Murine C1498 सेल लाइन और उसके एसोसिएटेड लेकिमिया माउस मॉडल निस्र्पक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल

Cancer Research
 

Summary

यह पांडुलिपि एक तकनीकी प्रक्रिया है कि इन विट्रो और तीव्र ल्यूकेमिया उनकी इंजेक्शन के बाद चूहों में प्रेरित में C1498 सेल संस्कृतियों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण से फ्लो, immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, cytochemistry और मई-Grünwald Giemsa धुंधला का उपयोग किया जाता है।

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Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (116), e54270, doi:10.3791/54270 (2016).

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Abstract

syngeneic या congenic चूहों में C1498 कोशिकाओं की नसों में इंजेक्शन के बाद से 1941 ये इंजेक्शन तीव्र ल्यूकेमिया के विकास में परिणाम प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, इस रोग की प्रकृति में अच्छी तरह से साहित्य में दर्ज़ नहीं किया गया है। यहाँ, हम इन विट्रो में C1498 कोशिकाओं निस्र्पक के लिए और इन विवो में प्रेरित ल्यूकेमिया की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए एक तकनीकी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रक्रिया के पहले भाग hematopoietic वंश और सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं के भेदभाव के मंच का निर्धारण करने पर केंद्रित है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric धुंधला hematopoietic सेल मार्कर पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, cytochemistry और एक मई-Grünwald Giemsa धुंधला तो myeloperoxidase की अभिव्यक्ति, esterases और सेलुलर आकृति विज्ञान की गतिविधि को क्रमश: आकलन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में प्रेरित किया है कि ल्यूकेमिया बीमारी का वर्णन करने के लिए समर्पित हैविवो। बाद के रक्त में लयूकेमिक और निहित कोशिकाओं की आवृत्तियों का निर्धारण करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, hematopoietic अंगों (जैसे, अस्थि मज्जा और तिल्ली) और गैर-लसीकावत् ऊतकों (जैसे, जिगर और फेफड़ों) विशिष्ट धुंधला का उपयोग और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती है। ल्यूकेमिया की प्रकृति तो अस्थि मज्जा में विशिष्ट esterases के लिए मई-Grünwald Giemsa धुंधला और धुंधला का उपयोग कर पुष्टि की है। यहाँ, हम परिणाम है कि उम्र से मिलान C1498- और पीबीएस इंजेक्शन चूहों में इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्राप्त किया गया प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) hematopoietic माइलॉयड कोशिकाओं है कि परिपक्वता के विभिन्न चरणों में अवरुद्ध कर रहे हैं के अनियंत्रित प्रसार की विशेषता है। इस अनियंत्रण granulocytic, monocytic, एरिथ्रोसाइटिक या megaryocytic भेदभाव रास्ते 1 को प्रभावित कर सकते हैं। एएमएल कोशिकाओं अस्थि मज्जा में जमा है, बिगड़ा hematopoiesis, जो thrombopenia, lymphopenia और एनीमिया में परिणाम के लिए अग्रणी। लयूकेमिक कोशिकाओं को भी रक्त और गैर-लसीकावत् अंगों पर आक्रमण।

C1498 माउस मॉडल तीव्र ल्यूकेमिया के बाद से कैंसर की कोशिकाओं को 1941 में एक लयूकेमिक 10 महीने की उम्र में C57BL / 6 (एच -2 बी) महिला माउस से अलग थे के लिए एक मॉडल के रूप में दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है साहित्य खून में आक्रमण का वर्णन , hematopoietic अंगों (जैसे, प्लीहा और लिम्फ नोड्स) और गैर hematopoietic अंगों (जैसे, यकृत, फेफड़े, अंडाशय, और गुर्दे) अत्यधिक proliferative C1498 कोशिकाओं द्वारा करने के बाद वे एक में के माध्यम से इंजेक्ट किया गयाtravenous, चमड़े के नीचे या अतिसंवेदनशील चूहों 2-4 में इंट्रा-पेरिटोनियल मार्ग। हालांकि, इस माउस मॉडल प्रेरित करने के लिए या तो granulocytic 2,5 या myelomonocytic 6 ल्यूकेमिया की सूचना मिली थी। हाल ही में, 2002 में प्रकाशित एक अध्ययन murine NKT सेल ल्यूकेमिया 7 के रूप में कैंसर के इस प्रकार का वर्णन किया। इस प्रकार, साहित्य इस C1498 सेल लाइन की प्रकृति और संबद्ध ल्यूकेमिया यह चूहों में लाती है के विषय में अलग है। 70 के दशक - इन विसंगतियों मुख्य रूप से विस्तृत की कमी और कोशिकाओं के बारे में अद्यतन जानकारी प्रकाशित और सामान्य में लयूकेमिक रोग क्योंकि कई अध्ययनों 1950 में प्रदर्शन किया गया के कारण हैं।

यहाँ हम कैसे C1498 कोशिकाओं विशेषताएँ और है कि चूहों में उनकी नसों में इंजेक्शन से प्रेरित है लयूकेमिक रोग की प्रकृति का विश्लेषण करने का वर्णन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का पहला खंड है कि इन विट्रो में संवर्धित किया गया है C1498 कोशिकाओं का एक विवरण के लिए समर्पित है। फ्लोरोसेंट विरोधीसतह और intracellular hematopoietic मार्कर के खिलाफ निर्देशित शव प्रवाह cytometry का उपयोग कर अपने phenotype निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। myeloperoxidase की उपस्थिति immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, उनके hematopoietic वंश और भेदभाव चरण esterases की गतिविधि का आकलन करने के cytochemistry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, और मई-Grünwald Giemsa धुंधला प्रदर्शन किया गया था। C1498 कोशिकाओं तो चूहों में इंजेक्ट किया गया है, और तीव्र ल्यूकेमिया बीमारी है जो प्रेरित किया गया था इस पांडुलिपि के दूसरे खंड में वर्णित है। एक ही तकनीक आवृत्तियों और अस्थि मज्जा में लयूकेमिक और निहित कोशिकाओं, परिधीय रक्त, प्लीहा और गैर hematopoietic अंगों (जिगर और फेफड़ों) के phenotypes निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

इस प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और यहाँ प्रस्तुत डेटा शोधकर्ताओं ने नई चिकित्सकीय रणनीति के प्रभाव का आकलन करने में मदद मिलेगी। यह ल्यूकेमिया माउस मॉडल पहले से ही immunotherapy एक दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएन डी विभिन्न कैंसर कीमोथेरेपी दवाओं 8,9। उनकी प्रभावकारिता ट्यूमर बोझ और जीवित रहने की दरों के विकास के निर्धारण से मूल्यांकन किया गया था। इस प्रोटोकॉल उपचार के दौरान वितरण और लयूकेमिक और अन्य hematopoietic सेल आबादी के निर्वाह के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

पशु आवास और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं स्थानीय पशु की देखभाल नैतिक समिति द्वारा, CEEA.NPDC (समझौते no.512012) अनुमोदित किया गया है, और सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए फ्रेंच और यूरोपीय दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. C1498 सेल लाइन के इन विट्रो लक्षण वर्णन में

