bir bis-iminoguanidinium ligand ile seçici kristalleştirme ile Sülfat Ayırma

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir bis (iminoguanidinium) ligand ve sülfat seçici olarak ayrılması kendi kullanım yerinde, sulu sentezi için bir protokol verilmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seipp, C. A., Williams, N. J., Custelcean, R. Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand. J. Vis. Exp. (115), e54411, doi:10.3791/54411 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Rekabetçi sulu çözeltilerden hidrofil oxoanions (örneğin, sülfat, kromat, fosfat) seçici ayrılması çevresel iyileştirme alaka, enerji üretimi ve insan sağlığı ile temel bir sorun teşkil etmektedir. 1,2 Sülfat özellikle sudan dolayı ayıklamak zor onun içsel isteksizlik kendi hidrasyon küresini döken ve daha az polar ortamlara göç ederler. 3. sulu sülfat çıkarma daha verimli yapma tipik sentezlemek ve genellikle zehirli maddeler ve çözücüler içeren arındırmak için zor ve sıkıcı olan karmaşık reseptörleri gerektirir. 4,5

Seçici kristalleşme sudan ayrılmasını sülfat için basit ama etkili bir alternatif sunuyor. 6-9 gibi Ba 2+, Pb 2+ veya Ra 2+ formu çok çözünmez sülfat tuzları gibi bazı metal katyonları, sülfat ayrılık kullanımları her zaman pratik olmamasına rağmen nedeniyle yüksek TOXI içinşehir ve bazen düşük seçicilik. sülfat precipitants organik ligantları kullanan, organik moleküllerin karakteristik tasarım yapısal farklılıkları ve amenability yararlanır. Sulu sülfat kristalizasyon için ideal bir organik ligand su içinde çözünür olması, ancak, nispeten kısa bir süre içinde ve iyonların yüksek konsantrasyonlarının varlığında, çözünmeyen sülfat tuzu ya da kompleks oluşturacaktır. Ayrıca, sentez ve geri dönüşüm kolay olmalıdır. Bu tür bir ligand, 1,4-benzen-bis (iminoguanidinium) (BBIG), kendi kendine bir araya iki ticari olarak temin edilebilir ön-maddeleri, tereptalaldehid ve aminoguanidinium klorür in situ, en son, sulu sülfat ayrılması son derece etkili olduğu tespit edilmiştir. 10 ligandı suda çözünür klorür formunda, ve seçici olarak kolayca basit bir filtreleme ile solüsyondan çıkarılabilir son derece çözünür bir tuza sülfat ile kristalize olur. BBIG ligandı sonra, deprotonasyon ile elde edilebilirqueous NaOH ve bir ayırma döngüsünün Lütfen, sulu HCI ile klorür formuna dönüştürülür, ve tekrar kullanılabilen nötr bis-iminoguanidine, kristalizasyonu. sudan sülfatın uzaklaştırılması bu ligandın etkinliği çözeltide kalan sülfat konsantrasyonu izleme anyonun eser miktarlarda doğru ölçümü sağlar daha gelişmiş bir teknik gerektirir artık önemsiz bir görev olduğu kadar büyüktür. Bu amaçla, β sıvı sintilasyon sayımı ile bağlantılı olarak radyo-etiketlenmiş 35S sülfat izleyici bir teknik yaygın sıvı-sıvı ekstre ayırımlar kullanılabilmektedir ve en son izleme sülfat kristalizasyon etkili olduğu gösterilmiştir, kullanılmıştır. 8

Bu protokol, in situ BBIG ligandının sentezi ve sulu çözeltilerden sülfat tuzu olarak kristalizasyonda tek kap gösterilmiştir. Ligandın 11 ex-situ sentezi da ortak olarak sunulmuşturKullanıma hazır olana kadar kristal formunda saklanabilir BBIG-Cl büyük miktarlarda üretimi için nvenient yöntemi. önceden hazırlanmış BBIG-Cı ligand kullanılarak deniz suyundan sülfat çıkarılması daha sonra gösterilmiştir. Son olarak, 35 S-etiketli sülfat ve deniz suyundaki sülfat konsantrasyonunun ölçülmesi için β sıvı sintilasyon sayımı kullanımı gösterilmiştir. Bu protokol, sulu anyon ayrılması için seçici kristalizasyon kullanımını keşfetmek geniş ilgilenenler için bir öğretici sağlamak için tasarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 1,4-benzen-bis (iminoguanidinium) klorid (BBIG-CI)

