マウスにおける正常および不良骨治癒を分析するために大腿骨骨切り術の標準化された固定用髄内ロッキングネイル

1Department of Trauma, Hand and Reconstructive Surgery, Saarland University, 2Institute for Clinical & Experimental Surgery, Saarland University, 3RISystem AG
Published 11/13/2016
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Medicine

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Summary

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Histing, T., Menger, M. D., Pohlemann, T., Matthys, R., Fritz, T., Garcia, P., et al. An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice. J. Vis. Exp. (117), e54472, doi:10.3791/54472 (2016).

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Abstract

骨治癒モデルは、臨床的骨折の治療のための新しい治療戦略の開発に不可欠です。さらに、マウスモデルは、外傷の研​​究に使用されるより一般的になってきています。彼らは、骨治癒の高度に差別化プロセスの背後にある分子機構の解析のための変異株と多数の抗体を提供しています。生体力学的環境を制御するために、標準化された、よく特徴付けられた骨接合技術は、マウスでは必須です。ここでは、マウスにオープン大腿骨骨切り術を安定化させるための髄内釘の設計および使用について報告します。医療グレードのステンレス鋼製の釘は、高い軸方向と回転剛性を提供します。さらにインプラントは定義され、一定の骨切り術ギャップの作成は0.00ミリメートルから2.00ミリメートルにサイズができます。 0.00ミリメートルと0.25ミリメートルのギャップサイズの大腿骨骨切り術の爪の安定化をロックする髄内には、軟骨内および膜内ossificatを通じて十分な骨の治癒をもたらしますイオン。萎縮性非組合で2.00ミリメートル結果のギャップサイズと大腿骨骨切り術の安定化。従って、髄内釘のロックは、治癒および非治癒モデルで使用することができます。他のオープン骨治癒のモデルと比較して、爪の使用のさらなる利点は、十分に骨統合のプロセスを研究するために、代用骨と足場を固定するための可能性です。髄内釘の使用の欠点は、閉じられたモデルと比較すると、開いているすべての手順に固有のより侵襲的な外科的手技、です。さらなる欠点は、髄外安定化手順と比較して、すべての髄安定化技術に固有の髄内腔に何らかの損傷を誘導することができます。

Introduction

骨治癒の生物学、細胞およびスフェロイド培養物を用いてインビトロで研究することができるが、それはまた、動物研究を使用して近づく、インビボで必要です。大動物実験はまだ前臨床試験において重要な役割を果たしているが、製品や仮説の初期段階のテストでは、過去10年の間に変更されており、今日では多くの場合、小動物モデル1で行われます。このスイッチは、いくつかの理由のために実施しました。マウスおよびラットの生産とメンテナンスは豚や羊に比べて安くなっています。また、小動物は、慢性実験の大規模シリーズの性能を容易にどちらも短い再生時間と短く、通常の治癒期間を有します。最後に、遺伝子標的動物と特異的抗体の利用可能性は、骨治癒の分子メカニズムの分析を可能にします。以前より大きな動物モデルにおいて骨接合技術を使用しながら、しかし、最小限のvariatで翻訳することができましたヒトまたは動物の臨床患者のケアに使用される同様の手順からのイオンは、小型ラットおよびマウスにおける骨接合技術の開発及び適用は、困難であることが判明しました。

十分に生体力学的環境が著しく骨治癒プロセス2に影響与えることが知られています。 micromovementsと剛性の低い固定後の剛性固定および軟骨内骨化後の膜内骨化を含む、ヒトにおける骨折治癒、治癒の異なるモードでの骨折安定化結果の違いから知られているように。完全な軸または回転不安定性は、治癒プロセスを遅延させることができるか、非組合3になることがあります。従って、我々は、マウスおよびラットで洗練されたインプラントシステムと骨接合技術の開発が必要であると感じています。このようにして、生体力学的条件は、治癒過程を分析するときに有効な結果を保証し、適切に標準化することができます。

e_content ">高度に洗練されたネズミの安定化技術の相当数は、ここ数年の間に導入されているが、最も一般的に使用される技術はまだ簡単な髄内ピンである。この技術の主な欠点は、しかし、回転および軸方向の欠如であります安定性4。回転および軸方向の安定性を向上させるために、髄内スクリューは、マウス5に大腿骨の骨折を安定化するために導入された。しかし、ねじ固定が原因で骨片の間の接触および圧縮の必要性骨欠損の治癒を分析するために使用することができません回転安定性を維持するために。

爪をロック髄内はシンプルなピンと髄内スクリュー4と比較して、より高い軸方向および回転安定性を提供しています。なぜならジーリのためのガイドの可能性の高い再現性大腿骨骨切り術は、見て、定義されたギャップサイズを作成する機能は、通常のボン両方の分析を可能にします電子治癒および骨欠損の治癒6。インターロックピンを挿入する、爪をロック髄内は、全重量を保有しながらも、全体の治癒過程の間に一定のギャップの大きさを保証します。ここでは、正常および遅延骨治癒に関する実験的研究で、その長所と短所の髄内固定釘の設計と応用について報告するだけでなく、。

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Protocol

すべての手順はIACUCが承認したと制度ガイドライン(LandesamtエリーゼVerbraucherschutz、ZentralstelleAmtstierärztlicherDienst、ザールブリュッケン、ドイツ)を行いました。鎮痛および感染予防は、実験を行うべきであり、国や機関のそれぞれのガイドラインと一致する必要があります。

インプラントや手術器具の作製

  1. 顕微計器箱からメスの刃(サイズ15)、小準備はさみ、細かい鉗子、ドレッシング鉗子、小さなはさみ、24ゲージ(G)と27 G針、非吸収性縫合糸5-0、および針ホルダを選択。
  2. 髄内釘、連動ピン、特別な照準装置を箱から取り出し、ジリが見た、ジーリのテンプレートは、センタリングドリルビット(直径1mm)、ドリルビット(直径0.3mm)、およびハンドドリル( 図をて2;材料のリストを参照してください)。
    注:intramedullary釘(直径0.8mm、15.7ミリメートルの長さ)は、大腿骨への逆行性注入のための医療グレードのステンレス鋼製の髄内釘のロックです。釘は、近位ねじ山(4ミリメートルの長さ)と、軸方向及び回転の安定性( 図1)を達成するために、インターロックピン(直径0.3mm)を挿入するための2つの穴を有しています。
  3. 5分間消毒溶液( 例えば、96%アルコール)に移植し、すべての手術器具を公開したり(蒸気滅菌、130℃、25分)、それらを滅菌します。消毒または滅菌後、無菌操作布の上に機器を配置します。小動物動作テーブルに直接隣接し、無菌操作布を置きます。

2.動物、麻酔、および鎮痛

  1. 研究と対処すべき質問のために必要に応じてマウスの系統、年齢、性別を選択してください。
    注:この研究のために、12〜14週齢の雄CD-1マウスを用いました。ネイルimplaのため35グラム - ntationは、動物の理想体重は25です。
  2. 15ミリグラム/ kgのキシラジンおよび75 mgの/ kgのケタミンの腹腔内注射でマウスを麻酔。つま先のピンチによって麻酔を確認してください。麻酔中の乾燥から動物の目を保護するために目の潤滑剤を塗布します。麻酔の誘導後、体温を一定に保つために加熱ランプ下にマウスを置きます。
  3. 手術後3日目までは手術の前に1日目から鎮痛のための飲料水(2.5ミリグラム/ 100ミリリットル)にトラマドール塩酸塩を適用します。

3.外科的手順とネイル移植

  1. 手術前に、全体の右後肢を剃ると脱毛クリームを適用します。 5分後、クリームを除去し、水で足をきれいに。消毒溶液( 例えば 、96%アルコール)に移植し、すべての手術器具を公開したり(蒸気滅菌、130℃、25分)、それらを滅菌します。
  2. 無菌条件下では、畝を配置小動物の操作テーブルの上に仰臥位で、SE。膝の顆に前方アプローチを可能にするために右ひざを曲げます。手術用メスの刃を使用して、右膝に5ミリメートル内側parapatellar切開を行います。
  3. 細かいピンセットで膝蓋靱帯を持ち上げて、手術用メスの刃で慎重に靭帯を動員。その後、大腿骨の顆間ノッチを露出させるために、メスの刃で横方向に膝蓋骨をシフト。
  4. 髄内腔に到達するまで穿孔することによって顆間ノッチを開きます。
    1. ドリルビットを中心に1ミリメートルを使用して、大腿骨軸に対してオフセット45°で掘削を開始します。ゆっくりと、それは大腿骨の骨軸と平行になるまで掘削中にドリルビットの方向を変えます。髄内空洞に達した場合はドリル停止します。
  5. 顆間窩に骨を開いた後、大腿骨の全長にわたって髄内キャビティに24 G針を挿入します。 intrameを連手動で24 G針の回転運動を通して大腿骨のdullary空洞。 24 G針を外し、髄内キャビティにシンナー27 G針を挿入します。大転子で近位大腿骨の皮質骨を穿孔するために前方に針を押してください。
  6. 大腿骨から27 G針を外します。爪の先端が顆のレベルに達するまで、ハンドドリルを使用して、連続的な回転及び軸方向圧下顆間ノッチを通って髄内釘を打ち込みます。
    注:爪の先端が小さいマークで識別することができます。
  7. 左側臥位にマウスを置きます。外科的に大腿骨の中間シャフトを露出させるために股関節に膝関節からの横方向の大腿骨の骨幹部分に沿ってメスの刃を使用して、縦方向の皮膚切開を行います。
  8. 小さな準備ハサミを使用して、筋膜を分割し、側方からの大腿骨軸の方向に筋肉を広げました。大腿骨の骨幹の一部が露出するまでの筋肉を広げます。坐骨神経を保持します。
    1. ドレッシング鉗子で骨を損なうことにより、大腿骨の全周を準備します。次に、ドレッシング鉗子を広げることによって筋肉を撤回し、大腿骨を露出させます。
  9. 爪の先端に照準装置をマウントします。それは爪のアダプタフランジに取り付けられるまで、デバイスを前進させ、大腿骨の前外側の位置に照準装置の電源を入れます。
  10. 近位および遠位連動ピンと釘を連動。
    1. 近位の連動ピンと起動します。
    2. ハンドドリルにセンタリングドリルビット(直径1mm)を挿入します。近位の連動穴位置で骨を皿穴。
      注:皿穴により、小さな空洞が骨ドリルスルーせずに面した皮質骨に作成されます。この空洞は、薄いドリルビット(直径0.3mm)の改善されたセンタリングと案内が可能になり、後で使用。
    3. ハンドドリルにドリルビット(直径0.3mm)を挿入します。照準装置を使用して、対面および回避皮質骨(bicortical)の両方に穴を開けます。照準装置を介して第1連動ピンを挿入します。すぐに連動トルクが達成されるようにオフ連動ピン駆動軸ばさみ。
    4. 遠位連動ピンに対して、この手順を繰り返します。
  11. 骨幹骨切り術を行います。
    1. 2インターロックピン間の側面に照準装置に鋸ガイドを取り付けます。そして、ジリと骨は生理食塩水で連続灌漑の下で見た見ました。骨切り術が完了した後、骨に近い、一端でのこぎりをカット。軟組織への損傷を引き起こすことを避けるために慎重にのこぎりを削除します。
  12. 標線で髄内釘の残りのシャフトをオフクリップ、小さなペンチで、照準装置を取り外します。
  13. 緯度で筋肉層を閉じます大腿骨のERALサイトと単一縫合糸で皮膚閉鎖を行います。膝の前方サイトでは、膝蓋骨の位置を変更し、単一の縫合糸で筋肉に膝蓋骨腱を固定します。同様に、この傷を閉じるために、単一の縫合糸を使用してください。
  14. 彼らは麻酔から回復するまで加熱ランプの下で動物を保管してください。彼らは腹側横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻してきたまでは無人の動物を放置しないでください。動物施設内の単一のケージに動物を返します。
  15. 毎日慎重に動物を監視します。最初の3日間に術後鎮痛を維持します。発声、落ち着きのなさ、移動性の欠如、グルーミングの失敗、異常な姿勢、そして周囲の正常な関心の欠如によって示されるようにあれば鎮痛を続行し、手術後4日目に、動物はまだ、痛みの証拠を示します。動物が痛み自由であるとき鎮痛を終了します。

