDTA-lösning till 37 ° C före användning.
    Obs: Celler kan också odlas i medium med 2,5% volym / volym FCS 8.
  2. Aspirera odlingsmedia från en konfluent 10 cm 2 platta av BPH-1-celler och tvätta cellerna 2 x med 3 ml PBS för att avlägsna alla spår av odlingsmedium med serum som kan släcka trypsin reaktionen.
  3. Aspirera PBS och tillsätt 3 ml trypsin-EDTA-lösning för att täcka cellerna. Placera plattan i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 (med befuktning) under 5 min. Ta bort trypsin-EDTA-lösning när cellerna är runda men sitter kvar i skålen. Tvätta cellerna med 5 ml PBS.
  4. Efter avlägsnande av PBS, tillsätt 5 ml odlingsmedium och försiktigt pipettera upp och ner för att producera en suspension av enskilda celler. Överföra celler till ett 15 ml rör.
  5. Ta 2 ml av cellsuspensionen till ett nytt centrifugrör med 8 ml av kompletta medier och plattan BPH-1-celler ontoa 10 cm 2 odlingsplatta vid en 1: 5 passage utspädning för efterföljande experimentell användning. Räkna resten av cellerna med hjälp av en hemocytometer för att inrätta acini (se avsnitt 5.2).
    Obs: Håll reda på passagen nummer, som äldre BPH-1-celler inte bildar acini med en ordentlig arkitektur. En passage nummer mer än 10 är inte önskvärt.
  6. Ändra odlingsmedia varje 72 timmar.

5. 3D kultur prostatakörteln acini på Native och Stiff rbM

  1. Om RWPE-1-celler som används för att bilda acini, späd 5000 celler framställda i steg 3,5 i 300 pl komplett KSFM kompletterat med 2% volym / volym av BM-lösning.
  2. Om BPH-1-celler som används för att bilda acini, späd 2.500 celler framställda i steg 4,5 i 300 | il RPMI 1640 odlingsmedium kompletterat med 2% volym / volym av BM-lösning.
    Beakta: BPH-1-celler är större än RWPE-1-celler så sjunkande antalet nya BPH-1-celler används för att erhålla en liknande fördelning av acini efter 6 dagars culTure.
  3. Utsäde försiktigt cellerna på personen och AGE-stelnade rbM och försiktigt placera kulturer i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 (med befuktning) för att säkerställa en jämn fördelning av växande acini i brunnen och att varje cell delar sig för att producera en acina.
  4. Varje 2 dagar ersätta odlingsmediet med färskt odlingsmedium innehållande 2% volym / volym BM lösning för att säkerställa att cellerna har de tillväxtfaktorer som krävs för normal acina homeostas.
  5. Övervaka acinar morfologi i växande kulturer med hjälp av bright mikroskopi 13.
    Obs: Efter 3 dagar i odling enskilda celler bildar ett kluster av> 3 celler och efter en vecka prostatakörteln acini med en diameter på ~ 50 pm kommer att observeras.
  6. Följ protokoll som beskrivs i 2.3 för att utföra immunofluorescens med användning av antikroppar som är specifika för markörer av cellmatris sammanväxningar, cell-cell sammanväxningar, apico-basal polaritet och invasions 13.

6. 3D kultur av prostatatumörcellaggregat på ursprunglig och Stiff rbM

  1. Kultur PC3-celler i RPMI 1640-medium innehållande 10% volym / volym FCS och 50 U / ml penicillin med 50 | ig / ml streptomycin. Värma odlingsmedia, PBS och 0,25% vikt / vol trypsin-0,53 M EDTA-lösning till 37 ° C före användning.
  2. Aspirera odlingsmedium från ett sammanflytande 10 cm 2 odlingsskål av PC3-celler och tvätta cellerna 2x med 3 ml PBS för att avlägsna alla spår av FCS som kan släcka trypsin reaktion.
  3. Aspirera PBS och tillsätt 3 ml trypsin-EDTA-lösning för att täcka cellerna och inkubera i 1 min.
  4. När cellerna blir rundade, men sitter kvar i skålen, försiktigt aspirera trypsin-EDTA-lösning och tvätta med 3 ml PBS tillavlägsna alla spår av trypsin.
  5. Efter avlägsnande av PBS, tillsätt 5 ml odlingsmedium och försiktigt pipettera upp och ner för att producera en suspension av enskilda celler. Överföra celler till ett 15 ml rör.
  6. Ta 1 ml av PC3 cellsuspensionen in i ett nytt centrifugrör och tillsätt 9 ml odlingsmedia. Platta cellerna på en 10 cm 2 odlingsskål (1:10 utspädning) för efterföljande experimentell användning. Räkna de återstående cellerna med användning av en hemocytometer.
  7. Späd 2500 PC3-celler som framställts i steg 6,6 i 300 | il RPMI 1640 odlingsmedium kompletterat med 2% volym / volym av BM lösning för att medge bildning av en gradientgel i kulturen.
  8. Utsäde försiktigt cellerna på personen och AGE-stelnade rbM och försiktigt placera kulturen i inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 (med befuktning) för att säkerställa en jämn fördelning av växande sfäroider i brunnen.
  9. Ändra odlingsmedia varje 72 timmar.
  10. För att studera effekten av styvt (AGE-rika) rbMpå prostatatumörcell migration, bild PC3-celler med användning brightvideotidsförlopp mikroskopi med användning av temperatur / CO 2 kontroll och en fuktad kammare 17.
    Obs: PC3-celler växer i strängar på infödda rbM och inte bildar acini med en lumen, men om de lämnas att växa mer än 72 timmar på infödda rbM de kommer att utgöra 3D sfäroider.
  11. Efter datainsamling, manuellt spåra PC3-celler och beräkna deras migration hastighet, form (töjning ratio) och ihållande migrations 17-19.
    Obs: Persistence = förhållandet D / T, D = avstånd från början till slut av cell bana, T = total längd av cell bana.

Representative Results

3D Prostata acini odlade på Stiff rbM

Efter 6 dagar i kultur, PEC härrör från normal prostatavävnad (RWPE-1) (Figur 1A) och BPH vävnad (BPH-1) (Figur 1B) bildar acini på nativt (PBS-behandlade) rbM som är organiserade i enhetliga sfäroider av epitel celler. Dessa acini har också egenskaper starkt organiserade PEC med apikal till basala polaritet och en synlig luminalhåligheten 13,20.

Den acini bildas av PEC härledda från normal prostatavävnad (RWPE-1) (Figur 1A) och BPH vävnad (BPH-1) (Figur 1B) på stelnade (AGE-rika) rbM (behandlade med GLA) har en störd arkitektur (skiftning från sfärisk till polygonal form och celler utskjutande / migrera från acini i AGE-rika rbM) (Figur 1A). Dessa acini kännetecknas också av mycket oorganiserade PEC som har förlorat sin apikala till basala polaritet med en liten eller obefintlig luminala utrymmet 13.

Figur 1
Figur 1:. Prostata epitelceller odlas som 3D Glandulär acini på Native och Stiff Utspädd Basement Membrane (rbM) (A) bright bilder av RWPE-1-celler som odlas för 12 timmar upp till 6 dagar på RBM geler som behandlats med PBS (native) eller 50 mM glykolaldehyd under 14 h (AGE-rika stel); Skalstreck = 50 | im. (B) BPH-1-celler, odlades såsom beskrivits i panel A; Skalstrecken = 50 pm; informationen representerar 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1 "src =" / filer / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Tabell 1:. Kännetecken för Prostate Epithelial RWPE-1 acini Grown på Native, Semi-Stiff och Stiff rekonstituerade basalmembran (rbM) RWPE-1 acini odlades på rbM förbehandlats med PBS under 14 h (nativ), glykolaldehyd (GLA ) under 6 h (halvstyv) eller GLA i 14 h (styvt). För acinar form, i procent (%) ± standardavvikelse (SD) av runda, var halv polygonal och polygonal acini beräknas från 5 oberoende experiment (50 acini kvantifieras per tillstånd). Relativ acinar storlek beräknades (native rbM = 100%) från 3 oberoende experiment. För invasivitet ades% ± SD acini med en eller flera utskjutande celler beräknades från 3 oberoende experiment. Faldig förändring beräknas genom att dividera medelvärdet som erhållits enligt semi-styva eller stela förhållanden med motsvarande värde för naturliga förhållanden. P-värden beräknades med användning av Students t-test (α = 0,05).

INNEHÅLL "fo: keep-together.within-page =" 1 "> åldersberoende ökat rbM styvhet främjar PC3 prostatatumörcell migration

PC3-celler odlade på infödda rbM migrera genom att upprätthålla en kontinuerlig cell-cellkontakt, medan PC3-celler odlas på AGE-rika (styvt) rbM drag oberoende av varandra (Figur 2A). Efter 72 timmar i odlings PC3-celler bildar foci (sfäroider) på native (PBS-behandlade) rbM, medan PC3-celler på styva (AGE-rika) rbM inte från sfäroider och migrera oberoende (Figur 2B). PC3-celler på styva (AGE-rika) rbM är mer långsträckt än PC3-celler odlade på nativt rbM (figur 2C). PC3-celler på styva rbM migrerar snabbare än PC3-celler odlade på nativt rbM (figur 2D). PC3-celler på hård rbM visar en minskning av uthållighet jämfört med PC3-celler odlade på nativt rbM (Figur 2E).

"Bild Figur 2:. Prostatatumör Cell Migration på Native och Stiff Utspädd Basement Membrane (rbM) (A) bright bilder av PC3-celler odlade på RBM geler som behandlats med PBS (native) eller 50 mM glykolaldehyd under 14 h (AGE-rika, styvt) . Cellerna avbildas med en bright mikroskop (10X objektiv) och en upptagningshastighet av en bild per timme under 12 timmar följt av cell spårning för att generera banor. Bilderna motsvarar de tidpunkter efter 0, 3, 6, 9 och 12 timmar. Banor av enskilda celler visas för 12 timmar tidpunkt. Skalstreck = 100 | j, m. (B) PC3-celler odlades på nativt eller styv rbM i 72 h, och avbildas såsom beskrivits i panel (A). Skalstreck = 100 | j, m. Detalj visar markerade området vid 2X förstoring. (C) Medel ± SD cellängd (^ m); signifikant skillnad mellan nativt rbM och stel rbM (p = 1,2 x 10 -23). ( (E) Medelvärde ± SD persistens av cellrörelse (förhållande D / T, där D = avståndet från början till slutet av cell bana, T = total längd av cell bana); signifikant skillnad mellan nativt rbM och stel rbM (p = 0,0007). För paneler CE> 10 celler analyserades, är data som representerar 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Ett protokoll för generering av 3D körtel acini från MEC i rena RBM geler 6 ändrades i en tidigare studie genom tillsats av 4 mg / ml typ I-kollagen till rbM matrisen. Tillsatsen av kollagen resulterade i elasticitetsmodul rbM gel ökar från 175 ± 37 till 1589 ± 380 Pascal. Denna 9,1-faldig ökning av styvheten modul tillväxt, överlevnad, migration och differentiering av MEC 21. Protokollet ändrades igen genom att inkludera en behandlingssteg med D - (-) - ribos för att främja icke-enzymatisk tvärbindning av typ I kollagen som hade lagts till rbM gel. Den resulterande ökningen 15-faldig i styvhet befanns samarbeta med onkogen transformation av MEC att främja deras invasiva beteende 22. Den experimentella tillvägagångssätt att lägga typ I-kollagen till RBM geler underlättar direkt interaktion av MEC med kollagenfibrer, som endast förekommer i mänsklig vävnad efter den fysiska barriären mellan stromaoch epitel från BM genomgår proteolytisk nedbrytning. Genom att generera 3D körtel acini från PEC i rena RBM geler förbehandlats med GLA, öppnar det nuvarande protokollet sättet att studera hur BM styvhet i sig kan utlösa sin invasiva beteende (Figur 3). Nivåerna av BM styvhet inducerade i detta protokoll har fysiologiska relevans. Inkubation med 50 mM GLA under 6 h och 14 h respektive ökade elasticitetsmodul för det rena rbM gel till 175 ± 90 och 322 ± 160 jämfört med 122 ± 55 Pascal i RBM-geler som behandlats med PBS (tabell 1). Detta 1,7-3,2-faldig ökning av rbM styvhet rekapitulerar den 2,5- till 3,4-faldig ökning av styvheten som observerats i malign jämfört med normal prostata eller BPH vävnad 23-26. Som beskrivs i en nyligen publicerad 13 morfologiska förändringar inducerade av ansamling av AGE och RBM stelhet i PEC acini kan kvantifieras för en statistiskt signifikant skifte från arounded till polygonal form, minskade luminal / total acinar område, och utskjutande celler migrerar från acina i AGE-rika rbM (Figur 3). Immunoblotting kan också användas för att bedöma markörer för EMT (t.ex. förlust av E-cadherin 13) och sammandragande beteende (t.ex. fosforylerad myosin lätt kedja-2, pMLC2 13) i Pecs odlas i normal kontra hård rbM (Figur 3). Ytterligare utvärdering med användning av immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi kan appliceras för att visualisera BM (t.ex. laminin, kollagen IV och AGE ackumulation 13), cellulär apikala-till-basal polaritet (t.ex. apikal lokalisering av EEA1: tidiga endosomala antigen 1; och GM130: 130 kDa cis-Golgi markör 13) och cellulära mönster av adhesionsmolekyler (t.ex. E-cadherin lokalisering till cellcellkontakter 13) (Figur 3).

"Bild Figur 3:. Översikt över de olika protokollen som presenteras här Diagrammet visar hur man förbereder och stelna den färdigberedda basalmembranet (rbM) med glykolaldehyd (Maillard reaktion), hur man ympa celler på den styva rbM, hur man analyserar den styva rbM ( omfattningen av Maillard reaktion) och procedurer som kan användas för att analysera de cellulära och molekylära förändringar som induceras av AGE-rika rbM. AGE avancerade glykation slutprodukter; BM, basalmembranet; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1 tidigt endosomala antigen 1; GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenas; GLA, glykolaldehyd; GEE, glycinetylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi markör; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosin lätt kedja-2 fosforylerad vid platser treonin 18 och serin 19; rbM, rekonstruerad basalmembranet; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores. För RWPE1 acini Scale bar = 10 | am; för PC3 tumörcellsfäroider Scale bar = 100 | j, m. Denna siffra har ändrats från referens 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Felsökningssteg kommer att vara nödvändiga om D - (-) - ribos väljs som tvärbindningsmedel för rbM. Under protokoll utveckling fann man att behandling med en M D - (-) - ribos i 72 h, som tidigare beskrivits för rbM / kollagengeler 22, resulterade i dehydratisering och krympning av RBM-geler. Utvärderingen av lägre koncentrationer av D - (-) - ribos och kortare behandlingstider kan bidra till att övervinna denna begränsning.

En potentiell begränsning i framtida tillämpningar av protokollet kan påträffas där högre nivåer av rbM styvhet önskas. Om längre inkubationstider och högre koncentrationer av GLA används för att inducera högre nivåer av rbM gel styvhet kommer det att vara nödvändigt att bedöma om dessa behandlingsförhållanden har en inverkan på cellöverlevnad och -proliferation, såsom tidigare beskrivits 13. Det bör också noteras att inkubation av RWPE-1-celler med serum inducerar en fenotypisk EMT liknande övergång och exponering för serum eller seruminnehållande material bör undvikas. Till exempel, om experiment involverar transfektion av kort interfererande RNA (siRNA) oligonukleotider, förfarandet bör optimeras med hjälp av RWPE-1-celler som odlas i KSFM, utan att växla cellerna låg serum transfektion media. Denna nackdel kan äventyra nivån av gen tysta uppnås vid användning av övergående siRNA strategier i modellen. För vissa målproteiner skulle det vara klokt att använda inducerbara shRNA vektorer för avstämbara geners uttryck och den önskade minskningen i proteinnivåer. Anpassningar som innehåller enzymatisk tvärbindning genom stromal cell eller tumörcell associerad lysyloxidas (LOX) 17 skulle också kunna införlivas i framtida modeller.

jove_content "> Detta protokoll kommer att underlätta framtida studier av pro-invasiva mekanismer som utlöses av åldersberoende BM stelhet i Pécs (RWPE-1, BPH-1) och utvärdering av anti-metastaserande mål i invasiva PTC (PC3). Med tanke på att BPH anses vara en störning i ämnesomsättningen 27 protokollet banar också väg för vår förbättrade förståelse för sambandet mellan metabola sjukdomar och ökad risk prostatacancer. med tanke på att BM styvhet induceras av sin exponering mot AGE kan vara en utlösande faktor för invasiv i andra cancer typer, kommer det att vara av intresse att använda protokollet för att upprätta liknande modeller som innehåller normala epitelceller och tumörceller från andra organ (t.ex. bröst, tjocktarm, äggstockar, bukspottkörtel).

Kritiska steg i protokollet, tillsammans med sin tidsplanering, sammanfattas i figur 4. Under det inledande steget är det viktigt att behålla stamlösningen av rbM vid 4 ° C medan den tinar att förhindra dess polymerization. Pipettspetsar bör inte placeras i rm stamlösning tills de har kylts till 4 ° C. För nästa steg är det också viktigt att se till kammarobjektglas har jämviktats till 4 ° C innan de beläggs med den rbM lösningen. Så snart som temperaturen hos rbM lösning ökas över 4 ° C kommer det att genomgå irreversibel polymerisation för att bilda en gel. Det viktigt att rbM inte störs under polymerisationssteget så att den bildar en jämn yta som är lämplig för cellodling och mikroskopisk analys. Längden på inkubation med GLA med eller utan hämmare av Maillard-reaktionen (natriumcyanoborohydrid och amingoguanidine) avgör hur styv rbM gelen blir. Det rekommenderas att använda en 6 timmars inkubation med GLA om halv styva villkor krävs, och 14 timmars inkubation om stela förhållanden krävs (tabell 1). Alternativa inkubationstider eller koncentrationer av GLA kan användas om olika nivåerav styvhet önskas. I detta fall reologisk analys av RBM geler måste införlivas som ett viktigt steg. Efter steget att släcka Maillard-reaktionen genom inkubering med GEE och de efterföljande tvättsteg med PBS, kan RBM geler användas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i upp till 48 h före deras användning för cellodling. När cellkulturer sätts upp är det viktigt att ändra odlingsmediet (inklusive eventuella behandlingar) varannan dag. Det rekommenderas att hålla 3D cellkulturer för 3-12 dagar enligt parametrarna är föremål för undersökning. För 3D PEC acini rekommenderas att analysera kulturerna efter 6 dagar, och för 3D PTC sfäroider analys rekommenderas efter 3 dagars odling i första instans.

figur 4
Figur 4:. Enkel översikt av protokollet med Kritiska steg och tider indikerade flow diagram visar hur man förbereder och stelna den färdigberedda basalmembranet (rbM) med glykolaldehyd (Maillard reaktion) med kritiska steg och tider som anges. Punkter där protokollet kan stoppas, och RBM geler lagrade, är också indikerade. rbM, rekonstruerad basalmembranet; GLA, glykolaldehyd; GEE, glycinetylester; ON, över natten; PBS, fosfatbuffrad saltlösning; RT rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I - Material for monolayer culture
BPH-1 CaP Cell Line Database PCaCL-132 Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media  ThermoFisher Scientific 17005-075 Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum  First Link UK Ltd 02-00-850 Store at -20 ºC in aliquots
PC3  American Type Culture Collection CRL-1435
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets Oxoid BR0014G
RPMI 1640 medium  Sigma-Aldrich R5886 warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1  American Type Culture Collection CRL-11609
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
Name Company Catalog Number Comments
II - Material for 3D culture
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Aminoguanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 396494 Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well  Thermo Scientific Nunc Lab-Tek TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract  AMS Biotechnology 3445-005-01 Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide  Sigma-Aldrich C91492 Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid Sigma-Aldrich 695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) Sigma-Aldrich 50060 Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA) Sigma-Aldrich G6805
Sodium cyanoborohydride  Sigma-Aldrich 71435 Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns Appleton Woods BC680
Name Company Catalog Number Comments
III - Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThemoFisher Scientific D3571 light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders Sigma-Aldrich C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11001 light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11034 light sensitive
Goat serum Abcam ab7481 Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media  Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb TransGenic Inc KH012
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich F8775 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody   Acris Antibodies R1041 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb Santa Cruz Biotechnology Inc sc-7292 Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) Sigma-Aldrich T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) Sigma-Aldrich P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer ThemoFisher Scientific 66333
Name Company Catalog Number Comments
IV - Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X magnification) microscope Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast  Olympus 
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer BMG Labtech
Name Company Catalog Number Comments
V - Software
Image J 1.47v National Institute of Health, USA
MetaXpress Molecular Divices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18, (2), 123-132 (1996).
  2. Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132, (2), 278-291 (1988).
  3. Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7, (1), 64-71 (2013).
  4. Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29, (5), 402-410 (2010).
  5. To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
  6. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  7. Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18, (6), 1215-1223 (1997).
  8. Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31, (1), 14-24 (1995).
  9. Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17, (1), 16-23 (1979).
  10. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  11. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  12. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, (10), 785-794 (1990).
  13. Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235, (4), 581-592 (2015).
  14. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  15. Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52, (4), 1013-1025 (2008).
  16. Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32, (14), 1863-1868 (2013).
  17. Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3, (2), 151-165 (2016).
  18. Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162, (5), 789-794 (2003).
  19. Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175, (2), 337-347 (2006).
  20. Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13, (3), 538-547 (2015).
  21. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  22. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  23. Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33, (3), 302-309 (2011).
  24. Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4, (4-5), 213-225 (2008).
  25. Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20, (4), 260-274 (1998).
  26. Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34, (7), 1033-1042 (2008).
  27. Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. Article ID:329456 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics