Cancer Research
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यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण
Chapters
Summary September 5th, 2019
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हम murine स्वस्थ hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) और ल्यूकेमिया कोशिकाओं घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) द्वारा संचालित के एक माउस मॉडल से mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के लिए मल्टीपैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन MLL-AF9.
Transcript
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां या आरओएस, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां हैं जो कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होती हैं, और उनके व्यवहार को प्रभावित करती हैं। हालांकि अतिरिक्त ROS भी व्यापक सेलुलर तबाही का कारण बन सकता है, और गंभीर मामलों में, सेल मौत । इस प्रकार, आरओएस होमोस्तासिस का रखरखाव सेलुलर कार्य और अस्तित्व के लिए मौलिक महत्व का है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, एक विशिष्ट प्रकार के आरओएस को मापने पर केंद्रित है, जो माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा उत्पन्न होता है, मुख्य रूप से लाइव, सामान्य, या स्वस्थ हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिका आबादी में मेटाबोलिक बाय-प्रोडक्ट के रूप में, साथ ही साथ रक्त कैंसर के माउस मॉडल से ल्यूकेमिया कोशिकाओं में, एक्यूट मायलॉयड ल्यूकेमिया या एएमएल। इस प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है कि जीन विलोपन या अतिअक्सरता जैसे आनुवंशिक हेरफेर, कई स्वस्थ और घातक हेमेटोपोइटिक आबादी में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस को कैसे प्रभावित करता है। और नतीजतन, संभावित रूप से रेडक्स राज्य और संभवतः कोशिकाओं के चयापचय के बारे में व्यावहारिक जानकारी प्रदान करते हैं।
यह तकनीक स्वस्थ और घातक हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक उप-आबादी में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन की निगरानी के लिए एक प्रोटोजेनिक जांच के प्रवाह व्यवस्थित मीट्रिक विश्लेषण को अधिकृत करती है। यह प्रोटोकॉल सीधा है और कुछ घंटों में पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, यह लाइव सेल विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और धुंधला के सतह निशान का उपयोग करते हुए, बोन मैरो में स्टेम सेल आबादी में माइटोकॉन्ड्रियल रोस को अलग करने और विश्लेषण करने की अनुमति देता है।
पांडुलिपि के अनुसार, जंगली तंग चूहों और ल्यूकेमिक एमएलएल-एएफ9 चूहों से मोनोन्यूक्लियर बोन मैरो कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, सेल निलंबन के 200 माइक्रोलीटर नौ एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों में से प्रत्येक में एलिकोट 200 माइक्रोलीटर। शेष कोशिकाओं को अन्य प्रयोगात्मक ट्यूबों में अलीकोट करें, प्रत्येक 200 माइक्रोलीटर। फिर एक अपकेंद्रित्र दो प्रयोगात्मक ट्यूबों में रखें जिसमें क्रमशः बोन मैरो कोशिकाएं और ल्यूकेमिक कोशिकाएं और एक नियंत्रण ट्यूब शामिल हैं।
पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर सेंट्रलाइज । इसके बाद, सुपरनैंट को कम करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक जीवित/मृत कोशिका दाग के साथ कमरे के तापमान एफ-पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
बाद में, तीन जीवित/मृत दाग ट्यूबों के लिए कमरे के तापमान एफ-पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई धुंधला के लिए एक एकल रंग नियंत्रण ट्यूब । ट्यूबों को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र में रखें। फिर, डीएमएसओ के 13 माइक्रोलीटर में 50 माइक्रोग्राम माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई को फिर से निलंबित करके 5 मिलीमोलर माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई स्टॉक समाधान प्राप्त करें।
फिर पांच माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में पतला करने के लिए 13 माइक्रोलीटर माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई में कमरे के तापमान एफ-पीबीएस के 13 मिलीलीटर जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो माइटोकॉन्ड्रियल एफ्लक्स पंपों को बाधित करने के लिए समाधान में 50 मिलीमोलर वेरापमिल के 13 माइक्रोलीटर जोड़ें। अपकेंद्रित्र से ट्यूब प्राप्त करें और लाइव/डेड सेल दाग के धोने से बाहर हो जाते हैं ।
लाइव/डेड स्टेनिंग कंट्रोल में एफ-पीबीएस के २०० माइक्रोलिटर जोड़ें और विश्लेषण शुरू करने के लिए तैयार होने तक इसे बर्फ में रखें । प्रत्येक प्रयोगात्मक ट्यूब के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल रोस स्टेनिंग कंट्रोल ट्यूब में वेरापामिल युक्त माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई दाग के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर मिश्रण और अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए ।
फिर नियंत्रण और प्रयोगात्मक ट्यूबों में कमरे के तापमान एफ-पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर ३०० बार जी पर पांच मिनट सेंट्रलाइज । सुपरनेट से एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को कमरे के तापमान एफ-पीबीएस के अतिरिक्त एक मिलीलीटर के साथ धोएं।
सेंट्रलाइज फिर से पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर, कमरे के तापमान पर । सबसे पहले, स्वस्थ और ल्यूकेमिया बोन मैरो कोशिकाओं के लिए दो एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। स्वस्थ अस्थि मज्जा कोशिकाओं युक्त प्रयोगात्मक ट्यूब से सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और ट्यूब में एंटीबॉडी कॉकटेल नंबर एक के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।
भंवर मिश्रण करने के लिए। एफ-पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर और संबंधित एंटीबॉडी के एक माइक्रोलीटर जोड़कर सिंगल कलर कंट्रोल ट्यूब तैयार करें। अंधेरे में बर्फ पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
ल्यूकेमिया बोन मैरो युक्त प्रायोगिक ट्यूब से सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और एंटीबॉडी कॉकटेल नंबर दो के 200 माइक्रोलीटर को ट्यूब में जोड़ें। भंवर मिश्रण करने के लिए। अंधेरे में बर्फ पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
उसके बाद, सभी ट्यूबों को 1 मिलीलीटर ठंड एफ-पीबीएस और सेंट्रलाइज के साथ कमरे के तापमान पर 300 गुना जी पर पांच मिनट के लिए धोएं। कोल्ड एफ-पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल सस्पेंशन को एग्रीगेट्स को छोड़कर 40 माइक्रोमीटर फिल्टर के साथ प्रत्येक फ्लो साइटोमीटर ट्यूब में ट्रांसफर करें।
सबसे पहले, प्रवाह साइटोमेट्री मशीन में एक नो स्टेन कंट्रोल ट्यूब डालें और प्रवाह साइटोमेट्री मशीन को क्षतिपूर्ति करने के लिए अधिग्रहण शुरू करें। अन्य नियंत्रण ट्यूबों के लिए दोहराएं। बाद में, फाटक स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक ट्यूब पढ़ें।
आकार और सेल आबादी की जटिलता का विश्लेषण करने के लिए, स्वस्थ एचएसपीसी के लिए पहले, आगे तितर बितर क्षेत्र और पक्ष तितर बितर क्षेत्र भूखंडों आबादी सेट । स्क्वायर गेट बटन दबाएं, आगे और साइड स्कैटर प्लॉट से बाहरी मलबे को गेट आउट करें। फिर, एक आगे तितर बितर क्षेत्र और ऊंचाई साजिश पर, डबल बाहर गेट करने के लिए एक डबल विवेचक का उपयोग करें ।
लाइव कोशिकाओं, वंश कम कोशिकाओं, और विभिन्न स्वस्थ एचएसपीसी का चयन करें। ब्याज की प्रत्येक आबादी के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल रोस सिग्नल में मतभेदों का मूल्यांकन करने के लिए, एक हिस्टाग्राम साजिश में टीआरपीई चैनल की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण करें। ल्यूकेमिया आबादी के लिए आकार विश्लेषण, गेटिंग और हिस्टोग्राम प्लॉटिंग की एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
अस्थि मज्जा स्वस्थ चूहों से अलग कोशिकाओं को एक जीवित/मृत डाई और एक माइटोकॉन्ड्रियल रोस डाई के साथ दाग रहे थे, और बाद में वंश मार्कर को पहचानने एंटीबॉडी के साथ दाग: प्लस CD48, सी किट, एससीए-1, CD34 और CD150 । इसके अलावा, ल्यूकेमिया चूहों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को भी CD45.1 के साथ दाग स्वस्थ प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा कोशिकाओं से MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए CD45.2 के साथ दाग थे । स्वस्थ सीडी 48 नकारात्मक एलएसके और माइलॉयड प्रोजेनिटर के बीच माइटोकॉन्ड्रियल रोस स्टेनिंग की तुलना से पता चलता है कि माइलॉयड प्रोजेनिटर माइटोकॉन्ड्रियल रोस स्टेनिंग के काफी उच्च स्तर प्रदर्शित करते हैं।
इसके अलावा, सी-किट उच्च ल्यूकेमिया जनक माइटोकॉन्ड्रियल रोस स्टेनिंग के काफी उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं, सी-किट मध्यवर्ती कम ल्यूकेमिया कोशिकाओं, स्वस्थ सीडी 48 नकारात्मक एलएसके और माइलॉयड जनकों की तुलना में। सी-किट मध्यवर्ती कम ल्यूकेमिया कोशिकाओं, भी CD48 नकारात्मक LSK कोशिकाओं की तुलना में एक काफी अधिक मूल्य प्रदर्शित किया है, लेकिन myeloid जनक के लिए नहीं । माइटोकॉन्ड्रियल रोस रंग अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए उचित धोने के कदम की आवश्यकता होती है कि निम्नलिखित चरणों को शुरू करने से पहले डाई की किसी भी अतिरिक्त को हटा दिया गया है।
लाइव हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में रेडक्स स्थिति के ज्ञान को प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जा सकते हैं, कई रासायनिक रूप से अलग रोस फ्लोरोजेनिक रंग हैं। इस तकनीक का बड़े पैमाने पर साहित्य में उपयोग किया गया है, और मेटाबोलिक और सिग्नलिंग रास्तों पर उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो ल्यूकेमिया कोशिकाओं में अलग-अलग विनियमित हैं, यदि उनके सामान्य समकक्षों के साथ तुलना की जाती है।
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