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Representative Results

外科的処置のための全体的な時間は、創傷閉鎖するために皮膚切開から約30分でした。提供される外科用インプラントを使用して、外科手術は、ステレオ顕微鏡なしで行うことができます。手術後、動物を毎日モニターしました。動物のどれもが、この期間の後の痛み(発声、落ち着きのなさ、移動性の欠如、グルーミングの失敗、異常な姿勢、または周囲の正常な関心の欠如)の証拠を示さなかったため、術後鎮痛は、3日後に終了しました。動物は、手術後2日以内に正常体重支持を示しました。創傷感染または二次骨折は、全観察期間中に観察されませんでした。

発生する可能性が最も重要な合併症は、膝関節( 図3 A)の顆と釘レベルの突起と、ロック爪の不正確な移植です。これは主に発生します照準装置の誤った取り扱いや原因、特に20グラム以下の体重を有するマウスにおける小さすぎる大腿骨で動物の使用に起因秒。別の合併症が連動ピン( 図3 B)の転位です。この合併症は、中または手術直後に正しいインプラント配置のX線写真を確認することによって回避することができます。この問題は、主にピンの不完全な挿入によって引き起こされます。インターロックピンを除去することが困難であったため最後に、実験の終了時に骨の収穫は数回を妨げました。これは、ピン位置の周りの骨架橋によるものでした。

5週は0.25ミリメートルの骨切り術のギャップの完全な治癒を確認した後、放射線分析します。この時点で、骨膜カルスは、ほぼ完全に( 図4 A)改造しました。これとは対照的に、2.00ミリメートル間隔で安定化大腿骨に、骨切り術は治癒しませんでした。大腿骨は確実にありました nは非組合形成萎縮性。これは、骨の治癒( 図4 B)の10週間後に確認されました。

0.25ミリメートルの骨切り術ギャップが安定した後、組織学的分析は、膜内および軟骨内骨化を含むカルス形成、二次骨折治癒の典型的なパターンを明らかにしました。 5週間後、骨切り術を完全に骨組織で架橋しました。この時点で、織骨がすでにラメラ骨( 図5 A)に改造しました。これとは対照的に、2.00ミリメートルの骨切り術ギャップで安定化大腿骨は観察の10週間後に萎縮性非組合を示しました。これは、骨切り術のギャップ内の線維組織の高い量と関連していました。骨切り術のいずれも、骨治癒または組織学的に分析した場合、ブリッジング( 図5 B)の徴候を示しませんでした。

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図1:インプラント。 A.髄内釘の近位のスレッド(矢印、4ミリメートルの長さ)と連動ピンを挿入するための二つの穴(矢頭)と(直径0.8mm、15.7ミリメートルの長さ)。釘は、適用を容易にするために、シャフト(二重矢印)に接続されている。B.インターロックピン(直径0.3mm、矢印)は、回転と軸方向の安定性を達成します。連動ピンは、アプリケーションを容易にするために、シャフト(二重矢印)に接続されている。C.髄内釘をマウスの大腿骨への移植後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 爪の移植のための手術器具。 A.挿入するためのデバイスを目指し爪の。B.は、0.25ミリメートルのギャップサイズと骨切り術の作成に使用するガイドを見た。C.ドリルビットをインターロックピン用の穴を掘削するため。D.が連動ピンホールの皿穴のためのドリルビットをセンタリング。E.ハンドドリルは、爪の挿入、皿穴、穴あけ、およびインターロックピンを挿入するために使用される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 術後X線写真。 A. X線写真は、顆のレベルで膝関節に爪の突起(矢印)を実証する。B. X線写真は、近位interlocの不完全な挿入を実証しますキングピン(矢印)。スケールバーは、4ミリメートルを表しています。

図4
図4:骨治癒の5および10週間後にX線写真。大腿骨のA.放射線写真分析は、十分な骨の治癒を実証し、5週間後に0.25ミリメートルの骨切り術のギャップで安定化。大腿骨のB. X線写真分析は萎縮性非組合を実証し、10週間後に2.00ミリメートルの骨切り術のギャップで安定化。スケールバーは、4ミリメートルを表しています。