  1. Yerinde 1,4-benzen-bis (iminoguanidinium) Klorür Ligand (BBIG-Cl) sentezi ve sülfat ile olan kristalizasyonda
    1. Manyetik bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 25 mL yuvarlak tabanlı bir şişe içinde 0.067 tereptalaldehid g deiyonize su, 10 ml aminoguanidinium klorid, 0.5 M sulu çözelti, 2.2 ml.
    2. 20 ° C de dört saat süre ile manyetik olarak solüsyonu ilave edin. Bu BBIG-CI hafif san bir çözelti sağlayacaktır.
    3. sodyum sülfat 1 M sulu çözeltiden 0.5 ml ilave edilir. Bu kristalli beyaz bir katı olarak BBIG-SO 4 anında çökelti oluşturmasına neden olur.
    4. BBIG-SO 4 kurtarmak için katı kullanılarak vakum filtrasyonu Filtre. Saf sülfat tuzu elde etmek üzere filtre kağıdı üzerinde 5 ml su alikoları ile beş kez bir katı yıkayın.
    5. kristal BBIG-SO faz saflığını kontrol 12. Şekil 1 'de gösterilen model ile karşılaştır.
  2. 1,4-benzen-bis ex-situ N- (iminoguanidinium) Klorür 11
    1. tereptalaldehid 4 g ve 50 ml bir manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış yuvarlak tabanlı bir şişe içinde 20 ml etanol ile aminoguanidinium klorür 7.26 g ekleyin.
    2. Bir ocak gözünü kullanılarak 60 ° C için solüsyonu ısıtacak ve 2 saat için bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırılmıştır. 20 ° C'ye kadar çözelti soğutulur ve daha sonra, 3 saat oturup bir kağıt filtre donatılmış Buchner hunisinden vakumla süzme ile bir katı toplama sağlar.
    3. kaynayıncaya kadar bir ocak etanol ve ısı elde katı 20 ml Askıya. Katı toplandı ve bu noktada çözelti içine tamamen girmiyorsa tüm katı eriyene kadar, her seferinde kaynama ulaşmak için çözelti sağlayan etanol az miktar (1 mi) ilave edin.
    4. Şişe oda temperatu kadar soğumasını bekleyin, Daha sonra gece boyunca 0 ° C dondurucu içinde yer yeniden. Vakum filtrasyonu kullanılarak Buchner hunisi donatılmış bir filtre kağıdı içinden filtre edilerek bir katı toplamak.
    5. 1H NMR spektroskopisi 13 tarafından BBIG-Cl kimliğini ve saflığını onaylayın. Şekil 2'de gösterilen spektrum ile karşılaştırın.

Deniz Suyundan 2. Sülfat ayrılması

  1. BBIG-SO 4 olarak Sülfat kristalleşme
    Not: sülfat kaldırmak için gerekli BBIG-Cl miktarı deniz suyu sülfat miktarını tam olarak bağlıdır. Bu sülfat% 99 çıkarılması sülfat sonuçlara BBIG-Cı nisbetle 1.5 eşdeğer kullanılarak tespit edilmiştir. BaCl 2 ile titrasyon ile saptandığı haliyle, bu protokolde kullanılan deniz suyu, 30 mM sülfat bir konsantrasyona sahiptir.
    1. süspanse partikülleri ve biyo organizmaları çıkarmak için küçük bir gözenek boyutuna sahip olan bir 0.22 um şırınga filtresi ya da filtrasyon membranı ile deniz suyunun süzülmesi.
    2. 30 yapmakÖnceki bölümde tarif edildiği gibi hazırlanan, iyonu giderilmiş su ve katı BBIG-Cl kullanılarak BBIG-Cl mM çözeltisi.
    3. 1 (hacim / hacim) oranı: 1.5 deniz suyuna BBIG-Cı solüsyonu eklenir.
    4. sülfat nicel (>% 99) çıkarılmasını sağlamak için birkaç saat boyunca karıştırın.
    5. Vakum filtrasyonu kullanılarak Buchner hunisi donatılmış bir filtre kağıdı içinden filtre edilerek bir katı toplamak. 5 ml su alikoları ile filtre kağıdı üzerinde beş kez bir katı yıkayın.
    6. vakum altında izole katı kurutun ve verimi belirlemek için tartın.
  2. ligand Kurtarma
    1. Manyetik bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 20 mL sintilasyon şişesine NaOH (% 10) içindeki bir 2 mi çözeltisine BBIG-SO 4 53.1 mg ekleyin.
    2. 20 ° C'de iki saat boyunca karıştırın. Hafif san bir çökelti oluşturacak.
    3. Vakum filtrasyonu kullanılarak Buchner hunisi donatılmış bir filtre kağıdı içinden bir katı filtre. 0.2 filtre kağıdı üzerinde bir katı yıkayınml su ve vakum altında kurutulur.
    4. Bis (guanidin), serbest baz olarak kendi kimliğini teyit etmek için NMR 13 tarafından kurtarıldı katı karakterize eder. Şekil 3'te gösterilen NMR spektrumu ile karşılaştır.
  3. Sıvı sintilasyon sayımı ß ile Deniz Suyundan kaldırıldı Sülfat Miktarının Belirlenmesi
    DİKKAT: Bu teknik normalde çoğu laboratuarlarda karşılaşılan olandan tehlikelerin farklı bir sınıf teşkil radyoizotopların, kullanımını gerektirir. radyonüklid işlerken özel radyasyondan korunma ekipmanları genellikle gereklidir. Nedenle, prosedür dikkatle takip edildiği ve bir güvenlik görevlisi tavsiye ve rehberlik için istişare esastır.
    1. (Ci aşağıdaki denklemler (cpm ve Curies kullanarak deniz suyu çözeltisinin mililitre başına dakikada (cpm) başına en fazla 5 milyon sayar, olmadığından emin olmak için kullanılan kükürt-35 radyoizotop (5 mCi / ml) stok çözeltisi hacmi hesaplayın ) ölçü f iki birimleridirya da radyoaktivite):
      denklem 1
      denklem 2
      denklem 3
    2. 35S radyo-etiketli sodyum sülfat çözeltisi 5.0 mCi / ml solüsyon 0.0112 ml deniz suyunun 25 ml başak.
    3. Iyonu giderilmiş su içinde BBIG-Cl, 0, 15, 30, 33, 45 ve 60 mM solüsyonları hazırlamak ve 35S-radyo işaretli sülfat eşit hacimde bu çözeltilerin 0.750 ml birleştiren bir 2 ml santrifüj tüpü içinde deniz suyu arttı.
    4. 24 saat boyunca 25 ± 0.2 ° C arasında sabit bir sıcaklıkta tutulan bir kuluçka / hava kutusuna bir döner tekerlek veya girdap ile karıştırın.
    5. 25 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin çözümler.
    6. Santrifüj işleminden sonra, bir şırınga kullanarak her bir çözeltisi 1.2 mi kaldırmak sonra süspansiyon kaldırmak için 0.22 um'lik bir şırınga filtresinden filtresinden çökelti. Pipet polipropilen sintilasyon şişeleri sintilasyon kokteyli 20 ml bu solüsyonların her birinden 1.0 mi. Resim BBIG-CI (kontrol çözeltisi) ihtiva eden çözelti, önceden sintilasyon kokteyli ilave deiyonize su ile on kat seyreltilmelidir.
    7. örnekleri ve bir sıvı sintilasyon sayacında sintilasyon kokteyli içeren sintilasyon şişelerine yerleştirilir ve öncesinde koyu adapte örnekleri izin vermek için sayma 1 saat bekletin.
      Not: Ön örnekleri sayma, aleti kalibre edilmesi ve her bir numune, 30 dakika boyunca sayısı sağlar. çözelti içinde sülfat konsantrasyonları belirlenirken kullanılan bir plan düzeltmesi sağlamak için tek skintilasyon kokteyli içeren ilave şişe sayın.
    8. aşağıdaki denklemler kullanılarak kaldırıldı sülfat miktarını belirlemek:
      denklem 4
      54411 / 54411eq5.jpg "/>
      Denklem 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBIG-SO 4 (Şekil 1) toz X-ışını kırınım deseni kristalize bir katı kimliğinin kesin doğrulama sağlar. referans bir karşı elde edilen desen karşılaştırılmasında, pik şiddeti tepe konumlandırma az önemlidir. referans gösterilen tüm güçlü tepe noktası elde numunede mevcut olması gerekmektedir. Referans desen bulunmadığına örnek güçlü tepe görünümü yabancı maddelerin varlığına işaret etmektedir.

1H-NMR BBIG-CI ve geri kazanılan ligandı (Şekiller 2 ve 3) yaklaşık% 5 bileşiklerin kimliğine ve saflık, hem bir değerlendirmesini sağlar. Bu spektrumlar yardımıyla karşılaştırması ligandın tam olarak oluşmuş emin olmak için herhangi bir safsızlıkların yeterli ölçüde filtrasyon ve / veya yeniden kristalleştirmeden sırasında kaldırıldığını. OBT karşılaştırılmasındareferansa göre ained spektrumu, her tepe gösterilen tam pozisyonlarında mevcut olduğundan emin olmak için önemlidir. piklerin bağıl kayma değiştirmek gerekmez böylece referans spektrumları kullanılan aynı solventler kullanmayın.

Deniz suyundan sülfat ayırma sonuçları sülfat% 99 BBIG-Cl 1.5 molar eşdeğeri kullanılarak kaldırılmakta birlikte Tablo 1 'de gösterilmiştir. Bu tarif edilen tekniğin etkinliğini gösteren, orta, yüksek iyonik güçte rağmen, deniz suyundan sülfat yakın bütünüyle ayrılmasını ifade eder.

BBIG-SO 4 BBIG-Cl yerinde sentez yoluyla% 86 verimle elde edilmiştir ise BBIG-CI, ex-situ yöntemi ile% 70 ürün olarak elde edildi. Ligand geri kazanım ürünü oranı% 93 idi. Bu prosedürde yürütülen tüm organik reaksiyonlar yaparak, yüksek getirili ve operasyonel basitHatta bir acemi kimyager kolayca erişilebilir bileşikler.

Şekil 1
Şekil 1:. BBIG-SO 4 toz X-ışını kırınım modeli model yansıtma modunda düz numune kademesi kullanılarak bir toz X-ışını difraktometresi ile elde edildi. Güçlü zirveleri kırmızı olarak işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2.:. BBIG-Cl 1 H-NMR spektrumu spektrumu 400 MHz NMR cihazı ile DMSO-d6 içinde alınmış için tıklayınBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil 3,
Şekil 3:.. Kurtarıldı BBIG ligandının 1 H-NMR spektrumu spektrum 400 MHz NMR cihazı ile MeOD alındı ​​bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1:. Deniz suyundan sülfat ayrılması Örnek sonuçları verileri BBIG-Cl 1.5 M eşdeğeri kullanılarak deniz suyundan sülfat% 99'a kadar varan kaldırılmasını gösterir. deniz suyu ilk sülfat konsantrasyonu 30 mm idi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu teknik oldukça sağlam hale getirir yazılı prosedür, birçok sapmalar oldukça hoşgörülü olduğunu. takip edilmelidir ancak iki kritik adımlar vardır. İlk olarak, BBIG-Cı ligandı mümkün olduğu kadar saf olmalıdır. Yabancı maddeler, sadece kristalleşme ve elde edilen sülfat tuzu çözünürlüğü etkileyebilir, ancak, aynı zamanda zor çözeltiden niceliksel sülfat çıkarılması için gerekli olan miktarını hesaplamak için yapacaktır. Bu tekniğin ince değişikliklere çok duyarlı olabilir İkinci olarak, β sıvı sintilasyon sayma bölümünde tüm adımları, titizlikle takip edilmesi gerekir.

Nedeniyle kristalleşme kolaylığı için, sorun muhtemelen gerekli olmayacaktır. aşağıdaki gibi bazı ortak sorunlar üzerinde durulmaktadır. BBIG-CI ligand çözeltisi içinde sülfat çıkarılmasından gibi görünmüyor durumda, iki konulardan biri büyük olasılıkla suçlu. BBIG sentezlenmiş ex situ kullanıyorsanız-cı, Kendi kimliğini ve saflığını teyit etmektedir. Başlangıç ​​malzemesinin, bir 1H-NMR alın ve Şekil 2'de referans spektrumu ile karşılaştırın. Bu sorun, bir diğer yaygın görülen bir nedendir çözeltisinin pH değeridir. In situ BBIG-Cı ligandı sentezleme ise, (pH = 5-6) çözeltisi emin pH'ı hafif asidik olan tercih. aktif türler protonlanmış bağ olduğu gerçeğine bağlı olarak, yöntem, çözelti pH duyarlıdır. Temel çözümler sülfat kristalize aciz bir nötr ligandın verimli, guanidinyum grupları deprotone edecek. pH bazik ise yaklaşık 5-6 arasında bir pH değerine HCI ile basit bir ayar niceliksel sülfat uzaklaştırılması için en uygun koşulları sağlayacaktır. Bu sorun, temel çözümlerden sülfat kaldırmak mümkün olmadığına, bu tekniğin, temel sınırlamaları birini vurgulamak yok. Bununla birlikte, BBIG bağ oldukça aside-kararlı, yani çözeltinin pH değerinin ayarlanması, bu soruna bir çözüm sağlar, basit. başka bir değişkenBu sülfat kristalizasyon etkinliği bir solüsyonun iyonik gücü olan etkileyebilir. deniz suyundan sülfat ayrılması oldukça etkin olsa da, bu yöntem çok yüksek iyonik gücü olan çözümlere uygulandığında sülfat ayırma verimi düşük olması mümkündür.

Bu protokolde gösterilen teknik etkili, son derece verimli, seçici, yeşil ve maliyetidir. Karşılaştırıldığında, alternatif sülfat giderme yöntemleri, düşük ayırma seçicilik ile pahalı ve yüksek bakım membranlar veya iyon değişim sütunları içerir. 3 Dahası, mevcut yöntemlere göre, burada sunulan teknik çok basit ve ayırma kimyasında biraz teknik bilgi ve deneyim gerektirir.

Bu kristalleşme tekniği sulu çözeltilerden sülfat kantitatif çıkarılmasına genel bir yaklaşım sunuyor. Deniz suyu tekniği göstermek için bu protokolde kullanılan iken, bu kristalleşme yöntemideniz suyu ile sınırlı değildir, ve hemen hemen herhangi bir sulu çözeltilerden sülfat kaldırılması için kullanılabilir. bis sınıfı yana kolay hazır dialdehid ve aminoguanidinium prekürsörlerinden bir aşamada sentezlenebilir kullanılan (iminoguanidinium) ligandları, sülfat ya da diğer oxoanions için etkili bir çökeltme maddesi ile sonuçlanabilir diğer basit kombinasyonlar potansiyel vardır. Böylece, bu protokol sunulan teknikleri mastering Burada sunulan BBIG ligand daha potansiyel daha iyi seçicilik ve etkinlik ile onun / onu kendi kristalleşme ligandı geliştirmek için bir olanak sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

BBIG eşdeğer Sol [Sülfat] (mM) Sülfat çıkarıldı (%)
1 3.5 88
1.1 1.6 95
1.5 0.3 99
2 0.3 99
Name Company Catalog Number Comments
Terephthalaldehyde Sigma T2207
Aminoguanidinium Chloride Sigma #396494
Sodium Sulfate Sigma #239313
Barium Chloride Sigma #342920 Highly Toxic
Ethanol Any Reagent Grade (190 proof)
Sodium Hydroxide EMD SX0590-1
Hydrochloric Acid Sigma #258148
Filter Paper Any - Any qualitative or analytical filter paper will work
Syringe Filter (0.22 μm) Any - Nylon filter
35S Labeled Sulfate Perkin Elmer NEX041005MC
Ultima Gold Scintillation Cocktail Perkin Elmer #6013329
Polypropylene Vials  Any -
Disposable Syringe (2-3 ml) Any - Any disposable plastic syringe works

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langton, M. L., Serpell, C. J., Beer, P. D. Anion Recognition in Water: Recent Advances from Supramolecular and Macromolecular Perspective. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1974-1987 (2016).
  2. Busschaert, N., Caltagirone, C., Van Rossom, W., Gale, P. A. Applications of Supramolecular Anion Recognition. Chem. Rev. 115, 8038-8155 (2015).
  3. Moyer, B. A., Custelcean, R., Hay, B. P., Sessler, J. L., Bowman-James, K., Day, V. W., Sung-Ok, K. A Case for Molecular Recognition in Nuclear Separations: Sulfate Separation from Nuclear Wastes. Inorg. Chem. 52, 3473-3490 (2013).
  4. Kim, S. K., Lee, J., Williams, N. J., Lynch, V. M., Hay, B. P., Moyer, B. A., Sessler, J. L. Bipyrrole-Strapped Calix[4]pyrroles: Strong Anion Receptors That Extract the Sulfate Anion. J. Am. Chem. Soc. 136, 15079-15085 (2014).
  5. Jia, C., Wu, B., Li, S., Huang, X., Zhao, Q., Li, Q., Yang, X. Highly Efficient Extraction of Sulfate Ions with a Tripodal Hexaurea Receptor. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 486-490 (2011).
  6. Rajbanshi, A., Moyer, B. A., Custelcean, R. Sulfate Separation from Aqueous Alkaline Solutions by Selective Crystallization of Alkali Metal Coordination Capsules. Cryst. Growth Des. 11, 2702-2706 (2011).
  7. Custelcean, R. Urea-Functionalized Crystalline Capsules for Recognition and Separation of Tetrahedral Oxoanions. Chem. Commun. 49, 2173-2182 (2013).
  8. Custelcean, R., Sloop, F. V. Jr, Rajbanshi, A., Wan, S., Moyer, B. A. Sodium Sulfate Separation from Aqueous Alkaline Solutions via Crystalline Urea-Functionalized Capsules: Thermodynamics and Kinetics of Crystallization. Cryst. Growth Des. 15, 517-522 (2015).
  9. Custelcean, R., Williams, N. J., Seipp, C. A. Aqueous Sulfate Separation by Crystallization of Sulfate-Water Clusters. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 10525-10529 (2015).
  10. Custelcean, R., Williams, N. J., Seipp, C. A., Ivanov, A. S., Bryantsev, V. S. Aqueous Sulfate Separation by Sequestration of [(SO4)(H2O)4]4- Clusters within Highly Insoluble Imine-Linked Bis-Guanidinium Crystals. Chem. Eur. J. 22, 1997-2003 (2016).
  11. Khownium, K., Wood, S. J., Miller, K. A., Balakrishna, R., Nguyen, T. B., Kimbrell, M. R., Georg, G. I., David, S. A. Novel Endotoxin-Sequestering Compounds with Terephthaldehyde-bis-guanylhydrazone Scaffolds. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 1305-1308 (2006).
  12. Pecharsky, V. K., Zavalij, P. Y. Fundamentals of Powder Diffraction and Structural Characterization of Materials. Springer. (2005).
  13. Goldenberg, D. P. Principles of NMR Spectroscopy: An Illustrated Guide. 3rd, University Science Books. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics