Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Environment

Användning av ett batteri av kemiska och ekotoxikologiska metoder för bedömning av effekten av rening av avloppsvatten för att ta bort östrogena potens

1, 1, 1, 2, 2, 2, 1

1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Hormonstörande ämnen (EDC) utgöra en betydande risk för vattenmiljön. Kommunala reningsverk är viktiga bidragsgivare till östrogena potens ytvatten. Den metod som anges i detta dokument medger en bedömning av effektiviteten och lämpligheten rening av avloppsvatten med avseende på EDC borttagning.

    Date Published: 9/11/2016, Issue 115; doi: 10.3791/54243

    Cite this Article

    Beresford, N., Baynes, A., Kanda, R., Mills, M. R., Arias-Salazar, K., Collins, T. J., et al. Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency. J. Vis. Exp. (115), e54243, doi:10.3791/54243 (2016).

    Introduction

    Oro över de negativa effekterna av hormonstörande föreningar på djur reproduktiv hälsa har lett Europeiska unionen att placera två östrogena ämnen (estradiol och etinylestradiol) på en "bevakningslista" under ramdirektivet för vatten (WFD). EDC omfattar en mängd olika kemiska klasser, inklusive naturliga och syntetiska steroid östrogener, läkemedel, bekämpningsmedel och industrikemikalier och beståndsdelar i konsumentprodukter med kända skadliga effekter på djurlivet. Vissa av dessa föreningar kan potentiellt påverka människors hälsa 1.

    Forskning har visat att avloppsvatten från reningsverk är östrogena att fiska två och som en följd många recipienten är också östrogena för fisk tre. Detta visades först genom nationella undersökningar i Storbritannien som visade ökade vitellogenin koncentrationer (en kvinnlig specifik äggula proteinprekursor 4) i blodet hos vilda manliga fisk och en hög prevalens intersex (utveckla ägg och / eller kvinnliga reproduktiva kanaler i testiklarna hos manliga fisk) i normalt gonochoristic fiskarter 5,6.

    Konventionell reningsverk är typiskt en trestegsprocess som består av en preliminär screening följt av primär och sekundär behandling som avlägsnar både upplöst och suspenderat organiskt material. Effekten för avlägsnande av enskilda EDC är beroende av fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de ämnen och om effektiviteten i reningsprocessen tillämpas. För många EDC avlägsnas via adsorption och biologisk nedbrytning kan vara betydande men ofullständig. Tertiär behandling, såsom sandfiltrering, kan vara effektivt att öka EDC borttagning 7 medan avancerad behandling med avancerad oxidation (t ex ozon) eller aktivt kol kan vara effektiva för att uppnå nästan fullständig borttagning 7.

    Bedömningen av all ny teknik för avloppsvattenrening needs för att bestämma effekten av den föreslagna processen i EDC borttagning. Ett batteri av tester, inklusive riktad kemisk analys tillsammans ekotoxikologi tester med in vivo och in vitro bioanalyser, ger omfattande uppgifter för detta ändamål. Även om mycket användbar för regulatoriska ändamål, kan riktad kemisk analys endast lämna uppgifter om föreningarna (och specifika metaboliter) övervakas. Bioanalyser dessutom låta "upptäckt" av negativa effekter av metaboliter och behandling genererade avloppsvatten omvandling biprodukter som annars skulle oupptäckt 8,9. Detta dokument beskriver användningen av ett batteri av kemiska och ekotoxicitet laboratorieanalyser för att bedöma effekten av ett antal avancerade och framväxande rening av avloppsvatten för att avlägsna den östrogena potens av råolja och renat avloppsvatten och recipienter.

    Protocol

    Etik uttalande: Protokoll för bedömning av hormonstörande aktivitet av kemikalier / blandningar i fisk har godkänts av Brunel University Londons djurskydd och etiska granskningsorganet (AWERB) och det brittiska inrikesdepartementet enligt Djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986.

    1. Vatten Provtagning, Bevarande och extraktion

    1. Provtagning och bevarande
      1. Före användning, rengöra flaskorna med en lämplig ytaktivt rengöringsmedel. Efter rengöring, skölj flaskorna med vatten, avlopp och torr.
      2. Samla prover i glasflaskor av 2-L kapacitet, med ett konserveringsmedel som består av 0,5 g koppar (II) nitrat och 6 ml 3,6 M saltsyralösning. Förvara proverna under 10 ° C. Extrahera och analysera så snart som möjligt efter insamling och bevarande.
    2. Provextraktion och sanering (för steroid östrogen analys) 10
      1. Solid Phase Extraction (SPE)
        1. Före extraktionen, för att minska suspenderade fasta ämnen, filter vattenprov med användning av en | j, m porstorlek filterpapper.
          1. En gång filtrerade, grov spik prover med intern standard genom att tillsätta 100 pl av spiking deutererad inre standard stamlösning innehållande 2,4,16,16-d4 -estrone: 2,4,16,16-d4 -17β-estradiol (E2) : och 2,4,16,16-d 4 -17α-etinylöstradiol (EE2) (alla vid 40 mikrogram / ​​L i metanol) till 1000 ml utflöde (eller 100 ml inflödet) resulterar i inre spik 2 ng / L för avloppsvatten utflödesprover och 20 ng / L för avloppsvatten inflödet prover.
        2. Fäst engångsventilfoder, styren divinylbensen SPE patroner och patronreservoarer till SPE apparaten. Omkopplare på vakuumpumpen för att testa Utrustningen skall vara ordentligt tätad.
        3. Pipettera 5 ml etylacetat till varje reservoar, för att konditionera patronerna. Slå på vakuumpumpen (till under 10 inHg för att tillåta en flödeshastighet av mindre än 10 ml per minut)och dra igenom vätskan. Låt inte SPE patroner torka ut. Upprepa processen med 5 ml metanol följt av 5 ml vatten.
        4. Fyll på varje patron reservoar med vatten och anslut 1/8 "PTFE-rör mellan patronreservoarer och glasprovflaskor. Slå på vakuum vid en flödeshastighet av mindre än 10 ml per minut och medge hela provet att passera genom patronen. tömma avfalls kolven vid behov.
        5. Torka SPE patroner under vakuum (eller genom att använda luft eller kväve) tills innehållet patron ändra färg (t.ex. från mörkbrun till ljusbrun).
        6. Sätt rena, torra 10 ml glasinsamlingsflaskor i rack och plats i utsugningsröret. Kontrollera att varje spengummi är över en injektionsflaska. Pipett 8 ml diklormetan i varje provbehållare, slå på vakuumpumpen (flödeshastighet mindre än 10 ml per minut) och dra vätskan genom in flaskorna insamlings.
        7. Ta 10 ml flaskor från SPE grenröroch använda en koncentrator för att reducera volymen till 1 ml. Överför varje prov i auto-sampler flaska och ytterligare koncentrera till 100 ul med hjälp av kväve blåsa ner utrustning.
      2. Gelpermeationskromatografi (GPC) sanering
        1. Injicera 95 pl av det eluerade provextraktet i GPC utrustad HPLC med användning av de betingelser som beskrivs i tabell 1. Koncentrera GPC extrahera ner till 200 ul med hjälp av en koncentrator och kväve blåsa ner apparat och sedan göra upp till 2,0 ml med hexan.
      3. SPE sanering
        1. Fäst engångsventilfoder, aminopropyl patroner och patronreservoarer till SPE grenröret. Sätt rena, torra 10 ml glasinsamlingsflaskor i rack och plats i utsugningsröret. Pipett 2 ml hexan i varje behållare, för att påverka patronerna. Låta vätskan passera genom patronerna.
        2. Pipettera GPC provextraktet in i reservoaren och återigen låta vätskanpassera genom patronen. Samla provet eluatet i flaskan och ta bort från grenröret. Kasta inte bort eluatet.
        3. Sätt en ny ren torr 10 ml uppsamlingskärl i rack och placera i utvinningskanalen. Att tvätta patronen, tillsätt 2 ml etylacetat i hexan (30% volym / volym) till reservoaren och dra vätskan genom patronen. Upprepa med ytterligare 2 ml etylacetat i hexan, kasta alla tvättningar.
        4. Placera original 10 ml uppsamlingskärl (steg 1.2.3.2) tillbaka i rack i utsugningsröret. Pipett 2 ml etylacetat i aceton (50% v / v) i behållaren, slå på vakuumpumpen (till under 2 inHg att tillåta en flödeshastighet av mindre än 2 ml per minut) och dra vätskan genom i flaskan . Upprepa processen med en annan 2 ml etylacetat.
        5. Avlägsna provflaskan och använda en koncentrator för att reducera extraktvolymen till 1 ml. Överför provet till en mindre glasflaska och använda kväve blåsa ner utrustning, för att avdunsta than extrahera till begynnande torrhet.
        6. Tillsätt 100 | il metanol och blanda väl. Överför extraktet till en automatisk provtagare flaskan (med 0,3 ml insats) och locket flaskan. Analysera prover med LCMS / MS (se avsnitt 2).
    Kolumn: PL-gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 fim
    Guard Kolumn: PL-gel, 50 x 7,5 mm, 5 | im
    Mobil fas: diklormetan
    Flödeshastighet: 1 ml per minut
    Kolonntemperatur: 25 ° C
    UV-detektor: 210 nm
    Injektionsvolym: 95 | il
    Insprutningsläge: Ståard
    Rita hastighet: 500 ml per minut
    Mata ut hastighet: 500 ml per minut
    Rita läge: 3 mm
    Fraktion juveler: 3 ml fraktion (7-10 min) i 10 ml injektionsflaskor

    Tabell 1. Förhållanden och parametrar för gelpermeationskromatografi (GPC) sanering av extraherade avloppsvattenprover. Tabell detaljer GPC-kolonn, mobil fas, temperatur, injektionsvolym, och detektorvåglängden.

