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对污水处理工艺的疗效评估利用化学和生态毒理学方法的电池,以消除雌激素潜能

1, 1, 1, 2, 2, 2, 1

1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

Article
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    Summary

    内分泌干​​扰物(EDC)构成重大风险到水生环境。城市污水处理厂的主要贡献者,以地表水的雌激素效力。本文提供的方法允许疗效和污水处理工艺的适用性相对于EDC去除的评估。

    Date Published: 9/11/2016, Issue 115; doi: 10.3791/54243

    Cite this Article

    Beresford, N., Baynes, A., Kanda, R., Mills, M. R., Arias-Salazar, K., Collins, T. J., et al. Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency. J. Vis. Exp. (115), e54243, doi:10.3791/54243 (2016).

    Introduction

    关于内分泌干扰物对野生动物的生殖健康产生不利影响的担忧已导致欧盟在水框架指令(WFD)“观察名单”上放置两个雌激素物质(雌二醇和炔雌醇)。 EDC包括各种化学类,包括天然和合成的类固醇的雌激素,药物,杀虫剂和工业化学品和消费产品上的野生动物已知的不利影响的成分的。这些化合物的一些可能潜在地影响人类健康1。

    有研究表明,污水处理厂的污水是雌激素对鱼类2并因此很多受纳水体也雌激素对鱼类3。这是首先通过在英国的全国调查表明,野生雄鱼的血液和前期高位表明卵黄蛋白原增加浓度(女卵黄蛋白前体4)阴阳的价(发展雄鱼睾丸鸡蛋和/或女性生殖管道)的正常雌雄异体鱼种5,6。

    传统的污水处理通常是由经过初步筛选后一级和二级处理从而消除溶解和悬浮有机物的一个三阶段的过程。除去个别的EDC的功效依赖于物质的物理化学性质和所采用的治疗方法的有效性。对于通过吸附和生物降解许多EDC去除可以显著,但不完整的。三级处理,如砂滤,可在采用先进的氧化(例如臭氧)增加,而先进的治疗EDC拆除7有效或活性炭能有效地接近完全去除7实现。

    任何新技术的污水处理NEE评估DS确定EDC除去所提出的方法的功效。测试,包括有针对性的化学分析毒理学一起测试, 使用体内体外生物测定的电池,为此提供了全面的数据。虽然监管是非常有用的,有针对性的化学分析只能提供有关监测化合物(和具体的代谢物)数据。生物测定另外允许的副产品代谢物和治疗产生的废水变换的不利影响,否则将被未被发现-8,9-“检测”。本文介绍了使用化学和生态毒性实验室检测的电池的评估除去原油的雌激素效力和处理后的污水和受纳水体的一些先进和新兴的污水处理工艺的功效。

    Protocol

    伦理声明:评估内分泌干扰鱼类化学品/混合物的活动协议已通过布鲁内尔大学的动物福利和伦理审查机构(AWERB)和英国内政部的动物下(科学程序)1986年法令。

    1.水样采集,保存和提取

    1. 样品采集和保存
      1. 在使用之前,清洗瓶与合适的表面活性清洁剂。清洁后,用清水冲洗干净,沥干和干燥瓶。
      2. 收集在含有由0.5克铜(II)硝酸盐和6ml 3.6摩尔的盐酸溶液的防腐剂2升容量的玻璃瓶的样本。商店的样品在10℃以下。提取并尽快分析地跟踪收集和保存。
    2. 样品提取和清理(类固醇雌激素分析)10
      1. 固相萃取(SPE)
        1. 之前提取,以减少悬浮固体,用1微米孔径的滤纸过滤水的样品。
          1. 2,4,16,16-D 4-17β-雌二醇(E2):一旦通过添加100μl的尖峰含有氘代内标准储备溶液2,4,16,16-D 4 -estrone的过滤,用内标穗样品:和2,4,16,16-D 4-17α炔雌醇(EE2)(均为40微克/升的甲醇)达1,000ml流出物(或100毫升进水)导致的2纳克/升污水内部尖峰流出物的样品,和用于污水进水样品20纳克/升。
        2. 附上一次性阀套,苯乙烯乙烯基苯SPE墨盒,硒鼓和水库的SPE设备。交换机上的真空泵,以测试设备被适当密封。
        3. 吸管溶于5ml乙酸乙酯中成每个储存,以调节墨盒。打开真空泵(至低于10英寸汞柱,以允许小于每分钟10毫升流速)并通过液体拉。不要让固相萃取柱干燥。用5毫升甲醇,随后用5毫升水重复过程。
        4. 补足每个盒水库用水和盒水库和玻璃样品瓶之间连接1/8“的PTFE管中。以每分钟小于10毫升流速开关在真空,并允许整个样本穿过盒。废瓶作为必要的空。
        5. 彻底干燥固相萃取柱真空(或使用空气或氮气),直到墨盒内容改变颜色( 例如,从深褐 ​​色到浅棕色)。
        6. 放在洁净干燥的10ml玻璃管收集瓶放入提取歧管内的机架和地点。检查每个衬垫是小瓶的上方。吸管8毫升二氯甲烷到每个样品贮器,开关上的真空泵(每分钟为小于10 mL流量)和拉液体通过进入收集瓶。
        7. 从SPE歧管移除10部mL样品瓶和使用一个集中的体积减少至1ml。每个样品转移到自动进样瓶中,并进一步集中到100微升用氮气吹下来的设备。
      2. 凝胶渗透色谱(GPC)的清理
        1. 注入95微升洗脱样品提取到使用表1记载的条件的GPC配备高效液相色谱法。浓缩GPC提取向下到200微升使用集中器和氮气吹下来的装置和然后使高达2.0毫升己烷。
      3. SPE清理
        1. 一次性安装阀门衬里,氨丙基墨盒,硒鼓和水库的SPE多方面的。放在洁净干燥的10ml玻璃管收集瓶放入提取歧管内的机架和地点。加入2毫升己烷到每个储,以调节墨盒。允许液体穿过墨盒。
        2. 移液器GPC样品提取到容器并再次允许液体通过墨盒。收集样品洗脱液在小瓶和从歧管中移除。不要丢弃洗脱液。
        3. 换上新的清洁干燥10毫升收集瓶插入机架并将提取歧管内。洗盒,加入2毫升乙酸乙酯的己烷(30%V / V)的贮存器,并通过暗盒拉液体。用在己烷中的另外2毫升乙酸乙酯重复,丢弃所有的洗涤。
        4. 将原来的10 ml收集瓶(步骤1.2.3.2)早在提取歧管内的机架。吸管2毫升乙酸乙酯在丙酮(50%体积/体积)到容器,在真空泵开关(低于2英寸汞柱,以允许小于每分钟2ml的流速),并通过拉液体到小瓶。重复该过程与另外2毫升乙酸乙酯。
        5. 取出样品瓶,并使用一个集中的提取量减少至1ml。将样品转移到一个较小的玻璃小瓶,用氮气吹下来的设备,蒸发Ť他解压到初期干燥。
        6. 加入100μl甲醇拌匀。转移提取到自动取样管形瓶(用0.3ml插入)和帽的小瓶中。分析使用LCMS / MS样品(见第2节)。
    柱: PL凝胶,50 A,300×7.5毫米,5微米
    保护柱: PL凝胶,50×7.5毫米,5微米
    流动相: 二氯甲烷
    流量: 1毫升每分钟
    柱温度: 25℃
    紫外检测器: 210纳米
    注射体积: 95微升
    注入方式: 站ARD
    绘制速度: 500毫升每分钟
    弹出速度: 500毫升每分钟
    绘制位置: 3毫米
    分数收集: 3毫升级分(7 - 10分钟)在10毫升的小瓶

    表1条件和凝胶渗透色谱法(GPC)萃取废水样品的清理参数。表详细GPC柱,流动相,温度,注射量,并且检测器波长。

    1. 样本提取(酵母雌激素屏幕)
      1. 过滤器样品在第1.2.1.1详细的。附上一次性阀套,C18 SPE墨盒,硒鼓和水库的SPE设备。交换机上的真空泵,以测试设备被适当密封。
      2. 吸管5ml甲醇到每个储存,调节所述Ç18墨盒。打开真空(约5英寸汞柱,以允许每分钟约5ml的流),并让通过液体运行,暂停通过1分钟一半。不要让墨盒干涸。无论是用HPLC级或双蒸水重复过程(DDH 2 O)。同样不干涸。
      3. 提取如第1.2.1.4所述的水样。继续在真空中​​至少30分钟以彻底干燥墨盒。
      4. 将清洁的干10毫升收集瓶成在提取歧管机架中。检查每个衬垫是小瓶的上方。 5ml甲醇加入到每个容器。打开真空(5毫升/分钟的最大流量),并允许液体通过暗盒通入小瓶中,暂停对通过2分钟的一半。
      5. 在此之前使用YES屏幕分析,采用氮提取物减少初期干燥,用500-1000微升乙醇重组。密封样品瓶的盖,以避免蒸发,并保持在4℃(在一个火花 - 自由冰箱)。

    2.化学分析用LCMS / MS

    1. 优化使用制造商的说明LCMS / MS系统的操作条件。
    2. 分析校准标准溶液,将样品提取物,空白和分析质量控制(AQC)样品用液相色谱法和质谱法的条件下,和监视离子跃迁如表2详细描述。使用内部确定在样品提取的类固醇雌激素的浓度标准10。
    LCMS
    液相色谱
    柱: C18(2),150×4.6毫米,5微米。
    注射体积: 20微升
    流: 0.5毫升每分钟。
    中号obile阶段: 溶剂A:含0.1%氨水。
    溶剂B:乙腈。
    梯度程序:
    时间(min) 0 10 18 24 28
    A:B溶剂比 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
    质谱
    资源: 电(负离子)
    气源: CUR:20磅,GS1:70磅,GS2:30磅
    透射电镜:600°C,CAD气体5和离子喷雾电压-900
    MRM转换:
    E1: 一百四十五分之二百六十九&一百四十三分之二百六十九
    E2: 一百四十五分之二百七十一&一百四十三分之二百七十一
    EE2: 一百四十五分之二百九十五&一百四十三分之二百九十五
    E1-D4: 147分之273
    E2-D4: 147分之275
    EE2-D4: 145分之299

    表2详细参数和用于在废水中提取甾类雌激素的LCMS / MS分析的条件。表给出样品注入量和流速,流动相条件一第二梯度。

    3.雌激素活性利用体外酵母雌激素屏幕(YES)分析8

    1. 制备和基本培养基和培养基组分存储按表3的(a)(g)。
    (一)最小中(pH值为7.1):
    通过加入 Fe 2(SO 4)3〜50的双蒸水毫升(DDH 2 O的)的40毫克制备 Fe 2(SO 4)3溶液
    添加1升的DDH 2 O到2L玻璃烧杯
    添加下列组件到烧杯中:
    13.61克KH 2 PO 4
    1.98克(NH 4)2 SO 4
    4.2克KOH
    0.2克硫酸镁
    将1ml Fe 2(SO 4)
    50毫克的L-亮氨酸
    50毫克L-组氨酸
    50毫克腺嘌呤
    20毫克的L-精氨酸-HCl
    20毫克L-甲硫氨酸
    30毫克L-酪氨酸
    30毫克L-异亮氨酸
    30毫克的L-赖氨酸盐酸
    25毫克L-苯丙氨酸
    100毫克的L-谷氨酸
    150毫克的L-缬氨酸
    375毫克L-丝氨酸
    放在加热搅拌器的烧杯中带有磁性跳蚤和搅拌,直到它被全部溶解
    检查pH值是7.1,必要时调整
    使用50毫升无菌注射器分配45毫升等份与金属螺丝顶盖玻璃瓶
    消毒在121℃下进行10分钟基本培养基在高压釜中
    室温保存
    (二)D - (+) -葡萄糖:
    准备在DDH 2 O 20%w / v的解决方案
    免除20毫升等分在玻璃小瓶用金属螺旋盖盖
    消毒在121℃下进行10分钟的葡萄糖溶液在高压釜中
    室温保存
    (三)L-天门冬氨酸:
    使4毫克/毫升原液在DDH 2 O
    免除20毫升等分在玻璃小瓶用金属螺旋盖盖
    消毒在121℃的L-天门冬氨酸溶液10分钟在高压釜中
    室温保存
    (四)维生素溶液:
    加入2毫克生物素至100毫升的DDH 2 O的准备生物素的解决方案
    称出8毫克硫胺素,8毫克吡哆醇,8毫克泛酸,40毫克肌醇。所有的干组分和20毫升的生物素溶液中加入180毫升的DDH 2 O
    打10毫升无菌等分试样通过0.2微米孔径的一次性过滤器进入无菌玻璃瓶过滤,在空气层流柜
    保存在4℃,
    (五)L-苏氨酸:
    准备含100毫升24毫克/毫升的L-苏氨酸在DDH 2 O
    将10毫升分装到玻璃小瓶中与金属螺丝顶部盖
    消毒在121℃下进行10分钟的L-苏氨酸溶液在高压釜中
    室温保存
    准备为25ml 20 mM的硫酸铜溶液,在DDH 2 O
    使得5面毫升无菌等分试样通过0.2微米孔径的过滤器进入无菌玻璃瓶过滤,在层流柜
    室温保存
    (G)氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG):
    准备25毫升CPRG的10毫克/毫升的溶液,在DDH 2 O
    使得5面毫升无菌等分试样通过0.2微米孔径的过滤器进入无菌玻璃瓶过滤,在层流柜
    保存在4℃,

    表3. 酵母雌激素化验画面;制备和基本培养基和培养基成分的存储。

    1. 编制和斯道10倍浓缩的酵母培养物GE
      1. 在第1天,制备生长培养基(如在3.4.1详述)并倒入无菌锥形瓶中。从保存在-20°C的低温瓶中加入125微升10X集中酵母。孵育接种的培养基在28℃下于轨道摇床约24小时。
      2. 第2天,使生长培养基(约50毫升)的两瓶倒入独立的无菌锥形瓶中。加入1ml的24小时培养的酵母进入生长介质的每个烧瓶中。孵育接种的培养基在28℃下于轨道摇床约24小时。
      3. 第3天,每次倒24小时的文化融入到无菌的50毫升离心管中。离心机在4℃下在50ml试管在2000×g下10分钟。倒出上清,在5ml基本培养基与15%甘油重新悬浮每个粒料。使10倍浓缩的酵母培养物0.5毫升分装在1.2毫升无菌离心管并储存在-20°C,最长4个月。
    2. 准备工作标准曲线口粮和储存化工股
      1. 冲洗所有玻璃器皿和铲两次用无水乙醇,并留下使用前干燥,除去污染物的任何痕迹。
      2. 直接称重E2成以粉末称量柜的玻璃小瓶中,并通过在无水乙醇体积调整浓度。稀释到2×10 -7 M(54.48微克/升)的浓度。密封盖子,储存在4°C(在无火花冰箱)。
    3. 法生产
      1. 第0天,准备生长培养基。到45毫升瓶装基本培养基加入5 ml的葡萄糖溶液,1.25 ml的L-天冬氨酸溶液,0.5 ml维生素溶液,0.4 ml的L-苏氨酸溶液和硫酸125微升铜(II)溶液。倾生长培养基到无菌锥形瓶中。
        1. 添加125微升10倍浓缩储备(-20℃存储解冻)到烧瓶中,并在28°C孵育接种的媒体约24小时的轨道摇床。
      2. 在第1天,标号无菌96孔'稀释板“和使系列稀释的E2标准曲线和测试化学(多个)/流出物提取物(多个)( 例如 ,EE2)(以乙醇100微升体积)。
      3. 标签无菌的96孔光学平底微量滴定'测定板(秒)“。在每个板包括空白(加/减溶剂)和一个E2标准曲线中,除了试验化学物/流出物提取物(S)的行。
      4. 移取10微升各浓度(E2,化学或提取物)到分析板的相应的孔。吸取10μl乙醇到测定板的每个'溶剂空白“好。离开测定板与盖关闭蒸发至干。
      5. 使一个瓶生长培养基(约50毫升),并添加0.5氯酚毫升每瓶红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)溶液。通过在平板读数器测量所述培养物的浊度在620nm确定在24小时培养的酵母细胞的密度。接种一从24小时培养4×10 7酵母细胞SSAY网上平台。
      6. 倾接种测定培养基到无菌槽。使用多通道移液器加入200微升接种测定培养基到96孔测定板的各孔中。
      7. 放置在96孔测定板的盖子和密封用胶带的边缘。摇测定板(多个)剧烈上的滴定板摇床2分钟,并在自然通风的加热室中在32℃下孵育。
      8. 第2天,摇动测定板(多个)大力上的滴定板摇床2分钟。返回到32℃培养箱。
      9. 在第4天,摇动测定板(多个)剧烈上的滴定板摇床2分钟。离开板(多个)使用读板器下放置约1小时,然后在540纳米(对于CPRG〜575nm的最佳吸光度)和620纳米(浊度)的吸光度读取测定板(多个)。留在室温下板(S),必要时以后阅读。
    4. 雌激素活性的计算<OL>
    5. 使用以下等式正确测定读数浊度:修正值=样品或在540nm标准(E2)的吸光度 - [在620nm样品或标准(E2)吸光度 - 在620nm空白吸光度]。情节E2标准曲线适当的空白(检查是否有污染)8。
    6. 使用校正样品(提取物或化学)来计算“雌二醇等价物”。使用E2绘制的标准曲线值和回归方程(三参数多项式或者根据拟合线性)插值采样/解压吸光度值E2相当值。使用浓度因子( ,水萃取和乙醇体积的提取物被再悬浮于)计算萃取前的样品中的雌激素活性。

    采用体内卵黄蛋白原诱导雄性黑头呆鱼雌激素活性4.实验室基础的评估

    1. 使用雄性黑头呆鱼( 黑头软口鲦)> 4个月大,这显示第二性征( 婚瘤的发展和背fatpad)表示男性性的决心。
      1. 为了防止产卵活性,单独的成熟雄性3周(±3天)之前,试验开始。至少设置两个45升的玻璃水族箱中的3克/升的最大负荷。为了确保健康的鱼足够数量的测试,至少使用100的男性。
      2. 保持雄鱼相同的环境条件下,如将在测试经历( ,水温为25±1℃,16:8小时光照:黑暗光周期)。保持稀释水的流速,以每罐,以确保至少每6至8小时, 95%的更换时间对于一个45升罐330毫升/分钟。
    2. 试验设备和实验设计
      1. 使用大玻璃箱,以适应每升笏的最高到3G鱼负载呃。对于8成年男性(每名义上4.5克),使用10-20升罐。
        1. 使用两个重复坦克每次处理,并从任何不必要的视觉干扰屏蔽每个水箱( 即,使用坦克之间的夹层卡屏幕)。识别每个罐的一项研究号码,暴露浓度和船舶识别号。
      2. 对于废水排放研究
        1. 到达目的地后,立即在10±1℃下转移流出物到储存罐。开始收到出水的两个小时之内用药污水。
        2. 喂流出物,通过蠕动泵,从10℃贮存罐到驯化容器中。加热在驯化容器18±2℃的流出。泵从驯化容器内的加热的流出物,以计量/混合容器,然后向测试水族箱(其保持鱼)。加热水族箱到25±1℃的温度。
      3. 对于加药的研究
        1. 称量测试的化学品呈粉末称重柜。准备在DDH 2 O浓化工股最好不使用溶剂。
          注意:如果溶剂是必需的,以溶解试验化合物,使用的溶剂对照除了稀释水控制。
        2. 重力进料或泵稀释水经由流量控制装置(S)的温度控制的封头箱,以计量/混合容器中。泵使用蠕动泵系统的计量/混合容器集中化工股票(S)。控制泵速率和水的流动速率(稀释水)(库存化学的),以获得所需的暴露浓度。
          注意:使用硅胶管来从计量给水/化学测试每个试验容器/混合容器。使用的流速足以在至少24小时提供75%的容器的更换, 20毫升/为20升罐分钟。保持在指定的标称值的±10%的流速。
        维持曝光水箱温度在25±1℃,溶解氧的空气饱和度值的70%以上(5.8毫克的L -1,在25℃)和±0.5 pH单位在整个研究(起始6.5和8.5之间的pH)。集照明条件下16小时的光光照:8小时黑暗,用20分钟黎明/黄昏的过渡期。
      4. 喂两次在2.5(±0.1)新鲜冷冻解冻成年丰年虾( 卤虫 )天鱼每料罐克同时喂鱼,每天一次用的热带鱼的鳞片食品少量(双指捏)。留下一个最低每进之间3小时。
        1. 保持每天喂养记录监视进食反应/行为(良好,中等或较差,与对照组相比)。虹吸罐至少每周两次(优选每日),以消除任何吃剩的食物和粪便。清洁测试容器的四周和底部,每周至少一次。
      5. 每周取的水样从每个水箱s到确认雌激素活性(通过酵母屏)和化学成分(通过分析化学)。见水样采集,提取和分析的细节部分1-3。
        注意:对于每个实验,用稀释水对照(阴性对照),阳性对照(E2或EE2)加流出物(100,50和25%)中的至少三个稀释或测试化学以监测剂量反应。如果新技术进行试验,使用的化合物/流出物具有或不处理( 例如 ,EE2没有接受治疗,EE2与TAML /过氧化氢 ​​(H 2 O 2)处理12; 图1)。

    图1
    图1.图表代表体内鲦卵黄蛋白原生物测定,以确定使用去除TAML /过氧化水处理17α炔雌醇的生态毒性的实验设计,使用EXPerimental成立由八个11升的玻璃水族箱每个美联储的水源源不断。个体化学储备溶液和水(过滤去氯化)被递送到混合腔室。名义浓度(无反应)在混合容器是2纳克/升EE2,80nM的TAML和0.16微克/ LH 2 O 2。化学储备溶液(EE2,H 2 O 2和TAML)制备并使得反应在混合容器开始分别给药。鱼(每罐8雄性黑头呆鱼)被暴露于大约45分钟的反应接触时间后的混合物(S)。水样品从每周曝光罐服用。血浆样品从黑头呆鱼带到测量从基准组的雌激素生物标记卵黄蛋白原(VTG),在研究开始时,和后曝光21天所有其他的鱼。具体治疗方法如下:'-C';阴性对照组(稀释水只),'+'; EE2的阳性对照,'+ H'; EE2加H 2 O 2,“+ T”; EE2加H 2 O 2加TAML。这个数字已经从米尔斯等人。201512修改。 请点击此处查看本图的放大版本。

    1. 测试程序
      1. 适应期
        1. 测量每个性成熟的公鱼的湿重(g),并随机分配给每个罐(每罐8名男性)。
        2. 远离同批未分配的鱼,同样的测试条件下进行维护。使用这些鱼来代替,显示的物理损坏或在7天的适应期缺乏条件的任何迹象的个体。确保在驯化期间的各处理槽具有8个男性已充分驯化试验条件的结束。
        3. 就拿“基线”血浆样品从附加男性8例来自同一个BA雄鱼的TCH。按照第4.4节的采血方法和4.5卵黄蛋白原(VTG)的分析方法。
      2. 适应期后,如4.2.2或4.2.3描述的污水输送或化学加药股曝光坦克21天。显示器死亡率,行为和鱼类中的每个的物理外观复制罐每日前一天的第一进料。记录任何异常行为或事件。
        注意:确保环境条件和喂养率保持鱼(第4.2.4和4.2.5)的健康。
    2. 21天的暴露期后鱼取样
      1. 取样前12小时,停喂鱼。
      2. 血样的采集标签微离心管中,添加〜5微升抑肽酶(蛋白酶抑制剂),并把它们放在冰上。
      3. 由每1升去氯化水溶解500mg的MS222的使MS222(麻醉剂)的500毫克/升溶液(预先驯化至25±1℃)。中和MS222使用的1M NaOH pH为7.4±0.4。
      4. 移动每条鱼从油箱到缓冲MS222。保持在溶液中,直到所有厣运动(一般为5±1分钟)的停止。
      5. 测量并记录终端麻醉下叉长度(mm)。使用一次性解剖刀锯掉的尾部,并使用肝素hemocrit管从尾动脉( 图2)收集血液。仔细分配血液进入预标记的微量离心管中,并保持在冰上。
      6. 拉血后,立即杀鱼。确认通过循环和/或大脑的破坏永久停止死亡。测量和记录总鱼体重(以精确到0.01克),并根据需要解剖组织。
      7. 收集的2小时内离心血液(在4℃7000 XG 5分钟)。传送用吸管等离子体上清液到新的标记0.4毫升微量桶ES和存储在冰上。冻结含血浆在干冰上离心并储存在30分钟内于-80℃血浆VTG浓度的分析之前的管中。

    图2
    图2描绘照片男性鲦( 黑头软口鲦 ),血浆采集和睾丸的位置。在为期21天的曝光结束所有的鱼应该杀收集血液样本。一旦下应测,紧接着采血从尾动脉该终端麻醉鱼的长度(叉长,毫米)光A:红色虚线显示为尾截肢位置(一次性手术刀应采用截肢的尾巴)。 照片-B显示用于收集血液肝素化hemocrit管。每条鱼应已采取其血液样品后,然后立即被杀死,在这种情况下,整个头已经从主体( 照片-C)的切断。一旦鱼已被杀害体腔可以打开,露出内脏。照片-C显示与在鲤科鱼类, 黑头呆鱼,斜齿鳊,鲤鱼鱼鳔(SB)睾丸(性腺)的位置, 请点击此处查看该图的放大版本。

    1. 测量血浆VTG浓度与专为黑头呆鱼设计同源VTG酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
      1. 制备VTG标准和缓冲液作为生产商的方案所述。稀释血浆样品1:50,1:5000和1:500000,测定它们在一式两份的VTG标准曲线范围按制造商的说明中获得的读数。按照制造商的准则来计算卵黄蛋白原浓度。

      5.高级/新型废水处理技术的实地评估缓解雌激素活性采用体内卵黄蛋白原和雌雄同体诱导罗奇( 拟鲤

      1. 野生蟑螂捕捉住了下来污水处理厂排污口流
        注意:使用罗奇( 拟鲤 )或其他丰富的淡水或咸水鱼类物种,这是雌雄异体,并已知对雌激素内分泌干扰敏感。
        1. 捉鱼使用电力捕鱼,用网捕,诱捕或根据情况13其他公认的捕鱼方式。在运输罐充气鱼回实验室进行采样。
        2. 准备离心管中4.4.2详述。如在4.4.3所述准备缓冲MS222。麻醉鱼在4.4.4详细说明。
        3. 测量终端麻醉情况下,鱼的长度和重量。
        4. 从尾动脉使用DISPO采集血液紫貂肝素的注射器。杀了血样采集后立即每条鱼。仔细免除血液进入预标记的离心管中,并保持在冰上。如步骤4.4.7说明准备血浆和通过ELISA(4.5)衡量VTG。
        5. 使用镊子从每条鱼取出2-3鱼鳞并将在单独标记纸的小信封。信封存放在供以后鱼的年龄测定及增长分析干燥条件室温。
        6. 开放体腔用手术刀以显示内部器官。取出肠道透露与位于两侧性腺一个( 图2)鱼鳔。小心地取出用细镊子鼻子和地点配对性腺到玻璃瓶。覆盖布安的1:10组织的比例固定液性腺:固定剂。
        7. 取决于组织的大小(固定剂穿透以每小时1毫米)留在布安的所述组织为6-24小时。一旦固定,倒出布安固定液的d用70%的工业用甲醇变性酒精(IMS)取代。在室温下储存的固定的组织,直到组织被用于组织病理学(第5.3节)处理。
      2. 用蟑螂体内卵黄蛋白原和阴阳感应雌激素活性的现场评估基础
        1. 实验设计和设置
          注意:设置坦克和试验工厂提前做好体内开始工作的。开始流动之前的任何加成鱼到系统3-4周的坦克。监测水的流速,水的质量和条件(pH,温度,溶解氧 )经常以确保参数可以保持。
          1. 构建大罐( 例如 ,300-1,000 L)在现场中试工厂,它可以接收“控制”去氯化自来水,标准处理后的污水(S)和先进的并行处理的污水(S)。安装空气泵/曝气机的坦克。一套水流速以达到至少6罐V每天olume交流。
            注意:确保坦克以及绝缘和阴影,以防止过度的日常温度波动。设计储罐以允许鱼的观察,为行为改变(缺乏饲养, ),疾病和死亡的迹象。
        2. 浮动蟑螂的袋子(从养鱼场),在各自的坦克1小时开始曝光。鱼缸水添加到袋子逐渐直至水温和条件是周围环境。松开鱼放入他们的坦克。
        3. 每天在鱼食(0.5-0.8大小)饲料成年蟑螂。日常小包衣(颗粒尺寸100-300)非雌激素饲料14自由采食,剩余饲料的基础上调整的饲料少年蟑螂。保持每天喂养记录文档化进食反应/行为(良好,中等或较差,与对照组相比)。
        4. 每周取的水样从每个水箱确认雌激素活性和化学成分。硒对于水取样和分析方法的细节Ë第1-3款。
      3. 鱼的性腺组织病理学15
        1. 小心取出解剖和固定性腺从砧板上镊子和地方的容器(在步骤5.1.6和5.1.7所述)。
        2. 使用切片机刀片每个性腺切成3部分(前,中,后),并从每个部分切3-5毫米厚的横截面。小心地将所有六个片放入一个标记的塑料活组织检查盒,并使用表4中所列的定时放入组织处理器。
        3. 蜡嵌入组织和旋转切片机(3-5微米)部分。转印部到标记的生物粘合剂涂覆的玻璃载片和地点上滑动一个受热板(设定在45℃)干燥24小时。
        4. 染色的幻灯片,手动或使用自动染色机,使用表5中详述的定时。将安装剂在染色的组织的下降和lAY的玻璃盖玻片上,以保护组织的安装剂。
        5. 首先,检查在低放大倍数的每个滑板(20X, 2X目标,具有10X眼线放大率),以确定性别和附着物体腔15的点的数量。请注意每条鱼任何异常。
        6. 在更高的放大倍数(100X或400X),检查组织以评估配子阶段,异常和卵母细胞在睾丸组织的存在。使用以下分级系统范围从0(正常的雄性组织)到7(100%的卵巢组织)6( 见表6)记录雌雄同体的严重性。
      步数 治疗 目的 时间(hr)
      1 70%IMS 脱水 3
      2 90%IMS 脱水 2.5
      3 95%IMS 脱水 1.5
      4 100%IMS 脱水 1.5
      100%IMS 脱水 1.5
      6 100%IMS 脱水 1.5
      7 100%IMS 脱水 1.5
      8 组织学清除剂空地 1.5
      9 组织学清除剂空地 1.5
      10 组织学清除剂空地 1。五
      11 蜡渗透 1.25
      12 蜡渗透 1.25
      20小时TOTAL

      对于蜡浸渍组织病理学组织组织表4处理制度。应该在自动组织处理器进行处理。组织应沉浸在详细为指定时间内的解决方案。

      色斑没有。 弄脏 目的 时间(min)
      1 组织学清除剂溶解蜡 15
      2 水化 2
      3 90%IMS 水化 2
      4 70%IMS 水化 2
      自来水(RUNNING) 冲洗 2
      6 苏木污渍细胞核蓝色 10
      7 自来水(RUNNING) 去除多余的 10
      8 酸化IMS 脱氯 20秒
      9 自来水(RUNNING) 冲洗 20秒
      10 LICO 3 20秒
      11 自来水(RUNNING) 冲洗 20秒
      12 1%曙红(水溶液) 渍粉红色细胞质 20秒
      13 自来水(RUNNING) 去除多余的
      14 70%IMS 脱水 2
      15 90%IMS 脱水 2
      16 100%IMS 脱水
      17 组织学清除剂删除IMS,结合剂

      表5.解决方案和浸泡时间苏木精和曙红(H&E)鱼性腺组织染色,幻灯片应该被放置在每次洗澡的ALLOC顺序ated时间。组织H&E染色需要确定鱼类性腺雌激素废水排放的发育或组织的影响。

      得分了 部分说明
      0 正常男性的睾丸
      1 多灶性卵睾1-5卵母细胞(通常是单)散落在睾丸组织中
      2 多灶性卵睾,6-20卵母细胞经常在小群分散在睾丸组织中
      3 多灶性卵睾,21-50卵母细胞群
      4 > 50和<100卵母细胞。部分通常是多灶性,具有试验的马赛克外观icular和卵巢组织。
      > 100的卵母细胞,通常是多焦点但也可以是焦点与来自睾丸组织分离卵巢和睾丸组织的清晰可辨的区域。
      6 >每对部分中的性腺组织的百分之50是卵巢癌和来自睾丸组织由上皮细胞和吞噬组织清楚地分开。
      7 对部分性腺组织的100%的卵巢。

      表6.评分体系来评估在蟑螂雌雄同体病情的严重性。组织学性腺组织准备的幻灯片应该在光学显微镜下检查,在20X,100X和400X的放大倍率,以评估任何异常和卵母细胞在睾丸组织的存在。此表由Jobling <改性青霉>等。 2006年6。

    Representative Results

    试图了解的改进废水处理过程的影响或确定最合适的技术在现有污水处理厂相对于除去排出废水的内分泌干扰活性的功效加装设备作为三级处理,不仅需要键化学的测定即进入工作,但需要分解产物也可以具有内分泌干扰活性的分析组件。在生活污水流出物,目前最雌激素物质是类固醇激素,雌酮(E1),17β雌二醇(E2)和17α炔雌醇(EE2)5,8。类固醇的雌激素主要从体内排出作为非活性结合物16,17的混合物。这些结合雌激素基本上在污水处理系统由细菌活动deconjugated和污水处理厂发生进一步退化。该deconjugated AR类固醇e。通过吸附从废水流中去除污泥或导致形成二次处理过程中降解,首先改造的副产品,并最终完全矿化可能发生的初始​​活性组分。的流出流中的所有单个化合物的化学分析将是困难的,耗时的和昂贵的,并且不会涵盖存在于样品中未知的活性成分。此外,各成分的雌激素贡献的总和将只提供所分析的化合物的样品的累积雌激素效力的指示。这是转化过程产生未知的雌激素物质或者其中流入是工业来源的风险。 在体内 和体外生态毒理学生物测定组合化学分析提供了在混合物如处理过的污水中的溶液到未知的雌激素组分的存在, 在体外测定,如酵母雌血肌酐EEN(YES),已被广泛用于确定污水流出物的雌激素活性,并帮助识别处理的样品8,18,19的活性成分。然而, 在体内体外试验比较可以显著11,新工艺相对于治疗内分泌干扰效能的综合评估,需要化学和生态毒理学测试电池。

    可使用随后的样品的提取,浓缩和分析前提取物的清理化学分析来实现的个别处理厂或过程是否从废水流中除去活性化合物A的确定,使用LCMS(/ MS)或GCMS最多进行(/ MS)的方法。从化学分析获得的数据可以被用来确定是否符合个别预测无影响浓度(PNEC)20或环境质量标准S(EQS)特定个人化合物21,因此这种方法对于法规遵从数据至关重要。此外,定位或非靶向化学分析方法允许用生物学方法,它提供了一个总的响应相比单个化合物或异构体的鉴定和定量。因此化学分析方法允许进行离散化合物的评估,以满足和解决个别处理厂的基础上,这些废水处理的挑战。有研究表明,虽然除去合成激素的EE2趋于较少有效的常规废水处理( 例如,活性污泥处理厂)可能是在去除天然类固醇激素的高度有效的。使用利用的技术,如臭氧先进的治疗领域的研究中,颗粒活性炭(GAC)和膜已经证实,尽管成本高,它们可以作为尾管的溶液以除去EE2至低于预计值icted效果水平和低于检测限。 图3显示了EE2的使用GAC在中试规模的城市污水处理厂的拆除。在中试规模在用管GAC治疗结束市政污水处理厂进行的研究还显示以下的GAC在雌激素效力减少使用如图4中可见的酵母雌激素屏幕(是)进行测定。

    图3
    图3.实例字段数据显示以下高级三级处理去除炔雌醇(A)样品是从污水处理厂以下为以下保存样品描述的步骤常规(活性污泥)处理收集。 (B)样品固相萃取,净化后用正相SPE去除干扰物质提取,凝胶渗透色谱法。 (C)的清洁浓缩提取物浓缩至小体积并在MRM模式使用负离子电LCMS / MS进行分析。结果是使用采用同位素标记的内标内部标准化计算。在所示的例子中,EE2是在0.1纳克/升的预测没有影响水平(PNEC)以上的浓度存在于最终的ASP流出物并用活性炭和臭氧去除(O 3),以对环境安全的浓度。 请按此查看该图的放大版本。

    图4
    图4.照片一个酵母雌激素屏幕(是)试验板(A)中示出从黄色到红色的颜色变化,与该样品的雌激素活性。从YES分析板显示创建的图形校正吸光度(540雌二醇标准(B)的纳米),活性污泥处理的流出物(ASP)和粒状活性炭(GAC)处理过的废水流出物的样品(C)将每个样品一式两份进行测试。 ASP和GAC废水提取和使用第1节中列出的SPE方法集中请点击此处查看该图的放大版本。

    臭氧也是从常规治疗的污水处理厂去除类固醇雌激素和雌激素活性高效。臭氧是能够氧化多种有机污染物和溶解的有机物质的废水样品中,并提供消毒性能。臭氧化的有效性取决于水的特性如pH,有机物量和臭氧的施用剂量。由常规处理除去不良的雌激素可以是从废水0.8和2毫克O 3 /毫克之间DOC去除剂量。臭氧是一种选择性的氧化剂,其与富电子网站(不饱和碳 - 碳键,芳族化合物,包括芳族醇),这使得适用于一个号码的EDC的击穿臭氧反应。然而,单独的化合物的消除并不必然导致对原始化合物的完全矿化。有机物质以下臭氧可能的副产物,其中包括一些低分子量的转化产生的中间体或转化氧化,极性类型的化合物如醛,酮,羧酸,酮基羧酸,和溴化的化合物。实例包括溴酸盐,甲醛,乙醛和羧酸。 采用体内 和体外生物测定已经表明,尽管臭氧仅部分氧化一些化学物质,将得到的主要转变产物具有较低estrogENIC效力并因此臭氧在一个较高的去除雌激素活性的适当剂量的结果的应用程序。

    一个废水处理额外的主要优点是在受纳水雄鱼女性化的减少;产生不利影响,可导致减少的生育3。使用鱼体内研究( 例如 ,蟑螂或黑头呆鱼)暴露于废水显示雌性生殖细胞或卵母细胞的雄性鱼的精巢( 例如,如在图5中看到)。阴阳或男性VTG缺席或鱼类以下先进的治疗,如海关总署7或臭氧22显著减少。这些研究表明,臭氧化过程中产生的变换的产品没有雌激素,然而,这并没有解决所产生的流出物的毒性。此问题已在其他研究中得到解决,例如通过马格德堡的研究

    图5
    图5.正常男性(A)和阴阳的显微照片(B,C)从成年罗奇( 拟鲤 )性腺在基于实地评估。显微照片-A 暴露于废水 ,描绘了正常男性睾丸的组织切片。显微照片-B和-C,描绘了阴阳公鱼的组织切片,被暴露在活性污泥法处理废水排放六个月。箭头指示存在于睾丸组织卵母细胞。比例尺为100μm在每个显微照片。 请点击此处查看该图的放大版本。

    12,24在有机微双氧水氧化- 26。 TAML与H 2 O 2活化剂,有效地降解EE2和其他类固醇雌激素在纯实验室用水,以及在城市污水处理厂的污水和尖刺尿样12英寸实验室的研究,示出TAML / H 2 O 2的处理提供了高类固醇的雌激素去除包括EE2去除和实质上降低使用是生物测定和质体外测定雌激素活性LLY减少鱼女性化使用VTG生物测定( 图1图6)测量体内

    图6
    图6.平均EE2浓度和雌激素活性处理和未处理的罐水域(A)和基线血浆卵黄蛋白原并暴露雄鱼(B)的A)EE2浓度(ng / L,深蓝色条)通过LCMS / MS测量,雌激素活性(EE2当量纳克/升,深绿色条)通过体外酵母雌激素屏幕测量(YES)。B)血浆卵黄蛋白原(毫微克/毫升,淡蓝色的条)浓度男性黑头呆鱼通过定量酶测定 - 连接的免疫吸附测定(ELISA)。报告为EE2化学分析结果<0.03纳克/升EE2( 即,高于检测限(LOD)低级)被视为具有一半的LOD(即 2 O 2 + TAML,EE2 + H 2 O 2和EE2只。在图-A误差棒代表平均值的标准误差,在图-B误差棒代表标准偏差。以上图-B条字母代表统计相似。这个数字已经从米尔斯等人修改。12 ,请点击这里查看本图的放大版本。

    Discussion

    废水处理厂是用EDC地表水污染的主要途径。去除常规的,先进的或新出现的治疗过程的内分泌活性的效力的评估需要使用的各种化学和生物测定的。用非靶向和靶向分析化学分析提供了关于除去各组分的功效的定性或定量的数据,因此,允许对环境质量标准生产或预测分析的化合物或化合物的混合物无影响浓度的评估。

    从下面的治疗和未知的生物活性成分的废水中存在的物质的不完全矿化所得转化产物的产生限制单独化学测试是有用的。 A 体内体外生物测定结合分析化学家组合RY筛选提供了一个有用的工具箱新兴废水处理过程,以确定的EDC去除的效力。这些测试时,除了传统的水质参数和其他毒理学和微生物学终点进行允许现有和新兴的废水处理技术的一个重要的评价。

    要注意的是酵母基于雌激素的屏幕( 例如 ,是)是很重要的并不是唯一的体外测定,以确定化学品和废水的雌激素效能。一些稳定转染基于哺乳动物细胞的测定法,已经开发过,对ER-CALUX 27和与人乳腺癌细胞或子宫颈肿瘤细胞hERα-的HeLa-9903 28分别为例子。的是已经相比类似哺乳动物基于细胞的测定法,并已发现具有可重复性的一个可比较的水平高,真阳性和真阴性雌激素的识别率29本书虽然啊它有时被认为是稍微较不敏感的27。基于酵母报告分析的一个优点是,在不与哺乳动物细胞培养显著经验的实验室的是,可以更容易地通过,因为它需要较少的严格的生物控制措施和无菌技术(可置于工作台顶部,如果必要,可以进行是) 。人细胞为基础的分析也需要 CO 2孵化器和光度计相比,在是使用的标准培养箱和酶标仪。两个基于酵母的雌激素记者分析(YES, 酿酒酵母A-YES,Arxula adeninivorans)的ISO 19040的认证目前正在实验室间的小径“水质-水和废水的雌激素潜在的测定”突出产业在这些技术的兴趣。

    有一些所描述的方法的局限性,其中包括的潜在的污染的采样,样品存储和分析来自现场或实验室环境或人类污染( 例如,增塑剂,表面活性剂,个人护理产品)始发雌激素作用物质中的样品。这种类型中的YES测定(或其他基于细胞的报告分析)污染将提升的背景和影响使用该测定的。存储在塑料瓶的水样或溶剂极易造成假阳性。假阴性也备受关注既是LCMS / MS和YES检测要求SPE到雌激素到集中检测水平。基质中,SPE吸附剂和洗脱溶剂的选择可影响萃取效率和类型洗脱化合物。使用C18 SPE柱,使用在此协议中描述的条件可以产生负偏压的提取,作为高极性和碱性化合物会通过吸附剂进行很差保留。此外,该协议要求从甲烷洗脱YES洗脱液重建醇通过蒸发乙醇至干产生挥发性化合物的损失出资者氮。其结果是该协议可以提供低估测试的样品的雌激素活性。考虑到是检测未知的或意外的化合物可能会被错过,因为他们没有被提取或他们因蒸发而丢失时,这些限制是特别重要的。此外,LCMS / MS技术利用了内标来校正恢复;这种方法不能与YES测定中使用。

    体内流出物的测试显著局限性包括相比体外方法进行评估所需的高成本和时间。目前使用的鱼胚胎试验检测雌激素活性是有限的。然而,已经有了一些成功的生产雌激素反应转基因发光斑马鱼胚胎30,这可能会对未来的应用。黑头呆鱼(在此protoc使用醇)是一种常见的实验室物种和VTG诱导雄性鱼是雌激素暴露的证据充分的生物标志物和废水流出物雌激素22或其它的雌激素化合物或其混合物31的量化度量。对内分泌干扰物质的OECD测试规定已使用成人黑头呆鱼,青鳉日本和斑马鱼32,33验证,与VTG是在所有三种雌激素暴露的敏感生物标志物。然而,VTG感应不直接相关的生殖障碍,因此废水曝光的生态后果,如严重雌雄同体蟑螂3所示。在另一方面,蟑螂是不是生态毒理学研究的一个经典的“实验室物种,由于其大尺寸,长的生成时间(2 - 3年才能达到性成熟),生殖风格;组产卵(繁殖)发生一年一次,难识别从女性的男性(比在其他产卵季节)。然而,这通常雌雄异体物种已被很好的研究在英国,这是因为雌激素废水排放的下游,雄鱼展出扰动他们的内分泌( 例如 ,在他们的血液女性特有的卵黄蛋白原的存在)和组织病理学(ovotestes发现-开发鸡蛋睾丸和/或女性生殖管道)5,6。因此,这些协议的应用前景,罗奇(或类似物质)可能是一个有益的野生物种定点显示,如果废水质量(并降低雌激素)真正的改善河流接受先进的污水处理被看见。它们也可以在配管系统的端部来监视从试验规模的工厂7技术上改进的废水。当考虑在体内废水评估要使用的物种有相对快速和受控的测试用实验室物种之间的折衷相比长场为主,但更多的环境有关​​,使用本地物种进行测试。然而,这种在体内的评价是成本高,只应视为最后一组使用以下化学分析评估,试验和体外试验。

    所述的协议中的关键步骤包括制备和样品和玻璃器皿的处理( 即,瓶和取样设备应用适当的表面活性清洁剂预先处理),以避免从环境污染物包括限制样品接触与塑料和样品的污染能产生误报的其他材料。设计和构建水族馆鱼曝光系统时,这是非常重要的。理想的情况是水族馆(住宅存量和期间暴露)应从材料建成具有低吸附32以最小的污染风险。不锈钢可以用于流出物或水储水槽。而一个玻璃结构的坦克是优选的鱼缸(因为这也提供了鱼便于观察)。使用低等级塑料管或管道的,应避免32,PVC 34和ABS可以当'适当调味'被使用, 即,留在运行稀释水中至少12小时,使用前以浸出任何污染物。医用级硅管已经在我们的蠕动泵输送化学品和废水/稀释水的坦克工厂成功应用。除了考虑建筑雌激素污染和养殖系统的运行,它考虑鱼的饮食也很重要;许多鱼类礼仪食品已被认为是雌激素对鱼类。因此它来测试任何食物为活动( 例如 ,在酵母雌激素屏幕,查看贝雷斯福德等人 14)在这些类型的研究使用它们之前是重要的。

    故障排除的描述,如果质量保证样本,包括多个行程,实验室和溶剂空白分析一起阳性对照和实际样品,以消除假阳性和假阴性结果是简化了化学分析或YES测定协议。正( 例如 ,EE2)和负极(稀释仅水)控制应也总是在体内测定可用于证实预期生物标志物或端点( ,VTG或组织病理学)的灵敏度,并且允许任何意外污染待检测( 例如,从实验装置,饮食,或稀释水域)。在协议的任何修改之前应进行任何研究来验证。

    与进入通过污水处理厂的污水对环境的雌激素化合物的更严格的法规它是设想更有效的污水处理技术将需要开发。在这个手稿中描述的测试电池恭维生态毒理学和化​​学评估测试通常用于污水处理厂的污水排放。因此,这种类型的测试应使废水技术开发商与设备操作员,整体的电池的应用前景实行最生态安全设计考虑的最佳方法同时删除特定的调节雌激素类化学和整体的生物活性。

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Wellwash Versa plate washer Thermo Scientific 5165010
    Plate reader Molecular Devices SpectraMax 340PC
    Incubator Memmert INB 400 37 °C incubation required for carp assay
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Icemaker Scotsman AF80
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    ELISA kits Biosense Laboratories V01018401-096 (Fathead minnow)
    V01003402-096 (Carp)
    Microfuge tubes, 0.5 ml Alpha labs LW2372
    Microfuge tubes, 1.5 ml Alpha labs LW2375
    Sulphuric acid, 95-98% Sigma-Aldrich 258105
    Histology
    Tissue processor Leica Biosystems TP1020
    Wax dispenser Thermo Scientific Raymond Lamb E66HC
    Metal embedding mold Leica Biosystems Various
    Hot plate Thermo Scientific Shandon 3120063
    Cold plate (EG1150 C) Leica Biosystems 14038838037
    Heated forceps (EG F) Leica Biosystems 14038835824
    Microtome Leica Biosystems RM2235
    Paraffin section floatation  bath Electrothermal MH8517
    Slide drying bench Electrothermal MH6616
    Stainmate automated stainer Thermo Scientific Shandon E103/S10L
    Cassettes, Histosette II, biopsy Simport M493
    Paraffin wax Thermo Scientific Raymond Lamb W1
    Histo-Clear II National Diagnostics HS-202
    IMS (ethanol mix), IDA99 Tennants ID440
    Polysine adhesion slides Thermo Scientific Gerhard Menzel J2800AMNZ
    Cover slips, 22x50 mm VWR 631-0137
    Histomount National Diagnostics HS-103
    Haematoxylin Harris GURR VWR 351945S
    Eosin, 1%, aqueous Pyramid Inovation S20007-E
    Fisherbrand slide boxes Fisher Scientific 11701486
    Microtome blades, MB35 Thermo Scientific Shandon 3050835
    Bouin’s solution Sigma Aldrich HT10132-1L
    Yeast screen
    Flow cabinet Labcaire Systems Ltd SC12R
    Cooled incubator LMS Cooled Incubator 303
    Incubator Memmert INB 400
    Shaker Grant PSU-10i
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Plate shaker Heidolph Titramax 100 544-11200-00
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    12-channel pipette, electronic Sartorius 735441
    96-well flat-bottom microplates MP Biomedicals
    Thermo Scientific Nunc
    Sarstedt
    76-232-05
    260860
    82.1581.001
    We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
    HPLC grade water Rathburn RH1020
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    Potassium phosphate monobasic anhydrous Sigma-Aldrich P-5655
    Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A-2939
    Potassium hydroxide, pellets Sigma-Aldrich P-1767
    Magnesium sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich M-2643
    Iron(III) sulfate Sigma-Aldrich 307718
    L-Leucine Sigma-Aldrich L-8912
    L-Histidine Sigma-Aldrich H-6034
    Adenine Sigma-Aldrich A-2786
    L-Argenine, hydrochloride Sigma-Aldrich A-6969
    L-Methionine Sigma-Aldrich M-5308
    L-Tyrosine Sigma-Aldrich T-8566
    L-Isoleucine Sigma-Aldrich I-7403
    L-Lysine, hydrochloride Sigma-Aldrich L-8662
    L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P-5482
    L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G-8415
    L-Valine Sigma-Aldrich V-0513
    L-Serine Sigma-Aldrich S-4311
    Thiamine, hydrochloride Sigma-Aldrich T-1270
    Pyridoxine Sigma-Aldrich P-5669
    D-Pantothenic acid, hemicalcium salt Sigma-Aldrich P-5155
    Inositol Sigma-Aldrich I-5125
    D-Biotin Sigma-Aldrich B-4639
    D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers Sigma-Aldrich G-7021
    L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A-4534
    L-Threonine Sigma-Aldrich T-8441
    Copper(II) sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich C-1297
    Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 10884308001
    Glycerol Sigma-Aldrich G-2025
    17 β-Estradiol Sigma-Aldrich E-8875
    Steroids
    Acetone Rathburn
    Acetonitrile Rathburn
    Ammonia solution Rathburn
    Ethylacetate Rathburn
    Copper(II) nitrate Sigma-Aldrich
    Acetone Rathburn
    Dichloromethane Rathburn
    2,4,16,16-d4-17β-estradiol CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-estrone CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol CDN Isotopes
    17β-estradiol Sigma-Aldrich
    Estrone Sigma-Aldrich
    17α-ethynyl oestradiol Sigma-Aldrich
    Hexane Rathburn
    Hydrochloric acid Sigma-Aldrich
    Methanol Sigma-Aldrich
    Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich
    Sodium hydroxide Sigma-Aldrich
    Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) Biotage
    Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) Biotage
    Fish study
    orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 Watson Marlow 982.0063.000
    straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 Watson Marlow 999.2008.000
    pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m Watson Marlow 913.A008.016
    200 series multi-channel persitaltic pump Watson Marlow 205CA
    Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) VWR SFM1-3250
    silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) VWR SFM1-5450
    2.5 L glass winchester pk 4 Fisher Scienctific BTF-505-050B
    magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 Fisher Scienctific FB55595 
    Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma Aldrich E10521-10G
    17α-Ethynylestradiol Sigma Aldrich E4876-100MG
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    SPE
    1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 Sigma Aldrich 57276
    disposable liners for manifold Sigma Aldrich 57059
    filtration tubes without frits 6 ml pk 30 Sigma Aldrich 57242
    reservior adaptors pk 12 Sigma Aldrich 57020-U
    stainless steel weight for manifold pk 4 Sigma Aldrich 57278
    male Luer plug for manifold pk 12 Sigma Aldrich 504351
    SPE Vacuum Manifold Sigma Aldrich 57265
    stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 Waters WAT054806
    Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50  Waters WAT020515
    Methanol HPLC grade 2.5 L Fisher Scientific M/4056/17
    7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 Fisher Scientific TUL-520-031K
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump Camlab 1136915

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