Avaliando Retinal microglia fagocítica Função

Immunology and Infection

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Summary

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

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Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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Abstract

Introduction

O objetivo geral deste método consiste em avaliar com precisão e quantificar na fagocitose microglial vivo. Microglia são os macrófagos residentes de tecido do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham uma variedade de funções para assegurar a manutenção da homeostase dos tecidos. Estes incluem a vigilância imunológica, a secreção de fatores neurotróficos e, de importância fundamental, fagocitose 1. Fagocitose microglial é fundamental em diversos eventos importantes durante o desenvolvimento do cérebro e da retina, tais como fagocitose de sinapses irrelevantes (poda sináptica) e remoção dos neurónios apoptóticas 2-4. Além disso, a fagocitose da microglia de neurónios danificados ou apoptóticas, detritos celulares, e os micróbios invasores foi demonstrado ser essencial para a manutenção da homeostase do SNC através da idade adulta 5. Finalmente, a fagocitose da microglia tem sido implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer e Age-Relateddegeneração macular, onde tem sido sugerido que a capacidade fagocítica defeituoso ou insuficiente, podem contribuir para a acumulação de amilóide-p placas e drusas (Ap), respectivamente 6,7.

função da microglia é fortemente regulada por seu microambiente, nomeadamente por factores solúveis, tais como o factor de crescimento tumoral-β ou interacções célula-célula. Os neurónios expressam constitutivamente vários ligandos da superfície celular, tais como CD200 e CX3CL1, enquanto microglia expressam exclusivamente os respectivos receptores CD200R e CX3CR1. Esses receptores contêm imunor motivos de inibição baseada em tirosina (ITIMs) em sua porção intracelular. Estes receptores são críticos inibidor para prevenir a sobre-estimulação da microglia, que pode contribuir para neuroinflama�o. Deste modo, sob condições fisiológicas normais, a interacções célula-célula entre neurónios e microglia microglia manter num estado de repouso. Durante lesão tecidual, no entanto, os neurônios podem infra-regular expression destes ligandos, removendo o seu efeito inibidor na activação da microglia. Função da microglia (incluindo fagocitose) é, portanto, fortemente ligado ao seu microambiente 8. No entanto, até à data, não existem testes padronizados para estudar a fagocitose da microglia num contexto fisiológico ou de uma maneira que replica totalmente o seu microambiente do SNC.

Vários ensaios foram desenvolvidos para medir a actividade fagocítica de microglia in vitro, em que a microglia primárias ou linhas de células da microglia foram cultivadas com células alvo (por exemplo, neurónios apoptóticos) ou esferas marcadas com fluorescência. Captação alvo é então avaliada por microscopia de imagem fluorescente ou citometria de fluxo 9-12. Estes ensaios permitir o teste de como a manipulação genética ou farmacológica pode afectar a fagocitose da microglia e, ao mesmo tempo informativo, não conseguem replicar completamente o complexo no ambiente in vivo. Métodos indiretos para examinar a fagocitose microglialin vivo foram relatados: estes são realizadas através de coloração de moléculas que se pensa estarem envolvidos na fagocitose (por exemplo, CD68), avaliando a proximidade física da microglia e alvos para a fagocitose (por exemplo, neurónios comprometidos ou elementos sináptica), ou por detecção imuno-histoquímica de fagocítica alvos dentro das células microgliais (por exemplo, Ap) 13-17. Dois estudos usaram abordagens mais diretas para avaliar microglia fagocitose in vivo. Hughes e seus colegas usaram técnicas de imagem para medir o aporte de microglial de contas entregues por via intracraniana 18. Sierra et ai. Desenvolveram um método aperfeiçoado para avaliar quantitativamente a fagocitose da microglia de células apoptóticas, utilizando técnicas de imagem complexas 4. No entanto, estes métodos envolvem protocolos complicados para a preparação do tecido, corte, de imagem e análise. Temos anteriormente utilizada a análise de citometria de fluxo para avaliar a fagocitose de fotorreceptor para forasegmentos de er por células da retina epitélio pigmentado (RPE) em cultura 19. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a absorção rápida de marcação fluorescente partículas por microglia da retina como uma medida quantitativa da in vivo microglia fagocitose.

O protocolo aqui descrito permite a medição fiável e quantitativa da fagocitose da microglia da retina em pouco menos de seis horas em três passos críticos: (1) a entrega intravítrea de partículas marcado por fluorescência, (2) da colheita e da preparação de tecido retiniano, e (3) o fluxo A análise de citometria. O método que desenvolvemos é um método robusto para avaliar a fagocitose da microglia na retina, e pode ser utilizado com sucesso para testar como vários compostos ou manipulação genética alterar esta função chave na microglia configurações fisiológicas. Como uma área especializada do sistema nervoso central, a retina é um sistema modelo facilmente acessível para estudar a função microglia 20. Enquanto este método foi desenvolvido no tele olho, acreditamos que ele pode ser útil para todos os neurocientistas que investigam função microglia fagocítica.

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Protocol

Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Preparação de materiais para Injection

  1. Esterilizar uma agulha de 33 G e seringa: desmontar e autoclave a 115 ο C. Prepare agulhas para injecção pelo aumento em fosfato salino estéril (PBS).
  2. Descongelar partículas marcadas por fluorescência à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. Preparar a solução de partículas para injecção através da reconstituição de uma solução a 50 mg / ml em PBS estéril com Ca 2+ / Mg 2+.
    NOTA: partículas AF488-rotulados de origem fúngica que foram validados por ensaios de fagocitose são utilizados neste protocolo 21-23. Para a absorção óptima, preparar partículas fresco e imediatamente antes da injeção.
    Nota 2: As concentrações de partículas pode ser optimizado para cada experiência específica.

2. A injeção intravítrea de Solução Bead

NOTA: Dois pessoas são necessários para realizar a injecção, de uma maneira tal que a pessoa que executa a injecção pode conter o rato e manter o foco sobre o globo ocular, enquanto a outra pessoa passa a seringa carregada e empurra o êmbolo.

  1. Anestesiar a roedores por injecção intraperitoneal de 100 mg / ml de cetamina e 10 mg / ml de xilazina na dose de 20 mL / 10 g de peso corporal. Antes da injecção, utilize toe pitada para avaliar o nível de anestesia.
    NOTA: O isoflurano tem um profundo efeito sobre a função de células mielóides, assim, a sua utilização ao longo deste ensaio devem ser evitados 24,25.
  2. Carga agulha com 0,5 ul de solução de partículas marcado por fluorescência.
  3. Coloque o mouse de lado sob um microscópio cirúrgico (Figura 1A-B). Usar um material macio, por exemplo, um pacote de gel, para um melhor posicionamento do rato. Para ratos jovens em que os olhos ainda não estão abertas, abrir suavemente as pálpebras com a ajuda de finos 45 o forceps ângulos, criando um fissure ao longo da fenda de onde as pálpebras acabará aberto.
    1. Com a ajuda de uma pinça fina 45 o ângulo cuidadosamente aplicar pressão em torno da pálpebra, para que o globo ocular aparece ligeiramente para fora do soquete. Segure a cabeça com dois dedos logo acima da orelha e pela sua mandíbula e delicadamente esticar a pele em paralelo com as pálpebras para manter o olho ligeiramente para fora do soquete. Tenha cuidado para não entender muito perto da garganta (Figura 1B).
  4. Para perfurar o globo ocular, inserir a agulha da seringa no limbo da córnea (onde a córnea e esclera conectar). Isto é visível como um círculo cinzento em ratos pigmentados. Retrair a agulha ligeiramente para expulsar um pequeno volume de fluido vítreo e depois injectar. A pessoa que executa a injecção deve gentilmente segure o mouse com uma mão e a agulha com a outra; a segunda pessoa deve lentamente empurre o êmbolo.
  5. Retrair a seringa lentamente. hidratante aplicar colírio para manter o olho hidratado. </ Li>
  6. Deixe o roedor se recuperar em uma jaula sobre uma almofada de calor e continuar a monitorar o animal. Se trabalhar com filhotes, não devolver o animal para uma gaiola com outros animais de alerta até que seja respiração e capazes de movimento espontâneo. Se trabalhar com adultos, não devolva o roedor a uma gaiola com outros animais de alerta até que ele recupere decúbito esternal.

3. Colheita de tecido da retina

NOTA: tecido da retina dos olhos não injetadas com partículas fluorescente etiquetado deve ser coletado como um controle para análise de citometria de fluxo. Embora o ensaio pode ser realizado utilizando um único retina, para melhor desempenho, duas retinas devem ser reunidas em conjunto.

  1. Recolha de tecido da retina de 3 horas após a injecção intravítrea de partículas marcadas com fluorescência.
    NOTA: Enquanto o tempo após a injecção da solução de partículas pode ser optimizada para cada experiência específica, verificou-se que três horas após a injecção, a absorção da partícula poderia ser visto ao longo maioria das camadas óf a retina (Figura 1C-D).
  2. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical.
  3. Recolher os globos oculares pressionando suavemente contra a pálpebra com a ajuda de 45 o forceps angulares finos para proptose do globo ocular. Posicionar a pinça por trás do globo ocular e puxar.
  4. Dissecar a retina sob um microscópio de dissecação. Transferir o globo ocular para uma placa de Petri contendo uma pequena quantidade de PBS com Ca 2+ / Mg 2+. Em uma área seca da placa de Petri, perfurar o globo ocular no limbo da córnea com a ponta da pinça superfina.
  5. Segurar o globo ocular com o auxílio de uma pinça fina 45 o ângulo e utilize uma tesoura para cortar mola em torno do limbo da córnea, até cerca de metade da circunferência do limbo da córnea é cortado.
  6. Segure o globo ocular com as finas 45 o forceps angulares e trazer o globo ocular em PBS. Com um segundo par de fórceps finos 45 o rasgo angular da córnea e esclera separados. A lente e retina vai sair intact.
  7. Separe a lente e retina. Recolhe-se o retina e transferir para um tubo de ensaio de 5,4 ml de poliestireno contendo 2 mL de PBS com Ca 2+ / Mg 2+.

4. Preparar uma suspensão única célula

  1. Preparar suspensões de células individuais utilizando um kit de dissociação de tecido neuronal com pequenas modificações com as instruções do fabricante. Resumidamente, retinas Triturar por pipetagem cima e para baixo com uma pipeta P1000 e realizar uma digestão enzimática a 37 ° C sem agitação.

5. suspensões de células individuais de coloração para Análise de Citometria de Fluxo

  1. Ressuspender as células em 200 ul de tampão de coloração (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com albumina de soro bovino 0,2% (BSA) e 0,09% de azida de sódio) e transferência para uma placa com fundo em U de 96 poços. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g.
    NOTA: A azida de sódio é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Uso adequado de protecção pessoal equipamentos dend descartar os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
  2. Inverter a placa sobre uma pia para descartar sobrenadante. Para bloquear os receptores Fc, ressuspender as células em 25 ul de tampão de coloração contendo 5 ug / ml de anticorpo anti-ratinho de CD16 / CD32 por poço. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Adicionar 25 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de anti-ratinho de Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml de anti-rato Ly6G-Pe-Cy7 e 2,5 ug / ml de anti-rato-CD11b AF650. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  4. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g. Inverta a placa para descartar o sobrenadante. Lavar as células por ressuspensão em 200 ul de tampão de coloração.
  5. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g. Ressuspender em 200 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de iodeto de propídio (PI). Transferir 1,2 ml para tubos de microtitulação.
  6. Lavar os poços com um adicional de 100 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de PI e piscina com as anteriores em 200 ul do1,2 ml de tubos de microtitulação. Obtém-se um volume total de 300 ul de células coradas.

6. análise citométrica de fluxo

  1. Usando um laser convencional de três (violeta, azul e laser vermelho), evitar o PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e corantes PI devido ao transbordamento significativo dos AF488-partículas fluorescentes extremamente brilhantes. Utilize uma quarta laser (amarelo) para optimizar este ensaio, uma vez que permite um PI e anticorpos marcados com PE (no canal mCherry em vez do canal PerCP-Cy5.5) a ser usado (Figura 2).
    NOTA: Se um laser amarelo não estiver disponível, use um corante de exclusão de células mortas em outro canal.
  2. Portão em células negativas para PI (PI-) para excluir as células mortas (Figura 2B).
  3. Depois de excluir as células mortas, porta de células positivas CD11b (CD11b +), isso vai incluir todas as células mielóides (Figura 2C).
  4. Dentro da população CD11b +, portão Ly6C - / Ly6G - para excluirneutrófilos (CD11b + / + Ly6G) e monócitos (CD11b + / + Ly6C; Figura 2D). Depois de gating em microglia (aqui definido como CD11b + / Ly6C - / Ly6G - para simplificar), duas populações claras deve ser visível; uma negativa e uma positiva para as partículas marcadas com fluorescência. As células fagocíticas terá tomado as partículas e, portanto, AF488 + (Figura 2E).
    NOTA: populações Ly6C positivo ou Ly6G positivos podem também ser analisados ​​para medir a absorção de partículas usando esta abordagem coloração. A percentagem de células fagocíticas CD11b + correlaciona-se bem com a percentagem de microglia fagocítica (Figura 2F). Para os investigadores sem experiência de citometria de fluxo, uma análise mais simples apenas com CD11b de coloração pode ser realizado, embora este incluirá neutrófilos e monócitos fagocíticas, bem como microglia. Dentro deste CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> população, estas células são> 99% da microglia, como avaliado por coloração com os marcadores de F4 / 80 e CX3CR1; estes marcadores podem ser adicionados, mas não são necessárias nas nossas mãos.

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Representative Results

Descrevemos aqui um método para rapidamente e de forma fiável quantificar o número de microglia da retina fagocíticas num ambiente fisiológico utilizando análise de citometria de fluxo (Figura 2). Este método pode ser adaptado para testar o efeito dos compostos e / ou manipulação genética sobre a capacidade fagocítica de microglia (Figuras 3A, 3B). Ele também pode ser usado em jovens (10 - 20 dias pós-parto) ou ratinhos adultos (Figura 3C). Diferentes doses de lipopolissacárido (LPS) foram administrados por via intraperitoneal. 24 horas após a provocação com LPS, o protocolo aqui descrito foi utilizado para avaliar a função fagocítica microglia da retina (Figura 3A). Uma dose de 1,42 mg / kg de LPS induziu um aumento estatisticamente significativo na percentagem de microglia fagocíticas quando comparado com o controlo de veículo (Figura 3B), como seria de esperar 26.


Figura 1: Configuração injeção intravítrea e Seção Retinal Representante mostrando Partículas marcado por fluorescência em camadas da retina. (A) Um pacote de gel é colocado sob o microscópio de dissecação. (B) Um roedor é realizada como se mostra a posição do olho por injecção intravítrea. (C) Três horas após a injecção de partículas marcadas com fluorescência pode ser visto camadas durante a maior parte da retina. (D , ratinhos e) CX3CR1 GFP / GFP e partículas marcadas com um fluoróforo vermelho foram usadas para visualizar a captação de partículas por microglia. Microglia no mais profundo (D) e as camadas superficiais (E) ocupam partículas. Barras de escala -. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Estratégia de gating selecionar fagocítica microglia (A) As células suspensões individuais de tecido retiniano de um rato p10 são analisados (B) Após a exclusão de células mortas (PI +), (C) células CD11b + são seleccionadas (D)... seleccionar apenas para a microglia, CD11b + neutrófilos (Ly6G +) e monócitos (Ly6C +) estão excluídos. (e) microglia fagocítica terá tomado as partículas marcadas com fluorescência. (F) O número de células fagocíticas CD11b + é semelhante ao da microglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, reunidos a partir de três experiências independentes; barras de erro representam a média ± SEM.rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Microglia fagocítica função pode ser avaliado após LPS Desafio e em filhotes e ratos adultos (A) ratos Young (p10) foram desafiados com LPS intraperitoneal em doses variadas, 24 horas antes de avaliar a fagocitose (B) Desafio com 1,42 mg /. kg resultou em um aumento significativo da percentagem de microglia da retina fagocíticas quando comparados aos controles do veículo (p = 0,0021). (C) Este protocolo pode ser usado para medir a função fagocitária microglial da retina em filhotes e adultos ratos igualmente. Há uma percentagem significativamente menor de microglia fagocitária em ratinhos adultos jovens quando comparado com (P10) ratos (p = 0,019) não desafiados com LPS. n = 9 -12, reunidas de três para quatroexperiência independente; barras de erro representam a média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Existem três passos críticos neste método: (1) injecção intravítrea de partículas marcado por fluorescência; (2) a colheita e preparação do tecido da retina; e (3) análise de citometria de fluxo. Recomendamos que os pesquisadores praticar injeções intravítreas antes de realizar o método que aqui apresentamos. Murganhos albinos (por exemplo, murganhos BALB / C) e uma solução de cor (por exemplo, partículas marcadas por fluorescência) pode ser utilizado para facilitar a visualização da agulha e solução injetadas. injecções intravítreas são desafiadoras e se não for realizado corretamente conduzirá a resultados tendenciosos e variáveis. Os problemas comuns associados com má técnica de injecção são a perfuração da lente e / ou danos na retina, o que pode resultar em hemorragia e inflamação. Para minimizar o risco de trauma para o olho, o roedor deve estar numa posição estável com o movimento da cabeça mínima. Para penetrar no globo ocular, a seringa deve ser inserido lentamente e não empurrado longe demais para evitar bateras lentes. Outra complicação comum é o refluxo do material injectado para fora do olho. Para evitar isso, o êmbolo deve ser pressionado lentamente e, após a injeção, o globo ocular deve ser deixada retrair no soquete de olho e a seringa deve ser recolhido lentamente. Os melhores injecções intravítreas activar microglia em níveis baixos, mas claras diferenças entre os grupos tratados e não tratados podem ser medidos. É essencial que os controlos apropriados (por exemplo, ratos, não desafiado) são utilizados em cada experiência para determinar os níveis de linha de base fagocíticas. Outro aspecto do presente método requer que a prática é a dissecção da retina. Para garantir preparações de células única comparáveis ​​entre espécimes, tecido da retina devem ser recolhidos de forma rápida e com o mínimo de interrupção de tecido possível. Realizando os últimos passos de dissecção em PBS (ver 3,4-3,7) irá facilitar a recolha. Finalmente, é importante preparar o tecido retiniano por citometria de fluxo correctamente. microglia activados upregulate Fcreceptores e, portanto, a ligação não específica para a porção Fc de anticorpos podem ocorrer 7. Um bloco de Fc deve ser realizado para evitar coloração não específica. Seleção de fluoróforos e compensações configurar adequados também é importante 27.

Nós usam rotineiramente camundongos com idade entre 10 a 20 dias pós-natais para estas experiências. No entanto, este protocolo pode também ser utilizada para avaliar a função fagocítica microglial em ratinhos adultos (Figura 3C). É de notar que, devido à presença da vasculatura hialóide, as populações de células mielóides exógenos (Ly6C + ou Ly6G +) são mais proeminentes em ratos jovens (aproximadamente 40 - 50% de todas as células CD11b +) do que em adultos (cerca de 5% de todos CD11b + células). Os investigadores devem determinar a idade mais adequada para seus experimentos. O protocolo aqui apresentado permite a detecção robusta dos níveis de microglia fagocítica na retina. No entanto, recomendamos que 3-4 biológicaai replica ser utilizado em cada experiência, e que, pelo menos, três experiências independentes são realizados. Enquanto as partículas utilizadas neste protocolo foram validados para ensaios fagocíticas 21-23, se a validação adicional é necessária, poderia ser realizada imuno-histoquímica co-localização das partículas com marcadores fagocíticas específicos.

Uma limitação potencial deste método é o acesso diferencial da microglia às partículas. Na retina normal, microglia residem em duas camadas, a camada mais profunda plexiforme externa, e a camada plexiforme interna mais superficial, a qual está mais perto ao vítreo 7. Após a estimulação, ou durante o envelhecimento, microglia pode migrar em todas as camadas da retina. Neste método, as partículas marcadas com fluorescência são injectados para dentro do vítreo. Três horas após a injecção, isso resulta em acumulação de partículas ao longo da retina e, particularmente, ao longo da superfície vítrea. Os pesquisadores podem otimizar ainda mais os concentratina de partículas ou do tempo de injeção para seus experimentos. É provável que a microglia em estreita proximidade com o vítreo terá acesso mais fácil para as partículas. No entanto, mostra-se que as partículas se espalhar através da retina e são captados por microglia em todas as camadas, mas não em células do epitélio pigmentado da retina (RPE), provavelmente devido ao acesso limitado talão (Figura 1C-E). Ainda temos que determinar se microglia sub-retiniana (que pode acumular com a idade) teria acesso às partículas. Se isso é importante para o pesquisador, este protocolo poderá ser realizada após a injeção sub-retiniana cuidadosa das partículas. Outra consideração importante é que não podem ser inerentemente diferentes comportamentos entre microglia da retina e microglia em outras regiões do SNC. É bem conhecido que as regiões específicas do cérebro têm diferentes susceptibilidades a doenças. Por exemplo, na doença de Parkinson, os neurónios na substantia nigra são principalmente afectados, enquanto nos Alzdoença de heimer, os neurônios do hipocampo são os mais afetados 28. Assim, quando se estuda a patologia de uma doença específica, a região do cérebro é provável que seja um factor importante. Um protocolo semelhante ao descrito aqui pode ser realizada após a injecção intracraniana para explorar as diferenças de potencial na resposta fagocítica entre microglia da retina e do cérebro. A retina tem muitas características comuns com outras regiões do cérebro, incluindo a presença de um sangue-retina-barreira 20. Microglia retina e microglia cérebro originam dos mesmos progenitores saco vitelino e parecem muito semelhantes em relação à morfologia e da superfície celular expressão do marcador 7,29. Além disso, várias doenças cerebrais (por exemplo, doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla e) têm manifestações oculares, indicando que a retina é também afectado 20. Enquanto os pesquisadores devem estar cientes dos potenciais diferenças regionais, acreditamos que este é um modelo informativo paratodas as pesquisas microglia, e sugerem que todos os neurocientistas que estudam fagocitose microglial poderia usar este protocolo.

Uma vantagem distinta para a realização deste ensaio no olho é que várias técnicas têm sido desenvolvidas para induzir tensões diversas neurogénicos na retina, e as respostas de stress pode ser monitorizada in vivo e quantificado usando protocolos padronizados 30. Ao induzir estresse neurogênica e depois da realização do ensaio descrito aqui, os pesquisadores podem analisar função microglia em um amplo espectro de insultos que variam em gravidade. Finalmente, quando combinado com as técnicas de triagem de citometria de fluxo, este protocolo tem a vantagem sobre os imuno-histoquímica que pode permitir a análise em profundidade da microglia fagocítica (por exemplo, qPCR, cultura celular, proteómica).

A absorção de partículas tenha sido previamente utilizado para medir a função fagocítica, tanto in vitro e in vivo em sistemas. a latter envolveu a injeção intracraniana de partículas, colheita e congelamento de tecido cerebral, cryosectioning, imunocoloração, de imagem e análise pós-imaging 18. O protocolo aqui apresentado permite a quantificação muito mais rápida da função fagocítica microglia da retina. Tem a vantagem sobre os sistemas in vitro que a microglia altamente sensíveis não são removidos do seu microambiente, permitindo a avaliação da função fagocítica, num contexto fisiológico. Especificamente, ele deve permitir o teste de defeitos como em outros tipos de células (por exemplo, a ablação genética de genes em neurónios) afectam a função fagocítica microglia. Ele também tem a vantagem sobre os anteriores ensaios in vivo que utiliza a citometria de fluxo, permitindo a detecção rápida e quantitativa, e exacta das populações de células fagocíticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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