In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Bu makalede, diyaliz yöntemi ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri açıklanmaktadır. Bu mikroçiplerin ana avantajlarından biri, imalat malzemelerinin seçimidir ve talaşları oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım veri toplama için uyumlu hale getirir. Çip üzerinde kristalizasyon deneyleri, protein örneğinin küçük hacimlerini gerektirir ve bu yüksek değerli makromoleküllerle çalışmanın genel maliyetini azaltır.

Çip üzerinde kristalizasyon, geleneksel kristalografi deneyleri sırasında kriyo soğutma ile birlikte sıklıkla uygulanan kırılgan protein kristallerinin manuel olarak toplanmasını da ortadan kaldırır. Ayrıca, mikroçiplerimiz protein kristalizasyonu için cromulent konsantrasyonuna yaklaşmak için yarı geçirgen bir membran yoluyla çökelti konsantrasyonunu dengelemeyi amaçlayan difüzyon bazlı bir yöntem olan protein kristalizasyonu için mikrodiyaliz kullanır ve kristalizasyon koşulları üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağlar. Sıcaklık kontrolü ile birlikte mikrodiyaliz, aynı protein örneğini kullanırken çökelti konsantrasyonunu değiştirerek faz diyagramlarını araştırmak için çekirdeklenmeyi kristal büyümesinden ayırmak için kullanılabilir.

İlk önce 50 gram PDMS silikon tabanı hazırlayın ve 10 ila bir kütle oranında kürleme maddesidir. İki malzemeyi bir beherde bir spatula ile karıştırın. Karıştırdıktan sonra, tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için karışımı bir vakum odasına yerleştirin.

Mikroakışkan kanalın ve sütunların desenlerini içeren ilk SU8’e yaklaşık beş milimetre yüksekliğe kadar 25 gram önceden karıştırılmış PDMS koyun. Daha sonra PDMS’nin kalan 25 gramını, sadece sütunların desenlerini içeren ikinci SU8 master’ına dökün. İki PDMS katmanını 338 kelvin’deki bir fırında bir saat boyunca iyileştirin.

Su8 ustalarının desenlerinin etrafındaki kürlenmiş PDMS katmanlarını neşterle kesin ve PDMS kalıplarını silikon kalıplarından hafifçe soyun. PDMS kalıbını, hem kanalları hem de sütunları yukarı bakacak şekilde sert bir mikroskop cam kaydırağa yerleştirin. Protein odası olarak tasarlanan PDMS kalıbının merkezi direğini örtmek için küçük bir parça rejenere selüloz diyaliz zarı kesin.

Diyaliz zarının moleküler ağırlık kesmesi, protein örneğinin moleküler ağırlığına ve kristalizasyon çözeltisinin çökeltilerine göre seçilir. Daha sonra yenilenmiş selüloz diyaliz zarının kuru parçasını dikkatlice ayırın. Ayrılmış diyaliz zarının küçük bir parçasını kesin.

Bu membranın boyutu çipin tasarımına bağlıdır. Ve özellikle, merkezi sütunun boyutlarına bağlıdır. Diyaliz zarının parçasını cam kaydırağın üzerinde desteklenen PDMS kalıbının merkez direğine, direği ve kanalları yukarı bakacak şekilde yatırın.

Ardından, yalnızca aşağı bakan sütunları içeren ikinci PDMS kalıbını, cam slaytta zaten desteklenen PDMS kalıbının üzerine yerleştirin. İki PDMS kalıbının tüm sütunlarını hizalayın. Rejenere selüloz diyaliz zarının parçası PDMS kalıplarının iki merkezi sütunu arasına sıkışmıştır.

İmalat prosedürünün bu adımı optik bir mikroskop altında veya tüm sütunların hizalamasını dikkatlice inceleyerek gerçekleştirilebilir. Montajı bir vakum odasına yerleştirin ve PDMS kalıplarındaki sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak ve bu protokolün bir sonraki adımında açıklanacak fotokür edilebilir NOA reçinesinin yerleştirilmesini geliştirmek için 30 dakika boyunca kurulayın. Montajı vakum odasından çıkarın ve iki PDMS kalıbı arasındaki boş boşluğu kılcal imbibition ile fotosüre edilebilir tiyolin bazlı reçine NOA 81 ile doldurun.