  1. C1498 कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति में
    1. तैयार पूरा RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) 1640 मध्यम भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 मिलीलीटर (एफबीएस), पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर जोड़कर (100 यू / एमएल) (100 माइक्रोग्राम / एमएल), 50 मिमी β-mercaptoethanol के 500 μl -streptomycin एन-2-hydroxyethylpiperazine-एन-2-ईथेन सल्फोनिक एसिड (HEPES) के 5 मिलीलीटर, गैर आवश्यक अमीनो एसिड के 5 मिलीलीटर और RPMI माध्यम के 500 मिलीलीटर के लिए सोडियम पाइरूवेट के 5 एमएल।
    2. पूरा RPMI में C1498 सेल लाइन के लिए आगे बढ़ें। pipetting द्वारा निलंबन में कोशिकाओं फसल, और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। 10 मिनट के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र, और superna को दूरउग्रवादी।
    3. 10 मिनट के लिए 350 XG पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (1x) समाधान, अपकेंद्रित्र के 20 मिलीलीटर जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    4. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) बफर के 10 मिलीलीटर (गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) पाउडर के 2.5 ग्राम और 2 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) पीबीएस समाधान की 500 मिलीलीटर में समाधान के एमएल) में कोशिकाओं Resuspend। एक थोमा सेल trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद चैम्बर गिनती का उपयोग कोशिकाओं की गणना करें।
  2. C1498 सेल लाइन की प्ररूपी लक्षण वर्णन immunostaining का उपयोग कर और प्रवाह cytometry विश्लेषण
    1. कोशिका की सतह धुंधला
      1. FACS बफर तैयार करें।
      2. 10 7 कोशिकाओं / एमएल FACS बफर में काटा कोशिकाओं को समायोजित करें और ट्यूबों प्रवाह cytometry में प्रत्येक धुंधला प्रयोग के लिए (100 μl में) 10 6 कोशिकाओं बांटना।
      3. निम्नलिखित एंटीबॉडी या उनके संबद्ध निर्धारण नियंत्रण FACS बफर में पतला के 100 μl के साथ कोशिकाओं लेबल:
        1. प्रपत्रअग्रदूत और विभेदित कोशिकाओं के arkers, विरोधी CD11b / विरोधी CD18 (1), विरोधी Ly-6G (1), विरोधी CD19, विरोधी B220 (2), विरोधी NK1.1, विरोधी के साथ कोशिकाओं लेबल CD49b, विरोधी सीडी 4 (1), विरोधी सीडी 8 (2), विरोधी CD3 (3), विरोधी CD21 / 35, विरोधी CD115 और विरोधी TCRVβ एंटीबॉडी।
        2. hematopoietic स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं मार्करों के लिए, विरोधी CD34 के संयोजन का उपयोग / विरोधी CD117 / विरोधी Sca -1, विरोधी CD150 / विरोधी CD117 / विरोधी Sca -1, विरोधी CD117 / विरोधी CD127 या विरोधी CD16 / 32 बायोटिन अकेले एंटीबॉडी।
        3. सेल कार्यों (जैसे, आसंजन, प्रतिजन प्रस्तुति, सह उत्तेजक अणुओं और रिसेप्टर्स) की मार्करों के लिए, विरोधी CD18 (2) / विरोधी CD11a, विरोधी MHC वर्ग मैं, विरोधी MHC वर्ग द्वितीय, विरोधी के साथ कोशिकाओं दाग CD31, विरोधी CD44, विरोधी CD80 बायोटिन, विरोधी CD86, और विरोधी CD274 एंटीबॉडी।
      4. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नलियों प्रवाह cytometry के सभी सेते हैं।
      5. दो बार 5 मिनट के लिए 350 XG पर प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 2 मिलीलीटर, सेंट्रीफ्यूज जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 100 μl जोड़ें और फ्लोरोसेंट streptavidin के 100 μl biotinylated संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए (1/100 1/200 के अंतिम कमजोर पड़ने के लिए FACS बफर में) जोड़कर माध्यमिक धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
      6. दो बार के रूप में निम्नानुसार कोशिकाओं को धो लें: FACS बफर के 2 मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब, 5 मिनट के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों को जोड़ने, और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      7. ठंड पीबीएस के 500 μl में कोशिकाओं resuspend और बर्फ पर कोशिकाओं की जगह एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग नलियों को कवर करने से उन्हें अंधेरे में रखते हुए। एक कोशिकामापी 10 का उपयोग परिणामों का विश्लेषण।
    2. intracellular धुंधला
      1. पीबीएस समाधान के 375 मिलीलीटर के लिए एक 4% paraformaldehyde (पीएफए) के समाधान के 125 मिलीलीटर जोड़कर निर्धारण बफर तैयार करें।
        नोट: एक हवादार हुड में एक हलचल प्लेट पर लगभग 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 4% पीएफए ​​के 500 मिलीलीटर, गर्मी पीबीएस समाधान के 400 मिलीलीटर तैयार करने के लिए। पीएफए ​​पाउडर के 20 ग्राम जोड़ें, और पीएच जुटानेजब तक पीएफए ​​भंग कर रहा है। समाधान, शांत 6.9 पीएच को समायोजित, और पीबीएस के साथ 500 मिलीलीटर मात्रा को बनाने के लिए अनुमति दें।
      2. सैपोनिन की 0.5 ग्राम और पीबीएस समाधान के 500 मिलीलीटर के लिए बीएसए की 0.5 ग्राम जोड़कर permeabilizing बफर तैयार करें।
      3. 10 7 कोशिकाओं / एमएल FACS बफर में काटा कोशिकाओं को समायोजित करें और ट्यूबों प्रवाह cytometry में प्रत्येक धुंधला प्रयोग के लिए कोशिकाओं (100 μl) के 10 6 वितरित। 5 मिनट के लिए 350 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      4. 1% पीएफए ​​समाधान के 200 μl में कोशिकाओं को ठीक करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      5. permeabilizing बफर के 2 मिलीलीटर 5 मिनट के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रत्येक ट्यूब को जोड़ने, और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। प्रत्येक ट्यूब बफर permeabilizing के 100 μl जोड़ें।
      6. उन्हें बफर permeabilizing में गिराए के बाद निम्नलिखित एंटीबॉडी या उनके इसी निर्धारण नियंत्रण के 100 μl के साथ कोशिकाओं लेबल: विरोधी CD3 (2) / विरोधी सीडी 8 (1), विरोधी CD3 (3) / एकएनटीआई-सीडी 4 (2), विरोधी CD107b और विरोधी CD3 (3) / विरोधी TCRVβ।
      7. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
      8. दो बार प्रत्येक ट्यूब बफर permeabilizing के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 5 मिनट के लिए 350 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      9. कोशिकाओं के लिए बफर permeabilizing के 100 μl जोड़ें। biotinylated संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए बफर permeabilizing में पतला फ्लोरोसेंट streptavidin के 100 μl जोड़कर माध्यमिक धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
      10. , प्रत्येक ट्यूब बफर permeabilizing के 2 मिलीलीटर जोड़ें 5 मिनट के लिए 350 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। यह कदम एक बार और दोहराएँ।
      11. ठंड पीबीएस के 500 μl में कोशिकाओं resuspend, और फिर अंधेरे में बर्फ पर कोशिकाओं की जगह। 10 कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग परिणामों का विश्लेषण।
  3. माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर एक सेल निलंबन की तैयारी
    1. धो 10 6 हेक्टेयरrvested C1498 कोशिकाओं (कदम 1.1.4 में प्राप्त) ठंड FACS के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार बफर, और ठंड FACS बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को कमजोर। बर्फ पर ट्यूबों रखें।