図5
図5: 骨治癒の5および10週間後に組織切片。大腿骨のA.組織学的分析は、十分な骨の治癒を実証し、5週間後に0.25ミリメートルの骨切り術のギャップで安定化。層状骨とほぼ完全な再構築を注意してください。B.シーッ大腿骨の学的分析は、萎縮性、非組合を実証し、10週間後に2.00ミリメートルの骨切り術のギャップで安定化。骨切り術ギャップ内の繊維組織に注意してください。組織学的切片をトリクローム法に従って染色しました。スケールバーは800μmで表します。

図6
図6:代用骨移植マウスの右大腿骨における分節骨欠損を実証するin vivoでの写真欠陥は、代用骨(矢印)によって満たされています。代用骨は、適切な位置決め及び固定を提供する、爪の上に注入されます。

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Discussion

外科技術の最も重要なステップは、爪の正確な位置決め、照準装置、およびピンです。爪は、顆のレベルで膝関節への爪の突起が膝( 図3 A)の動きを制限することができるので、爪の先端にマークされたインデントに完全に挿入しなければなりません。したがって、大腿骨の大きさとは、従って、動物の体重を考慮しなければなりません。外科医はまた、爪のアダプタフランジを装着照準装置の最終位置に特別な注意を払う必要があります。これは、骨切り術が同一の中間シャフトの位置に常にあることを保証します。最後に、インターロックピンが観察期間( 図3 B)の間にピン転位を避けるために、完全にbicortically挿入する必要があります。したがって、ピンは回転運動と連続軸方向荷重を使用して大腿骨に挿入する必要があります。ピン駆動軸ばさみすぐに連動トルクが達成されるようにオフ。動物を研究プロトコルに含まれている前に釘やピンの最終的な位置は、X線撮影で確認する必要があります。

実験の最後に、骨の収穫時の最も重要なステップは、爪の連動ピンの除去です。かなり頻繁に、ピンの端部は、新たに形成された骨組織で覆われています。実際には、この骨組織は、ピンを除去することができるまで、切除されなければなりません。大腿骨の損傷が治癒した骨の生体力学的特性に影響を与えることができるので、これは、非常に慎重に行わなければなりません。場合によっては、ピンは、より容易に、大腿骨の背側から除去することができます。釘自体は、単純な針ホルダを使用して問題なく除去することができます。

この外科的処置のための器具とインプラントは非常に特異的であるため、プロシージャへの変更を行うことができません。手順は、COMを開発するかもしれないがひだは、私たちの手の中に、彼らは( すなわち、2%以下)まれです。例えば、手順の間に横方向にシフトされる膝蓋骨靱帯は、破裂することができます。これは、爪の移植後靱帯の縫合が必要です。 24 G針と大腿骨のリーミングの挿入中、顆が破裂することがあります。ジーリとピン挿入および骨切り術が見た時には、大腿骨骨幹中央地域で破損する可能性があります。そこにこれらの合併症のためのトラブルシューティングの可能性がないので、これらの動物は、標準化された実験に使用することはできません。

技術の1つの制限は、異なる動物の大きさ、したがって、大腿骨は、インプラントの異なるサイズを必要とすることです。インプラントの使用に関するさらなる制限は、画質に影響を与えるインプラント材料(医療用ステンレス鋼)、にほとんど不可能であるin vivoでのマイクロCTは治癒過程骨切り術の分析ということです。

インビボの骨治癒研究は開閉モデルを用いて行うことができます。ほとんどの研究では、大腿骨または脛骨の治癒を分析します。これは、過去10年間のマウスのために開発された技術やモデルにも当てはまります。これらは、剛性または剛性の低い固定を提供することができるオープン7-10モデルだけでなく、閉じ5,11,12手法を含みます。興味深いのは、マウスでの以前の研究では、単純な髄内ピンを使用していました。このような単純なピンで安定化骨折の治癒は巨大なカルス形成と関連していたが、技術は欠点のかなりの数を産みました。これらには、ピンの脱臼と軸と回転安定性の障害に起因する不均質な治癒応答。これらの欠点は、実験の結果、骨治癒のメカニズムを分析しようとする最近の研究に影響することが知られているが、まだ破壊がピン13でのみ安定化され、あるいは安定化放置されたマウスモデルを使用し15のプロセスに影響を与えるため、このように、我々は、臨床で使用されるものに匹敵する安定した骨接合技術は、また、マウスで使用されるべきであると感じています。

単純な髄内ピンのそれと比較した場合、髄内、ロック爪のコストが大幅に高くなります。しかし、ピンは脱臼のリスクを負担し、軸方向および回転安定性を提供していません。これは、結果の品質に影響を与え、研究のための動物のより多くを必要とすることができます。対照的に、釘をロック髄内、結果の減少ばらつき、その結果、標準化度の高い骨切り術や骨欠損の安定化を可能にします。これは、動物の必要数の減少につながります。

一般的に使用されるピンの軸と回転不安定性を克服するために、いくつかのインプラントは、過去数年の間に導入されています。これらは、特に変更された遠位ヘッドおよび近位ねじ山5によって破壊圧縮を誘発する髄内ネジを、含まれています。

ネジを移植するために必要な外科技術は、簡単で、髄内釘のそれより低侵襲的です。ただし、ネジは釘4と比較してより低い回転剛性を示しています。軸方向の安定性は、骨折を横切って骨片の軸方向の圧縮によって達成されるので、また、欠陥の治癒のモデルとして使用することができません。

剛性固定するために使用することができる内部ロックプレートは、膜内骨化9によって支配されている骨の治癒をもたらします。癒しのこのタイプは少しカルス形成に関連付けられているため、このモデルでは、生化学的および分子解析のためのカルス組織のより大量を必要とする実験では好まれないことがあります。興味深いのは、内部ロッキングプレートもdをすることができますより柔軟な固定法16のためesigned。このフレキシブルプレートを使用して、骨の治癒は、軟骨内骨化およびカルス組織より多くの量でこのような結果に支配されています。しかし、カルス形成は、サイト反対プレートの配置で主に発生し、不均一です。ロッキングプレートは、骨欠損の安定化を可能にします。しかしながら、ギャップの大きさは限られており、信頼性の高い非癒合形成6をもたらしません。

マウスのための創外固定器は、骨欠損の治癒を分析するための爪に明確に定義された代替手段を提供しています。ここで紹介した爪に比べて創外固定器の主な利点は、骨治癒17の間、in vivoでのインプラントの剛性を確認するための可能性です。しかし、外部から印加された固定部品へのピンの感染症と正常な身体活動の変化も考慮しなければなりません。

特別な関心、どちらもint型のernalロックプレートも創外固定器は、骨欠損の治癒に分析することができる別個の代用骨および組織工学構築物の標準化された固定を可能にします。これら2つの手法を使用する場合、代用骨または組織工学構築物は、通常、追加の固定18を必要とする欠陥に入れなければなりません。これとは対照的に、釘の使用は、適切な位置決めと固定( 図6)を設け、爪の上に代用骨の移植を可能にします。

ここで紹介髄ロック爪は、臨床診療における外傷患者の治療のために使用される釘に匹敵します。したがって、我々は、爪が正常から不良に至るまで、マウス骨治癒研究の広いスペクトルで使用することができることを感じています。

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Acknowledgements

この作品はRISystem AG、ダボス、スイスによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MouseNail RISystem AG 221,122
MouseNail aiming device RISystem AG 221,201
MouseNail interlocking pin RISystem AG 221,121
Centering bit RISystem AG 592,205
Drill bit RISystem AG 590,200
Gigli wire saw RISystem AG 590,100
Suture (5-0 Prolene) Ethicon 8614H
Forceps Braun Aesculap AG &CoKG  BD520R
Dressing forceps Braun Aesculap AG &CoKG  BJ009R
Scissors Braun Aesculap AG &CoKG  BC100R
Needle holder Braun Aesculap AG &CoKG  BM024R
24 G needle BD Mircolance 3 304100
27 G needle Braun Melsungen AG 9186182
Scalpel blade size 15 Braun Aesculap AG &CoKG  16600525
Pincers Knipex 7932125
Heat radiator Sanitas 605.25
Depilatory cream Asid bonz GmbH NDXZ10
Eye lubricant Bayer Vital GmbH 2182442
Xylazine Bayer Vital GmbH 1320422
Ketamine Serumwerke Bernburg 7005294
Tramadol Grünenthal GmbH 2256241
Disinfection solution (SoftaseptN) Braun Melsungen AG 8505018
CD-1 mice Charles River 22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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