Reçineyi montajın dört tarafının üçüne uygulayın. Montajı çapraz bağlayıcıya yerleştirin ve santimetrekare başına 35 miliwatt’lık kolimli bir UV lambası kullanarak sekiz saniye boyunca UV ışığına maruz kalarak NOA reçinesini iyileştirin. Mikroskop cam kaydırağın standart boyutlarında 175 mikrometre kalınlığında bir PMMA parçası kesin ve PMMA parçasının her iki tarafındaki plastik korumayı soyun.

İlk UV maruziyeti tamamlandıktan sonra, üst PDMS kalıbını, üzerine kısmen çapraz bağlanmış bir NOA reçinesi takılı olarak alt PDMS kalıbından ve cam kaydıraktan çıkarın. Üst PDMS kalıbının montajını ve PMMA parçasındaki kısmen kürlenmiş NOA reçinesini hafifçe bastırın. Yeni montajı çapraz bağlayıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca UV ışığına maruz kalarak NOA reçinesini tekrar kürlayın.

Üst PDMS kalıbını dikkatlice çıkarın. Rejenere edilmiş bir selüloz diyaliz membranı gömen ve bir PMMA parçası üzerinde desteklenen tamamen çapraz bağlantı NOA reçineden yapılmış diyaliz çipi hazırdır. Mikroakışkan kanalın giriş ve çıkış noktalarında piyasada bulunan konektörleri hızlı epoksi tutkalla bağlayın.

Sıvı kullanımı için, konektörlerin boyutuna göre PTFE tüplerinin çapını seçin. Tüpler, diyaliz çipinin akışkan kanalı içinde kristalizasyon çözeltisinin tanıtımı için kullanılır. Pipet, diyaliz zarının hemen üzerinde bulunan protein rezervuarının içindeki protein örneğinin bir damlacığı.

Protein damlacıklarının hacmi, kullanılan mikroçip tasarımına bağlıdır. Ve özellikle, merkezi sütunun hacmine bağlıdır ve 0.1 veya 0.3 mikrolitre olabilir. Protein rezervuarının etrafına ince bir yüksek vakumlu silikon gres tabakası dikkatlice uygulayın.

Küçük bir PMMA parçasını kesin ve silikon yağın ince tabakasının üzerine hafifçe yerleştirin. Protein rezervuarının üzerine yerleştirilen PMMA parçasını kapton bandından bir parça kesin ve tüm kenarlarda NOA çipine yapışın. Protein örneği rezervuar içinde kapsüllenmiştir ve çip kristalizasyon deneyleri için kullanılabilir.

öncelikle tamponun uygun hacimlerini ve çökelti çözeltilerini karıştırarak kristalizasyon çözeltisinin yaklaşık 500 mikrolitresini hazırlayın. Diyaliz çipi noktasındaki kristalizasyon solüsyonunu, şırınna ile manuel olarak veya otomatik basınç tahrikli bir sistemle akışkan konektörler aracılığıyla enjekte edin. Akışkan kanal kristalizasyon çözeltisi ile doldurulduktan ve içinde hava sıkışmadığında, çipin giriş ve çıkış bağlantı noktalarını Parafilm bandı ile kapatın.

Pipet protein rezervuarı içindeki protein çözeltisinin uygun hacmini ve daha önce açıklandığı gibi protein örneğini kapsüller. Protein kristal büyümesi dijital kamera ile görselleştirilebilir ve kaydedilebilir. Diyaliz mikroçiplerinin imalatı için optik olarak şeffaf ve biyolojik olarak inert malzemeler seçtik ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri için yüksek uyumluluk gösterdik.

X-ışını ışınının doğrudan yolunda bulunan çipin protein bölmesini oluşturan malzemelerin oluşturduğu arka plan gürültüsü değerlendirilmiştir. Protein bölmesi, yenilenmiş selüloz diyaliz zarı, Kapton bandı ve biri mikroçiplerin alt tabakası olarak kullanılan ve biri protein örneğinin kapsüllenmesi için kullanılan iki PMMA katmanından oluşur. Bu resimde Kapton bandı, rejenere selüloz diyaliz zarı, PMMA tabakası ve montajları tarafından oluşturulan arka plan gürültüsü gösterilmiştir.

Fotokürlenebilir reçine NOA mikroçiplerin ana gövdesini oluştursa da, protein odasının bir parçası olmadığı için bu ölçümlere dahil değildir. X ışınlarının malzemelerle etkileşimlerine atfedilen dağınık halkalar, Kapton bandı için dört angstromdan daha düşük çözünürlükte, PMMA dört ila sekiz angstrom arasında ve diyaliz zarı dört ila beş angstrom arasında görülebilir. Çip tarafından üretilen toplam arka plan gürültüsü esas olarak altı angstromdan daha düşük çözünürlükte gözlenir, bu da lysozyme yüksek çözünürlüklü kırınım verilerinin tedavisinin etkilenmediğini gösterir.

Mikroçipler, yerinde X-ışını kırınım deneyleri için tasarladığımız 3D baskılı bir destekle x-ray ışınının önüne monte edildi ve aynı anda üç çipe kadar dayanabiliyor. Model çözünür proteinlerin çip üzerinde kristalizasyonu için mikroçiplerin verimliliğini mikrodiyaliz yöntemi ile değerlendirmek amacıyla deneyler yapıldı. lysozyme kristalleri 293 kelvin’de iki farklı koşulda yetiştirildi.

İlk kristalizasyon durumu 1.5 molar sodyum klorür ve 0.1 molar sodyum asetat içeriyordu. İkinci kristalizasyon durumu bir azı dişi sodyum klorür, 0.1 molar sodyum asetat ve% 30 polietilen glikol 400 içeriyordu ve mikroçiplerin ve mikrodiyaliz yönteminin yüksek moleküler ağırlık ve viskoz çözelti çökeltileri ile uyumluluğunu göstermek için seçildi. Kristalizasyon deneyleri statik koşullar altında gerçekleştirildi.

Mikroçipte lysozyme kristalleri yetiştirildikten sonra, oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri için kullanıldı. Mikroçipler 3D baskılı destek yardımıyla ışın hattına monte edildi ve iki lysozyme kristalinden eksiksiz X-ışını kırınım veri setleri toplandı. X-ışını kırınım verilerinin tedavisinden sonra, tek bir lysozyme kristalinin elektron yoğunluk haritası 1.95 angstrom çözünürlükte elde edildi, şekil A.Şekil B’de gösterildiği gibi 1.85 angstrom çözünürlüğünde elde edilen elektron yoğunluk haritası.

İki farklı lysozyme kristalinden elde edilen iki veri setini birleştirdikten sonra, her iki elektro yoğunluk haritası, oda sıcaklığında doğrudan diyaliz mikroçipleri üzerinde, tek veya çoklu protein kristallerinden yapılan yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile elde edilebilen ayrıntılı yapısal bilgileri göstermektedir. Mikrodiyaliz yöntemi ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için tasarlanmış mikroakışkan cihazlar için imalat prosedürünü ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneylerini gösterdik. Yerinde protein kristalografisi için uyumlu, yüksek X-ışını şeffaflığına sahip imalat malzemeleri kullandık.

Kırınım veri toplama, yongalar için doğrudan makromoleküler kristalografi kiriş hatlarına monte edilebilen 3D baskılı bir destek kullanılarak otomatikleştirilmiştir. Bu mikroçiplerin çok yönlülüğü, kristalizasyon koşullarını geri dönüşümlü olarak kontrol etmek ve küçük protein hacmini kullanarak faz diyagramlarını haritalamak için mikrodiyaliz kullanmaktan kaynaklanmaktadır. Cihazın prototiplenmesi basittir, bu da nispeten ucuz malzemelerle temiz bir odada tek bir günde 30 mikroçip üretilmesini sağlar.

Çiplerin bu özelliklerinin daha zorlu protein hedeflerinin seri X-ışını kristalografi çalışmaları için kullanılabileceğini bekliyoruz.