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अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता के आकलन के लिए रासायनिक और Ecotoxicological तरीकों की एक बैटरी का उपयोग estrogenic शक्ति को हटाने के लिए

1, 1, 1, 2, 2, 2, 1

1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

Article
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    Summary

    अंत: स्रावी में खलल न डालें यौगिकों (ईडीसी) जलीय पर्यावरण के लिए एक बड़ा जोखिम मुद्रा। नगरपालिका अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों सतह के पानी के estrogenic शक्ति के लिए प्रमुख योगदान कर रहे हैं। इस पत्र में प्रदान की कार्यप्रणाली ईडीसी हटाने के संबंध में प्रभावकारिता और अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रियाओं की उपयुक्तता के एक आकलन के लिए अनुमति देता है।

    Date Published: 9/11/2016, Issue 115; doi: 10.3791/54243

    Cite this Article

    Beresford, N., Baynes, A., Kanda, R., Mills, M. R., Arias-Salazar, K., Collins, T. J., et al. Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency. J. Vis. Exp. (115), e54243, doi:10.3791/54243 (2016).

    Introduction

    वन्य जीवों के प्रजनन स्वास्थ्य पर अंत: स्रावी बाधा पहुँचा यौगिकों के प्रतिकूल प्रभाव के बारे में चिंताओं को यूरोपीय संघ के एक "घड़ी सूची" जल फ्रेमवर्क निर्देशक (WFD) के तहत दो estrogenic पदार्थ (एस्ट्राडियोल और ethinylestradiol) जगह के लिए प्रेरित किया। ईडीसी प्राकृतिक और सिंथेटिक स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन, दवाओं, कीटनाशकों, और औद्योगिक रसायनों और वन्य जीवन पर ज्ञात प्रतिकूल प्रभाव के साथ उपभोक्ता उत्पादों के घटक सहित रासायनिक वर्गों की एक किस्म धरना। इन यौगिकों के कुछ संभावित मानव स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता 1।

    अनुसंधान दिखाया है कि WWTP से अपशिष्ट मछली के लिए 2 estrogenic कर रहे हैं और एक परिणाम के रूप में कई पानी प्राप्त भी मछली से 3 estrogenic हैं। यह पहला यूनाइटेड किंगडम में राष्ट्रीय सर्वेक्षणों के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है कि (एक महिला विशिष्ट जर्दी प्रोटीन अग्रदूत 4) से पता चला वृद्धि हुई vitellogenin सांद्रता जंगली नर मछली का खून और एक उच्च पूर्व मेंसंयोजक इंटरसेक्स की सामान्य रूप से gonochoristic मछली प्रजातियों 5,6 में (पुरुष मछलियों की वृषण में अंडे और / या महिला प्रजनन नलिकाओं के विकास)।

    पारंपरिक मलजल उपचार आम तौर पर एक तीन चरण में प्राथमिक और माध्यमिक उपचार है जो दोनों को भंग कर दिया और कार्बनिक पदार्थ निलंबित हटा द्वारा पीछा किया एक प्रारंभिक जांच से मिलकर प्रक्रिया है। व्यक्तिगत ईडीसी के हटाने की प्रभावकारिता पदार्थों के भौतिक गुणों पर और उपचार प्रक्रिया लागू की प्रभावशीलता पर निर्भर है। सोखना और जैविक गिरावट के माध्यम से कई ईडीसी हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन अधूरी हो सकता है। तृतीयक उपचार, जैसे रेत छानने के रूप में, ईडीसी हटाने 7 बढ़ती उन्नत उपचार जबकि उन्नत ऑक्सीकरण (उदाहरण के लिए ओजोन) का उपयोग करने में प्रभावी हो सकता है या सक्रिय कार्बन पूरी तरह हटाने 7 के पास प्राप्त करने में प्रभावी हो सकता है।

    अपशिष्ट उपचार nee के लिए किसी भी नई तकनीक के आकलनडी एस ईडीसी हटाने में प्रस्तावित प्रक्रिया की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए। ईकोटोकसीकोलौजी परीक्षण के साथ लक्षित रासायनिक विश्लेषण, vivo में इन विट्रो bioassays में उपयोग सहित परीक्षण, के एक बैटरी, इस उद्देश्य के लिए व्यापक डेटा प्रदान करता है। नियामक उद्देश्यों के लिए बहुत उपयोगी है, लक्षित रासायनिक विश्लेषण ही यौगिकों (और विशिष्ट चयापचयों) पर नजर रखी पर डेटा प्रदान कर सकते हैं। Bioassays इसके अतिरिक्त उत्पादों के द्वारा चयापचयों और उपचार उत्पन्न अपशिष्ट परिवर्तन के प्रतिकूल प्रभाव है कि अन्यथा 8,9 नहीं चल पाता होगा की "का पता लगाने" अनुमति देते हैं। इस पत्र रासायनिक और ecotoxicity प्रयोगशाला परीक्षणों की एक बैटरी के उपयोग के कच्चे तेल के estrogenic शक्ति और इलाज सीवेज को हटाने और पानी प्राप्त करने में उन्नत और उभरते अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रियाओं के एक नंबर की प्रभावकारिता का आकलन करने का वर्णन है।

    Protocol

    आचार बयान: मछली में रसायन / मिश्रण की गतिविधि में खलल न डालें अंत: स्रावी का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल Brunel विश्वविद्यालय लंदन के पशु कल्याण द्वारा अनुमोदित किया गया है और नैतिक समीक्षा शारीरिक (AWERB) और ब्रिटेन के गृह मंत्रालय द्वारा पशुओं के तहत (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986।

    1. पानी नमूना संग्रह, संरक्षण और निष्कर्षण

    1. नमूना संग्रह और संरक्षण
      1. एक उपयुक्त सतह सक्रिय सफाई एजेंट के साथ, का उपयोग साफ करने के लिए बोतलों से पहले। सफाई के बाद, पानी, नाली और सूखे के साथ बोतलों कुल्ला।
      2. 2-एल कॉपर (द्वितीय) नाइट्रेट की 0.5 ग्राम और 3.6 के 6 मिलीलीटर एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के घोल से मिलकर एक परिरक्षक युक्त क्षमता की कांच की बोतलों में नमूने ले लीजिए। 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे स्टोर नमूने हैं। निकालें और संभव निम्नलिखित संग्रह और संरक्षण के रूप में के रूप में जल्द ही विश्लेषण।
    2. नमूना निष्कर्षण और साफ-अप (स्टेरॉयड एस्ट्रोजन विश्लेषण के लिए) 10
      1. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई)
        1. निकासी के लिए पहले, निलंबित ठोस, फिल्टर पानी के नमूने 1 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर पेपर का उपयोग कम करने के लिए।
          1. एक बार छान आंतरिक मानक के साथ, कील नमूने spiking deuterated आंतरिक मानक शेयर युक्त समाधान 2,4,16,16-डी 4 -estrone के 100 μl जोड़कर: 2,4,16,16-डी 4 -17β-estradiol (E2) : और 2,4,16,16-डी 4 -17α-ethinylestradiol (EE2) (40 माइक्रोग्राम मेथनॉल में / एल पर सभी) 1000 मिलीलीटर प्रवाह (या 100 मिलीलीटर सहायक नदी) सीवेज के लिए 2 एनजी / एल की आंतरिक कील में जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह के नमूने, और सीवेज सहायक नदी के नमूने के लिए 20 एनजी / एल।
        2. विशेष तंत्र के लिए डिस्पोजेबल वाल्व लाइनर्स, styrene divinyl बेंजीन विशेष कारतूस, कारतूस और जलाशयों संलग्न। वैक्यूम पंप पर स्विच उपकरण का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त रूप से बंद है।
        3. पिपेट प्रत्येक जलाशय में एथिल एसीटेट के 5 मिलीलीटर, कारतूस हालत। वैक्यूम पंप पर (10 आईएनएचजी प्रति मिनट से कम 10 मिलीलीटर की एक प्रवाह की दर अनुमति देने के लिए नीचे करने के लिए) स्विचऔर तरल के माध्यम से खींच। एसपीई कारतूस बाहर सूखी मत देना। पानी की 5 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया मेथनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ दोहराएँ प्रक्रिया।
        4. पानी के साथ प्रत्येक कारतूस जलाशय ऊपर और कारतूस जलाशयों और कांच नमूना बोतलों के बीच 1/8 "PTFE ट्यूब कनेक्ट। प्रति मिनट से कम 10 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर निर्वात पर स्विच और पूरे नमूना कारतूस के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं। अपशिष्ट कुप्पी के रूप में आवश्यक खाली।
        5. अच्छी तरह से विशेष कारतूस वैक्यूम के अंतर्गत कारतूस सामग्री तक (या हवा या नाइट्रोजन का उपयोग करके) सूखी (जैसे, गहरे भूरे रंग से हल्के भूरे रंग के लिए) रंग बदल जाते हैं।
        6. रैक और निकासी कई गुना अंदर जगह में डाल साफ सूखी 10 मिलीलीटर कांच संग्रह शीशियों। जाँच करें कि प्रत्येक लाइनर एक शीशी से ऊपर है। पिपेट 8 वैक्यूम पंप (प्रति मिनट से कम 10 मिलीलीटर के प्रवाह की दर) पर प्रत्येक नमूना जलाशय में क्लोराइड, स्विच के माध्यम से मिली और संग्रह शीशियों में तरल खींच।
        7. एसपीई कई गुना से 10 मिलीलीटर की शीशियों हटायेऔर एक concentrator का उपयोग 1 मिलीलीटर मात्रा को कम करने के लिए। ऑटो पारखी शीशी में प्रत्येक नमूना स्थानांतरण और आगे नाइट्रोजन नीचे झटका उपकरण का उपयोग कर 100 μl करने के लिए ध्यान देना।
      2. जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) साफ-अप
        1. जीपीसी सुसज्जित की स्थिति तालिका 1 में वर्णित का उपयोग कर एचपीएलसी में eluted नमूना निकालने के 95 μl इंजेक्षन। ध्यान लगाओ जीपीसी एक concentrator और नाइट्रोजन तंत्र नीचे झटका और फिर हेक्सेन के साथ 2.0 मिलीलीटर तक बनाने का उपयोग कर 200 μl करने के लिए नीचे निकाल सकते हैं।
      3. विशेष साफ-अप
        1. एसपीई कई गुना करने के लिए डिस्पोजेबल वाल्व लाइनर्स, aminopropyl कारतूस, कारतूस और जलाशयों संलग्न। रैक और निकासी कई गुना अंदर जगह में डाल साफ सूखी 10 मिलीलीटर कांच संग्रह शीशियों। पिपेट प्रत्येक जलाशय में हेक्सेन के 2 मिलीलीटर, कारतूस हालत। तरल कारतूस के माध्यम से पारित करने की अनुमति दें।
        2. जलाशय में जीपीसी नमूना निकालने पिपेट और फिर से करने के लिए तरल की अनुमति देते हैंकारतूस के माध्यम से गुजरती हैं। शीशी में नमूना eluate लीजिए और कई गुना से हटा दें। eluate नहीं छोड़ें।
        3. रैक में एक नया साफ सूखी 10 मिलीलीटर संग्रह शीशी रखो और निकासी कई गुना अंदर जगह है। कारतूस धोने, जलाशय में हेक्सेन (30% वी / वी) में एथिल एसीटेट के 2 मिलीलीटर जोड़ने और कारतूस के माध्यम से तरल खींचने के लिए। एक और 2 हेक्सेन में एथिल एसीटेट की मिलीलीटर के साथ दोहराएँ, सभी धोने discarding।
        4. जगह मूल 10 मिलीलीटर संग्रह शीशी (कदम 1.2.3.2) निष्कर्षण कई गुना अंदर रैक में वापस। पिपेट एसीटोन में एथिल एसीटेट के 2 मिलीलीटर (50% वी / वी) जलाशय में, और शीशी में तरल के माध्यम से खींच (2 आईएनएचजी प्रति मिनट से कम 2 मिलीलीटर की एक प्रवाह की दर अनुमति देने के लिए नीचे करने के लिए) वैक्यूम पंप पर स्विच । एथिल एसीटेट की एक और 2 मिलीलीटर के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
        5. नमूना शीशी निकालें और एक concentrator का उपयोग करने के लिए 1 मिलीलीटर निकालने की मात्रा को कम करने के लिए। एक छोटे कांच की शीशी में नमूना स्थानांतरण और नाइट्रोजन का उपयोग उपकरणों के नीचे झटका, लुप्त हो जाना करने के लिए टीवह प्रारंभिक सूखापन को निकाल सकते हैं।
        6. मेथनॉल के 100 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। (0.3 मिलीलीटर डालने के साथ) एक ऑटो पारखी शीशी निकालने स्थानांतरण और शीशी टोपी। एलसीएमएस / एमएस का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण (धारा 2 देखें)।
    स्तंभ: पीएल जेल, 50 ए, 300 x 7.5 मिमी, 5 माइक्रोन
    गार्ड स्तंभ: पीएल जेल, 50 x 7.5 मिमी, 5 माइक्रोन
    मोबाइल फेज़: dICHLOROMETHANE
    प्रवाह की दर: प्रति मिनट 1 मिलीलीटर
    स्तंभ के तापमान: 25 डिग्री सेल्सियस
    यूवी डिटेक्टर: 210 एनएम
    इंजेक्शन की मात्रा: 95 μl
    इंजेक्शन मोड: खड़ाअर्द
    गति ड्रा: प्रति मिनट 500 मिलीलीटर
    गति निकालें: प्रति मिनट 500 मिलीलीटर
    ड्रा की स्थिति: 3 मिमी
    अंश एकत्र: 3 मिलीग्राम अंश (7 - 10 मिनट) 10 मिलीलीटर की शीशियों में

    तालिका 1 शर्तों और जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) निकाले अपशिष्ट जल के नमूनों की सफाई के लिए मानकों। तालिका विवरण जीपीसी स्तंभ, मोबाइल चरण, तापमान, इंजेक्शन की मात्रा, और डिटेक्टर तरंगदैर्ध्य।

    1. नमूना निष्कर्षण (खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन के लिए)
      1. खंड 1.2.1.1 में विस्तृत रूप फ़िल्टर नमूने हैं। विशेष तंत्र के लिए डिस्पोजेबल वाल्व लाइनर्स, C18 विशेष कारतूस, कारतूस और जलाशयों संलग्न। वैक्यूम पंप उपकरण का परीक्षण करने पर स्विच पर्याप्त रूप से बंद है।
      2. प्रत्येक जलाशय में पिपेट 5 मिलीलीटर मेथनॉल, हालत सी18 कारतूस। वैक्यूम पर (लगभग 5 आईएनएचजी करने के लिए प्रति मिनट के बारे में 5 मिलीलीटर की एक प्रवाह की अनुमति के लिए) मोड़ के माध्यम से 1 मिनट से आधे रास्ते के लिए रोक, और के माध्यम से तरल चलाते हैं। कारतूस सूखी चलाने की अनुमति न दें। या तो एचपीएलसी ग्रेड या डबल आसुत जल के साथ दोहराएँ प्रक्रिया (DDH 2 हे)। फिर सूखी नहीं चला है।
      3. खंड 1.2.1.4 में वर्णित के रूप में पानी के नमूने निकालें। कम से कम 30 मिनट के लिए वैक्यूम जारी अच्छी तरह से कारतूस को सुखाने के लिए।
      4. साफ सूखी 10 मिलीलीटर संग्रह शीशियों निकासी कई गुना में एक रैक में रखें। जाँच करें कि प्रत्येक लाइनर एक शीशी से ऊपर है। प्रत्येक जलाशय में मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें। वैक्यूम (5 मिलीग्राम / मिनट की अधिकतम प्रवाह) को चालू करें और तरल शीशी में कारतूस के माध्यम से पारित करने के लिए, के माध्यम से 2 मिनट से आधे रास्ते के लिए रोक देते हैं।
      5. हाँ स्क्रीन का उपयोग कर विश्लेषण करने से पहले, नाइट्रोजन का उपयोग करने के लिए प्रारंभिक सूखापन निकालने को कम करने और 500-1,000 μl इथेनॉल के साथ पुनर्गठित। नमूना शीशियों की पलकों सील वाष्पीकरण से बचने के लिए और (4 डिग्री सेल्सियस पर रखने में एक चिंगारी से मुक्तफ्रिज)।

    2. रासायनिक विश्लेषण एलसीएमएस / एमएस का उपयोग

    1. एलसीएमएस / एमएस प्रणाली के परिचालन की स्थिति निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर अनुकूलन।
    2. विश्लेषण अंशांकन मानक समाधान, नमूना के अर्क, खाली और विश्लेषणात्मक गुणवत्ता नियंत्रण (AQC) नमूने तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री शर्तों का उपयोग, और जैसा कि तालिका 2 में विस्तृत आयन संक्रमण की निगरानी। आंतरिक उपयोग नमूना निकालने में स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन की एकाग्रता का निर्धारण मानकों में 10।
    एलसीएमएस
    तरल क्रोमाटोग्राफी
    स्तंभ: C18 (2), 150 x 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन।
    इंजेक्शन की मात्रा: 20 μl
    बहे: प्रति मिनट 0.5 मिलीलीटर।
    एमबाइल चरण: विलायक एक: 0.1% अमोनिया युक्त पानी।
    विलायक बी: acetonitrile।
    ढाल कार्यक्रम:
    समय (मिनट) 0 10 18 24 28
    एक: बी विलायक अनुपात 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
    जन स्पेक्ट्रोमेट्री
    स्रोत: Electrospray (नकारात्मक आयन)
    गैस और स्रोत: CUR: 20 साई, जीएस 1: 70 साई, GS2: 30 साई
    मंदिर: 600 डिग्री सेल्सियस, सीएडी गैस 5 और IonSpray वोल्टेज -900
    एमआरएम संक्रमण:
    E1: 269/145 और 269/143
    E2: 271/145 और 271/143
    EE2: 295/145 और 295/143
    E1-D4: 273/147
    E2-D4: 275/147
    EE2-D4: 299/145

    तालिका 2 विवरण मानकों और अपशिष्ट जल के अर्क में स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन की एलसीएमएस / एमएस विश्लेषण के लिए शर्तें। टेबल नमूना इंजेक्शन की मात्रा देता है और प्रवाह की दर, मोबाइल चरण की स्थिति एकएन डी ढाल।

    3. estrogenic गतिविधि इन विट्रो खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन का प्रयोग (हाँ) 8 परख

    1. तैयार है और के रूप में प्रति तालिका 3 (क) (छ) के लिए कम से कम मध्यम और मध्यम घटकों की दुकान।
    (क) कम से कम मध्यम (पीएच 7.1):
    फे 2 (एसओ 4) 3 के लिए डबल आसुत जल का 50 मिलीलीटर (DDH 2 हे) के 40 मिलीग्राम जोड़कर एक फे 2 (एसओ 4) 3 समाधान तैयार
    1 जोड़े एल DDH 2 हे एक एल 2 गिलास बीकर
    बीकर के लिए निम्न घटकों को जोड़ें:
    13.61 छ के.एच. 2 4 पीओ
    1.98 ग्राम (एनएच 4) 2 अतः 4
    4.2 छ KOH
    0.2 ग्राम MgSO 4
    फे 2 (अतः 4) के 1 मिलीलीटर
    50 मिलीग्राम एल leucine
    50 मिलीग्राम एल हिस्टिडीन
    50 मिलीग्राम adenine
    20 मिलीग्राम एल arginine एचसीएल
    20 मिलीग्राम एल methionine
    30 मिलीग्राम एल tyrosine
    30 मिलीग्राम एल isoleucine
    30 मिलीग्राम एल Lysine एचसीएल
    25 मिलीग्राम एल फेनिलएलनिन
    100 मिलीग्राम एल glutamic एसिड
    150 मिलीग्राम एल valine
    375 मिलीग्राम एल सेरीन
    एक चुंबकीय पिस्सू के साथ गरम दोषी पर बीकर रखो और हलचल जब तक यह सब भंग कर रहा है
    जाँच करें कि पीएच 7.1 और यदि आवश्यक हो तो समायोजित
    एक 50 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज धातु पेंच शीर्ष lids के साथ कांच की बोतलों में 45 मिलीलीटर aliquots बांटना का प्रयोग
    एक आटोक्लेव में 10 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम मीडियम जीवाणुरहित
    कमरे के तापमान पर रखो
    (ख) डी - (+) - ग्लूकोज:
    एक 20% w / DDH 2 हे में v समाधान तैयार
    धातु पेंच शीर्ष lids के साथ कांच की शीशियों को 20 मिलीलीटर aliquots बांटना
    एक आटोक्लेव में 10 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज समाधान जीवाणुरहित
    कमरे के तापमान पर रखो
    (ग) एल Aspartic एसिड:
    DDH 2 हे में 4 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान करें
    धातु पेंच शीर्ष lids के साथ कांच की शीशियों को 20 मिलीलीटर aliquots बांटना
    एक आटोक्लेव में 10 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एल Aspartic एसिड समाधान जीवाणुरहित
    कमरे के तापमान पर रखो
    (घ) विटामिन समाधान:
    DDH 2 हे के 100 मिलीलीटर के लिए बायोटिन की 2 मिलीग्राम जोड़कर एक बायोटिन समाधान तैयार
    8 मिलीग्राम thiamine, 8 मिलीग्राम pyridoxine, 8 मिलीग्राम pantothenic एसिड, 40 मिलीग्राम inositol वजन। सभी सूखी घटकों और बायोटिन समाधान के 20 मिलीलीटर 180 मिलीलीटर DDH 2 हे में जोड़े
    एक लामिना हवा का प्रवाह कैबिनेट में बाँझ कांच की बोतलों में एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार डिस्पोजेबल फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, द्वारा 10 मिलीलीटर बाँझ aliquots बनाओ
    स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर
    (ई) एल Threonine:
    DDH 2 हे में 24 मिलीग्राम / एमएल एल threonine की 100 मिलीलीटर की तैयारी
    धातु पेंच शीर्ष lids के साथ कांच की शीशियों को 10 मिलीलीटर aliquots बांटना
    एक आटोक्लेव में 10 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एल threonine समाधान जीवाणुरहित
    कमरे के तापमान पर रखो
    DDH 2 हे में एक 20 मिमी कॉपर (II) सल्फेट समाधान के 25 मिलीलीटर की तैयारी
    एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में बाँझ कांच की बोतलों में एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, द्वारा 5 मिलीलीटर बाँझ aliquots बनाओ
    कमरे के तापमान पर रखो
    (G) Chlorophenol लाल-β-D-galactopyranoside (CPRG):
    DDH 2 हे में CPRG की एक 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 25 मिलीलीटर की तैयारी
    एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में बाँझ कांच की बोतलों में एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, द्वारा 5 मिलीलीटर बाँझ aliquots बनाओ
    स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर

    तालिका 3. खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन परख; तैयारी और कम से कम मध्यम और मध्यम घटकों के भंडारण।

    1. तैयारी और Stora10x केंद्रित खमीर संस्कृति के जीई
      1. 1 दिन, मध्यम विकास तैयार (3.4.1 में विस्तृत रूप में) और एक बाँझ शंक्वाकार फ्लास्क में डाल देना। -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत क्रायोजेनिक शीशी से 10x केंद्रित खमीर के 125 μl जोड़ें। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर लगभग 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर टीका मीडिया सेते हैं।
      2. 2 दिन, मध्यम विकास (~ 50 एमएल) की दो बोतलें बनाने के लिए और अलग बाँझ शंक्वाकार बोतल में डाल देना। विकास मीडिया के प्रत्येक फ्लास्क में 24 घंटे की सुसंस्कृत खमीर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर लगभग 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर टीका मीडिया सेते हैं।
      3. 3 दिन, एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक 24 घंटे की संस्कृति डालना। अपकेंद्रित्र 50 मिलीलीटर से कम 2000 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों। सतह पर तैरनेवाला डालो, और 15% ग्लिसरॉल के साथ कम से कम मध्यम के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली फिर से निलंबित। 4 महीने की एक अधिकतम के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.2 मिलीलीटर बाँझ cryovials और दुकान में 10x केंद्रित खमीर संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर aliquots बनाओ।
    2. prepaमानक घटता के लिए राशन और भंडारण की रासायनिक स्टॉक्स
      1. पूर्ण इथेनॉल के साथ दो बार सभी कांच के बने पदार्थ और spatulas कुल्ला और उपयोग करने से पहले सूखे के लिए contaminates के किसी भी निशान को दूर करने के लिए छोड़ दें।
      2. E2 एक पाउडर वजन कैबिनेट में एक कांच की शीशी में सीधे वजन और निरपेक्ष इथेनॉल में मात्रा से एकाग्रता समायोजित करें। 2x10 -7 एम (54.48 माइक्रोग्राम / एल) के एक एकाग्रता के लिए पतला। सील ढक्कन और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर (एक चिंगारी से मुक्त फ्रिज में)।
    3. परख निर्माता
      1. 0 दिन, मध्यम विकास तैयार करते हैं। कम से कम मध्यम की 45 मिलीलीटर की बोतल के लिए 5 मिलीलीटर ग्लूकोज समाधान, 1.25 मिलीग्राम एल Aspartic एसिड समाधान, 0.5 मिलीग्राम विटामिन समाधान, 0.4 मिलीग्राम एल threonine समाधान है, और 125 μl कॉपर (II) सल्फेट समाधान जोड़ें। एक बाँझ शंक्वाकार फ्लास्क में मध्यम विकास डालो।
        1. कुप्पी के लिए 10x केंद्रित शेयर (-20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से डीफ़्रॉस्ट) के 125 μl जोड़ें और एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर लगभग 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर टीका मीडिया सेते हैं।
      2. 1 दिन, एक बाँझ 96 अच्छी तरह से 'कमजोर पड़ने प्लेट' लेबल और धारावाहिक dilutions E2 मानक वक्र और परीक्षण रसायन (s) / प्रवाह निकालने (एस) (जैसे, EE2) के (इथेनॉल में 100 μl मात्रा) बनाते हैं।
      3. लेबल बाँझ 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकली फ्लैट नीचे microtiter 'परख प्लेट (s)'। हर थाली पर कारतूस (प्लस / ऋण विलायक) और एक E2 मानक वक्र, परीक्षण रसायन (s) / प्रवाह निकालने (एस) की पंक्तियों के अलावा शामिल हैं।
      4. पिपेट परख थाली का उचित अच्छी तरह से प्रत्येक एकाग्रता के 10 μl (E2, रासायनिक या निकालने)। पिपेट परख थाली के प्रत्येक 'विलायक खाली' अच्छी तरह से में इथेनॉल के 10 μl। सूखापन के लिए लुप्त हो जाना बंद ढक्कन के साथ परख थाली छोड़ दें।
      5. मध्यम विकास (~ 50 एमएल) की एक बोतल बनाने और chlorophenol के 0.5 मिलीलीटर लाल-β-D-galactopyranoside (CPRG) प्रति बोतल समाधान जोड़ें। एक प्लेट रीडर में 620 एनएम पर संस्कृति का मैलापन मापने के द्वारा 24 घंटे की संस्कृति में खमीर कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण करते हैं। एक टीका लगाना24 घंटा संस्कृति से 4x10 7 खमीर कोशिकाओं के साथ ssay माध्यम।
      6. एक बाँझ गर्त में टीका परख मध्यम डालो। एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग 96 अच्छी तरह से परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए टीका परख माध्यम के 200 μl जोड़ें।
      7. 96 अच्छी तरह से परख थाली पर ढक्कन लगा और टेप के साथ किनारों को सील। एक अनुमापांक थाली प्रकार के बरतन पर 2 मिनट के लिए परख प्लेट (ओं) को सख्ती से हिला और एक स्वाभाविक रूप से हवादार हीटिंग कैबिनेट में 32 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      8. 2 दिन, परख प्लेट (ओं) को सख्ती से 2 मिनट के लिए एक अनुमापांक प्लेट प्रकार के बरतन पर हिला। 32 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटें।
      9. 4 दिन, एक अनुमापांक प्लेट प्रकार के बरतन पर 2 मिनट के लिए परख प्लेट (ओं) सख्ती से हिला। प्लेट (ओं) को छोड़ दें तो लगभग 1 घंटे के लिए खड़े 540 एनएम (CPRG ~ 575 एनएम के लिए इष्टतम absorbance) और 620 एनएम (मैलापन के लिए) की एक absorbance पर परख प्लेट (ओं) को पढ़ने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग। कमरे के तापमान पर प्लेट (एस) और यदि आवश्यक हो तो बाद में पढ़ा छोड़ दें।
    4. Estrogenic गतिविधि गणना <राजभाषा>
    5. मैलापन के लिए सही परख रीडिंग निम्न समीकरण का उपयोग: सही मूल्य = नमूना या मानक (E2) 540 एनएम पर absorbance - [नमूना या 620 एनएम पर मानक (E2) absorbance - 620 एनएम पर खाली absorbance]। उचित कारतूस (संदूषण के लिए जाँच करने के लिए) के साथ साजिश E2 मानक वक्र 8।
    6. 'एस्ट्राडियोल समकक्ष' की गणना के लिए सही नमूना (निकालने या रासायनिक) का प्रयोग करें। नमूना बैठाना / E2 बराबर मूल्यों के absorbance के मूल्यों को निकालने के लिए साजिश रची E2 मानक वक्र मूल्यों और प्रतिगमन समीकरण (3 पैरामीटर बहुपद या रेखीय फिट पर निर्भर करता है) का प्रयोग करें। उपयोग एकाग्रता कारक (यानी, पानी निकाला और इथेनॉल की मात्रा निकालने में फिर से निलंबित कर दिया है) पूर्व निकाली नमूने में estrogenic गतिविधि गणना करने के लिए।

    4. प्रयोगशाला आधारित estrogenic गतिविधि का आकलन पुरुष मूर्ख मनुष्य Minnows इन विवो vitellogenin प्रेरण में उपयोग करना

    1. पुरुष मूर्ख मनुष्य minnows का प्रयोग करें (Pimephalespromelas)> 4 महीने पुरानी है, जो माध्यमिक यौन विशेषताओं (प्रदर्शित यानी, मंगल ट्यूबरकल के विकास और एक पृष्ठीय fatpad) पुरुष यौन दृढ़ संकल्प का संकेत।
      1. स्पॉन गतिविधि को रोकने के लिए, अलग परिपक्व तीन सप्ताह (± 3 दिन) परीक्षा की दीक्षा से पहले पुरुष थे। 3 जी / एल की एक अधिकतम लोड के साथ कम से कम दो 45 एल कांच एक्वेरियम की स्थापना की। परीक्षण के लिए स्वस्थ मछली की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए 100 पुरुषों की एक न्यूनतम का उपयोग करें।
      2. के रूप में परीक्षा में अनुभवी हो जाएगा समान पर्यावरणीय परिस्थितियों में पुरुष मछली रखें (यानी, 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस के पानी का तापमान और एक 16: 8 घंटा प्रकाश: अंधेरे फोटो पीरियड)। प्रत्येक टैंक के कमजोर पड़ने के पानी के प्रवाह दर को बनाए रखने में कम से कम हर 6 से 8 घंटा, यानी की एक 95% प्रतिस्थापन समय सुनिश्चित करने के लिए, एक 45 एल टैंक के लिए 330 मिलीग्राम / मिनट।
    2. टेस्ट उपकरण और प्रयोगात्मक डिजाइन
      1. प्रति लीटर वाट के मछली के ऊपर से 3 जी की एक लोडिंग को समायोजित करने के लिए बड़ा गिलास टैंक का उपयोगइंजी। 8 वयस्क पुरुषों (नाममात्र 4.5 ग्राम प्रत्येक) के लिए, एक 10-20 एल टैंक का उपयोग करें।
        1. (यानी, टैंकों के बीच टुकड़े टुकड़े में कार्ड स्क्रीन का उपयोग) प्रत्येक उपचार के लिए दो को दोहराने के टैंकों का प्रयोग करें और किसी भी अनावश्यक दृश्य गड़बड़ी से प्रत्येक टैंक ढाल। एक अध्ययन संख्या, एक जोखिम एकाग्रता और एक पोत पहचान संख्या के साथ प्रत्येक टैंक को पहचानें।
      2. अपशिष्ट जल के प्रवाह के अध्ययन के लिए
        1. उनके आगमन पर, तुरंत 10 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक भंडारण टैंक में प्रवाह हस्तांतरण। प्रवाह की प्राप्ति के दो घंटा के भीतर प्रवाह खुराक शुरू करो।
        2. एक दशानुकूलन पोत को प्रवाह फीड, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से, 10 डिग्री सेल्सियस भंडारण टैंक से। 18 ± 2 डिग्री सेल्सियस तक दशानुकूलन पोत में प्रवाह हीट। परीक्षण एक्वेरियम को खुराक / मिश्रण जहाजों के लिए दशानुकूलन पोत से गर्म प्रवाह पंप और उसके बाद (जो मछली रखती है)। 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान को एक्वेरियम हीट।
      3. रासायनिक खुराक पढ़ाई के लिए
        1. एक पाउडर वजन कैबिनेट में परीक्षण रसायन वजन। अधिमानतः सॉल्वैंट्स के उपयोग के बिना DDH 2 हे में केंद्रित रासायनिक स्टॉक तैयार है।
          नोट: सॉल्वैंट्स परीक्षण यौगिकों solubilize के लिए आवश्यक हैं, कमजोर पड़ने पानी के नियंत्रण के अलावा विलायक नियंत्रण का उपयोग।
        2. गुरुत्वाकर्षण फ़ीड या खुराक के लिए प्रवाह नियंत्रण डिवाइस (एस) के माध्यम से तापमान नियंत्रित हैडर टैंक / मिश्रण पोत से पंप कमजोर पड़ने पानी। पम्प रासायनिक शेयर (s) केंद्रित / खुराक के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पम्पिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए मिश्रण वाहिकाओं। और पानी के प्रवाह की दर (कमजोर पड़ने पानी) (शेयर रसायन के) पंप दर को नियंत्रित करने के लिए वांछित जोखिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
          नोट: उपयोग सिलिकॉन टयूबिंग / खुराक से प्रत्येक परीक्षा पोत को पानी / परीक्षण रासायनिक मिश्रण को खिलाने के लिए पोत। कि कम से कम 24 घंटे में एक 75% पोत प्रतिस्थापन प्रदान करने के लिए पर्याप्त है एक प्रवाह की दर, यानी, 20 मिलीग्राम / एक 20 एल टैंक के लिए मिनट का प्रयोग करें। निर्दिष्ट अंकित मूल्य के ± 10% से कम प्रवाह की दर को बनाए रखें।
        25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर जोखिम टैंक पानी का तापमान, हवा संतृप्ति मूल्य का 70% से ऊपर भंग ऑक्सीजन (5.8 मिलीग्राम एल -1 25 डिग्री सेल्सियस पर) और ± 0.5 पीएच इकाइयों अध्ययन के दौरान (6.5 और 8.5 के बीच पीएच शुरू) बनाए रखें। 16 घंटा प्रकाश की फोटो पीरियड के लिए प्रकाश व्यवस्था की स्थिति सेट: 8 घंटा अंधेरे, सुबह / शाम के संक्रमण 20 मिनट के समय के साथ।
      4. मछली 2.5 (± 0.1) पर हौसले डीफ़्रॉस्ट जमे हुए वयस्क नमकीन चिंराट (Artemia) के साथ दिन में दो बार फ़ीड प्रति टैंक प्रति छ फ़ीड। इसके अलावा एक उष्णकटिबंधीय परत मछली भोजन की एक छोटी मात्रा (दो उंगली चुटकी) के साथ मछली एक दिन में एक बार खिलाओ। प्रत्येक फ़ीड के बीच 3 घंटा की एक न्यूनतम छोड़ दें।
        1. खिला प्रतिक्रिया / व्यवहार (अच्छा, मध्यम या गरीब, नियंत्रण के साथ तुलना में) की निगरानी के लिए एक दैनिक खिला रिकॉर्ड रखें। टैंक (अधिमानतः दैनिक) एक सप्ताह में कम से कम दो बार अपनाना किसी भी uneaten भोजन और मल को दूर करने के लिए। पक्ष और परीक्षण वाहिकाओं के नीचे से साफ कम से कम एक बार प्रति सप्ताह।
      5. साप्ताहिक पानी के नमूने ले लोप्रत्येक टैंक से एस (खमीर स्क्रीन के माध्यम से) estrogenic गतिविधि और रासायनिक संरचना (विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के माध्यम से) की पुष्टि करें। पानी के नमूने, निकासी और विश्लेषण की जानकारी के लिए वर्गों 1-3 देखें।
        नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए, खुराक प्रतिक्रिया पर नजर रखने के कमजोर पड़ने पानी नियंत्रण (नकारात्मक नियंत्रण), सकारात्मक नियंत्रण (E2 या EE2) प्लस प्रवाह (100, 50 और 25%) के कम से कम तीन dilutions या परीक्षण रसायन का उपयोग करें। उपन्यास प्रौद्योगिकियों का परीक्षण कर रहे हैं, के साथ या बिना इलाज यौगिक / प्रवाह का उपयोग (जैसे, EE2 उपचार के बिना, TAML / हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ EE2 (एच 22) उपचार 12, चित्रा 1)।

    आकृति 1
    चित्रा 1. आरेख एक विवो मूर्ख मनुष्य छोटी मछली vitellogenin bioassay 17α-ethinylestradiol TAML / पेरोक्साइड पानी के उपचार का उपयोग करने का ecotoxicity के हटाने का निर्धारण करने की प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रतिनिधित्व। ऍक्स्पerimental की स्थापना आठ 11 एल कांच एक्वेरियम पानी के सतत प्रवाह के साथ प्रत्येक फेड के होते हैं। व्यक्तिगत रासायनिक स्टॉक समाधान और पानी (छान de-क्लोरीनयुक्त) मिश्रण कक्षों के लिए दिया जाता है। मिश्रण वाहिकाओं में नाममात्र सांद्रता (प्रतिक्रिया के बिना) 2 एनजी / एल EE2, 80 एनएम TAML और 0.16 माइक्रोग्राम / एलएच 2 2 हे हैं। रासायनिक शेयर समाधान (EE2, एच 22 और TAML) तैयार किया है और अलग से dosed इतना है कि प्रतिक्रियाओं मिश्रण वाहिकाओं में शुरू कर रहे हैं। मछली (टैंक प्रति 8 पुरुष मूर्ख मनुष्य minnows) मिश्रण (s) लगभग 45 मिनट की एक प्रतिक्रिया संपर्क समय के बाद सामने आ रहे हैं। पानी के नमूने लिए जोखिम टैंक साप्ताहिक से ले रहे हैं। प्लाज्मा नमूनों एक आधारभूत समूह से estrogenic बायोमार्कर vitellogenin (VTG) को मापने के लिए, अध्ययन के शुरू में जोखिम के 21 दिनों के बाद अन्य सभी मछली मूर्ख मनुष्य minnows से ले रहे हैं, और। विशिष्ट उपचार कर रहे हैं: 'सी'; नकारात्मक नियंत्रण (कमजोर पड़ने पानी केवल), '+'; EE2 के सकारात्मक नियंत्रण,'+ एच'; EE2 प्लस एच 22, '+ टी'; EE2 प्लस एच 22 प्लस TAML। यह आंकड़ा से मिल्स एट अल। 2015 12 संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. परीक्षण प्रक्रिया
      1. दशानुकूलन अवधि
        1. प्रत्येक यौन परिपक्व पुरुष मछली का गीला वजन (छ) उपाय है, और प्रत्येक टैंक (टैंक प्रति 8 पुरुषों) के लिए यादृच्छिक पर आवंटित।
        2. एक ही बैच से unallocated मछली रखें और एक ही परीक्षण परिस्थितियों में उन्हें बनाए रखना। किसी भी व्यक्ति को शारीरिक क्षति या 7 दिन दशानुकूलन अवधि के दौरान हालत की कमी के लक्षण दिखाने को बदलने के लिए इन मछलियों का प्रयोग करें। दशानुकूलन अवधि प्रत्येक उपचार टैंक 8 पुरुषों है कि पूरी तरह से परीक्षण की स्थिति को आदत है है के अंत में किया जाता है।
        3. एक ही बा से एक अतिरिक्त 8 पुरुषों से 'आधारभूत' प्लाज्मा नमूने ले लोनर मछली का दर्पण। धारा 4.4 में रक्त नमूने विधि और 4.5 में vitellogenin (VTG) विश्लेषण विधि का पालन करें।
      2. दशानुकूलन अवधि के बाद, 4.2.2 या 4.2.3 में वर्णित के रूप में 21 दिनों के लिए जोखिम टैंक के प्रवाह या रासायनिक खुराक शेयरों देने के लिए। मॉनिटर मृत्यु दर, व्यवहार और प्रत्येक में मछली की शारीरिक उपस्थिति टैंक दैनिक दिन के पहले फ़ीड करने से पहले दोहराने। किसी भी असामान्य व्यवहार या घटनाओं रिकॉर्ड।
        नोट: पर्यावरण की स्थिति सुनिश्चित करें और खिला दरों मछली के स्वास्थ्य (वर्गों 4.2.4 और 4.2.5) बनाए रखें।
    2. 21 दिन की अवधि के जोखिम के बाद मछली सैम्पलिंग
      1. नमूना लेने से पहले 12 घंटा, मछली खिलाने बंद करो।
      2. लेबल रक्त के नमूनों के संग्रह के लिए सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब, जोड़ने Aprotinin की ~ 5 μl (एक protease अवरोध) और बर्फ पर उन्हें जगह है।
      3. प्रति de-क्लोरीनयुक्त पानी का 1 एल MS222 के 500 मिलीग्राम भंग द्वारा MS222 (एनेस्थेटिक) के एक 500 मिलीग्राम / एल समाधान करें (पहले आदत25 ± 1 डिग्री सेल्सियस)। पीएच 7.4 ± 0.4 1 एम NaOH का उपयोग करने के लिए MS222 बेअसर।
      4. बफर MS222 में टैंक से प्रत्येक मछली ले जाएँ। सभी operculum आंदोलन (आमतौर पर 5 ± 1 मिनट) की समाप्ति तक समाधान में रखें।
      5. उपाय और कांटा लंबाई (मिमी) टर्मिनल संवेदनाहारी के तहत रिकॉर्ड है। पूंछ काटना, और दुम धमनी (चित्रा 2) से रक्त एकत्र करने के लिए एक heparinized hemocrit ट्यूब का उपयोग करने के लिए एक डिस्पोजेबल छुरी का प्रयोग करें। ध्यान से पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूब में रक्त बांटना और बर्फ पर रहते हैं।
      6. रक्त ड्राइंग के तुरंत बाद मछली को मार डालो। परिसंचरण और / या मस्तिष्क के विनाश की स्थायी समाप्ति से मौत की पुष्टि करें। उपाय और कुल वजन मछली (निकटतम करने के लिए 0.01 छ) रिकॉर्ड, और ऊतकों काटना के रूप में की आवश्यकता है।
      7. संग्रह के 2 घंटा के भीतर रक्त (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7000 XG) अपकेंद्रित्र। नया लेबल 0.4 मिलीलीटर microcentrifuge टब में एक पिपेट का उपयोग प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरणतों और बर्फ पर दुकान। प्लाज्मा VTG सांद्रता के विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ पर प्लाज्मा युक्त centrifugation और दुकान के 30 मिनट के भीतर नलियों रुक।

    चित्र 2
    चित्रा 2 एरोटिक पुरुष मूर्ख मनुष्य छोटी मछली (Pimephales promelas), प्लाज्मा संग्रह और वृषण के स्थान का चित्रण है। 21 दिन के लिए जोखिम के अंत में सभी मछली रक्त के नमूने एकत्र करने के लिए मार डाला जाना चाहिए। एक बार इस टर्मिनल संवेदनाहारी मछली की लंबाई (कांटा लंबाई, मिमी) मापा जाना चाहिए, जल्दी से दुम धमनी से रक्त संग्रह के द्वारा पीछा के तहत फोटो-एक:। लाल बिंदीदार रेखा पूंछ विच्छेदन के लिए स्थान को इंगित करता है (एक डिस्पोजेबल छुरी पूंछ काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए )। फोटो-बी रक्त एकत्र करने के लिए इस्तेमाल एक heparinized hemocrit ट्यूब से पता चलता है। प्रत्येक मछली तो इस मामले में पूरे सिर में तुरंत मार डाला जाना चाहिए के बाद अपने खून का नमूना लिया गया है,शरीर (फोटो-सी) से कटे किया गया है। एक बार मछली मारा गया है शरीर गुहा आंतरिक अंगों को प्रकट करने के लिए खोला जा सकता है। फोटो-सी तैरना मूत्राशय (एसबी) cyprinid मछली, जैसे, मूर्ख मनुष्य छोटी मछली, एक प्रकार की मछली, कार्प, आदि में के संबंध में वृषण (gonad) का स्थान पता चलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. उपाय मूर्ख मनुष्य minnows के लिए विशेष रूप से डिजाइन एक मुताबिक़ VTG एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट के साथ प्लाज्मा VTG सांद्रता।
      1. के रूप में निर्माता प्रोटोकॉल में उल्लिखित VTG मानकों और बफ़र्स तैयार करें। पतला प्लाज्मा नमूना 1:50, 1: 5000, और 1: 500,000 और उन्हें दो प्रतियों में परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार VTG मानक वक्र सीमा के भीतर रीडिंग प्राप्त करने के लिए। vitellogenin सांद्रता गणना करने के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन करें।

      5. उन्नत / उपन्यास अपशिष्ट जल उपचार प्रौद्योगिकी के क्षेत्र आकलन estrogenic गतिविधि को कम करने के लिए विवो vitellogenin और इंटरसेक्स प्रेरण रोच में (Rutilus rutilus) का प्रयोग

      1. जंगली एक प्रकार की मछली की कैद अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र outfalls की धारा नीचे रहने वाले
        नोट: उपयोग रोच (Rutilus rutilus) या अन्य प्रचुर मात्रा में ताजे पानी या खारा मछली प्रजातियों, जो gonochoristic और estrogenic endocrine विघटन के प्रति संवेदनशील माने जाते हैं।
        1. मछली पकड़ने, electrofishing का उपयोग कर फंसाना, फँसाने या अन्य मान्यता प्राप्त मछली पकड़ने की स्थिति पर निर्भर करता है 13 तरीकों। नमूना लेने के लिए प्रयोगशाला को वापस पदार्थो टैंक में मछली परिवहन।
        2. के रूप में 4.4.2 में विस्तृत microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें। 4.4.3 में वर्णित के रूप MS222 बफर तैयार करते हैं। मछली anesthetize के रूप में 4.4.4 में विस्तृत जानकारी दी।
        3. उपाय मछली की लंबाई और वजन टर्मिनल संवेदनाहारी के तहत।
        4. दुम dispo धमनी का उपयोग करने से रक्त एकत्रसेबल heparinized सिरिंज। तुरंत खून का नमूना संग्रह के बाद प्रत्येक मछली को मार डालो। ध्यान से पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूब में रक्त बांटना और बर्फ पर रहते हैं। कदम 4.4.7 में वर्णित के रूप में प्लाज्मा को तैयार है और एलिसा (4.5) द्वारा VTG उपाय।
        5. संदंश प्रत्येक मछली से 2-3 मछली तराजू को हटाने और व्यक्तिगत रूप से लेबल छोटे कागज के लिफाफे में जगह का उपयोग करना। बाद में मछली उम्र दृढ़ संकल्प है और विकास के विश्लेषण के लिए सूखे की स्थिति में कमरे के तापमान पर स्टोर लिफाफे।
        6. एक छुरी के साथ खुला शरीर गुहा आंतरिक अंगों को प्रकट करते हैं। एक gonad दोनों तरफ स्थित (चित्रा 2) के साथ तैरना मूत्राशय प्रकट करने के लिए पेट बाहर ले जाओ। ध्यान से एक कांच की शीशी में ठीक नाक संदंश और जगह के साथ रखा gonads को हटा दें। कवर 01:10 ऊतक के अनुपात में Bouin लगानेवाला साथ gonads: लगानेवाला।
        7. (मानव संसाधन लगानेवाला प्रति 1 मिमी पर प्रवेश) ऊतक के आकार पर निर्भर करता है 6-24 घंटे के लिए Bouin में ऊतक छोड़ दें। एक बार तय, Bouin लगानेवाला एक टपकना70% औद्योगिक methylated आत्माओं (आईएमएस) के साथ की जगह घ। कमरे के तापमान पर तय ऊतक स्टोर जब तक ऊतकों ऊतकविकृतिविज्ञानी (धारा 5.3) के लिए कार्रवाई कर रहे हैं।
      2. एक प्रकार की मछली में इन विवो vitellogenin और इंटरसेक्स प्रेरण का उपयोग कर estrogenic गतिविधि के क्षेत्र आधारित आकलन
        1. प्रयोगात्मक डिजाइन और स्थापना की
          नोट: इन विवो काम शुरू करने के पहले अच्छी तरह टैंकों और प्रायोगिक संयंत्र की स्थापना की। टैंक 3-4 सप्ताह व्यवस्था करने के लिए मछली के किसी अलावा पहले बहने लगे। मॉनिटर पानी के प्रवाह की दर, पानी की गुणवत्ता और शर्तों (पीएच, तापमान, भंग ऑक्सीजन, आदि) के लिए नियमित रूप से यकीन है कि मानकों को बनाने के लिए बनाए रखा जा सकता है।
          1. बड़े टैंक का निर्माण (जैसे, 300-1,000 एल) प्रायोगिक संयंत्र में साइट पर है, जो 'नियंत्रण' प्राप्त कर सकते हैं डे-क्लोरीनयुक्त पानी के नल, मानक इलाज प्रवाह (एस) और उन्नत समानांतर में इलाज प्रवाह (एस)। टैंक के लिए एयर पम्प / aerators संलग्न। सेट जल प्रवाह की दर कम से कम 6 टैंक वी प्राप्त करने के लिएप्रति दिन olume एक्सचेंजों।
            नोट: सुनिश्चित करें कि टैंक में अच्छी तरह से अछूता और अत्यधिक दैनिक तापमान के उतार चढ़ाव को रोकने के लिए धूसरित कर रहे हैं। डिजाइन टैंक मछली का अवलोकन, व्यवहार परिवर्तन (खिला की कमी, आदि), रोग और मृत्यु दर के संकेत के लिए अनुमति देने के लिए।
        2. 1 घंटे के लिए संबंधित टैंक में (मछली फार्म से) एक प्रकार की मछली के बैग चल द्वारा जोखिम की शुरुआत करें। धीरे-धीरे पानी का तापमान जब तक बैग करने के लिए टैंक पानी जोड़ें और शर्तों परिवेश कर रहे हैं। उनके टैंक में मछली रिलीज।
        3. वयस्क रोच दैनिक फीड pelleted मछली खाना (आकार 0.5-0.8) पर। किशोर रोच दैनिक फीड छोटे pelleted (गोली आकार 100-300) गैर estrogenic फ़ीड 14 जी भरकर, uneaten फ़ीड के आधार पर समायोजित पर। (अच्छा, मध्यम या गरीब, नियंत्रण के साथ तुलना में) एक दैनिक खिला रिकॉर्ड दस्तावेजीकरण खिला प्रतिक्रिया / व्यवहार रखें।
        4. estrogenic गतिविधि और रासायनिक संरचना इस बात की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक टंकी से साप्ताहिक पानी के नमूने ले लो। Seपानी के नमूने और विश्लेषण के तरीकों की जानकारी के लिए ई वर्गों 1-3।
      3. मछली की हिस्तोपैथोलोजी gonads 15
        1. ध्यान से विच्छेदित और तय gonads एक काटने बोर्ड पर चिमटी और जगह के साथ कंटेनर से (कदम 5.1.6 और 5.1.7 में वर्णित) को हटा दें।
        2. एक microtome ब्लेड का प्रयोग 3 भागों (पूर्वकाल, मध्य और पीछे) में और प्रत्येक भाग एक 3-5 मिमी मोटी पार अनुभाग में कटौती से प्रत्येक gonad कटौती करने के लिए। ध्यान से एक लेबल प्लास्टिक बायोप्सी कैसेट में सभी छह टुकड़े जगह है, और तालिका 4 में सूचीबद्ध समय का उपयोग ऊतक प्रोसेसर में जगह है।
        3. वैक्स एम्बेड ऊतकों और रोटरी microtome (3-5 माइक्रोन) पर अनुभाग। लेबल जैव चिपकने वाला लेपित गिलास स्लाइड और एक गर्म प्लेट (45 डिग्री सेल्सियस पर सेट) को स्लाइड के लिए स्थानांतरण वर्गों 24 घंटे के लिए सूखी।
        4. स्लाइड दाग, या तो स्वयं या एक स्वचालित stainer का उपयोग कर, समय तालिका 5 में विस्तृत इस्तेमाल करते हैं। दाग ऊतक पर बढ़ते एजेंट की एक बूंद प्लेस, और एलप्र एक गिलास ऊतक की रक्षा करने के लिए बढ़ते एजेंट के ऊपर coverslip।
        5. सबसे पहले, (10X आंख लाइनों बढ़ाई साथ 20X, यानी 2X उद्देश्य) कम बढ़ाई प्रत्येक स्लाइड और शरीर गुहा से 15 अनुलग्नकों के अंकों की संख्या लिंग का निर्धारण करने के लिए जांच करते हैं। प्रत्येक मछली के लिए किसी भी असामान्यताएं ध्यान दें।
        6. एक उच्च बढ़ाई (100x या 400X) में gametogenesis चरणों, असामान्यताएं और वृषण ऊतक में oocytes की उपस्थिति का आकलन करने के लिए ऊतक की जांच। इंटरसेक्स की गंभीरता को रिकॉर्ड 7 (100% डिम्बग्रंथि ऊतक) से 0 से लेकर निम्न ग्रेडिंग प्रणाली (सामान्य पुरुष ऊतक) का उपयोग कर 6 (6 तालिका देखें)।
      कदम नंबर इलाज उद्देश्य समय (मानव संसाधन)
      1 70% आईएमएस निर्जलीकरण 3
      2 90% आईएमएस निर्जलीकरण 2.5
      3 95% आईएमएस निर्जलीकरण 1.5
      4 100% आईएमएस निर्जलीकरण 1.5
      5 100% आईएमएस निर्जलीकरण 1.5
      6 100% आईएमएस निर्जलीकरण 1.5
      7 100% आईएमएस निर्जलीकरण 1.5
      8 प्रोटोकॉल समाशोधन एजेंट क्लियरिंग 1.5
      9 प्रोटोकॉल समाशोधन एजेंट क्लियरिंग 1.5
      10 प्रोटोकॉल समाशोधन एजेंट क्लियरिंग 1।5
      1 1 मोम वैक्स घुसपैठ 1.25
      12 मोम वैक्स घुसपैठ 1.25
      20 घंटा के कुल

      तालिका 4 मोम ऊतकविकृतिविज्ञानी के लिए ऊतकों impregnating के लिए प्रसंस्करण व्यवस्था। ऊतकों एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर में संसाधित किया जाना चाहिए। ऊतकों निर्दिष्ट समय की अवधि के लिए विस्तृत समाधान में डूब जाना चाहिए।

      दाग नहीं। दाग उद्देश्य समय (मिनट)
      1 प्रोटोकॉल क्लियरिंग एजेंट मोम घुल 15
      2 जलयोजन 2
      3 90% आईएमएस जलयोजन 2
      4 70% आईएमएस जलयोजन 2
      5 पानी के नल (दौड़) कुल्ला 2
      6 HAEMOTOXYLIN दाग सेल नाभिक नीले 10
      7 पानी के नल (दौड़) अतिरिक्त निकालें 10
      8 अम्लीय आईएमएस dechlorination 20 सेकंड
      9 पानी के नल (दौड़) कुल्ला 20 सेकंड
      10 LiCo 3 नमक 20 सेकंड
      1 1 पानी के नल (दौड़) कुल्ला 20 सेकंड
      12 1% eosin (जलीय) दाग कोशिका द्रव्य गुलाबी 20 सेकंड
      13 पानी के नल (दौड़) अतिरिक्त निकालें 5
      14 70% आईएमएस निर्जलीकरण 2
      15 90% आईएमएस निर्जलीकरण 2
      16 100% आईएमएस निर्जलीकरण 5
      17 प्रोटोकॉल क्लियरिंग एजेंट आईएमएस, बाध्यकारी एजेंट हटाये 5

      5 तालिका समाधान और Haematoxylin और eosin (एच एंड ई) मछली जननांगों ऊतकों की धुंधला के लिए विसर्जन बार। स्लाइड्स alloc के लिए प्रत्येक स्नान में रखा जाना चाहिएइस क्रम में समय पैदा। एच एंड ई ऊतकों की धुंधला मछली gonads पर estrogenic अपशिष्ट जल अपशिष्ट का विकास या संगठनात्मक प्रभावों का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है।

      स्कोर धारा विवरण
      0 सामान्य पुरुष वृषण
      1 बहुकेंद्रक 1-5 oocytes (आमतौर पर अकेले) वृषण ऊतक के बीच बिखरे हुए साथ ovotestis
      2 बहुकेंद्रक ovotestis, अक्सर छोटे समूहों में 6-20 oocytes वृषण ऊतक के बीच बिखरे हुए
      3 बहुकेंद्रक ovotestis, समूहों में 21-50 oocytes
      4 > 50 और <100 oocytes। धारा आमतौर पर मल्टीफोकल है और परीक्षण की पच्चीकारी की उपस्थिति हैicular गर्भाशय के ऊतक।
      5 > 100 oocytes, आमतौर पर मल्टीफोकल लेकिन यह भी वृषण ऊतक से अलग डिम्बग्रंथि और वृषण ऊतक की स्पष्ट रूप से पहचान क्षेत्रों के साथ फोकल हो सकता है।
      6 > 50 खंड पर जननांगों ऊतक प्रतिशत डिम्बग्रंथि है और स्पष्ट रूप से उपकला कोशिकाओं और ऊतकों phagocytic द्वारा वृषण ऊतक से अलग किया जाता है।
      7 खंड पर जननांगों ऊतक के 100 प्रतिशत डिम्बग्रंथि है।

      6 तालिका स्कोरिंग प्रणाली रोच में इंटरसेक्स स्थिति की गंभीरता का आकलन करने के लिए। Histologically जननांगों के ऊतकों की तैयार स्लाइड प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जानी चाहिए, 20X पर, 100X और 400X बढ़ाई, किसी भी असामान्यताएं और वृषण ऊतक में oocytes की उपस्थिति का आकलन करने के लिए। इस तालिका में Jobling <से संशोधित किया गया हैउन्हें> एट अल। 2006 6।

    Representative Results

    प्रयास अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रियाओं के लिए सुधार के प्रभाव को समझने के लिए या छुट्टी दे दी अपशिष्ट का अंत: स्रावी बाधा पहुँचा गतिविधि के हटाने की प्रभावकारिता के संबंध में मौजूदा WWTP में तृतीयक उपचार के रूप में उपकरण पुराना वापस करने के लिए सबसे उपयुक्त प्रौद्योगिकी का निर्धारण करने के लिए, न केवल कुंजी रसायन की माप की आवश्यकता है घटक है कि काम करता है, लेकिन प्रवेश टूटने उत्पादों जो भी अंत: स्रावी बाधा पहुँचा गतिविधि हो सकता है के विश्लेषण की आवश्यकता है। घरेलू सीवेज अपशिष्ट में, सबसे estrogenic मौजूद पदार्थों स्टेरॉयड हार्मोन, estrone (E1), 17β-estradiol (E2) और 17α-ethinylestradiol (EE2) 5.8 रहे हैं। स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन मुख्य रूप से निष्क्रिय conjugates 16,17 का एक मिश्रण के रूप में शरीर से उत्सर्जित कर रहे हैं। ये संयुग्मित एस्ट्रोजेन काफी बैक्टीरियल गतिविधि के द्वारा सीवरेज प्रणाली में deconjugated कर रहे हैं और आगे गिरावट WWTP में होता है। deconjugated स्टेरॉयड की गिरफ्तारीई सोखना द्वारा अपशिष्ट जल धारा से हटा कीचड़ या माध्यमिक गठन में जिसके परिणामस्वरूप उपचार के दौरान biodegraded, परिवर्तन byproducts के सबसे पहले और अंत में पूरा खनिज प्रारंभिक सक्रिय घटक के हो सकता है। प्रवाह धारा में सभी व्यक्तिगत यौगिकों के रासायनिक विश्लेषण के लिए मुश्किल होगा, समय लेने वाली और महंगा और अज्ञात सक्रिय एक नमूने में मौजूद घटक कवर नहीं करेंगे। इसके अलावा, प्रत्येक घटक के estrogenic योगदान की राशि केवल यौगिकों का विश्लेषण का एक नमूना की संचयी estrogenic शक्ति का एक संकेत प्रदान करेगा। यह एक जोखिम है, जहां परिवर्तन की प्रक्रिया अज्ञात estrogenic पदार्थ या जहां नदी औद्योगिक मूल की है उत्पन्न होता है। Vivo में इन विट्रो ईकोटोकसीकोलौजी bioassays में साथ रासायनिक विश्लेषण के संयोजन में इस तरह के इलाज सीवेज के रूप में मिश्रण में अज्ञात estrogenic घटकों की उपस्थिति के लिए एक समाधान प्रदान करता है। इस तरह के खमीर एस्ट्रोजेन Scr के रूप में इन विट्रो assayseen (हाँ) बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है मल अपशिष्ट का estrogenic गतिविधि निर्धारित करने के लिए और इलाज के नमूने 8,18,19 में सक्रिय घटकों की पहचान करने में मदद करने के लिए। हालांकि, इन विवो के बीच और इन विट्रो परीक्षण में महत्वपूर्ण तुलना 11 हो सकता है और अंत: स्रावी में खलल न डालें शक्ति के उपचार के संबंध में नई प्रक्रियाओं की एक व्यापक मूल्यांकन रासायनिक और ईकोटोकसीकोलौजी परीक्षणों के एक बैटरी की आवश्यकता है।

    अलग-अलग उपचार संयंत्रों या प्रक्रियाओं अपशिष्ट जल धारा से सक्रिय यौगिकों को हटाने के लिए कि क्या एक दृढ़ संकल्प रासायनिक विश्लेषण जो नमूना निकासी, एकाग्रता और निकालने विश्लेषण करने से पहले की साफ-अप इस प्रकार का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, सबसे अधिक बार एलसीएमएस (/ एमएस) या GCMS का उपयोग किया (/ एमएस) तरीकों। डेटा रासायनिक विश्लेषण से प्राप्त अनुपालन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता व्यक्ति के साथ कोई प्रभाव नहीं सांद्रता (PNEC) 20 या पर्यावरण की गुणवत्ता मानक की भविष्यवाणी कीएस (EQS) विशिष्ट व्यक्ति यौगिकों के 21 और इसलिए इस तरह के तरीकों नियामक अनुपालन डेटा के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, लक्षित या गैर लक्षित रासायनिक विश्लेषण के तरीकों जैविक विधियों, जो कुल प्रतिक्रिया उपलब्ध कराने के साथ तुलना की पहचान और व्यक्तिगत यौगिकों या isomers के quantitation अनुमति देते हैं। रासायनिक विश्लेषण के तरीकों इसलिए असतत यौगिकों के आकलन को पूरा करने और एक व्यक्ति के उपचार संयंत्र आधार पर इन अपशिष्ट उपचार चुनौतियों से निपटने के लिए किए जाने की अनुमति देते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि पारंपरिक अपशिष्ट उपचार (जैसे, सक्रिय कीचड़ संयंत्रों) प्राकृतिक स्टेरॉयड हार्मोन को हटाने में अत्यधिक प्रभावी हालांकि सिंथेटिक हार्मोन को हटाने के EE2 कम प्रभावी हो जाता है हो सकता है। उन्नत उपचार ऐसे ओजोन के रूप में तकनीक के उपयोग का उपयोग कर क्षेत्र का अध्ययन, दानेदार सक्रिय कार्बन (जीएसी) और झिल्ली उच्च लागत पर यद्यपि प्रदर्शन किया है, कि वे महीनो से नीचे करने के लिए EE2 दूर करने के लिए एक अंत की पाइप समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताicted प्रभाव के स्तर का पता लगाने और सीमा से नीचे है। चित्रा 3 एक पायलट पैमाने नगरपालिका अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र में जीएसी का उपयोग कर EE2 के हटाने से पता चलता है। पाइप जीएसी उपचार के अंत का उपयोग करते हुए नगरपालिका अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों में पायलट पैमाने पर किए गए अध्ययनों से यह भी estrogenic शक्ति में कमी के बाद जीएसी खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन (हाँ) चित्रा 4 में देखा के रूप में प्रयोग मापा जाता दिखा।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. उन्नत तृतीयक उपचार के बाद ethinylestradiol के हटाने दिखा उदाहरण क्षेत्र डेटा। (ए) नमूने पारंपरिक (सक्रिय कीचड़ संयंत्र) उपचार प्रक्रियाओं नमूना संरक्षण के लिए वर्णित निम्न निम्नलिखित WWTP से एकत्र कर रहे हैं। (बी) नमूने ठोस चरण निकासी, साफ-अप का उपयोग कर सामान्य चरण एसपीई का उपयोग कर हस्तक्षेप पदार्थों को दूर करने के लिए निकाले जाते हैं औरजेल पर्मिएशन क्रोमेटोग्राफी। (सी) स्वच्छ केंद्रित निकालने के लिए एक कम मात्रा करने के लिए ध्यान केंद्रित किया और एमआरएम मोड में नकारात्मक आयन electrospray एलसीएमएस / एमएस का उपयोग कर विश्लेषण किया है। परिणाम isotopically लेबल आंतरिक मानकों का प्रयोग आंतरिक मानकीकरण उपयोग कर की गणना कर रहे हैं। दिखाए गए उदाहरण में, EE2 के 0.1 एनजी / एल की भविष्यवाणी की कोई प्रभाव स्तर (PNEC) के ऊपर एक एकाग्रता में अंतिम एएसपी प्रवाह में मौजूद है और जीएसी और ओजोन का उपयोग कर निकाल दिया जाता है (ओ 3) एक पर्यावरण सुरक्षित एकाग्रता के लिए। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. एक खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन (हाँ) परख प्लेट (ए), लाल रंग के लिए पीले रंग से रंग बदलने दिखा नमूनों की estrogenic गतिविधि से संबंधित के फोटो। हाँ परख थाली दिखाने से बनाया भूखंड absorbance सुधारा (540एस्ट्राडियोल मानक (बी) के एनएम), सक्रिय कीचड़ प्रक्रिया प्रवाह (एएसपी) और बारीक सक्रिय कार्बन (जीएसी) में इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह के नमूने (सी)। प्रत्येक नमूना दो प्रतियों में परीक्षण किया गया था। एएसपी और जीएसी अपशिष्ट निकाले हैं और इस खंड 1 में उल्लिखित विशेष तरीकों का उपयोग कर केंद्रित थे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Ozonation भी पारंपरिक इलाज किया अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन और estrogenic गतिविधि को दूर करने में कुशल है। ओजोन अपशिष्ट जल के नमूनों में जैविक प्रदूषणों से एक विस्तृत श्रृंखला और भंग कार्बनिक पदार्थ oxidize करने में सक्षम है और कीटाणुशोधन गुण प्रदान करता है। Ozonation की प्रभावशीलता ऐसे पीएच, कार्बनिक पदार्थ की मात्रा और ओजोन के लागू खुराक के रूप में पानी विशेषताओं पर निर्भर करता है। एस्ट्रोजेन कि खराब पारंपरिक इलाज से हटा रहे हैं हो सकता है0.8 और 2 मिलीग्राम ओ 3 / मिलीग्राम डॉक्टर के बीच खुराक के साथ गंदे पानी से हटा दिया। ओजोन एक चयनात्मक ऑक्सीकरण एजेंट है, जो इलेक्ट्रॉन अमीर साइटों (असंतृप्त कार्बन-कार्बन बांड, खुशबूदार एल्कोहल सहित सुरभित यौगिकों), जो ओजोन ईडीसी के एक नंबर के टूटने के लिए लागू करता है के साथ प्रतिक्रिया करता है। हालांकि, व्यक्तिगत यौगिकों के उन्मूलन जरूरी मूल परिसर की पूरी खनिज करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है। कार्बनिक पदार्थों निम्नलिखित Ozonation द्वारा उत्पादों जो कम आणविक वजन का एक नंबर शामिल पैदा मध्यवर्ती या परिवर्तन ऑक्सीकरण तब्दील किया जा सकता है, इस तरह के एल्डीहाइड, कीटोन, कार्बोक्जिलिक एसिड होता है, कीटो एसिड होता है, और ब्रोमीन यौगिकों के रूप में यौगिकों के ध्रुवीय क्लासेस। उदाहरण Bromate, formaldehyde, एसीटैल्डिहाइड और कार्बोक्जिलिक एसिड शामिल हैं। विवो में उपयोग करना है और इन विट्रो bioassays में यह दिखाया गया है कि हालांकि ओजोन केवल आंशिक रूप से कुछ रासायनिक पदार्थों ऑक्सीकरण होता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रमुख परिवर्तन उत्पादों में एक कम estrog हैenic शक्ति और इसलिए estrogenic गतिविधि का एक उच्च हटाने में एक उचित खुराक परिणामों पर ओजोन के आवेदन।

    अपशिष्ट जल के अतिरिक्त उपचार के प्रमुख लाभ में से एक के पानी प्राप्त करने में नर मछली की feminization में कमी है; एक प्रतिकूल प्रभाव है कि प्रजनन क्षमता में कमी 3 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। vivo अध्ययन में मछली का उपयोग (जैसे, एक प्रकार की मछली या मूर्ख मनुष्य छोटी मछली) (के रूप में चित्रा 5 में देखा है, उदाहरण के लिए) नर मछली की वृषण में अपशिष्ट जल के शो मादा जनन कोशिकाओं या oocytes से अवगत कराया। इंटरसेक्स या पुरुष VTG अनुपस्थित या काफी ऐसे जीएसी 7 या ओजोन 22 के रूप में उन्नत इलाज के बाद मछली में कम है। इन अध्ययनों से पता चलता है कि परिवर्तन Ozonation दौरान निर्मित उत्पादों estrogenic नहीं कर रहे हैं, लेकिन इस प्रवाह उत्पादन की विषाक्तता का पता नहीं है। यह समस्या अन्य अध्ययनों में मैगडेबर्ग एट अल द्वारा एक अध्ययन संबोधित किया गया है, उदाहरण के लिए।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. एक सामान्य पुरुष (ए) और इंटरसेक्स की Photomicrographs (बी, सी) वयस्क रोच (Rutilus rutilus) से gonads एक क्षेत्र आधारित मूल्यांकन। सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़-ए में अपशिष्ट जल से अवगत कराया, सामान्य पुरुष वृषण की एक ऊतकीय खंड दर्शाया गया है। सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़-बी और सी, एक इंटरसेक्स पुरुष मछली के histological वर्गों, छह महीने के लिए सक्रिय कीचड़ प्रक्रिया अपशिष्ट प्रवाह को उजागर किया गया होने दर्शाया गया है। तीर वृषण ऊतक में मौजूद oocytes संकेत मिलता है। स्केल बार प्रत्येक सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ में 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    26 - TAML activators अपशिष्ट 12,24 में जैविक micropollutants की हाइड्रोजन पेरोक्साइड ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया है। TAML एच 22 के साथ activators प्रभावी रूप से शुद्ध प्रयोगशाला में पानी के साथ ही नगर निगम के अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से अपशिष्ट में और नुकीला मूत्र के नमूने 12 में EE2 और अन्य स्टेरॉयड एस्ट्रोजेन नीचा। प्रयोगशाला अध्ययन से पता चलता है कम कर देता है TAML / एच 22 उपचार EE2 हटाने सहित उच्च स्टेरॉयड एस्ट्रोजन हटाने प्रदान करता है और काफी हद तक इन विट्रो में मापा जाता estrogenic गतिविधि यस bioassay और द्रव्य का उपयोग करlly VTG bioassay (चित्रा 1 और चित्रा 6) का उपयोग करके मापा विवो में मछली feminization घटता है।

    चित्रा 6
    चित्रा 6 औसत EE2 एकाग्रता और में estrogenic गतिविधि और इलाज की टंकी के पानी (ए) और आधारभूत में प्लाज्मा vitellogenin और उजागर पुरुष मछली (बी)। ए) EE2 एकाग्रता (एनजी / एल, गहरे नीले रंग की सलाखों) एलसीएमएस / एमएस द्वारा मापा गया था , estrogenic गतिविधि (EE2 बराबर एनजी / एल, गहरे हरे रंग की सलाखों) में इन विट्रो खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन के माध्यम से मापा गया था (हाँ)। बी) प्लाज्मा vitellogenin (एनजी / एमएल, हल्के नीले रंग की सलाखों) पुरुष मूर्ख मनुष्य minnows में एकाग्रता एक मात्रात्मक एंजाइम के माध्यम से मापा गया immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े। EE2 रासायनिक विश्लेषण के रूप में रिपोर्ट परिणामों <0.03 एनजी / एल EE2 (यानी, पता लगाने सीमा (लोद) की तुलना में कम) आधा लोद (यानी होने के रूप में इलाज किया गया 2 ओ 2 + TAML, EE2 + एच 22, और EE2 केवल। ग्राफ-ए में त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं, ग्राफ-बी में त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। ग्राफ-बी में सलाखों के ऊपर पत्र सांख्यिकीय समानता का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा मिल्स एट अल से संशोधित किया गया है। 12 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र ईडीसी के साथ सतही जल प्रदूषण का प्रमुख मार्ग हैं। , पारंपरिक उन्नत या उभरते उपचार प्रक्रियाओं का अंत: स्रावी गतिविधि के हटाने की प्रभावकारिता का मूल्यांकन रासायनिक और जैविक assays की एक किस्म का उपयोग की आवश्यकता है। गैर लक्षित और लक्षित विश्लेषण का उपयोग रासायनिक विश्लेषण व्यक्तिगत घटकों के हटाने की प्रभावकारिता पर गुणात्मक या मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है और इसलिए अनुमति देता है एक आकलन के पर्यावरण की गुणवत्ता मानकों के खिलाफ किए गए या यौगिकों या यौगिकों के मिश्रण का विश्लेषण के लिए कोई प्रभाव नहीं सांद्रता भविष्यवाणी की जा सके।

    उपचार और अपशिष्ट जल में अज्ञात जैविक रूप से सक्रिय घटकों की उपस्थिति निम्नलिखित पदार्थों की अधूरी खनिज से उत्पन्न परिवर्तन उत्पादों की पीढ़ी अकेले रासायनिक परीक्षण की उपयोगिता को सीमित करता है। एक विश्लेषणात्मक रसायनज्ञ के साथ संयोजन में vivo में इन विट्रो bioassays में के संयोजनRY स्क्रीनिंग में उभर रहा अपशिष्ट जल उपचार प्रक्रियाओं से ईडीसी हटाने की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बॉक्स प्रदान करता है। इन परीक्षणों, जब पारंपरिक जल की गुणवत्ता मानकों और अन्य विषाक्तता और सूक्ष्मजीवविज्ञानी अंत अंक के साथ आयोजित वर्तमान और उभरते अपशिष्ट उपचार प्रौद्योगिकियों के एक महत्वपूर्ण मूल्यांकन अनुमति देते हैं।

    यह केवल इन विट्रो assays रसायन और अपशिष्ट जल के estrogenic शक्ति निर्धारित करने के लिए ध्यान दें कि खमीर आधारित एस्ट्रोजन स्क्रीन (जैसे, हाँ) महत्वपूर्ण है नहीं कर रहे हैं। स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी सेल आधारित assays के एक नंबर भी उदाहरण के लिए, ईआर CALUX 27 और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं या गर्भाशय ग्रीवा ट्यूमर कोशिकाओं के साथ hERα-हेला-9903 28 क्रमशः विकसित किया गया है। यस समान स्तनधारी सेल आधारित assays तुलना की गई है और reproducibility के एक तुलनीय उच्च स्तर पाया गया है, सच सकारात्मक और नकारात्मक सच estrogenic पहचान दरों 29, हालांकिऊ यह कभी कभी थोड़ा कम संवेदनशील 27 माना जाता है। खमीर आधारित संवाददाता assays के एक लाभ यह स्तनधारी सेल संस्कृति के साथ महत्वपूर्ण अनुभव के बिना प्रयोगशालाओं में हाँ अधिक आसानी से अपनाया जा सकता है कि, के रूप में यह कम कठोर जैव नियंत्रण के उपायों और बाँझ तकनीक की आवश्यकता है (हाँ बेंच शीर्ष यदि आवश्यक हो पर किया जा सकता है) । मानव कोशिका आधारित assays भी हाँ में इस्तेमाल मानक इनक्यूबेटर और microplate पाठकों की तुलना में सीओ 2 इन्क्यूबेटरों और luminometers की आवश्यकता होती है। दो खमीर आधारित एस्ट्रोजन संवाददाता assays (हाँ, Saccharomyces cerevisiae और एक-हाँ, Arxula adeninivorans) आईएसओ 19040 के सत्यापन के लिए वर्तमान दौर से गुजर रहे अंतर-प्रयोगशाला ट्रेल्स "पानी की गुणवत्ता - पानी और अपशिष्ट जल के estrogenic क्षमता का निर्धारण" उद्योगों पर प्रकाश डाला इन तकनीकों में रुचि।

    वर्णित विधि की सीमाओं की एक संख्या है जो संभावित प्रदूषण को शामिल कर रहे हैंनमूने, नमूना भंडारण और क्षेत्र या प्रयोगशाला वातावरण से या मानव संदूषण (जैसे, plasticizers, surfactants, पर्सनल केयर उत्पादों) से होने वाले estrogenic पदार्थों के साथ विश्लेषण के दौरान नमूनों की। हाँ परख (या अन्य सेल आधारित संवाददाता assays) में संदूषण की इस प्रकार की पृष्ठभूमि तरक्की और परख के उपयोग के प्रभाव होगा। पानी के नमूने या सॉल्वैंट्स प्लास्टिक की बोतलों में संग्रहित आसानी से झूठी सकारात्मक हो सकता है। दोनों के रूप में एलसीएमएस / एमएस और यस परख विशेष आवश्यकता detectable स्तर को एस्ट्रोजेन ध्यान केंद्रित करने की झूठी नकारात्मक चिंता का विषय भी हैं। मैट्रिक्स, एसपीई sorbent और क्षालन विलायक के चुनाव निकासी दक्षता और eluted यौगिकों के प्रकार को प्रभावित कर सकते हैं। स्थिति इस प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग कर एक नकारात्मक पूर्वाग्रह पैदा कर सकते हैं निकासी के लिए C18 एसपीई कारतूस का प्रयोग, के रूप में अत्यधिक ध्रुवीय और बुनियादी यौगिकों खराब sorbent द्वारा बनाए रखा जाएगा। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल methan से eluted यस eluent के पुनर्गठन की आवश्यकता हैराजभाषा वाष्पीकरण के माध्यम से इथेनॉल के लिए आर्थिक सहायता देने वाले अस्थिर यौगिकों के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप नाइट्रोजन सूखापन के लिए। एक परिणाम के रूप में प्रोटोकॉल का परीक्षण नमूनों की estrogenic गतिविधि को कम करके आंका प्रदान कर सकता है। इन सीमाओं को विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब विचार अज्ञात या अप्रत्याशित यौगिकों के रूप में हाँ परख, याद किया जा सकता है, क्योंकि वे निकाला नहीं किया गया है या वे वाष्पीकरण के कारण खो रहे हैं। इसके अलावा, एलसीएमएस / एमएस तकनीक लेबल आंतरिक मानकों वसूली के लिए सही करने के लिए का उपयोग करता है; इस दृष्टिकोण यस परख के साथ प्रयोग नहीं किया जा सकता है।

    अपशिष्ट का विवो परीक्षण के महत्वपूर्ण सीमाओं उच्च लागत और समय में इन विट्रो तरीकों की तुलना में मूल्यांकन के लिए आवश्यक शामिल हैं। वर्तमान में मछली भ्रूण परीक्षण के उपयोग estrogenic गतिविधि का पता लगाने के लिए सीमित है। हालांकि, वहाँ एस्ट्रोजन उत्तरदायी मछली भ्रूण 30 है, जो भविष्य अनुप्रयोगों सकता है चमक ट्रांसजेनिक के उत्पादन के साथ कुछ सफलता मिली है। मूर्ख मनुष्य minnows (इस protoc में इस्तेमाल कियाराजभाषा) एक आम प्रयोगशाला प्रजातियों और पुरुष मछली में VTG प्रेरण estrogenic जोखिम के एक अच्छी तरह से प्रलेखित जैव मार्कर और अपशिष्ट जल प्रवाह estrogenicity 22 या अन्य estrogenic यौगिकों या मिश्रण 31 के एक मात्रात्मक उपाय है कर रहे हैं। अंत: स्रावी में खलल न डालें रसायनों के लिए ओईसीडी परीक्षण के दिशा-निर्देशों VTG सभी तीन प्रजातियों में एस्ट्रोजन जोखिम के एक संवेदनशील बायोमार्कर होने के साथ वयस्क मूर्ख मनुष्य छोटी मछली, जापानी medaka और zebrafish 32,33 का उपयोग कर पुष्टि की है। हालांकि, VTG प्रेरण सीधे प्रजनन हानि और इसलिए अपशिष्ट जल जोखिम की पारिस्थितिकी परिणाम भुगतने के लिए, के रूप में गंभीर रूप से इंटरसेक्स रोच 3 में देखा सहसंबंधी नहीं है। दूसरी ओर, एक प्रकार की मछली ईकोटोकसीकोलौजी अनुसंधान के लिए एक क्लासिक 'प्रयोगशाला' प्रजाति उनके बड़े आकार, लंबे समय पीढ़ी (2-3 वर्ष यौन परिपक्वता तक पहुँचने के लिए), प्रजनन शैली की वजह से नहीं कर रहे हैं; समूह स्पॉन (प्रजनन) एक वर्ष में एक बार होता है, और कठिनाई महिलाओं से पुरुषों (दौरान की तुलना में अन्य की पहचान करने के लिएspawning के मौसम)। बहरहाल, यह सामान्य रूप से gonochoristic प्रजातियों बहुत अच्छी तरह से ब्रिटेन में अध्ययन किया गया है, खोज की है कि estrogenic अपशिष्ट जल अपशिष्ट का नीचे की ओर, पुरुष मछली उनकी Endocrinology को perturbations का प्रदर्शन (जैसे, उनके रक्त में महिला-विशिष्ट vitellogenin की उपस्थिति) और ऊतकविकृतिविज्ञानी (ovotestes के कारण - वृषण और / या महिला प्रजनन नलिकाओं) 5,6 में अंडे का विकास। इसलिए, इन प्रोटोकॉल के भविष्य के आवेदन के रूप में, एक प्रकार की मछली (या इसी तरह की प्रजाति) एक उपयोगी जंगली प्रजातियों प्रहरी को दिखाने के लिए यदि अपशिष्ट जल गुणवत्ता (और कम estrogenicity) के लिए वास्तविक सुधार उन्नत इलाज किया अपशिष्ट प्राप्त नदियों में देखा जाता है हो सकता है। उन्होंने यह भी पायलट पैमाने पर पौधे 7 से तकनीकी रूप से उन्नत अपशिष्ट की निगरानी के लिए पाइप सिस्टम के अंत में नियोजित किया जा सकता है। जब जो प्रजाति विवो अपशिष्ट जल आकलन में में उपयोग करने पर विचार वहाँ अपेक्षाकृत जल्दी और नियंत्रित परीक्षण का उपयोग कर प्रयोगशाला प्रजातियों के बीच एक tradeoff की तुलनालंबे समय तक मैदान पर आधारित है, लेकिन पर्यावरण के अधिक प्रासंगिक, देशी प्रजातियों का उपयोग कर परीक्षण। हालांकि, विवो आकलन में इस तरह के उच्च लागत रहे हैं और केवल निम्नलिखित रासायनिक विश्लेषण का उपयोग कर के आकलन परीक्षण के अंतिम सेट के रूप में और इन विट्रो assays में विचार किया जाना चाहिए।

    वर्णित प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम तैयारी और नमूने और कांच के बने पदार्थ की हैंडलिंग में शामिल हैं (यानी, बोतलें और नमूने उपकरण उपयुक्त सतह सक्रिय सफाई एजेंट के साथ पहले से व्यवहार किया जाना चाहिए) प्लास्टिक और साथ नमूने के संपर्क सीमित सहित पर्यावरण contaminants से नमूने के संक्रमण से बचने के लिए अन्य सामग्री है कि झूठी सकारात्मक उत्पादन कर सकते हैं। यह भी उतना ही महत्वपूर्ण है जब डिजाइनिंग और एक्वेरियम और मछली जोखिम प्रणालियों का निर्माण होता है। आदर्श रूप में एक्वेरियम (आवास स्टॉक और जोखिम के दौरान) कम से कम जोखिम के साथ प्रदूषण को कम सोखना 32 के साथ सामग्री से बनाया जाना चाहिए। स्टेनलेस स्टील के प्रवाह या जल धारण टैंक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।जबकि एक गिलास निर्माण के टैंक मछली टैंक के लिए पसंद कर रहे हैं (यह भी मछली की आसान अवलोकन प्रदान करता है के रूप में)। कम ग्रेड प्लास्टिक पाइप या ट्यूबिंग का प्रयोग नहीं होना चाहिए अगर 'ठीक से अनुभवी' 32, परमवीर चक्र 34 और ABS इस्तेमाल किया जा सकता है, यानी, उपयोग करने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए कमजोर पड़ने पानी चलाने में किसी भी दूषित पदार्थों को बाहर नमकीन पानी के लिए छोड़ दिया। चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन टयूबिंग टैंक के लिए रसायन और अपशिष्ट जल / कमजोर पड़ने पानी की क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप वितरण के लिए हमारी सुविधा में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। के रूप में अच्छी तरह से निर्माण में estrogenic संदूषण पर विचार और तैराकी प्रणाली के चलाने के रूप में, यह भी मछली के आहार के बारे में सोचने के लिए महत्वपूर्ण है; कई औचित्य मछली खाद्य पदार्थ मछली के लिए estrogenic होना पाया गया है। इसलिए यह किसी भी खाद्य पदार्थ उन्हें अध्ययन के इन प्रकारों में उपयोग करने से पहले (, जैसे खमीर एस्ट्रोजेन स्क्रीन में, देखें Beresford एट अल। 14) गतिविधि के लिए परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है।

    समस्या निवारणरासायनिक विश्लेषण या हाँ परख वर्णित एकाधिक यात्रा, प्रयोगशाला सहित यदि गुणवत्ता आश्वासन के नमूने और विलायक कारतूस सकारात्मक नियंत्रण और वास्तविक नमूने के साथ विश्लेषण कर रहे हैं झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी परिणाम को खत्म करने के लिए सरल है प्रोटोकॉल की। सकारात्मक (जैसे, EE2) और नकारात्मक (कमजोर पड़ने पानी केवल) नियंत्रण भी हमेशा इन विवो assays में इस्तेमाल किया जाना चाहिए उम्मीद जैविक बायोमार्कर या समापन बिंदु (यानी, VTG या ऊतकविकृतिविज्ञानी) की संवेदनशीलता की पुष्टि के लिए, और अनुमति किसी भी अप्रत्याशित संदूषण का पता लगाया जा सकता है ( जैसे, प्रयोगात्मक सेट अप, आहार, या कमजोर पड़ने के पानी) से। प्रोटोकॉल में किसी भी संशोधन के किसी भी अध्ययन का आयोजन करने से पहले मान्य किया जाना चाहिए।

    WWTP अपशिष्ट के माध्यम से वातावरण में प्रवेश estrogenic यौगिकों की सख्त विनियमन के साथ यह है कि और अधिक प्रभावी अपशिष्ट उपचार प्रौद्योगिकियों को विकसित किए जाने की आवश्यकता होगी परिकल्पना है। इस पांडुलिपि में वर्णित परीक्षण की बैटरी को बधाईecotoxicological और रासायनिक मूल्यांकन परीक्षण सामान्य रूप से अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र प्रवाह निर्वहन करने के लिए आवेदन किया। इसलिए, परीक्षण, अपशिष्ट जल प्रौद्योगिकी डेवलपर्स, और संयंत्र ऑपरेटरों को सक्षम होना चाहिए के समग्र बैटरी के इस प्रकार के भविष्य के आवेदन सबसे पारिस्थितिकी सुरक्षित दोनों विशिष्ट विनियमित estrogenic रसायनों और समग्र जैविक गतिविधि को दूर करने के लिए सर्वोत्तम तरीकों पर विचार डिजाइन को लागू।

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Wellwash Versa plate washer Thermo Scientific 5165010
    Plate reader Molecular Devices SpectraMax 340PC
    Incubator Memmert INB 400 37 °C incubation required for carp assay
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Icemaker Scotsman AF80
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    ELISA kits Biosense Laboratories V01018401-096 (Fathead minnow)
    V01003402-096 (Carp)
    Microfuge tubes, 0.5 ml Alpha labs LW2372
    Microfuge tubes, 1.5 ml Alpha labs LW2375
    Sulphuric acid, 95-98% Sigma-Aldrich 258105
    Histology
    Tissue processor Leica Biosystems TP1020
    Wax dispenser Thermo Scientific Raymond Lamb E66HC
    Metal embedding mold Leica Biosystems Various
    Hot plate Thermo Scientific Shandon 3120063
    Cold plate (EG1150 C) Leica Biosystems 14038838037
    Heated forceps (EG F) Leica Biosystems 14038835824
    Microtome Leica Biosystems RM2235
    Paraffin section floatation  bath Electrothermal MH8517
    Slide drying bench Electrothermal MH6616
    Stainmate automated stainer Thermo Scientific Shandon E103/S10L
    Cassettes, Histosette II, biopsy Simport M493
    Paraffin wax Thermo Scientific Raymond Lamb W1
    Histo-Clear II National Diagnostics HS-202
    IMS (ethanol mix), IDA99 Tennants ID440
    Polysine adhesion slides Thermo Scientific Gerhard Menzel J2800AMNZ
    Cover slips, 22x50 mm VWR 631-0137
    Histomount National Diagnostics HS-103
    Haematoxylin Harris GURR VWR 351945S
    Eosin, 1%, aqueous Pyramid Inovation S20007-E
    Fisherbrand slide boxes Fisher Scientific 11701486
    Microtome blades, MB35 Thermo Scientific Shandon 3050835
    Bouin’s solution Sigma Aldrich HT10132-1L
    Yeast screen
    Flow cabinet Labcaire Systems Ltd SC12R
    Cooled incubator LMS Cooled Incubator 303
    Incubator Memmert INB 400
    Shaker Grant PSU-10i
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Plate shaker Heidolph Titramax 100 544-11200-00
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    12-channel pipette, electronic Sartorius 735441
    96-well flat-bottom microplates MP Biomedicals
    Thermo Scientific Nunc
    Sarstedt
    76-232-05
    260860
    82.1581.001
    We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
    HPLC grade water Rathburn RH1020
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    Potassium phosphate monobasic anhydrous Sigma-Aldrich P-5655
    Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A-2939
    Potassium hydroxide, pellets Sigma-Aldrich P-1767
    Magnesium sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich M-2643
    Iron(III) sulfate Sigma-Aldrich 307718
    L-Leucine Sigma-Aldrich L-8912
    L-Histidine Sigma-Aldrich H-6034
    Adenine Sigma-Aldrich A-2786
    L-Argenine, hydrochloride Sigma-Aldrich A-6969
    L-Methionine Sigma-Aldrich M-5308
    L-Tyrosine Sigma-Aldrich T-8566
    L-Isoleucine Sigma-Aldrich I-7403
    L-Lysine, hydrochloride Sigma-Aldrich L-8662
    L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P-5482
    L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G-8415
    L-Valine Sigma-Aldrich V-0513
    L-Serine Sigma-Aldrich S-4311
    Thiamine, hydrochloride Sigma-Aldrich T-1270
    Pyridoxine Sigma-Aldrich P-5669
    D-Pantothenic acid, hemicalcium salt Sigma-Aldrich P-5155
    Inositol Sigma-Aldrich I-5125
    D-Biotin Sigma-Aldrich B-4639
    D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers Sigma-Aldrich G-7021
    L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A-4534
    L-Threonine Sigma-Aldrich T-8441
    Copper(II) sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich C-1297
    Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 10884308001
    Glycerol Sigma-Aldrich G-2025
    17 β-Estradiol Sigma-Aldrich E-8875
    Steroids
    Acetone Rathburn
    Acetonitrile Rathburn
    Ammonia solution Rathburn
    Ethylacetate Rathburn
    Copper(II) nitrate Sigma-Aldrich
    Acetone Rathburn
    Dichloromethane Rathburn
    2,4,16,16-d4-17β-estradiol CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-estrone CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol CDN Isotopes
    17β-estradiol Sigma-Aldrich
    Estrone Sigma-Aldrich
    17α-ethynyl oestradiol Sigma-Aldrich
    Hexane Rathburn
    Hydrochloric acid Sigma-Aldrich
    Methanol Sigma-Aldrich
    Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich
    Sodium hydroxide Sigma-Aldrich
    Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) Biotage
    Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) Biotage
    Fish study
    orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 Watson Marlow 982.0063.000
    straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 Watson Marlow 999.2008.000
    pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m Watson Marlow 913.A008.016
    200 series multi-channel persitaltic pump Watson Marlow 205CA
    Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) VWR SFM1-3250
    silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) VWR SFM1-5450
    2.5 L glass winchester pk 4 Fisher Scienctific BTF-505-050B
    magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 Fisher Scienctific FB55595 
    Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma Aldrich E10521-10G
    17α-Ethynylestradiol Sigma Aldrich E4876-100MG
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    SPE
    1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 Sigma Aldrich 57276
    disposable liners for manifold Sigma Aldrich 57059
    filtration tubes without frits 6 ml pk 30 Sigma Aldrich 57242
    reservior adaptors pk 12 Sigma Aldrich 57020-U
    stainless steel weight for manifold pk 4 Sigma Aldrich 57278
    male Luer plug for manifold pk 12 Sigma Aldrich 504351
    SPE Vacuum Manifold Sigma Aldrich 57265
    stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 Waters WAT054806
    Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50  Waters WAT020515
    Methanol HPLC grade 2.5 L Fisher Scientific M/4056/17
    7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 Fisher Scientific TUL-520-031K
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump Camlab 1136915

    References

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