    2. डिस्पोजेबल कक्षों में स्लाइड पूर्व जुड़ी फिल्टर कार्ड के साथ प्लेस और एक cytocentrifuge में इन जगह है।
    3. प्रत्येक कक्ष और फिल्टर कार्ड के लिए FACS बफर के 100 μl जोड़ें, और कम से 4.52 x जी 2 मिनट के लिए उन्हें स्पिन।
    4. प्रत्येक कक्ष और फिल्टर कार्ड के लिए कोशिकाओं के 100 μl जोड़ें, और 2 मिनट के लिए 4.52 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
    5. ध्यान कक्षों से स्लाइड हटाने और उन्हें myeloperoxidase (1.4 कदम), esterases (1.5 कदम) या मई-Grünwald Giemsa (1.6 चरण) के साथ धुंधला हो जाना से पहले स्लाइड हवा सूखी।
  4. immunofluorescence के लिए myeloperoxidase धुंधला
    1. 2 मिनट के लिए समाधान है, और उसके बाद स्लाइड हवा सूखी एक ठंडा मेथनॉल में स्लाइड्स डुबो कर स्लाइड पर कोशिकाओं को ठीक करें: एसीटोन (1: 1)।
    2. , कोशिकाओं से युक्त स्लाइड के क्षेत्र के लिए तरल सीमित करने के लिए एक सीआई आकर्षितएक पानी से बचाने वाली क्रीम कलम का उपयोग कोशिकाओं के आसपास rcle।
    3. 10 मिनट के लिए ठंड पीबीएस समाधान के 200 μl में कोशिकाओं कुल्ला।
    4. 3% बीएसए / पीबीएस सामान्य गधा सीरम के 10 μl और शुद्ध विरोधी CD16 / 32 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त बफर के 200 μl में कोशिकाओं को ब्लॉक।
    5. विरोधी माउस myeloperoxidase (3% बीएसए / पीबीएस बफर में 20 माइक्रोग्राम / एमएल पतला) के 200 μl लागू करें। एक आर्द्रता चैम्बर में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
    6. ठंड 0.1% बीएसए / पीबीएस के 200 μl के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    7. विरोधी बकरी आईजीजी 3% बीएसए / पीबीएस बफर में 1/250 में पतला एंटीबॉडी के 200 μl लागू करें। एक आर्द्रता चैम्बर में आरटी पर 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    8. कोशिकाओं 3 बार 0.1% बीएसए / पीबीएस बफर के 200 μl के साथ और दो बार ठंड पीबीएस में धो लें।
    9. 1/1000 में आरटी पर 2 मिनट के लिए (1 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता के लिए) पीबीएस में पतला Hoechst के 200 μl के साथ सेल नाभिक दाग।
    10. पानी के साथ स्लाइड्स धो लें और उन्हें mountin से पहले हवा शुष्क करने की अनुमतिजी। कोशिकाओं के माध्यम 1 बढ़ते की एक बूंद लागू करें, स्लाइड पर एक कवर कांच के एक किनारे जगह है, और ध्यान से संदंश का उपयोग कोशिकाओं पर यह कम है। किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे-कवर कांच पर प्रेस।
  5. esterase cytochemistry
    नोट: पूर्व गर्म आरटी के लिए सभी अभिकर्मकों।
    1. लगानेवाला तैयारी
      1. साइट्रेट एसीटोन-संक्रामक (सीएएफ) समाधान तैयार करने के लिए, साइट्रेट समाधान के 2.5 मिलीलीटर, एसीटोन की 6.5 मिलीग्राम और एक कांच की बोतल 0.8 37 मिलीलीटर% formaldehyde जोड़ें। धीरे मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. Naphthol रूप-डी Chloroacetate esterase (सीएई) गतिविधि परख
      1. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म विआयनीकृत पानी।
      2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, डाई समाधान के 1 मिलीलीटर के लिए सोडियम नाइट्राइट समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे मिक्स और 2 मिनट के लिए खड़े हो जाओ। जोड़े पूर्व गर्म विआयनीकृत पानी की 40 मिलीलीटर, पीएच 6.3 बफर ध्यान केंद्रित करने के 5 मिलीलीटर और naphthol रूप-डी Chloroacetate समाधान के 1 मिलीलीटर। मिक्स और एक Coplin जार में स्थानांतरित।
      3. पर कोशिकाओं को ठीक करेंस्लाइड सीएएफ समाधान (कदम 1.5.1.1 देखें) के साथ 30 सेकंड के लिए (धारा 1.3 देखें), और विआयनीकृत पानी के साथ 45 सेकंड के लिए स्लाइड्स धो लें।
      4. समाधान है कि कदम 1.5.2.2 में तैयार किया गया था में स्लाइड स्थानांतरण, और एक आर्द्रता चैम्बर प्रकाश से सुरक्षित में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेते हैं।
      5. स्लाइड सूखी और फिर 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में विसर्जन के माध्यम से उन्हें कुल्ला।
      6. Hematoxylin समाधान की कुछ बूँदें जोड़ने और उन्हें 1 मिनट के लिए incubating द्वारा कोशिकाओं Counterstain।
      7. तटस्थ पानी (पीएच 7) के साथ स्लाइड्स धो लें और उन्हें हवा शुष्क करने की अनुमति। कोशिकाओं के लिए मध्यम 2 बढ़ते की एक बूंद लागू करें, स्लाइड पर एक कवर कांच के एक किनारे डाल दिया है और ध्यान से संदंश का उपयोग कोशिकाओं पर यह कम है। किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे-कवर कांच पर प्रेस।
    3. अल्फा-Naphthyl butyrate esterase (NBE) गतिविधि परख
      1. गर्म α-naphthyl butyrate उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस का हल।
      2. सोडियम लीख की एक गोली पतलाविआयनीकृत पानी की 6.25 मिलीलीटर में संस्कार।
      3. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, एक Pararosaniline समाधान के 1.5 मिलीलीटर 1.5 एक सोडियम नाइट्राइट गोली समाधान के मिलीलीटर और जोड़ें। धीरे मिक्स और समाधान के 5 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं। फॉस्फेट बफर समाधान के 40 मिलीलीटर के साथ समाधान अनुपूरक। ध्यान से 10 एन NaOH dropwise जोड़कर 6 पीएच को ले आओ। , Α-naphthyl butyrate समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें पूरे समाधान का मिश्रण है, और यह एक Coplin जार में स्थानांतरित।
      4. आरटी पर सीएएफ समाधान का उपयोग कर 10 सेकंड के लिए स्लाइड पर कोशिकाओं को ठीक करें और विआयनीकृत पानी के साथ 45 सेकंड के लिए कुल्ला।
      5. स्थानांतरण समाधान है कि कदम 1.5.3.2 में तैयार किया गया था और एक आर्द्रता चैम्बर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक साथ सेते प्रकाश से सुरक्षित है, जबकि युक्त Coplin जार में स्लाइड।
      6. तटस्थ पानी में 2 मिनट (पीएच 7) और हवा शुष्क के लिए स्लाइड कुल्ला।
      7. स्लाइड पर कुछ बूँदें जोड़कर Methylene नीले समाधान के साथ कोशिकाओं Counterstain और 4 मिनट के लिए सेते हैं।
      8. deio में विसर्जित स्लाइड2 मिनट के लिए nized पानी और उन्हें हवा शुष्क करने की अनुमति। स्लाइड माउंट करने के लिए, कोशिकाओं के लिए मध्यम 2 बढ़ते की एक बूंद लागू होते हैं, स्लाइड पर कवर कांच के एक किनारे जगह है, और ध्यान से संदंश का उपयोग कोशिकाओं पर यह कम है। किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे-कवर कांच पर प्रेस।
  6. मई-Grünwald Giemsa (MGG) धुंधला
    1. 3 मिनट के लिए मई-Grünwald समाधान युक्त एक Coplin जार में स्लाइड्स डुबो कर कोशिकाओं (धारा 1.3 में तैयार) दाग।
    2. 1 मिनट के लिए 6.8 पीएच बफर समाधान युक्त एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण।
    3. उन्हें 10 मिनट के लिए Giemsa आर समाधान (पीएच 6.8 बफर समाधान में 1/20 को पतला) युक्त एक Coplin जार में रखकर स्लाइड दाग। 10 सेकंड के लिए तटस्थ पानी (पीएच 7) के साथ स्लाइड्स धो लें।
    4. नाली और स्लाइड हवा सूखी। कोशिकाओं पर मध्यम 2 बढ़ते की एक बूंद को लागू करने से स्लाइड माउंट। कवर कांच के एक किनारे स्लाइड पर रखें और ध्यान से उस पर कमकोशिकाओं के लिए संदंश का उपयोग। किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे-कवर कांच पर प्रेस।

2. विवो विकास में और तीव्र लेकिमिया की विशेषता

नोट: चार सप्ताह पुराने महिला congenic C57BL / 6J-Ly5.1 चूहों (एक बाँझ वातावरण में, यानी) विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा गया। चूहों इंजेक्शन थे जब वे 5 और 6 के बीच सप्ताह पुराने थे।

  1. C1498 कोशिकाओं के साथ नसों में इंजेक्शन
    1. pipetting द्वारा निलंबन में सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं फसल। 10 मिनट के लिए 350 XG पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण। दो बार ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो लें, और पीबीएस में 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन तैयार करते हैं। बर्फ पर सेलुलर निलंबन इंजेक्शन के प्रदर्शन से पहले रखें।
    2. एक restrainer में माउस प्लेस और एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं।
    3. में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए एक सिरिंज के साथ एक 29G सुई का प्रयोग करेंपूंछ नस। बाहर अंत में पूंछ समझ, और एक धुंध स्पंज 70% इथेनॉल में भिगो के साथ यह कीटाणुरहित। यकीन सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि होने की जाँच करें, और फिर धीरे धीरे पूंछ नस में (10 6 कोशिकाओं) C1498 सेल निलंबन के 100 μl इंजेक्षन।
    4. इंजेक्शन के बाद, पूंछ से सुई को हटाने, और इंजेक्शन स्थल पर एक बाँझ धुंध स्पंज के साथ लागू करने का दबाव द्वारा किसी भी खून बह रहा नियंत्रित करते हैं। अपने पिंजरे में पशु लौटें, और ध्यान से अगले घंटे और दिन भर में अपने स्वास्थ्य की जाँच करें।
  2. रेट्रो कक्षीय रक्त संग्रह
    1. लयूकेमिक रोग (जैसे, piloerection, समूह से अलगाव, और कम या पिंजरे में कोई आंदोलनों) के संकेत के लिए PBS- और C1498 इंजेक्शन चूहों के व्यवहार पर नजर रखने।
      ध्यान दें: यह आमतौर पर 17 से 19 दिनों के बीच होता है के बाद कोशिकाओं इंजेक्शन हैं।
    2. सिर्फ इच्छामृत्यु से पहले रेट्रो कक्षीय रक्त संग्रह प्रदर्शन करना एक लामिना का प्रवाह में बाँझ शर्तों के तहत (कदम 2.2.7 देखें)डाकू और एक हीटिंग दीपक के तहत हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए।
    3. संज्ञाहरण के लिए, 10 मिलीग्राम / किग्रा से कम 150 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine पर ketamine का उपयोग करें। पीबीएस समाधान के 18 मिलीलीटर में xylazine की ketamine के 1.5 मिलीग्राम और 0.5 मिलीलीटर गिराए द्वारा संवेदनाहारी समाधान तैयार है।
    4. नियंत्रण और लयूकेमिक चूहों anesthetize। एक intraperitoneal और 1 मिलीलीटर सिरिंज प्रति एक 26G सुई का उपयोग माउस के 10 ग्राम संवेदनाहारी समाधान के 200 μl के इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें। पेडल पलटा के नुकसान के लिए जाँच करें संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए।
    5. आंख की औसत दर्जे का नेत्रकोण में एक केशिका ट्यूब डालें। रक्त केशिका ट्यूब में कक्षीय साइनस से वृद्धि होगी। धीरे एक बाँझ धुंध स्पंज के साथ आंख पर दबाव लागू करने से खून बह रहा है नियंत्रण।
      नोट: खून की 100 से 200 μl की एक मात्रा इस तकनीक का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है।
    6. एक EDTA ट्यूब में रक्त ले लीजिए, और mononuclear कोशिकाओं को अलग करने से पहले बर्फ पर नमूना संग्रहीत करते हैं।
    7. ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग माउस euthanize, औरअंगों (धारा 2.3) को अलग-थलग करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. अंगों और कोशिकाओं अलगाव
    1. अंग अलगाव
      1. एक प्लास्टिक बोर्ड पर अपनी पीठ पर euthanized माउस प्लेस और अंग अलगाव की सुविधा के लिए जानवर के पैरों पिन करने के लिए सुइयों का उपयोग करें। माउस एक चीरा प्रदर्शन से पहले 70% इथेनॉल का उपयोग कीटाणुरहित।
      2. बाँझ कैंची का प्रयोग, गर्दन को पेट की त्वचा से एक उदर चीरा प्रदर्शन करते हैं। जिगर का उपयोग करने के लिए पेट की दीवार के माध्यम से कट। रिब पिंजरे और फेफड़ों का उपयोग करने के डायाफ्राम के माध्यम से कट। पक्ष को आंत ले जाएँ और तिल्ली बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग कर हटा दें।
      3. अस्थि मज्जा को अलग-थलग करने के लिए, संयुक्त बाँझ कैंची का उपयोग करके उपरोक्त femurs के शीर्ष पर पैर काट दिया। धीरे खींच कर फीमर से टिबिया काटना, और संदंश और कैंची का उपयोग हड्डियों से त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें।
      4. प्रत्येक अंग और ठंड पीबीएस युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में हड्डी की जगह, और बर्फ पर उन्हें जगह है।
    2. अंगों से कोशिकाओं का अलगाव
      1. कोशिकाओं में खलल न डालें से पहले तिल्ली वजन। यंत्रवत् एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक सिरिंज सवार का उपयोग कर एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से उन्हें दबाने से तिल्ली, फेफड़े और लीवर को बाधित, और ठंड पीबीएस के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं को इकट्ठा।
      2. अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए बर्फ पर एक पेट्री डिश में femurs और tibias रखा, बाँझ कैंची का उपयोग पांव काट, और एक 26G सुई एक 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के 5 मिलीलीटर युक्त सिरिंज से जुड़ी डालने से अस्थि मज्जा बाहर निकलवाने।
        1. सुई / सिरिंज के माध्यम से सेल निलंबन से गुजर रहा अस्थि मज्जा कोशिकाओं को बाधित, और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर।
      3. अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 350 XG पर अंगों और अस्थि मज्जा कोशिकाओं के प्रत्येक युक्त ट्यूबों के सभी। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और कोशिकाओं 2 (1x) सेल बफर के मिलीलीटर और फेफड़ों में और अस्थि मज्जा से एकत्र resuspendधीरे मिश्रण के ऊपर और नीचे pipetting द्वारा lysis बफर (1x) के 5 मिलीलीटर में जिगर और तिल्ली से अलग रहा है। ठंड पीबीएस के साथ 50 एमएल के लिए ट्यूबों भरें।
      4. 10 मिनट के लिए 350 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। फ्लो का विश्लेषण के लिए FACS बफर में कोशिकाओं resuspend या माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए। उन्हें trypan नीले रंग के साथ धुंधला के बाद एक थोमा सेल गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  4. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अंगों से अलग कक्षों की कोशिका की सतह धुंधला
    1. ट्यूब एक प्रवाह cytometry, लेबल 10 6 कोशिकाओं है कि शुद्ध विरोधी CD16 / 32 FACS बफर के 100 μl में एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ अंगों से अलग थे में।
    2. 10 6 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के लिए, निम्न एंटीबॉडी या संयोजन एंटीबॉडी की और उनके इसी निर्धारण नियंत्रण FACS बफर में पतला के 100 μl जोड़ें: विरोधी CD11b / विरोधी CD3 (1) / विरोधी Ly6C / विरोधी Ly6G (2), विरोधी B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, विरोधी CD115 / विरोधी CD3 (1) / एकतिवारी Ly6C / विरोधी Ly6G (2), विरोधी CD45.2, विरोधी Ly6G (2), विरोधी CD11b, विरोधी CD115 या अकेले मुआवजा सेटिंग्स के लिए विरोधी CD19।
    3. (विरोधी CD11b / विरोधी CD3 (1) / विरोधी Ly6C / विरोधी Ly6G (2), एंटी-B220 का एक संयोजन 1: splenocytes करने के लिए, FACS बफर में पतला निम्नलिखित एंटीबॉडी के 100 μl और उनके इसी निर्धारण नियंत्रण जोड़ने ) /anti-CD45.2/anti-CD19, विरोधी CD45.2, विरोधी Ly6G (2), विरोधी CD11b या मुआवजा सेटिंग्स के लिए विरोधी CD19।
    4. फेफड़े और यकृत कोशिकाओं के लिए, विरोधी CD45.2 एंटीबॉडी के 100 μl और अपनी इसी निर्धारण FACS बफर में 1/100 में पतला नियंत्रण जोड़ें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेल समाधान के सभी सेते हैं।
    6. प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 350 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला discarding। यह कदम एक बार और दोहराएँ।
    7. ठंड पीबीएस के 500 μl में लेबल की कोशिकाओं Resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें और एसी के लिए प्रवाह cytometry प्रदर्शन से पहले प्रकाश से सुरक्षितquisition और विश्लेषण 10।
  5. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए रक्त कोशिकाओं mononuclear और immunofluorescent धुंधला का अलगाव
    1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, पूर्व गर्म आरटी को अलग समाधान।
    2. एक microcentrifuge ट्यूब में, और पीबीएस / 1 मिमी EDTA समाधान जोड़ने जब तक समाधान मात्रा 500 μl है, खून का नमूना (2.2 कदम से प्राप्त 100 से 200 μl) हस्तांतरण। ध्यान से समाधान रक्त एक 30G सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग युक्त तहत समाधान को अलग करने के 500 μl परत। रक्त और अलग समाधान मिश्रण नहीं है।
    3. आरटी पर 20 मिनट के लिए 800 XG (ब्रेक के बिना) पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। बाद centrifugation, सेलुलर अंगूठी (अपारदर्शी सफेद परत) एक पिपेट का उपयोग कर इकट्ठा। एक microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
      नोट: अपारदर्शी सफेद परत लिम्फोसाइटों के साथ ही monocytes में शामिल है और निचले स्तर के बीच दिखाई देता है - अलग समाधान - और ऊपरी परत।
    4. 1 मिलीलीटर जोड़ेंपीबीएस समाधान, और सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 350 XG पर ट्यूब की। FACS बफर के 600 μl में कोशिकाओं Resuspend।
    5. शुद्ध विरोधी CD16 / 32 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम / एमएल (100 μl प्रत्येक) जोड़ें और छह अलग ट्यूबों में सेल निलंबन के 100 μl वितरित।
    6. निम्नलिखित एंटीबॉडी या उनके संबद्ध निर्धारण नियंत्रण FACS बफर में पतला के 100 μl के साथ कोशिकाओं लेबल: विरोधी CD3 (1) / एंटी-B220 (1) /anti-CD45.2 और विरोधी Ly6C / विरोधी CD115 का एक संयोजन /anti-CD45.2 या विरोधी CD45.2 और अकेले मुआवजा सेटिंग्स के लिए एंटी-CD115।
    7. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों के सभी सेते हैं।
    8. प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, और फिर 350 XG पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और एक पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. 500 μl ठंड पीबीएस में लेबल की कोशिकाओं Resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें और अधिग्रहण और विश्लेषण 10 प्रवाह cytometry प्रदर्शन से पहले प्रकाश से रक्षा की।
  6. माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर अस्थि मज्जा सेल निलंबन की तैयारी
    1. कदम धारा 1.3 में वर्णित का पालन करें, लेकिन कदम 1.3.1 में, 10 5 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं, कोशिकाओं प्रत्येक कक्ष में 72.26 XG पर 10 मिनट के लिए उपयोग करते हैं, और कदम 1.3.4 में स्पिन।
  7. Esterase गतिविधि assays अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उपयोग
    1. अस्थि मज्जा esterase cytochemistry assays के प्रदर्शन करने के लिए, कदम 1.5.3.7 1.5 से आगे बढ़ें।
  8. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के मई-Grünwald Giemsa धुंधला
    1. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं दाग, प्रोटोकॉल 1.6 खंड में वर्णित का पालन करें, लेकिन कदम 1.6.1 में, 5 मिनट के लिए मई-Grünwald समाधान में स्लाइड्स सेते हैं।

Representative Results

C1498 माउस मॉडल को चिह्नित करने के लिए, हम दो बड़े कदम के साथ रवाना हुए। सबसे पहले, C1498 कोशिकाओं इन विट्रो में उनकी hematopoietic वंश और परिपक्वता चरण (चित्रा 1) निर्धारित करने के लिए विशेषता थे। इन कोशिकाओं को फिर congenic चूहों में इंजेक्शन थे, और प्रेरित लयूकेमिक रोग की प्रकृति विभिन्न सुविधाओं निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया गया था: लयूकेमिक सेल घुसपैठ, उनके phenotype, अस्थि मज्जा में hematopoietic कोशिकाओं की एक मात्रा का ठहराव (परिपक्व और पूर्वज / व्यापारियों), आवृत्तियों C1498 कोशिकाओं और रक्त में परिपक्व hematopoietic कोशिकाओं और अंगों में सूजन का मूल्यांकन (तिल्ली, जिगर में, और फेफड़ों) और सेलुलर संरचना की।

इन विट्रो में C1498 सेल phenotypes को चिह्नित करने के लिए, कोशिकाओं है कि hematopoietic व्यापारियों और परिपक्व कोशिकाओं (1 टेबल) द्वारा व्यक्त कर रहे हैं अणुओं के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे, और परिणाम प्रवाह cytomet का उपयोग कर विश्लेषण किया गयाry। C1498 कोशिकाओं मैक-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%) की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे, और वे CD3ε, टी सेल रिसेप्टर (TCR) Vβ चेन और मैक के intracellular अभिव्यक्ति प्रदर्शित किया -3 (आंकड़े 2A और बी)। कोशिकाओं कोशिका की सतह मार्करों Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, सीडी 4, सीडी 8, NK1.1, और पैन-एन के अणुओं के लिए नकारात्मक रहे थे और सीडी 4 और सीडी 8 के intracellular अभिव्यक्ति के लिए (नहीं दिखाया डेटा) । वे तो hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और progenitors (तालिका 1) के मार्करों के लिए जांच की गई। उन्होंने यह भी CD117, CD34, SCA-1, CD150 और CD16 / 32 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक रहे थे (डेटा) नहीं दिखाया। ये लयूकेमिक कोशिकाओं तो आसंजन, प्रतिजन प्रस्तुति और सह उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया गया। कोशिकाओं की सतह मार्करों LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), और एच 2 डी बी व्यक्त की और MHC वर्ग द्वितीय के लिए नकारात्मक रहे थे, CD80, CD86 और CD274 (डेटा) नहीं दिखाया। C1498 कोशिकाओं टीherefore दोनों माइलॉयड (मैक -1, मैक-3) और लसीकावत् मार्कर (B220, CD3, TCR) व्यक्त किया।

बेहतर उनके hematopoietic वंश को चिह्नित करने के लिए, myeloperoxidase अभिव्यक्ति immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। कोशिकाओं के सभी myeloperoxidase, जो उनके माइलॉयड मूल (चित्रा 3 ए) सत्यापित लिए सकारात्मक थे। कोशिकाओं का बहुमत भी α-naphthyl butyrate esterases (चित्रा 3 बी, बाएं पैनल) के लिए सकारात्मक दाग, और उनमें से कुछ के रूप में naphthol-डी Chloroacetate esterases (काला तीर) (चित्रा 3 बी, सही पैनल) के लिए दाग। परिणामों से संकेत मिलता है कि कोशिकाओं monocytic और granulocytic कोशिकाओं का मिश्रण होता है। बाद मई-Grünwald Giemsa धुंधला प्रदर्शन किया गया था, C1498 कोशिकाओं को एक उच्च Nucleo-cytoplasmic अनुपात के साथ एक विस्फोट की तरह आकारिकी प्रदर्शित करने के लिए, नाभिक में 3 से 5 nucleoli, एक perinuclear हेलो, कई रिक्तिकाएं और एक Basophilic कोशिका द्रव्य (चित्रा -3 सी मनाया गया )। गुअमेरिका, C1498 सेल लाइन monoblasts और myeloblasts से बना है।

C1498 कोशिकाओं (CD45.2 +) तो नसों CD45.1 + चूहों में इंजेक्शन थे। चूहों आगे घुटने टेक दिए 17 से 19 दिनों के बाद कोशिकाओं को इंजेक्शन थे। इन चूहों बलिदान किया गया ताकि उनके ल्यूकेमिया प्रकार का विश्लेषण किया जा सकता है इससे पहले कि वे बीमारी से मृत्यु हो गई। चूहों पर नियंत्रण है, जो पीबीएस के साथ इंजेक्शन थे, तुलना के लिए एक ही समय बिंदुओं पर विश्लेषण किया गया। C1498 सेल इंजेक्शन चूहों उनके अस्थि मज्जा में C1498 कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर घुसपैठ दिखाया गया है, के रूप में कोशिकाओं के विस्फोट की तरह दिखने के द्वारा प्रदर्शन के बाद मई-Grünwald Giemsa धुंधला प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 4 क)। वे भी अपने monocytic और granulocytic phenotypes (चित्रा 4 बी और सी) संरक्षित, monoblastic और माईलोब्लास्टिक कोशिकाओं का एक संग्रह है कि तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया की विशेषता है का प्रदर्शन है।

विकास के लिएetermine कि क्या दिमाग़ी hematopoietic कोशिकाओं की संख्या, leukemic कोशिकाओं आक्रमण, CD45.2 + C1498 कोशिकाओं बी लिम्फोसाईटिक, monocytic और (पूर्वज, व्यापारियों और परिपक्व कोशिकाओं सहित) granulocytic आबादी निम्न कम थे immunofluorescent धुंधला और cytometry विश्लेषण मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह का उपयोग मात्रा गया। Leukemic कोशिकाओं hematopoietic कोशिकाओं का 36% करने के लिए 16 प्रतिनिधित्व किया (डेटा) नहीं दिखाया। अन्य प्रकार की कोशिकाओं सभी में काफी कम संख्या पीबीएस इंजेक्शन चूहों की तुलना में C1498 इंजेक्शन चूहों में (औसतन बी सेल सबसेट के लिए पेश किए गए 5 गुना से, granulocytic कोशिकाओं और औसतन 3 गुना के लिए औसत के आधार पर 4 गुना monocytic सबसेट के लिए) (सी चित्रा 5 ए)।

लयूकेमिक और नियंत्रण माउस के रक्त के नमूनों में mononuclear कोशिकाओं की आवृत्तियों की एक जांच से पता चला कि वे लिम्फोसाइटों (चित्रा 6A) के एक तुलनीय प्रतिशत लेकिन monocytic के एक उच्च आवृत्ति निहितऔर leukemic कोशिकाओं। इन विशेषताओं तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया 11 (चित्रा 6B) के प्रतिनिधि हैं।

तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया 12 की अन्य सुविधाओं के अलावा, C1498 इंजेक्शन चूहों में सूजन यकृत (हिपेटोमिगेली), फेफड़े और spleens (तिल्ली का बढ़ना) (चित्रा 7A) के साथ प्रस्तुत किया। CD45.2 + C1498 कोशिकाओं के विभिन्न आवृत्तियों immunofluorescent धुंधला का उपयोग कर इन अंगों में पता चला और विश्लेषण (चित्रा 7B) प्रवाह cytometry थे। के रूप में तिल्ली का बढ़ना घुसपैठ की monocytes की उच्च संख्या से परिणाम कर सकते हैं, हम भी प्लीहा आबादी के अनुपात का अनुमान है। Granulocytic सेल अंशों बी लिम्फोसाईटिक, monocytic में कोशिकाओं की संख्या में काफी बड़े थे 2 गुना की एक औसत से 2.5 गुना और 3 गुना, क्रमशः, नियंत्रण spleens (चित्रा 7C) की तुलना में लयूकेमिक spleens में।

पतली-पेज = "1"> आकृति 1
चित्रा 1। प्रोटोकॉल विट्रो संवर्धित C1498 सेल लाइनों में और तीव्र लेकिमिया के विवो विवरण में निस्र्पक के लिए स्थापित hematopoietic वंश और ऊतक सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं के भेदभाव चरण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पहले निर्धारित किया गया है। C1498 कोशिकाओं तो तीव्र ल्यूकेमिया के विकास के लिए प्रेरित करने के congenic चूहों में इंजेक्शन थे। अस्थि मज्जा, परिधीय रक्त, तिल्ली, जिगर और फेफड़ों के ऊतकों के अलगाव आवृत्तियों, phenotypes और C1498 कोशिकाओं घुसपैठ के बाद रूपात्मक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए किया गया था। चतुर्थ: अंतःशिरा MGG:। मई-Grünwald Giemsa यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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संस्कृति। इन विट्रो डॉट भूखंडों और कोशिका की सतह (ए) और intracellular (बी) के histograms cytometry प्रतिनिधि प्रवाह के बाद C1498 प्रकोष्ठों के चित्रा 2. प्ररूपी विश्लेषण C1498 व्यक्त अणुओं है कि hematopoietic परिपक्व सेल भेदभाव के साथ जुड़े थे दिखाए जाते हैं। C1498 कोशिकाओं, संस्कृतियों से काटा धोया और लेबल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी कि कोशिका की सतह CD11b, CD18 और B220 मार्कर या उनके निर्धारण नियंत्रण के लिए विशिष्ट थे इस्तेमाल कर रहे थे। intracellular धुंधला के लिए, कोशिकाओं, तय permeabilized और मैक-3, CD3ε के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी, और TCR (टी सेल रिसेप्टर) Vβ चेन या उनकी निर्धारण नियंत्रण का एक आम मिलान का उपयोग कर लेबल रहे थे। विश्लेषण जीवित कोशिकाओं के साथ gating का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. कार्यात्मक और संवर्धित C1498 प्रकोष्ठों के रूपात्मक विशेषता। C1498 कोशिकाओं संस्कृतियों से काटा और माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर centrifuged थे। (ए) myeloperoxidase अभिव्यक्ति के लिए धुंधला immunofluorescence का उपयोग किया गया था। (बी) Cytochemical प्रतिक्रियाओं α-naphthyl butyrate esterase (NBE) और naphthol रूप-डी Chloroacetate esterase का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया (सीएई) C1498 कोशिकाओं में गतिविधियों। कोशिकाओं (सी) मई-Grünwald Giemsa (MGG) C1498 कोशिकाओं के धुंधला प्रत्येक लेबल जब भूरा और लाल, बैंगनी, बड़े साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं, क्रमश मनाया गया के लिए सकारात्मक माना जाता था।। प्रत्येक धुंधला प्रयोग के लिए, माइक्रोस्कोपी उद्देश्य बढ़ाई संकेत दिया है। प्रत्येक छवि तीन अलग-अलग प्रयोगों का प्रतिनिधि है।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. PBS- और अस्थि मज्जा में Morphologies C1498 इंजेक्शन चूहों। अस्थि मज्जा की कोशिकाओं PBS- और C1498 सेल इंजेक्शन चूहों से अलग और माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर centrifuged थे। (ए) मई-Grünwald Giemsa (MGG) धुंधला हो जाना। (बी ) α-naphthyl butyrate esterase (NBE) और (सी) के रूप में naphthol-डी Chloroacetate esterase (सीएई) कार्यों cytochemistry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। पैनल में, बैंड (अपरिपक्व) या खंडों (परिपक्व) न्यूट्रोफिल पीबीएस इंजेक्शन चूहों की तुलना में C1498 इंजेक्शन चूहों की अस्थि मज्जा में कम दिखाई दे रहे हैं। पैनल बी और सी का संकेत नियंत्रण अस्थि मज्जा में मनाया संख्या की तुलना में लयूकेमिक अस्थि मज्जा में monocytic और granulocytic कोशिकाओं का एक संग्रह था। सबसूक्ष्म विश्लेषण एक 100X बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. PBS- और दिमाग़ी आबादी के मात्रात्मक विश्लेषण C1498 इंजेक्शन चूहों। अस्थि मज्जा की कोशिकाओं PBS- और C1498 सेल इंजेक्शन चूहों से अलग और अनुमान के बाद सेल गिनती प्रदर्शन किया गया था रहे थे। अलग सेल आबादी की आवृत्तियों immunostaining और जीवित कोशिका गेटेड प्रवाह cytometry विश्लेषण के बाद निर्धारित किया गया है। (ए) बी सेल सबसेट शामिल CD19 + B220 + बी लिम्फोसाइटों (बी) में granulocytic कोशिकाओं परिपक्व करने के लिए समर्थक बी कोशिकाओं से चरणों में कोशिकाओं CD3 - और CD11b + Ly6G + प्रजातियों, जो व्यापारियों के लिए एक शामिल। एन डी अपरिपक्व और परिपक्व granulocytes (सी) monocytic सबसेट CD3 के रूप में परिभाषित किया गया है - CD115 + और monocyte चरणों परिपक्व करने के पूर्वज कोशिकाओं में शामिल थे। एन = 7 चूहों / समूह है, और डेटा ± SEM के साधन दिखा histograms के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। ***, पी <0.0001 और **, पी <0.01, अयुगल छात्र की टी परीक्षण PBS- और C1498 इंजेक्शन चूहों की तुलना। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा PBS- और mononuclear सेल सबसेट के 6. रक्त विश्लेषण C1498 इंजेक्शन चूहों। (ए) और टी बी लिम्फोसाइट प्रतिशत, के डॉट भूखंडों जो क्रमशः PBS- और C1498 में CD3 + और B220 + कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया cytometry प्रतिनिधि प्रवाह सेल के इंजेक्शन। और CD115 + Ly6C उच्च कोशिकाओं - चूहों (बी) C1498 लयूकेमिक और नियंत्रण में monocytic सेल आवृत्तियों (पीबीएस) चूहों CD115 + Ly6C का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया है। विश्लेषण जीवित कोशिकाओं gating द्वारा किया गया था। लयूकेमिक और नियंत्रण चूहों की तुलना करने के लिए, CD45.2 + C1498 कोशिकाओं बाहर रखा गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
लयूकेमिक और नियंत्रण चूहों में प्लीहा आबादी का 7 चित्रा आकलन। (ए) यकृत, फेफड़े और तिल्ली के प्रतिनिधि तस्वीरों लयूकेमिक चूहों में सूजन चूहों पर नियंत्रण की तुलना में। Spleens एकत्र किए गए थे और तौल, और splenocytes गिना रहे थे ऊतक विघटन के बाद। (बी) हिस्टोग्राम रचनाकार में लयूकेमिक सेल आवृत्तियों का प्रतिनिधित्वerent अंगों के बाद immunostaining CD45.2 + कोशिकाओं के लिए प्रदर्शन किया गया था और परिणाम प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण किया गया। (सी) प्लीहा बी, immunostaining के बाद granulocytic और monocytic सेल नंबर के अनुमानों और विश्लेषण gating प्रवाह cytometry लाइव CD19 + B220 की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया गया + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - और CD3 - CD11b + Ly6C उच्च कोशिकाओं। पैमाने फेफड़े, यकृत spleens और के लिए दिखाया सलाखों 1 सेमी से संकेत मिलता है। ।। एन = 5 - 8 चूहों / समूह है, और डेटा ± SEM के साधन के रूप में histograms में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं *, पी <0.05; **, पी = 0.0033, अयुगल छात्र की टी PBS- और तुलना परीक्षण C1498 इंजेक्शन चूहों कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल प्रकार झिल्ली या intracellular अणु
व्यापारियों और परिपक्व कोशिकाओं
एन.के. कोशिकाओं NK1.1 +, अखिल एन.के. +
NKT कोशिकाओं NK1.1 +, अखिल एन.के. +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 +
टी lymphocytes TCR Vbeta +, CD3 +, सीडी 4+, सीडी 8 +
बी कोशिकाओं व्यापारियों और बी लिम्फोसाइट B220 +, CD19 +, CD21 / 35 +
granulocytic व्यापारियों और granulocytes Ly6G +, मैक-1 +, CD11b +
monocytic व्यापारियों और monocytes / मैक्रोफेज CD11b +, मैक-1 +, मैक-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi
प्रोजेनिटर्स
multipotent progenitors CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-)
लसीकावत्-primed multipotent progenitors CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-)
आम लसीकावत् पूर्वज CD117lo Sca-1lo CD127 + (Lin-)
आम माइलॉयड progenitors CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- Sca-1-)
granulocyte बृहतभक्षककोशिका पूर्वज CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- Sca-1-)
megakaryocyte एर्य्थ्रोइद पूर्वज CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- Sca-1-)
Hematopoietic स्टेम सेल CD117 + Sca -1 + CD150 + (Lin- CD34-)

तालिका 1 Hematopoietic सेल प्रजातियों और भेदभाव का मार्करों।
सीडी: भेदभाव के क्लस्टर; लिन: परिपक्व कोशिकाओं के मार्कर; न्यूनतम:कम अभिव्यक्ति; अधिकतम: उच्च अभिव्यक्ति; int: मध्यवर्ती अभिव्यक्ति; एन.के.: प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं; TCR: टी-सेल रिसेप्टर।

Discussion

पिछले अध्ययनों में, C1498 सेल लाइन तीव्र granulocytic 5, myelomonocytic 6 या 7 NKT सेल ल्यूकेमिया के एक inducer के रूप में वर्णित किया गया था। हालांकि, साहित्य में ठोस डेटा या तो अनुपस्थित या अधूरा थे। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऐसे प्रवाह cytometry, immunofluorescence, MGG धुंधला और cytochemical assays के रूप में विभिन्न तकनीकों, सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और है कि चूहों में प्रेरित किया है के बाद वे इंजेक्शन हैं ल्यूकेमिया की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए उपयोग करता है।

जब हम immunostaining के बाद इन विट्रो सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं में phenotyped और प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन किया गया है, हम कुछ सीमाएं मनाया क्योंकि इन कोशिकाओं कुछ कोशिका की सतह hematopoietic मार्करों है कि पहले साहित्य 6.7 में वर्णित किया गया व्यक्त किया। हमारे परिणामों के साथ समझौते में, Labelle एट अल। प्रवाह cytomet का उपयोग कर C1498 कोशिकाओं पर परिपक्व TCR की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का पालन नहीं कियाRY धुंधला हो जाना। हालांकि, वे उन्हें विचार के लिए एक NKT सेल लाइन हो जाने के बाद वे CD3ε और TCRVβ8.2 mRNAs 7 का पता चला। हम यह भी कोशिकाओं (> 70%) के अधिकांश में TCRVβ चेन और CD3ε अणुओं के intracellular अभिव्यक्ति मनाया, लेकिन उनके hematopoietic प्रजातियों निर्धारित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि वहाँ भी था मैक 3 अणु के सहवर्ती intracellular अभिव्यक्ति।

Myeloperoxidase, MGG धुंधला और आकलन cytochemistry का उपयोग कर कार्यात्मक esterases विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया है कि C1498 सेल लाइन एक माइलॉयड मूल था और monoblasts और myeloblasts से बना था। इन परिणामों के मैक 3 + कोशिकाओं का प्रतिशत है कि धुंधला प्रवाह cytometry विश्लेषण में प्राप्त किया गया साथ सहमत थे। हालांकि मात्रात्मक नहीं, इन चरणों कुंजी प्रयोगों का प्रतिनिधित्व प्रदर्शन किया जाएगा। दरअसल, वे रहते हैं, अब तक, hematopoietic कोशिकाओं कि व्यक्त नहीं या एफ के वंश और भेदभाव चरण निस्र्पक के लिए सबसे अच्छा मौजूदा तरीकोंईडब्ल्यू विशिष्ट प्ररूपी मार्करों।

धुंधला प्रवाह cytometry congenic चूहों में तीव्र ल्यूकेमिया के विकास का प्रदर्शन C1498 कोशिकाओं नसों में इंजेक्शन थे के बाद के लिए मददगार थे। CD45.2 + C1498 कोशिकाओं है कि परिधीय रक्त और विभिन्न अंगों में घुसपैठ अलग थे, और उनके आवृत्तियों निर्धारित किया गया है। मात्रा का ठहराव भी immunophenotyping के बाद निहित दिमाग़ी और प्लीहा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। जब C1498 सेल phenotype अंगों में जांच की गई थी के रूप में वे कुछ hematopoietic मार्कर व्यक्त की सीमाओं का सामना करना पड़ा रहे थे (केवल एक उनमें से कुछ B220 + थे)। मनाया तीव्र ल्यूकेमिया की प्रकृति, मई-Grünwald Giemsa धुंधला और monocytic की गतिविधियों के एक विश्लेषण परिभाषित करने के लिए और granulocytic esterases अस्थि मज्जा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। नतीजे बताते हैं कि C1498 कोशिकाओं उनके माईलोब्लास्टिक और monoblastic आकृति विज्ञान और समारोह संरक्षित, myelomonocytic ल्यूकेमिया की शुरुआत खुलासा।

(जैसे, रक्त, अस्थि मज्जा, और तिल्ली कोशिकाओं) के सभी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए बचाने के लिये। कोई धुंधला से फ्लो या / और immunofluorescence प्रयोगों, एंटीबॉडी के संदर्भ, उनके भंडारण पुनः में मनाया जाता हैप्रशस्तियां और उनके dilutions जाँच की जानी चाहिए। सामग्री / उपकरण तालिका में निर्दिष्ट संदर्भों से फ्लो या immunofluorescence अनुप्रयोगों के लिए चयनित किया गया है। प्राथमिक / माध्यमिक एंटीबॉडी या उनके संयुग्मित fluorophores अनुचित भंडारण की वजह से उनकी गतिविधियों को खो सकता है (उदाहरण के लिए, प्रकाश या गर्मी के लिए जोखिम), अनुचित कमजोर पड़ने, व्यापक ठंड / विगलन या दूषित बफ़र्स का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि वे ठीक से काम कर रहे हैं। माउस अस्थि मज्जा या तिल्ली व्युत्पन्न कोशिकाओं है कि ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है का प्रयोग करें। उच्च पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को ठीक से धो रहे हैं और उच्च आर्द्रता (immunofluorescence के लिए) पर रखा है और एंटीबॉडी के रूप में निर्देश पतला कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ही एकाग्रता और कमजोर पड़ने का उपयोग सही ढंग से नमूने में पृष्ठभूमि के स्तर को निर्धारित करने के लिए। esterase cytochemistry प्रयोगों के लिए,अभिकर्मकों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शुद्ध माउस प्लीहा granulocytic (Ly6G +) और monocytic (CD115 +) कोशिकाओं से युक्त स्लाइड्स का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है।

प्रक्रिया इस अध्ययन में बताया गया है कि पता चला C1498 कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद चूहों में मनाया लयूकेमिक सुविधाओं के कई मानव तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया 11,12 के साथ आम पहचान साझा की है। आक्रमण leukemic कोशिकाओं परिपक्व और अपरिपक्व (progenitors और व्यापारियों) दिमाग़ी hematopoietic कोशिकाओं की कमी के परिणामस्वरूप। के रूप में monocytic कोशिकाओं रहे हैं C1498 कोशिकाओं, परिधीय रक्त में उच्च आवृत्ति (> 20%) में मौजूद हैं। हिपेटोमिगेली और तिल्ली का बढ़ना leukemic कोशिकाओं की घुसपैठ से परिणाम के लिए मनाया गया, और बी लिम्फोसाइट और माइलॉयड कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि भी तिल्ली का बढ़ना साथ देने के लिए मनाया गया। Thrombopenia भी जब ब्लड प्लेटलेट्स की संख्या एक रुधिर विश्लेषक का उपयोग अनुमान लगाया गया था मनाया गया।

यह शो थाn, इन विट्रो प्रयोगों में उपयोग करते हुए, C1498 कोशिकाओं सामान्य murine hematopoiesis घुलनशील कारकों 13 स्रावित द्वारा बाधित है। कई ट्यूमर माउस मॉडल में, अपरिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं (monocytic और granulocytic कोशिकाओं सहित) भी अस्थि मज्जा से तिल्ली, जहां वे विरोधी ट्यूमर विशेष टी सेल सक्रियण और प्रसार 14 को बाधित करने के लिए विस्थापित करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, hematopoietic कोशिकाओं में कमी है कि अस्थि मज्जा में मनाया गया तो hematopoiesis में और / या उनके उत्प्रवास से एक की कमी से हुई हो सकता था। यह बाद तंत्र परिधीय रक्त में monocytosis की उपस्थिति या तिल्ली में बढ़े माइलॉयड अंशों का अवलोकन समझा सकता है। यह भी बोधगम्य है कि इन कोशिकाओं में सुधार प्लीहा hematopoiesis से प्राप्त किया गया है हो सकता है। दरअसल, स्थिर राज्य शर्तों के तहत, प्लीहा बी कोशिकाओं के कुछ सबसेट की पहचान की गई परिपक्व बी के व्यापारियों लिम्फोसाइटों के रूप में 15। इसके अलावा, भड़काऊ शर्तों के तहत, मेडullary स्टेम और progenitors कोशिकाओं तिल्ली को स्थानांतरित करने के लिए परिपक्व monocytes 16 के उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल हमें तंत्र है कि ल्यूकेमिया के विकास में शामिल हैं, और अतिरिक्त कार्यात्मक रूप में अच्छी तरह के रूप में आणविक assays ऐसा करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए के बारे में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए अनुमति नहीं है। हालांकि, इन आंकड़ों तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया के नैदानिक ​​सुविधाओं के बारे में विस्तृत जानकारी शामिल है और मूल्यांकन करने और नए चिकित्सीय एजेंट के प्रभाव को समझने के लिए शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C1498 cell line ATCC TIB 49
C57BL/6J-Ly5.1 Charles River B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl
Cells culture reagents
2-Mercaptoethanol, Gibco ThermoFisher Scientific 21985
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10270
HEPES, Gibco (1 M) ThermoFisher Scientific 15630
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco   ThermoFisher Scientific 11140
Penicillin-Streptomycin, Gibco  ThermoFisher Scientific 15140
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) ThermoFisher Scientific 61870
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360
Flow cytometry staining reagents
anti-mouse B220 APC (1) ebiosciences 17-0452 clone RA3-6B2, final dilution 1/100
anti-mouse B220 biotin (2) ebiosciences 13-0452 clone RA3-6B2, 1/400
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) ebiosciences 48-0032 clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE (2) BD biosciences 555275 clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) ebiosciences 15-0031 clone 145-2C11, 1/100
anti-mouse CD4 APC (1) ebiosciences 17-0041 clone GK1.5, 1/500
anti-mouse CD4 PE (2) ebiosciences 12-0041 clone GK1.5, 1/200
anti-mouse CD8 biotin (1) ebiosciences 13-0081 clone 53-6.7, 1/100
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) ebiosciences 48-0081 clone 53-6.7, 1/500
anti-mouse CD11a biotin ebiosciences 13-0111 clone M17/4, 1/100
anti-mouse CD11b PE  ebiosciences 12-0112 clone M1/70, 1/200
anti-mouse CD16/32 biotin ebiosciences 13-0161 clone 93, 1/400
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking)  BD biosciences 553141 clone 2.4G2
anti-mouse CD18 biotin (1) ebiosciences 13-0181 clone M18/2, 1/100
anti-mouse CD18 FITC (2) ebiosciences 11-0181 clone M18/2, 1/50
anti-mouse CD19 PE ebiosciences 12-0193 clone 1D3, 1/200
anti-mouse CD21/35 PE ebiosciences 12-0211 clone 8D9, 1/50
anti-mouse CD31 PE ebiosciences 12-0311 clone 390, 1/100
anti-mouse CD34 eFluor660 ebiosciences 50-0341 clone RAM34, 1/20
anti-mouse CD44 PE BD biosciences 553134 clone IM7, 1/50
anti-mouse CD45.2 FITC  ebiosciences 11-0454 clone 104, 1/100
anti-mouse CD49b/Pan NK PE  BD biosciences 553858 clone DX5, 1/50
anti-mouse CD80 biotin ebiosciences 13-0801 clone 16-10A1, 1/200
anti-mouse CD86 biotin ebiosciences 13-0862 clone GL1, 1/200
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE ebiosciences 12-5989 clone M3/84, 1/40
anti-mouse CD115 PE ebiosciences 12-1152 clone AFS98, 1/100
anti-mouse CD117 eFluor450 ebiosciences 48-1171 clone 2B8, 1/100
anti-mouse CD127 PE ebiosciences 12-1271 clone A7R34, 1/100
anti-mouse CD150 APC ebiosciences 17-1501 clone 9D1, 1/20
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin ebiosciences 13-5982 clone MIH5, 1/200
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE ebiosciences 12-5981 clone D7, 1/100
anti-mouse Ly-6C APC ebiosciences 17-5932 clone HK1.4, 1/200
anti-mouse Ly-6G  (Gr-1) biotin (1) ebiosciences 13-5931 clone RB6-8C5, 1/400
anti-mouse Ly-6G FITC (2) ebiosciences 11-9668 clone 1A8, 1/50
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin ebiosciences 13-5999 clone 28-14-8, 1/50
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 ebiosciences 15-5321 clone M5/114.15.2, 1/1000
anti-mouse NK1.1 PE BD biosciences 557391 clone PK136, 1/50
anti-mouse TCRVb FITC BD biosciences 553170 clone H57-597, 1/50
streptavidin PE-Cy5 ebiosciences 15-4317    1/200
Immunofluorescence staining reagents
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody)  Santa Cruz Biotechnology sc-16129 1/10 (20 µg/ml)
 anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) Jackson Immunoresearch 705-076-147 1/250
Normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001
Hoechst solution BD Biosciences 561908 1/1000
Mounting medium 1 (Fluoromount)  Sigma-Aldrich F4680
Acetone VWR  20066
Methanol Merck Millipore 106009
Esterase cytochemical staining reagents
Naphtol AS-D chloroacetate solution Sigma-Aldrich 911
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) Sigma-Aldrich 912
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) Sigma-Aldrich 913
Sodium nitrite solution Sigma-Aldrich 914
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich GHS3
Acetone VWR  20066
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich F1635
α-naphthyl butyrate solution Sigma-Aldrich 1801
Phosphate buffer solution Sigma-Aldrich 1805
Sodium nitrite Tablet Sigma-Aldrich 1809
Pararosaniline solution Sigma-Aldrich 1804
Methylene blue solution Sigma-Aldrich 1808 1/10
mounting medium 2 (Clearmount) Invitrogen 00-8010
May-Grünwald Giemsa staining reagents
May-Grünwald solution RAL Diagnostics 320070
Giemsa R solution  RAL Diagnostics 320310    1/20
pH 6.8 buffer solution RAL Diagnostics 330368
Others materials, reagents and equipment
Ketamine 1000 (100 mg/ml) VIRBAC 3597132111010
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml) CEVA
Bovin albumin serum (BSA) powder ThermoFisher Scientific BP671
PBS solution (1x concentrate) ThermoFisher Scientific 14190
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich 158127
Saponin  Sigma-Aldrich 47036
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575
Separating solution (Pancoll Mouse) PANBIOTECH P04-64100
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10x) BD Biosciences 555899 1/10
NaOH 10 N ThermoFisher Scientific SS267
Trypan blue solution (0.4 %) ThermoFisher Scientific 15250-061 1/2
50 ml tube (Falcon) Fisher Scientific 14-432-22
70 µm Cell Strainer (Falcon)  Corning Life Sciences 352350
 Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) Thermo Scientific A78710003
Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm Knittel Glass VD1 2424 Y100
Slides (Starfrost - ground edges 90) Knittel Glass VS1137# 077FKB
EDTA Tube Greiner Bio-One 454034
Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube) Fisherbrand 1154-6963
26 G needle Terumo NN-2613R
 insulin syringe and needle 29 G Terumo BS05M2913
30 G needle  Becton & Dickinson 304000
Flow cytometry tubes (blue) Beckman Coulter 2523749
Water-repellent pen (Dakopen) Dako S200230
Sharp sterile scissors  Nessi-care SCI-01
Sterile forceps Dominique Dutscher 956506
Thoma cell counting chamber VWR 631-0397
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) ThermoFisher Scientific S33580A
Microcentrifuge tube (1.5 ml) ThermoFisher Scientific 05-408-129
Cylindrical Restrainer 15 - 30 gm Stoelting 51338
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge ThermoFisher Scientific
10 ml syringe Terumo SS-10L
1 ml syringe Terumo SS-01T
Ethanol Merck 1.08543
Sterile gauze sponges URGO 501580

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References

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