    1. Provextraktion (för jäst Östrogen Screen)
      1. Filterprov som beskrivs i avsnitt 1.2.1.1. Fäst engångsventilfoder, C18 SPE patroner och patronreservoarer till SPE apparaten. Omkopplaren på vakuumpumpen för att testa Utrustningen skall vara ordentligt tätad.
      2. Pipettera 5 ml metanol till varje reservoar, för att konditionera C18 patroner. Slå på vakuum (till ca 5 inHg för att tillåta ett flöde av ca 5 ml per minut) och låt vätskan genomgång, pausa under 1 min halvvägs igenom. Låt inte patronerna sinat. Upprepa processen med antingen HPLC-kvalitet eller dubbel destillerat vatten (DDH 2 O). Återigen inte köras torr.
      3. Utdrag vattenprover som beskrivs i avsnitt 1.2.1.4. Fortsätt vakuum under minst 30 minuter för att torka patronerna.
      4. Placera rena, torra 10 ml uppsamlingsflaskor i ett rack i utvinningskanalen. Kontrollera att varje spengummi är över en injektionsflaska. Tillsätt 5 ml metanol till varje reservoar. Slå på vakuum (maximalt flöde av 5 ml / min) och låta vätskan passera genom patronen i flaskan, pausa för 2 min halvvägs igenom.
      5. Före analys med hjälp av JA skärmen minska extraktet till begynnande torrhet med hjälp av kväve och rekonstruera med 500-1000 ul etanol. Försegla locken på provflaskor för att undvika avdunstning och hålla vid 4 ° C (i en gnista frittkylskåp).

    2. Kemisk analys med användning av LCMS / MS

    1. Optimera driftsförhållanden LCMS / MS-systemet med hjälp av tillverkarens instruktioner.
    2. Analysera kalibreringsstandardlösningar, provextrakt, blank och analytisk kvalitetskontroll (AQC) prover med hjälp av vätskekromatografi och masspektrometri förhållanden, och övervaka jon övergångar enligt tabell 2. Bestäm koncentrationen av steroid östrogener i provextraktet med hjälp av intern standarder 10.
    LCMS
    vätskekromatografi
    Kolumn: C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 | j, m.
    Injektionsvolym: 20 ^
    Flöde: 0,5 ml per minut.
    Mdannons för mobiltelefoner fas: Lösningsmedel A: vatten innehållande 0,1% ammoniak.
    Lösningsmedel B: acetonitril.
    Gradientprogram:
    Tid (min) 0 10 18 24 28
    A: B-förhållande lösningsmedel 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
    Masspektrometri
    Källa: Elektro (negativ jon)
    Gas och källa: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi
    TEM: 600 ° C, CAD gas 5 och Jonspray spänning -900
    MRM övergångar:
    E1: 269/145 & 269/143
    E2: 271/145 & 271/143
    EE2: 295/145 & 295/143
    E1-D4: 273/147
    E2-D4: 275/147
    EE2-D4: 299/145

    Tabell 2. Detaljer parametrar och villkor för LCMS / MS-analys av steroid östrogener i avloppsvatten extrakt. Tabell ger provinjektionsvolym och flödeshastighet, mobila villkor fas And gradient.

    3. östrogena aktiviteten Använda In Vitro Jäst Östrogen Screen (JA) Analys 8

    1. Förbered och lagra minimala medel och mediumkomponenter enligt tabell 3 (a) till (g).
    (a) Minimal Medium (pH 7,1):
    Förbered en Fe2 (4) 3-lösning genom att tillsätta 40 mg Fe2 (SO 4) 3 till 50 ml dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O)
    Tillsätt 1 L DDH 2 O till en 2 liters glasbägare
    Lägga till följande komponenter till bägaren:
    13,61 g KH 2 PO 4
    1,98 g (NH4) 2 SO4
    4,2 g KOH
    0,2 g MgSO 4
    1 ml av Fe2 (4)
    50 mg L-leucin
    50 mg L-histidin
    50 mg adenin
    20 mg L-arginin-HCl
    20 mg L-metionin
    30 mg L-tyrosin
    30 mg L-isoleucin
    30 mg L-lysin-HCl
    25 mg L-fenylalanin
    100 mg L-glutaminsyra
    150 mg L-valin
    375 mg L-serin
    Sätt bägaren på uppvärmda omrörare med en magnetisk loppa och rör om tills allt är löst
    Kontrollera att pH är 7,1 och justera vid behov
    Med hjälp av en 50 ml steril spruta fördela 45 ml portioner i glasflaskor med metallskruvlock lock
    Sterilisera Minimal Medium vid 121 ° C under 10 min i en autoklav
    Förvaras vid rumstemperatur
    (b) D - (+) - Glukos:
    Bered en 20% vikt / vol lösning i DDH 2 O
    Fördela 20 ml portioner i glasflaskor med metall skruvlock lock
    Sterilisera glukoslösning vid 121 ° C under 10 min i en autoklav
    Förvaras vid rumstemperatur
    (c) L-asparaginsyra:
    Gör en stamlösning av 4 mg / ml i DDH 2 O
    Fördela 20 ml portioner i glasflaskor med metall skruvlock lock
    Sterilisera L-asparaginsyra-lösning vid 121 ° C under 10 min i en autoklav
    Förvaras vid rumstemperatur
    (d) Vitamin Lösning:
    Bered en biotin-lösning genom att tillsätta 2 mg av biotin till 100 ml DDH 2 O
    Väg ut 8 mg tiamin, 8 mg pyridoxin, 8 mg pantotensyra, 40 mg inositol. Lägg till alla de torra komponenterna och 20 ml av biotin lösning till 180 ml ​​DDH 2 O
    Gör 10 ml sterila alikvoter genom filtrering genom ett 0,2 | im porstorlek engångsfilter i sterila glasflaskor, i ett laminärt luftflöde skåp
    Lagra vid 4 ° C
    (e) L-Treonin:
    Bered 100 ml av 24 mg / ml L-treonin i DDH 2 O
    Fördela 10 ml portioner i glasflaskor med metall skruvlock lock
    Sterilisera L-treonin-lösning vid 121 ° C under 10 min i en autoklav
    Förvaras vid rumstemperatur
    Bered 25 ml av en 20 mM koppar (II) sulfatlösning i DDH 2 O
    Gör 5 ml sterila alikvoter genom filtrering genom ett 0,2 | im porstorlek i sterila glasflaskor, i ett laminärt flöde skåp
    Förvaras vid rumstemperatur
    (g) klorfenol red-β-D-galaktopyranosid (CPRG):
    Bered 25 ml av en 10 mg / ml lösning av CPRG i DDH 2 O
    Gör 5 ml sterila alikvoter genom filtrering genom ett 0,2 | im porstorlek i sterila glasflaskor, i ett laminärt flöde skåp
    Lagra vid 4 ° C

    Tabell 3. Jäst Östrogen Screen analys; beredning och lagring av minimalt medium och mediumkomponenter.

    1. Förberedelse och StoraGE av 10x koncentrerade jästkultur
      1. På dag 1, förbereda odlingsmedium (enligt beskrivningen i 3.4.1) och häll i en steril konisk kolv. Lägg 125 ul av 10x koncentrerade jäst från kryogen flaskan lagrades vid -20 ° C. Inkubera det inokulerade media vid 28 ° C i ungefär 24 timmar på en orbital skakanordning.
      2. På dag 2, gör två flaskor tillväxtmedium (~ 50 ml) och häll i separata sterila koniska kolvar. Tillsätt 1 ml 24-hr odlade jästen i varje kolv i tillväxtmediet. Inkubera det inokulerade media vid 28 ° C i ungefär 24 timmar på en orbital skakanordning.
      3. På dag 3, häll varje 24-hr kultur i en steril 50-ml centrifugrör. Centrifugera 50 ml rören vid 4 ° C under 10 min vid 2000 x g. Häll av supernatanten och återsuspendera varje pellet i 5 ml minimalt medium med 15% glycerol. Gör 0,5 ml alikvoter av 10x koncentrerade jästkultur i 1,2-ml sterila cryovials och förvara vid -20 ° C i högst 4 månader.
    2. Preparansonerings och lagring av kemiska lager för standardkurvor
      1. Skölj alla glas och spatlar två gånger med absolut etanol och låt torka före användning för att avlägsna alla spår av föroreningar.
      2. Väg E2 direkt i en glasflaska i en pulvervägningsskåp och justera koncentrationen i volym i absolut etanol. Späd till en koncentration av 2x10 -7 M (54,48 ug / L). Tätning lock och förvara vid 4 ° C (i en gnista fritt kylskåp).
    3. analys producent
      1. På dag 0, förbereda tillväxtmedium. Till 45 ml flaska minimalt medium tillsätt 5 ml glukoslösning, 1,25 ml L-asparaginsyra lösning, 0,5 ml vitaminlösning, 0,4 ml L-treonin-lösning och 125 | j, l koppar (II) sulfatlösning. Häll odlingsmedium i en steril konisk kolv.
        1. Lägg 125 ul av 10x koncentrerad förråds (tinas från -20 ° C lagring) till kolven och inkubera de inokulerade media vid 28 ° C i ungefär 24 timmar på en orbital skakanordning.
      2. På dag ett, märka en steril 96-brunn utspädningsplatta "och göra serieutspädningar (100 pl volymer i etanol) av E2 standardkurva och testkemikalie (s) / avloppsextrakt (s) (t.ex. EE2).
      3. Etikett sterila 96-väl optiskt plan botten mikro "analysplatta (s). På varje platta innefattar ämnen (plus / minus lösningsmedel) och ett E2 standardkurva, förutom rader av testkemikalie (er) / effluent extrakt (s).
      4. Pipettera 10 | il av varje koncentration (E2, kemiska eller extrakt) i lämplig brunn i analysplattan. Pipettera 10 | il av etanol till varje "blankprovlösningen" brunn av analysplattan. Lämna analysplatta med locket av att avdunsta till torrhet.
      5. Göra en flaska tillväxtmedium (~ 50 ml) och tillsätt 0,5 ml av klorfenolrött-β-D-galaktopyranosid (CPRG) lösning per flaska. Bestämma densiteten av jästceller i 24-hr kultur genom att mäta grumlighet av kulturen vid 620 nm i en plattläsare. Inokulera enssay medium med 4x10 7 jästceller från 24 tim odling.
      6. Häll ympade analysmedium i en steril tråg. Med användning av en multikanalpipett tillsätt 200 | il av inokulerade analysmedium till varje brunn i 96-brunnars analysplatta.
      7. Sätta på locket på 96-brunnars analysplatta och försegla kanterna med tejp. Skaka analysplattan (er) om kraftigt under 2 min på en titer plattskakare och inkubera vid 32 ° C i en naturligt ventilerade värmeskåpet.
      8. På dag 2, skaka analysplattan (er) kraftigt på en titer plattskakare under 2 min. Återgå till 32 ° C inkubator.
      9. På dag 4, skaka analysplattan (er) om kraftigt under 2 min på en titer plattskakanordning. Lämnar plattan (er) för att stå i ungefär en timme sedan läsa analysplattan (er) vid en absorbans av 540 nm (optimal absorbans för CPRG ~ 575 nm) och 620 nm (för grumlighet) med användning av en plattläsare. Lämna skylt (ar) vid rumstemperatur och läsa senare om det behövs.
    4. Östrogena aktiviteten beräkningar <ol>
    5. Korrekta analysavläsningar för turbiditet med hjälp av följande ekvation: Korrigerat värde = prov eller standard (E2) absorbansen vid 540 nm - [prov eller standard (E2) absorbans vid 620 nm - blank absorbans vid 620 nm]. Plot E2 standardkurva med lämpliga ämnen (för att kontrollera kontaminering) 8.
    6. Använd den korrigerade provet (utdrag eller kemisk) för att beräkna "Estradiol motsvarigheter". Använd plottade E2 standardkurva värden och regressionsekvationen (3-parameter polynom eller linjära beroende på passform) att interpolera provet / extrahera absorbansvärden till E2 motsvarande värden. Användning koncentrationsfaktor (dvs vatten extraheras och volym etanol extraktet återsuspenderas i) att beräkna östrogen aktivitet i pre-extraherat prov.

    4. Laboratorie baserad bedömning av östrogen aktivitet med in vivo vitellogenin Induktion i Male Fathead promelas

    1. Använda manliga fathead minnows (Pimephalespromelas)> 4 månader gamla, som uppvisar sekundära sexuella egenskaper (det vill säga utvecklingen av bröllops tuberkler och en rygg fatpad) tyder på manlig sexuell beslutsamhet.
      1. För att förhindra lek aktivitet, män separat mogna tre veckor (± 3 dagar) före inledandet av testet. Ställ upp åtminstone två 45 L glas akvarier med en maximal belastning av 3 g / L. För att säkerställa tillräckliga mängder frisk fisk för testet, använder minst 100 män.
      2. Håll den manliga fisk under identiska miljöförhållanden som kommer att upplevas i testet (dvs vattentemperatur på 25 ± 1 ° C och en 16: 8 h ljus: mörk fotoperiod). Bibehålla spädvattenflödeshastigheten till varje tank för att säkerställa en 95% ersättning av minst var 6 till 8 h, dvs 330 ml / min för en 45 L tank.
    2. Testapparat och experimentell design
      1. Använd stora glasbehållare för att rymma en laddning av upp till 3 g fisk per liter water. För 8 vuxna män (nominellt 4,5 g vardera), använd en 10-20 L tank.
        1. Använd två likadana tankar för varje behandling och skydda varje tank från onödiga synrubbningar (dvs använda laminerade kort skärmar mellan tankarna). Identifiera varje tank med en studienummer, en exponeringskoncentration och ett identifieringsnummer för fartyg.
      2. För avloppsvatten som studier
        1. Vid ankomsten, omedelbart överföra utflödet in i en lagringstank vid 10 ± 1 ° C. Börja doserings utflödet inom två timmar efter mottagandet av utflödet.
        2. Mata utflödet via peristaltisk pump, från 10 ° C lagringstank till en acklimatisering kärl. Värm effluenten i acklimatisering kärlet till 18 ± 2 ° C. Pumpa det uppvärmda utflödet från acklimatisering kärlet till doserings / blandningskärlen och därefter till testakvarier (som har fisken). Värm de akvarier som till en temperatur av 25 ± 1 ° C.
      3. För kemiska doseringsstudier
        1. Väg testkemikalier i ett pulver som väger skåp. Förbered koncentrerade kemiska lager i DDH 2 O företrädesvis utan användning av lösningsmedel.
          Obs: Om lösningsmedel krävs för att solubilisera testföreningar, använda kontroller med lösningsmedel utöver utspädnings vatten kontroll.
        2. Gravity foder eller pump utspädningsvatten från en temperaturstyrd header tank via styrflödesmätaren (s) till dosering / blandningskärl. Pump koncentrerad kemisk lager (s) med en peristaltisk pumpsystem till dosering / blandningskärlen. Styra pumpen hastigheten (slut kemiska) och vattenflödeshastighet (utspädningsvatten) för att uppnå den önskade koncentrationen exponering.
          Obs: Använd silikonslang för att mata vatten / testkemikalie till varje provkärl från doserings / blandningskärl. Använda en flödeshastighet som är tillräcklig för att ge en 75% kärl ersättare i åtminstone 24 timmar, det vill säga, 20 ml / min för en 20 L tank. Bibehålla flödeshastigheten vid ± 10% av den specificerade nominella värdet.
        Hålla exponeringen tank vattentemperatur vid 25 ± 1 ° C, löst syre ovanför 70% av luftmättnadsvärdet (5,8 mg L -1 vid 25 ° C) och ± 0,5 pH-enheter (med start pH mellan 6,5 och 8,5) under hela studien. Ställ ljusförhållanden till fotoperiod av 16 timmar ljus: 8 timmar mörker, med gryning / skymning övergångsperioder 20 min.
      4. Mata fiskarna två gånger om dagen med nyligen tinas frysta vuxen artemia (Artemia) på 2,5 (± 0,1) g per tank per foder. Också mata fiskarna en gång om dagen med en liten mängd (två fingrar nypa) av en tropisk fling fiskmat. Lämna minst 3 timmar mellan varje foder.
        1. Håll en daglig utfodring post för att övervaka matningssvar / beteende (bra, måttlig eller dålig, jämfört med kontrollerna). Sifon tankarna åtminstone två gånger i veckan (företrädesvis dagligen) för att avlägsna eventuellt överblivet mat och avföring. Rengör sidorna och bottnarna av testkärlen åtminstone en gång per vecka.
      5. Ta vecko vattenprovs från varje tank för att bekräfta östrogenaktivitet (via jäst skärmen) och kemisk sammansättning (via analytisk kemi). Se avsnitt 1-3 för mer information om vattenprovtagning, extraktion och analys.
        Obs: För varje experiment, använd spädvattenkontroll (negativ kontroll), positiv kontroll (E2 eller EE2) plus åtminstone tre utspädningar av avloppsvatten (100, 50 och 25%) eller testkemikalien för att övervaka dos-respons. Om nya tekniker testas, använd förening / utflödet med eller utan behandling (t.ex. EE2 utan behandling, EE2 med TAML / väteperoxid (H 2 O 2) behandling 12, Figur 1).

    Figur 1
    Figur 1. Diagram representerar experimentell design av ett in vivo amerikansk elritsa vitellogenin bioanalys för att bestämma avlägsnande av ekotoxicitet 17α-etinylestradiol använder TAML / peroxid vattenrening. EXPerimental inrättat består av åtta 11 L glasakvarier varje matade med kontinuerligt flöde av vatten. Individuella kemiska stamlösningar och vatten (filtrerat de-klorerat) levereras till blandningskamrarna. Nominella koncentrationer (utan reaktion) i blandningskärlen är 2 ng / L EE2, 80 nM TAML och 0,16 mikrogram / ​​LH 2 O 2. Kemisk stamlösningar (EE2, H2O 2 och TAML) bereds och doseras separat så att reaktionerna påbörjas i blandningskärlen. Fisk (8 manliga fathead minnows per tank) exponeras för blandningen (er) efter en reaktionstid kontakttid av ca 45 minuter. Vattenprover tas från exponeringstankarna vecka. Plasmaprover tas från fathead promelas att mäta östrogena biomarkör vitellogenin (VTG) från en baslinje grupp, i början av studien, och alla andra fiskar efter 21 dagars exponering. De särskilda behandlingar är: "-C"; negativ kontroll (späd vatten endast), "+"; positiv kontroll av EE2,'+ H'; EE2 plus H2O 2 "+ T"; EE2 plus H2O 2 plus TAML. Denna siffra har ändrats från Mills et al. 2015 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. Test procedur
      1. acklimatiseringsperiod
        1. Mät våtvikt (g) av varje könsmogna manliga fisk och fördela på måfå till varje tank (8 hanar per tank).
        2. Håll ofördelade fisk från samma parti och underhålla dem under samma testförhållanden. Använd dessa fiskar att ersätta personer som visar tecken på fysisk skada eller brist på tillstånd under 7 dagar acklimatiseringsperiod. Se till i slutet av acklimatisering period varje behandlingstanken har 8 hanar som helt har acklimatiserats till testförhållandena.
        3. Ta "grundläggande" plasmaprover från ytterligare 8 hanar från samma batch manliga fisk. Följ blodprovtagningsmetod i avsnitt 4.4 och vitellogenin (VTG) analysmetod i 4,5.
      2. Efter acklimatiseringsperiod leverera avloppsvatten eller kemiska doserings bestånd exponerings tankar för 21 dagar enligt 4.2.2 eller 4.2.3. Monitor dödlighet, beteende och utseende av fisken i varje replikat tank dagligen före den första matningen av dagen. Spela någon onormalt beteende eller incidenter.
        Obs: Se till miljöförhållanden och utfodring priser bevara hälsan hos fisken (avsnitt 4.2.4 och 4.2.5).
    2. Provtagning av fisk efter 21-dagars exponering period
      1. 12 timmar före provtagning, sluta mata fiskarna.
      2. Etikettmikro centrifugrör för insamling av blodprover, tillsätt ~ 5 l aprotinin (en proteashämmare) och placera dem på is.
      3. Gör en 500 mg / L lösning av MS222 (bedövningsmedel) genom att lösa 500 mg MS222 per 1 liter de-klorerat vatten (tidigare acklimatiseradtill 25 ± 1 ° C). Neutralisera MS222 till pH 7,4 ± 0,4 med användning av 1 M NaOH.
      4. Flytta varje fisk från tanken till den buffrade MS222. Håll lösningen tills upphörandet av all operculum rörelse (typiskt 5 ± 1 min).
      5. Mäta och registrera den gaffellängd (mm) under den terminala bedövningsmedel. Använd en engångs skalpell att amputera svansen, och använda en heparin hemocrit rör för att samla upp blod från svansartären (Figur 2). Noggrant dispensera blodet in pre-märkt mikrocentrifugrör och förvara på is.
      6. Döda fisken omedelbart efter dragning blodet. Bekräfta döden genom definitivt upphörande av cirkulationen och / eller destruktion av hjärnan. Mät och registrera den totala fisk vikt (till närmaste 0,01 g), och dissekera vävnad efter behov.
      7. Centrifugera blodet (7000 x g under 5 min vid 4 ° C) inom 2 h av samlingen. Överför plasmavätskan med hjälp av en pipett till ny märkt 0,4 ml mikro badkares och lagra på is. Frysa rören innehållande plasma på torris inom 30 min centrifugering och förvaras vid -80 ° C före analys av plasma VTG koncentrationer.

    figur 2
    Figur 2. Bilder som visar manliga amerikansk elritsa (Pimephales promelas), plasma och placering av testikel. Vid slutet av 21-dagars exponering bör dödas all fisk för att samla blodprover. När enligt denna terminal bedövningsmedel fisklängd (gaffellängd, mm) bör mätas, snabbt följt av uppsamling av blod från svansartären Foto-A. Röda streckade linjen anger plats för svansen amputation (en engångs skalpell bör användas för att amputera svansen ). Foto-B visar ett hepariniserat hemocrit röret används för att samla blodet. Varje fisk skall sedan avlivas omedelbart efter blodprov har tagits, i detta fall hela huvudethar avskilts från kroppen (Photo-C). När fisken har dödats kroppskaviteten kan öppnas upp för att avslöja de inre organen. Foto-C visar placeringen av testiklarna (gonad) i förhållande till simblåsan (SB) i karpfisk, t.ex. amerikansk elritsa, mört, karp, etc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. Mäta plasma VTG koncentrationer med en homolog VTG enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) -kit som utformats speciellt för fathead minnows.
      1. Förbered VTG standarder och buffertar som beskrivs i tillverkarens protokoll. Späd plasmaprov 1:50, 1: 5000 och 1: 500.000 och analysera dem i två exemplar för att erhålla avläsningar inom VTG standardkurvan intervall enligt tillverkarens anvisningar. Följ tillverkarens riktlinjer för att beräkna vitellogenin koncentrationer.

      5. Fält Bedömningar av Advanced / Novel Wastewater Treatment Technologies att minska östrogen aktivitet Använda In Vivo vitellogenin och inter Induktion i Roach (Rutilus rutilus)

      1. Fångst av vilda mört lever nedströms reningsverket utlopp
        Obs! Använd mört (Rutilus rutilus) eller andra rikligt sötvatten eller bräckt fiskarter, som är gonochoristic och kända för att vara känsliga för östrogenhormonstörande.
        1. Fånga fisk med hjälp av electro, nät, fånga eller andra erkända fiskemetoder beroende på situationen 13. Transport av fisken i luftade tankar tillbaka till laboratorium för provtagning.
        2. Förbered mikrocentrifugrör som beskrivs i 4.4.2. Förbered buffrad MS222 såsom beskrivits i 4.4.3. Söva fisk som beskrivs i 4.4.4.
        3. Mät fisk längd och vikt under terminal bedövningsmedel.
        4. Samla blod från svansartären med hjälp av DISPOsable hepariniserad spruta. Döda varje fisk omedelbart efter blodprovinsamlings. Noggrant fördela blodet i förväg märkta mikrocentrifugrör och hålla på is. Förbereda plasma såsom beskrivs i steg 4.4.7 och mät VTG genom ELISA (4,5).
        5. Använd pincett bort 2-3 fiskfjäll från varje fisk och placera in individuellt märkta små papperskuvert. Förvara kuvert vid rumstemperatur under torra förhållanden för senare fisk åldersbestämning och tillväxtanalys.
        6. Öppet lastutrymme med en skalpell för att avslöja de inre organen. Ta ut tarmen för att avslöja simblåsan med en gonad placerade på vardera sidan (Figur 2). Försiktigt bort de parade könskörtlarna med fina nosed pincett och placera i en glasflaska. Täck gonaderna med Bouins fixativ i ett förhållande av 01:10 vävnad: fixativ.
        7. Lämna vävnaden i Bouins för 6-24 h beroende på storleken av vävnaden (fixativ penetrerar vid en mm per timme). När fasta, häll bort Bouins fixerings end ersätta med 70% denaturerad industrisprit (IMS). Förvara den fasta vävnaden vid rumstemperatur tills vävnader bearbetas för histopatologi (avsnitt 5.3).
      2. Fältbaserad bedömning av östrogenaktivitet med hjälp av in vivo vitellogenin och intersex induktion i mört
        1. Experimentell design och inrätta
          Obs: Ställ in tankar och pilotanläggning i god tid in vivo arbetet börjar. Starta tankarna flödar 3-4 veckor före någon tillsats av fisk till systemet. Övervaka vattenflöden, vattenkvalitet och villkor (pH, temperatur, löst syre, etc.) regelbundet för att se parametrar kan upprätthållas.
          1. Konstruera stora tankar (t.ex. 300-1,000 L) på plats i pilotanläggningen, som kan ta emot "kontroll" de-klorerat kranvatten, standard behandlade avloppsvattnet (s) och avancerade behandlade avloppsvattnet (s) parallellt. Fäst luftpump / luftare till tankarna. Ställ vattenflöden att uppnå minst 6 tank volym utbyten per dag.
            Obs: Se till att tankarna är välisolerade och skuggade för att förhindra alltför stora dagliga temperaturvariationer. Design tankar att tillåta granskning av fisken, för beteendeförändringar (brist på utfodring, etc.), tecken på sjukdom och dödlighet.
        2. Starta exponeringen med flytande påsar med mört (från fiskodlingen) i respektive tankar för en timme. Lägg tank vatten till påsarna gradvis tills vattentemperaturen och villkor är omgivningen. Släpp fisken i sina tankar.
        3. Feed vuxen mört dagligen på pellet fiskmat (storlek 0,5-0,8). Feed juvenil mört dagligen på små pellet (pelletsstorlekar 100-300) icke-östrogena foder 14 efter behag, justerat på grundval av uppätet foder. Håll en daglig utfodring rekord dokumentera utfodring svar / beteende (bra, måttlig eller dålig, jämfört med kontrollerna).
        4. Ta vecko vattenprov från varje tank för att bekräfta östrogen aktivitet och kemisk sammansättning. SEe avsnitt 1-3 för mer information om vatten provtagning och analys.
      3. Histopatologi av fisk könskörtlar 15
        1. Försiktigt bort dissekerade och fixerade könskörtlar (som beskrivs i steg 5.1.6 och 5.1.7) från behållaren med pincett och placera på en skärbräda.
        2. Använd en mikrotom blad för att skära varje gonad i 3 delar (främre, mitten och bakre) och från varje del skär en 3-5 mm tjock tvärsnitt. Placera försiktigt alla sex stycken i en märkt plast biopsi kassett, och placera i vävnadsprocessor med hjälp av tiderna som anges i tabell 4.
        3. Wax bädda vävnader och avsnittet om roterande mikrotom (3-5 pm). Överför sektioner till märkta bio-vidhäftande belagda glasskivor och placera objektglasen på en uppvärmd platta (inställd på 45 ° C) för att torka i 24 timmar.
        4. Färga objektglasen, antingen manuellt eller med hjälp av en automatiserad Stainer, med användning av de tidsinställningar som anges i tabell 5. Placera en droppe monteringsmedel på färgade vävnaden, och lay ett täckglas över monteringsmedel för att skydda vävnaden.
        5. Först undersöker varje bild vid låg förstoring (20X, dvs 2X objektiv, med 10x ögonlinjer förstoring) för att bestämma kön och antalet poäng i bilagor till kroppskaviteten 15. Notera eventuella avvikelser för varje fisk.
        6. Vid en större förstoring (100X eller 400X), undersöka vävnaden att bedöma gametogenes steg, avvikelser och förekomsten av äggceller i testikelvävnad. Spela in svårighetsgraden av intersexuella med användning av följande graderingssystem som sträcker sig från 0 (normal manlig vävnad) till 7 (100% äggstocksvävnad) 6 (se tabell 6).
      steg nummer Behandling Syfte Tid (h)
      1 70% IMS Uttorkning 3
      2 90% IMS Uttorkning 2,5
      3 95% IMS Uttorkning 1,5
      4 100% IMS Uttorkning 1,5
      5 100% IMS Uttorkning 1,5
      6 100% IMS Uttorkning 1,5
      7 100% IMS Uttorkning 1,5
      8 Histologi clearing agent Clearing 1,5
      9 Histologi clearing agent Clearing 1,5
      10 Histologi clearing agent Clearing 1.5
      11 VAX vax infiltration 1,25
      12 VAX vax infiltration 1,25
      20 hr TOTALT

      Tabell 4. förädling för vax impregnering vävnader för histopatologi. Vävnader bör behandlas i en automatisk vävnadsprocessor. Vävnader bör vara nedsänkta i lösningarna som anges för den tid som anges.

      Färga nr. Fläck Syfte Tid (min)
      1 Histologi Clearing agent löser upp vax 15
      2 hydra~~POS=TRUNC 2
      3 90% IMS hydra~~POS=TRUNC 2
      4 70% IMS hydra~~POS=TRUNC 2
      5 KRANVATTEN (löpning) Skölj 2
      6 HAEMOTOXYLIN Fläckar cellkärnor blå 10
      7 KRANVATTEN (löpning) Ta bort överflödigt 10
      8 surgjord IMS deklorering 20 sek
      9 KRANVATTEN (löpning) Skölj 20 sek
      10 LICO 3 Salt 20 sek
      11 KRANVATTEN (löpning) Skölj 20 sek
      12 1% EOSIN (vattenhaltig) Fläckar cytoplasman rosa 20 sek
      13 KRANVATTEN (löpning) Ta bort överflödigt 5
      14 70% IMS Uttorkning 2
      15 90% IMS Uttorkning 2
      16 100% IMS Uttorkning 5
      17 Histologi Clearing agent Ta IMS, bindemedel 5

      Tabell 5. Lösningar och dopptider för Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning av fisk gonad vävnader. Diabilder bör placeras i varje bad för alloctid ated i följd. H & E färgning av vävnader krävs för att bestämma utvecklings eller organisatoriska konsekvenser av östrogena avloppsvatten avloppsvatten på fiskkönskörtlar.

      Göra avsnitt Beskrivning
      0 Normal male testis
      1 Multifokal ovotestis med 1-5 ägg (vanligtvis ensamma) utspridda bland testikelvävnad
      2 Multifokal ovotestis, 6-20 ägg ofta i små grupper utspridda bland testikelvävnad
      3 Multifokal ovotestis, 21-50 oocyter i klasar
      4 > 50 och <100 oocyter. Avsnitt är vanligtvis multifokal och ger intryck av en mosaik av testicular och äggstocksvävnad.
      5 > 100 ägg, vanligtvis multifokal men kan också fungera som kontaktpunkter med tydligt identifierbara zoner äggstocks- och testikelvävnad separeras från testikelvävnad.
      6 > 50 procent av gonadal vävnaden på sträckan är äggstockscancer och tydligt åtskilda från testikelvävnad från epitelceller och fagocytiska vävnader.
      7 100 procent av gonadal vävnad på sektionen är äggstocks.

      Tabell 6. poängsystem för att bedöma svårighetsgraden av intersex tillstånd mört. Histologiskt preparerade diabilder av gonadal vävnad bör granskas under ljusmikroskop vid 20X, 100X och 400X förstoring, för att bedöma eventuella avvikelser och förekomsten av äggceller i testikelvävnad. Denna tabell är modifierad från Jobling <em> et al. 2006 6.

    Representative Results

    Försök att förstå effekterna av förbättringar rening av avloppsvatten eller för att bestämma den lämpligaste tekniken för att eftermontera utrustning som tertiär behandling vid befintliga reningsverk med avseende på effektiviteten för avlägsnande av hormonstörande aktivitet hos urladdade avloppsvatten kräver inte bara mätning av nyckel kemisk komponenter som kommer in verken men kräver en analys av de nedbrytningsprodukter som också kan ha hormonstörande aktivitet. I inhemska avloppsvatten, de östrogena ämnen som förekommer är de steroidhormoner, östron (E1), 17β-estradiol (E2) och 17α-etinylestradiol (EE2) 5,8. Steroid östrogener primärt utsöndras från kroppen som en blandning av inaktiva konjugat 16,17. Dessa konjugerade östrogener väsentligen dekonjugerad i avloppssystemet genom bakteriell aktivitet och ytterligare nedbrytning sker i reningsverket. De dekonjugerad steroider are avlägsnas från avloppsvattenströmmen genom adsorption till slam eller ned biologiskt under sekundär behandling som resulterar i bildandet, för det första av transformations biprodukter och slutligen fullständig mineralisering kan uppstå av den ursprungliga aktiva komponenten. Den kemiska analysen av alla enskilda föreningar i utflödesströmmen skulle vara svårt, tidskrävande och kostsam och skulle inte omfatta okända aktiva komponenter närvarande i ett prov. Dessutom kommer en summa av östrogena bidraget från varje komponent endast ge en indikation av den ackumulerade östrogena potens av ett prov av föreningarna analyseras. Detta är en risk om omvandlingsprocesser genererar okända östrogena ämnen eller där inflödet är industriellt ursprung. Kombinera kemisk analys med in vivo och in vitro ekotoxikologiska bioanalyser tillhandahåller en lösning på närvaron av okända östrogena komponenter i blandningar såsom behandlat avloppsvatten. In vitro-analyser såsom Yeast Östrogen Screen (JA) har använts i stor utsträckning för att bestämma den östrogena aktiviteten av avloppsvatten och för att identifiera de aktiva komponenterna i behandlade prover 8,18,19. Däremot kan jämförelser mellan in vivo och i att testa vitro vara betydande 11 och en omfattande utvärdering av nya processer med avseende på behandling av hormonstörande potens kräver ett batteri av kemiska och ekotoxikologi tester.

    Fastställande av huruvida enskilda reningsverk eller processer bort aktiva föreningar från avloppsvattenströmmen kan åstadkommas med hjälp av kemisk analys som följer prov utvinning, koncentrering och sanering av extraktet före analys, oftast genomförs med hjälp av LCMS (/ MS) eller GCMS (/ MS) metoder. Data som erhållits från kemisk analys kan användas för att bestämma överensstämmelse med individuell Uppskattad nolleffektkoncentrationer (PNEC) 20 eller miljökvalitetsnorms (EQS) 21 av specifika individuella föreningar och därför sådana metoder är avgörande för regleringsuppgifter efterlevnad. Dessutom riktade eller icke-riktade metoder kemisk analys möjliggöra identifiering och kvantifiering av enskilda föreningar eller isomerer jämfört med biologiska metoder, som ger en total svar. Kemiska analysmetoder tillåter därför bedömningen av diskreta föreningar som skall göras för att möta och för att möta dessa avloppsrenings utmaningar på en individuell behandlingsanläggning basis. Studier har visat att konventionell avloppsrening (t.ex. aktivslamanläggningar) kan vara mycket effektiva i att avlägsna naturliga steroidhormoner även avlägsnande av det syntetiska hormonet EE2 tenderar att vara mindre effektiva. Fältstudier med hjälp av avancerad behandling som utnyttjar tekniker såsom ozon har granulerat aktivt kol (GAC) och membran visat, om än på höga kostnader, att de kan användas som en end-of-pipe-lösning för att avlägsna EE2 nedan Predicted effektnivåer och till under detektionsgränserna. Figur 3 visar avlägsnandet av EE2 använder GAC vid ett kommunalt avloppsreningsverk pilotskaleanläggning. Studier som genomförts vid pilotskala vid kommunala reningsverk använder ände av röret GAC behandling visar också minskningen av östrogen potens efter GAC mäts med Jäst Östrogen Screen (JA) såsom visas i Figur 4.

    Figur 3
    Figur 3. Exempel fältdata som visar avlägsnandet av etinylestradiol efter avancerad tertiär rening. (A) Prover samlas in från reningsverket följande konventionella (aktivslamanläggning) behandling efter de förfaranden som beskrivs för prov bevarande. (B) Proverna extraheras med hjälp av fastfasextraktion, rensade upp för att ta bort störande ämnen med hjälp av normal fas SPE ochgelpermeationskromatografi. (C) Den rena koncentrerade extraktet koncentreras till en liten volym och analyseras med hjälp av negativa joner elektro LCMS / MS i MRM-läge. Resultaten beräknas med hjälp av intern standardisering med hjälp av isotopmärkta interna standarder. I det visade exemplet är EE2 närvarande i den slutliga ASP utflödet vid en koncentration över den förväntade nolleffektnivå (PNEC) på 0,1 ng / L och tas bort med GAC och ozon (O 3) till en miljömässigt säker koncentration. Klicka här att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4. Bild av en jäst Östrogen Screen (JA) analysplatta (A) visar färgförändring från gult till rött, i samband med östrogen aktivitet av proverna. Tomter skapas från JA analysplattan visar korrigerade absorbansen (540nm) av estradiol standard (B), aktiverat slam processavloppet (ASP) och granulärt aktivt kol (GAC) behandlade avloppsvatten utflödesprover (C). Varje prov testades i duplikat. ASP och GAC utsläpp extraherades och koncentrerades med användning av SPE metoder som beskrivs i avsnitt 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Ozon är också effektiv i att ta bort steroid östrogener och östrogen aktivitet från konventionellt behandlade reningsverk. Ozon är i stånd att oxidera ett brett spektrum av organiska föroreningar och löst organiskt material i avloppsvattenprover och ger desinfektionsegenskaper. Effektiviteten av ozon beror på vattnets egenskaper såsom pH, mängden av organiskt material och den applicerade dosen av ozon. Östrogener som är dåligt avlägsnas genom konventionell behandling kan varaavlägsnas från avloppsvatten med doser mellan 0,8 och 2 mg O 3 / mg DOC. Ozon är ett selektivt oxidationsmedel, som reagerar med elektronrika områden (omättade kol-kolbindningar, aromatiska föreningar inkluderande aromatiska alkoholer), vilket gör ozon tillämplig för nedbrytningen av ett antal EDC. Emellertid inte eliminering av enskilda föreningar inte nödvändigtvis leda till en fullständig mineralisering av den ursprungliga föreningen. Organiska ämnen efter ozonering kan omvandlas genererande mellanprodukter eller transformations oxidation biprodukter som inkluderar ett antal med låg molekylvikt, polära klasser av föreningar, såsom aldehyder, ketoner, karboxylsyror, keto syror, och bromerade föreningar. Exempel innefattar, bromat, formaldehyd, acetaldehyd och karboxylsyror. Använda in vivo och in vitro bioanalyser har det visat sig att även om ozon endast delvis oxiderar vissa kemiska ämnen, de resulterande stora omvandlingsprodukter har en lägre estrogENIC potens och därmed tillämpningen av ozon vid en lämplig dos resulterar i en hög avlägsnande av östrogenaktivitet.

    En av de stora fördelarna med ytterligare behandling av avloppsvatten är minskningen av feminisering av manliga fisk i recipienten; en negativ effekt som kan leda till minskad fertilitet 3. In vivo-studier med användning av fisk (t.ex., mört eller amerikansk elritsa) som utsätts för avloppsvatten visar kvinnliga könsceller eller oocyter i testikeln av manlig fisk (t.ex., såsom visas i fig 5). Inter eller manliga VTG är frånvarande eller minskas avsevärt i fisk efter avancerad behandling såsom GAC 7 eller ozon 22. Dessa studier visar att nedbrytningsprodukter som produceras under ozon inte östrogena, men detta inte tar upp toxicitet utflödet produceras. Denna fråga har tagits upp i andra studier, t ex en studie av Magdeburg et al.

    figur 5
    Figur 5. Mikrofotografier av en normal hane (A) och intersex (B, C) ​​gonader från vuxna mört (Rutilus rutilus) utsätts för avloppsvatten i ett fält baserad bedömning. Photomicrograph-A, visar en histologisk sektion av normal manlig testikel. Mikrofotografi-B och -C, visar histologiska sektioner av ett inter manliga fisk, har utsatts för aktivslamprocess avloppsvatten som under sex månader. Pilar indikerar ägg som finns i testikelvävnad. Skala stapel representerar 100 nm i varje mikrofotografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    12,24 - 26. TAML aktivatorer med H2O 2 effektivt försämra EE2 och andra steroid östrogener i rent laboratorium vatten samt utsläpp från kommunala reningsverk och spetsade urinprover 12. Laboratoriestudier visar TAML / H2O 2 behandling ger hög steroid östrogen borttagning inklusive EE2 bort och väsentligt minskar östrogenaktivitet mätt in vitro med hjälp av JA bioanalys och substantially minskar fisk feminisering in vivo mättes med användning av VTG bioanalys (figur 1 och figur 6).

    figur 6
    Figur 6. Genomsnittlig EE2 koncentration och östrogen aktivitet i behandlade och obehandlade tank vatten (A) och plasma vitellogenin i baslinjen och utsatt manliga fisk (B). A) EE2 koncentration (ng / L, mörkblå staplar) mättes genom LCMS / MS , östrogena aktiviteten (EE2 motsvarande ng / L, mörkgröna staplar) mättes genom in vitro jäst Östrogen Screen (JA). B) Plasma vitellogenin (ng / ml, ljusblå staplar) koncentration i manliga fathead minnows mättes via en kvantitativ enzym -kopplade immunabsorberande analys (ELISA). EE2 kemisk analysresultat rapporteras som <0,03 ng / L EE2 (dvs., lägre än detektionsgränsen (LOD)) behandlades såsom har halv LOD (dvs., H2O 2 + TAML, EE2 + H2O 2, och EE2-bara. Felstaplar i graf-A representerar standardfelet av medelvärdet, felstaplar i grafen-B representerar standardavvikelse. Bokstäver ovanför barer i graf B representerar statistisk likhet. Denna siffra har ändrats från Mills et al. 12 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    Reningsverk är den huvudsakliga vägen för förorening ytvattnet med EDC. En utvärdering av effekten av borttagande av endokrin aktivitet konventionella, avancerade eller nya behandlingsprocesser kräver användning av en mängd olika kemiska och biologiska analyser. Kemisk analys med användning av icke-riktade och målinriktad analys ger kvalitativa eller kvantitativa data om effekten av avlägsnande av enskilda komponenter och därför tillåter en bedömning göras mot miljökvalitetsnormer eller uppskattad nolleffektkoncentrationer för föreningar eller blandningar av föreningar analyseras.

    Generering av omvandlingsprodukter som härrör från ofullständig mineralisering av ämnen efter behandling och närvaron av okända biologiskt aktiva komponenter i avloppsvattnet begränsar användbarheten av kemisk testning enbart. En kombination av in vivo och in vitro bioanalyser i kombination med analytisk kemistry screening ger en användbar verktygslåda för att bestämma effekten av EDC avlägsnas genom nya rening av avloppsvatten. Dessa tester, när genomförts tillsammans traditionella vattenkvalitetsparametrar och andra toxikologiska och mikrobiologiska endpoints möjliggöra en kritisk utvärdering av nuvarande och nya avloppsvattenbehandlingsteknik.

    Det är viktigt att notera att jäst baserade östrogen skärmar (t.ex. YES) är inte den enda in vitro analyser för att bestämma östrogen potens av kemikalier och avloppsvatten. Ett antal stabilt transfekterade däggdjurs cellbaserade analyser har utvecklats för, till exempel, ER-CALUX 27 och hERa-HeLa-9903 28 med humana bröstcancerceller eller cervikala tumörceller respektive. JA har jämförts med liknande däggdjurs cellbaserade analyser och har visat sig ha en jämförbar hög reproducerbarhet, sant positiva och sant negativa östrogena identifieringspriser 29, althousch det ibland anses vara något mindre känslig 27. En fördel med jäst baserad reporter analyser är att i laboratorier utan betydande erfarenhet med däggdjurscellkultur kan JA lättare antas, eftersom det kräver mindre stränga bio-kontrollåtgärder och steriltekniker (YES kan utföras på bänken topp vid behov) . De humana cell baserade analyser kräver också CO 2 inkubatorer och luminometrar jämfört med standard inkubator och mikroläsare används i JA. Två jäst baserad östrogen reporter analyser (JA, Saccharomyces cerevisiae och A-JA, blastobotrys adeninivorans) är för närvarande genomgår mellan laboratorier spår för validering av ISO 19040 "Water quality - Fastställande av östrogena potential vatten och avloppsvatten" lyfta industrin intresse för dessa tekniker.

    Det finns ett antal begränsningar hos de metoder som beskrivits vilka innefattar den potentiella föroreningenprov under provtagning, prov lagring och analys med östrogena ämnen som härstammar från området eller laboratoriemiljö eller av mänsklig smitta (t.ex. mjukgörare, ytaktiva ämnen, personliga hygienprodukter). Denna typ av förorening i JA-analysen (eller andra cellbaserade reporter analyser) kommer att lyfta bakgrunden och påverka användningen av analysen. Vattenprover eller lösningsmedel som lagras i plastflaskor kan lätt orsaka falsklarm. Falska negativa är också av intresse som både LCMS / MS och JA analysen kräver SPE att koncentrera östrogener till detekterbara nivåer. Matrisen, valet av SPE sorbenten och elueringslösningsmedel kan påverka extraktion effektivitet och vilka typer av föreningar elueras. Använda C18 SPE patroner för extraktion med användning av de förhållanden som beskrivs i detta protokoll kan generera en negativ bias, som mycket polära och basiska föreningar skulle vara dåligt behållas av sorbenten. Dessutom kräver beredning av den eluerade JA eluenten från metan detta protokollol till etanol via indunstning till torrhet funder kväve resulterar i förlust av flyktiga föreningar. Som ett resultat protokollet kan ge skattas östrogena aktivitet av testade prover. Dessa begränsningar är särskilt viktigt när man överväger JA analysen som okända eller oväntade föreningar kan missas, eftersom de inte har utvunnits eller de går förlorade på grund av avdunstning. Dessutom gör LCMS / MS teknik användning av märkta interna standarder för att korrigera för återvinning; detta tillvägagångssätt kan inte användas med JA-analysen.

    Betydande begränsningar av in vivo-testning av avloppsvatten innefattar hög kostnad och tid som krävs för bedömning jämfört med in vitro-metoder. För närvarande användningen av fiskembryo tester för att upptäcka östrogena aktivitet är begränsad. Däremot har det skett en viss framgång med att producera östrogen svarar transgen glödande fiskembryon 30, som skulle kunna få framtida tillämpningar. Fathead minnows (som används i denna protocol) är en vanlig försöksdjur och VTG induktion i manliga fisk är en väldokumenterad bio-markör för östrogen exponering och ett kvantifierbart mått på avloppsvatten som östrogeniciteten 22 eller andra östrogena föreningar eller blandningar 31. OECD riktlinjer för hormonstörande kemikalier har validerats med vuxen amerikansk elritsa, japanska medaka och zebrafisk 32,33, med VTG är en känslig biomarkör för östrogen exponering i alla tre arterna. Däremot VTG induktion inte direkt korrelerar med fortplantningsfunktion och därmed de ekologiska konsekvenserna av avloppsvatten exponering, vilket kan ses i allvarligt inter mört 3. Å andra sidan, mört är inte en klassisk "försöksdjur" för ekotoxikologi forskning på grund av sin storlek, lång generationstid (2-3 år att nå könsmognad), reproduktions stil; grupp lekande (avel) sker en gång om året, och det är svårt att identifiera hanar från honor (andra än underlekperioden). Dock har detta normalt gonochoristic arter varit mycket väl studerade i Storbritannien på grund av upptäckten att nedströms östrogena avloppsvattenutsläpp, hanfiskar uppvisade störningar till deras endokrinologi (t.ex. förekomst av kvinnospecifika vitellogenin i blodet) och histopatologi (ovotestes - utveckling av ägg i testiklarna och / eller kvinnliga reproduktiva kanaler) 5,6. Därför, som en framtida tillämpning av dessa protokoll, kan mört (eller liknande arter) vara ett användbart vilda kontrollarter som visar om verkliga förbättringar av avloppsvatten kvalitet (och minskad östrogenicitet) ses i floder som får avancerade behandlade avloppsvatten. De kan också användas i slutet av rörsystem för att övervaka tekniskt förbättrade utsläpp från pilotskaleanläggningar 7. När man överväger vilka arter ska användas i vid bedömningar vivo avlopps finns en avvägning mellan relativt snabba och kontrollerade tester med försöksdjur jämfört medlängre fält baserad, men mer miljö relevant, testning med inhemska arter. En sådan i bedömningar vivo är höga kostnader och bör endast ses som den sista uppsättningen av testerna bedömningar med hjälp av kemisk analys och in vitro-analyser.

    Kritiska steg i protokollen omfattar beredning och hantering av prover och glas (dvs flaskor och provtagningsutrustning bör förbehandlas med lämpligt ytaktivt rengöringsmedel) för att undvika kontaminering av prover från miljöföroreningar, inklusive att begränsa kontakten mellan prover med plast och andra material som kan ge falska positiva. Detta är lika viktigt när man utformar och bygga akvarier och fiskexponeringssystem. Helst akvarier (bostadslager och under exponering) bör byggas av material med låg adsorption 32 med minimal föroreningsrisk. Rostfritt stål kan användas för avloppsvatten eller vattenhållande tankar.Medan tankar i en glaskonstruktion är att föredra för akvarier (som detta ger också lätt observation av fisk). Användningen av låga rör eller slang plast bör undvikas 32, PVC 34 och ABS kan användas om "rätt kryddat", det vill säga vänster att laka ut eventuella föroreningar i rinnande utspädning vatten i minst 12 timmar före användning. Medicinsk kisel slang har använts med framgång i vår anläggning för peristaltisk pump leverans av kemikalier och avloppsvatten / späd vatten tankar. Samt med tanke på östrogena förorening i konstruktion och drift av vattensport systemet, är det också viktigt att tänka på kosten för fisk, många proprietyen fisk livsmedel har visat sig vara östrogena för fisk. Därför är det viktigt att testa alla livsmedel för aktivitet (t.ex. i jäst Östrogen Screen Se Beresford et al. 14) innan du använder dem i den här typen av studier.

    Felsökningav den kemiska analysen eller JA analysprotokoll som beskrivs förenklas om kvalitetssäkring prover inklusive flera resor, laboratorium och lösningsmedelsämnen analyseras tillsammans positiva kontroller och verkliga prover för att eliminera falskt positiva och falskt negativa resultat. Positiva (t.ex. EE2) och negativa (utspädning endast vatten) kontroll bör också alltid användas i in vivo-analyser för att bekräfta känslighet förväntad biologisk biomarkör eller slutpunkt (dvs VTG eller histopatologi) och tillåta oväntad förorening som skall detekteras ( t.ex. från experimentell uppsättning upp, kost, eller utspädnings vatten). Eventuella ändringar i protokollet ska valideras innan någon studie.

    Med striktare reglering av östrogena föreningar kommer ut i miljön via WWTP avloppsvatten är det förutse att effektivare avloppsvattenbehandlingsteknik kommer att behöva utvecklas. Batteriet i tester som beskrivs i detta manuskript komplimangekotoxikologiska och kemiska tester utvärderings tillämpas normalt reningsverket utsläpp av avloppsvatten. Därför framtida tillämpning av denna typ av helhets batteri av tester bör göra det möjligt avloppsvatten teknikutvecklare och anläggningsoperatörer, genomföra de mest ekologiskt säkra konstruktioner överväger de bästa metoderna för att ta bort både specifika reglerade östrogena kemikalier och totala biologiska aktivitet.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Wellwash Versa plate washer Thermo Scientific 5165010
    Plate reader Molecular Devices SpectraMax 340PC
    Incubator Memmert INB 400 37 °C incubation required for carp assay
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Icemaker Scotsman AF80
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    ELISA kits Biosense Laboratories V01018401-096 (Fathead minnow)
    V01003402-096 (Carp)
    Microfuge tubes, 0.5 ml Alpha labs LW2372
    Microfuge tubes, 1.5 ml Alpha labs LW2375
    Sulphuric acid, 95-98% Sigma-Aldrich 258105
    Histology
    Tissue processor Leica Biosystems TP1020
    Wax dispenser Thermo Scientific Raymond Lamb E66HC
    Metal embedding mold Leica Biosystems Various
    Hot plate Thermo Scientific Shandon 3120063
    Cold plate (EG1150 C) Leica Biosystems 14038838037
    Heated forceps (EG F) Leica Biosystems 14038835824
    Microtome Leica Biosystems RM2235
    Paraffin section floatation  bath Electrothermal MH8517
    Slide drying bench Electrothermal MH6616
    Stainmate automated stainer Thermo Scientific Shandon E103/S10L
    Cassettes, Histosette II, biopsy Simport M493
    Paraffin wax Thermo Scientific Raymond Lamb W1
    Histo-Clear II National Diagnostics HS-202
    IMS (ethanol mix), IDA99 Tennants ID440
    Polysine adhesion slides Thermo Scientific Gerhard Menzel J2800AMNZ
    Cover slips, 22x50 mm VWR 631-0137
    Histomount National Diagnostics HS-103
    Haematoxylin Harris GURR VWR 351945S
    Eosin, 1%, aqueous Pyramid Inovation S20007-E
    Fisherbrand slide boxes Fisher Scientific 11701486
    Microtome blades, MB35 Thermo Scientific Shandon 3050835
    Bouin’s solution Sigma Aldrich HT10132-1L
    Yeast screen
    Flow cabinet Labcaire Systems Ltd SC12R
    Cooled incubator LMS Cooled Incubator 303
    Incubator Memmert INB 400
    Shaker Grant PSU-10i
    Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
    Plate shaker Heidolph Titramax 100 544-11200-00
    12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
    12-channel pipette, electronic Sartorius 735441
    96-well flat-bottom microplates MP Biomedicals
    Thermo Scientific Nunc
    Sarstedt
    76-232-05
    260860
    82.1581.001
    We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
    HPLC grade water Rathburn RH1020
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    Potassium phosphate monobasic anhydrous Sigma-Aldrich P-5655
    Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A-2939
    Potassium hydroxide, pellets Sigma-Aldrich P-1767
    Magnesium sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich M-2643
    Iron(III) sulfate Sigma-Aldrich 307718
    L-Leucine Sigma-Aldrich L-8912
    L-Histidine Sigma-Aldrich H-6034
    Adenine Sigma-Aldrich A-2786
    L-Argenine, hydrochloride Sigma-Aldrich A-6969
    L-Methionine Sigma-Aldrich M-5308
    L-Tyrosine Sigma-Aldrich T-8566
    L-Isoleucine Sigma-Aldrich I-7403
    L-Lysine, hydrochloride Sigma-Aldrich L-8662
    L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P-5482
    L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G-8415
    L-Valine Sigma-Aldrich V-0513
    L-Serine Sigma-Aldrich S-4311
    Thiamine, hydrochloride Sigma-Aldrich T-1270
    Pyridoxine Sigma-Aldrich P-5669
    D-Pantothenic acid, hemicalcium salt Sigma-Aldrich P-5155
    Inositol Sigma-Aldrich I-5125
    D-Biotin Sigma-Aldrich B-4639
    D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers Sigma-Aldrich G-7021
    L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A-4534
    L-Threonine Sigma-Aldrich T-8441
    Copper(II) sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich C-1297
    Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 10884308001
    Glycerol Sigma-Aldrich G-2025
    17 β-Estradiol Sigma-Aldrich E-8875
    Steroids
    Acetone Rathburn
    Acetonitrile Rathburn
    Ammonia solution Rathburn
    Ethylacetate Rathburn
    Copper(II) nitrate Sigma-Aldrich
    Acetone Rathburn
    Dichloromethane Rathburn
    2,4,16,16-d4-17β-estradiol CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-estrone CDN Isotopes
    2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol CDN Isotopes
    17β-estradiol Sigma-Aldrich
    Estrone Sigma-Aldrich
    17α-ethynyl oestradiol Sigma-Aldrich
    Hexane Rathburn
    Hydrochloric acid Sigma-Aldrich
    Methanol Sigma-Aldrich
    Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich
    Sodium hydroxide Sigma-Aldrich
    Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) Biotage
    Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) Biotage
    Fish study
    orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 Watson Marlow 982.0063.000
    straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 Watson Marlow 999.2008.000
    pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m Watson Marlow 913.A008.016
    200 series multi-channel persitaltic pump Watson Marlow 205CA
    Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) VWR SFM1-3250
    silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) VWR SFM1-5450
    2.5 L glass winchester pk 4 Fisher Scienctific BTF-505-050B
    magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 Fisher Scienctific FB55595 
    Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma Aldrich E10521-10G
    17α-Ethynylestradiol Sigma Aldrich E4876-100MG
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    SPE
    1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 Sigma Aldrich 57276
    disposable liners for manifold Sigma Aldrich 57059
    filtration tubes without frits 6 ml pk 30 Sigma Aldrich 57242
    reservior adaptors pk 12 Sigma Aldrich 57020-U
    stainless steel weight for manifold pk 4 Sigma Aldrich 57278
    male Luer plug for manifold pk 12 Sigma Aldrich 504351
    SPE Vacuum Manifold Sigma Aldrich 57265
    stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 Waters WAT054806
    Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50  Waters WAT020515
    Methanol HPLC grade 2.5 L Fisher Scientific M/4056/17
    7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 Fisher Scientific TUL-520-031K
    Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
    vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump Camlab 1136915

    References

    1. Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals. Toxicol. Lett. 211, (2012).
    2. Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35, (3), 462-470 (2001).
    3. Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66, (2), 272-281 (2002).
    4. Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166, (7), 418-426 (1996).
    5. Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32, (17), 2498-2506 (1998).
    6. Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
    7. Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46, (10), 5565-5573 (2012).
    8. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15, (3), 241-248 (1996).
    9. Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84, (10), 1512-1520 (2011).
    10. The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
    11. Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66, (2), 183-195 (2004).
    12. Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
    13. EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. British Standards Institute. London, UK. (2006).
    14. Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30, (5), 1139-1145 (2011).
    15. Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58, (1), 160-176 (2001).
    16. Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302, (1-3), 199-209 (2003).
    17. Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85, (1), 1-14 (2005).
    18. Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20, (2), 297-308 (2001).
    19. Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45, (3), 1015-1024 (2011).
    20. Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31, (6), 1396-1406 (2012).
    21. Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
    22. Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44, (11), 4348-4354 (2010).
    23. Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88, (8), 1008-1014 (2012).
    24. Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35, (9), 782-790 (2002).
    25. Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27, (9), 279-285 (1994).
    26. Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15, (9), 2339-2343 (2013).
    27. Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21, (1), 16-23 (2002).
    28. Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing. Paris. (2009).
    29. Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24, (7), 2030-2040 (2010).
    30. Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
    31. Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113, (6), 721-728 (2005).
    32. Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. OECD Publishing. Paris. (2009).
    33. Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. OECD Publishing. Paris. (2009).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter