Immunology and Infection
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Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo
Chapters
Summary April 10th, 2019
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Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.
Transcript
Este ensaio de fagocitose in vivo permite que os pesquisadores realizem telas genéticas e estudos de associação genoma para identificar novos genes que regulam a fagocitose em células sanguíneas adultas. Este experimento é quantitativo, fácil de realizar, e pode ser aplicado à triagem de animais vivos para fatores hospedeiros que influenciam o reconhecimento, absorção e liberação de patógenos. Depois de puxar capilares de vidro de parede fina com um puxador de agulha, use um micrômetro para segurar a agulha sob um microscópio, e use o número cinco, pinças de aço inoxidável de ponta fina para quebrar a ponta para um diâmetro de ponta de 100 micrômetros.
Para medir o volume de líquido que será injetado em cada mosca, carregue uma agulha capilar com coloração de alimentos estéril de 5% em PBS e expela o líquido em uma gota de óleo mineral em um micrômetro de estágio de 0,01 milímetros. Distribua 10 microlitadores de 1,6 miligramas por partículas mililitros em um pequeno quadrado de Parafilm, e puxe o líquido para dentro da agulha. Monte a agulha no bocal do injetor, e forra as moscas anestesiadas ao longo de sua área designada na plataforma de voo, lado ventral para cima, com as cabeças orientadas para a frente da almofada.
Coloque os frascos em áreas correspondentes no banco, e injete as moscas no canto superior do abdômen com cinco bombas de 100 milissegundos de líquido para entregar cerca de 10 nanoliters de partículas totais. Transfira cada mosca para o frasco apropriado à medida que for injetado, observando o tempo no frasco. Em seguida, carregue uma nova agulha com solução 0,4%Trypan Blue, e ajuste o injetor pneumático para o portão, para permitir um fluxo constante de ar para empurrar o líquido para fora da agulha.
30 minutos após a injeção inicial, injete cada abdômen de mosca com Trypan Blue até que os abdômens estejam cheios e distendidos. Monte as moscas em deslizamentos de microscópio com fita elétrica, lado ventral para baixo, empurrando as asas para o lado da mosca para fixá-las à fita. Em seguida, empurre suavemente a cabeça para dentro da fita para garantir que a mosca não se mova.
Imediatamente depois de todas as moscas terem sido protegidas, imagem os insetos, um de cada vez, em uma ampliação 25 ou 32 vezes em um microscópio de fluorescência invertida ligado a uma câmera digital e computador, focando no vaso dorsal de cada mosca usando o software do computador para a câmera digital. Em seguida, regise o tempo de exposição e a ampliação entre os experimentos. Para quantificar a fluorescência, abra um programa de análise de imagem apropriado e abra uma imagem.
Para medir a intensidade da fluorescência do vaso dorsal, desenhe um polígono ao redor do vaso dorsal e selecione Medida para registrar a intensidade da fluorescência dentro do polígono. Para determinar a intensidade da fluorescência de fundo, copie o primeiro polígono e mova-o para uma área adjacente ao vaso dorsal de cada mosca. Em seguida, selecione Medir e regise a intensidade da fluorescência da área de fundo.
Para normalizar a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, depois de medir as intensidades de fluorescência do resto das moscas, divida a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, e calcule a intensidade média normalizada da fluorescência do vaso dorsal de todas as moscas em uma cepa. Após ser montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita elétrica, os dois primeiros segmentos do abdômen, onde o vaso dorsal está localizado, são claramente visíveis. As principais fontes de erro experimental surgem nas etapas de injeção e imagem do procedimento.
Usar a mesma agulha para injetar várias moscas pode fazê-la ficar entupida com tecido de mosca ou partículas. Moscas que não recebem fluorescência trippan azul suficiente brilhantemente em todo o seu abdômen, o que pode reduzir a razão do vaso dorsal para a fluorescência de fundo, diminuindo assim a verdadeira razão de intensidade de fluorescência do animal. As moscas devem ser fotografadas enquanto imobilizadas por dióxido de carbono, pois moscas em movimento ativo produzem imagens embaçadas que não podem ser quantificadas.
Uma linha mutante da coleção Zuker de moscas tratadas com metanosulfonato etílico são incapazes de fagocytose gram-negativas e gram-positivas bactérias e não exibe quase nenhuma fluorescência de vaso dorsal no ensaio de fagocitose in vivo, emparelhado com a cepa de fundo isogênico Zuker e outra cepa comum de controle de laboratório. Acompanhe o tempo e a ordem em que as moscas são injetadas para garantir que as moscas estejam em estágios comparáveis de reconhecimento e absorção de patógenos quando imagens. Os mecanismos moleculares subjacentes aos defeitos fagocíticos podem ser determinados estudando hemócitos únicos com microscopia confocal ou após a triagem celular ativada pela fluorescência ou pelo isolamento magnético de hemócitos adultos.
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