Author Produced

Парные шарик и магнит массив для литья Microwells с переменной геометрией вогнутый

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Эта рукопись вводит надежный метод изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Использование магнитных сил, стальных шариков и массив через отверстие, несколько сотен microwells были сформированы в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Сфероида культура является полезным инструментом для понимания клеточного поведения в том, что он обеспечивает в естественных условиях-как трехмерной среде. Различные методы производства сфероида такие как non клей поверхностей, спиннер колбы, висит капли и microwells были использованы в исследованиях по вопросам взаимодействия в ячейке, иммунной активации, наркотиков скрининг, стволовых дифференцировки клеток и органоид поколения. Среди этих методов microwells с трехмерной геометрии вогнутой завоевали внимание ученых и инженеров, учитывая их преимущества единообразного размера сфероида поколения и легкость, с которой может быть ответы отдельных сфероидов мониторинг. Даже несмотря на то, что были предложены эффективные методы такие, как использование гибких оболочек и льда литографии, эти методы понести серьезные недостатки, такие как сложно контролировать размеры шаблона, достижение высоких пропорций и производство большие области microwells. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы предлагаем надежный метод для изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Этот метод использует массив через отверстие 30 x 30, несколько сотен микрометр порядка стали бусы и магнитные силы для изготовления 900 microwells в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см. Чтобы продемонстрировать применимость нашего метода ячейку биологических приложений, мы культивировали жировых стволовых клеток для 3 дней и успешно производится с помощью нашей платформы микрорезервуар сфероидов. Кроме того мы провели магнитостатических моделирования для изучения механизма, согласно которому магнитная сила была использована для ловушку стальные шарики через отверстия. Мы считаем, что предлагаемый микрорезервуар изготовление метод может применяться для многих сотовых исследования, основанные на сфероиде таких наркотиков скрининг, регенерации тканей, дифференцировки стволовых клеток и рак метастазы.

Introduction

Клетки, превратилась в форму сфероида больше похожи на реальные ткани в организме, чем двумерной плоскости культуры1. Учитывая это преимущество, использование сфероидов был принят для улучшения деятельности по изучению взаимодействия в ячейке2,3, иммунной активации4, наркотиков скрининг5и6дифференциации. Кроме того недавно были применены к organoids (рядом физиологических трехмерные (3D) ткани), которые являются очень полезными для изучения человеческого развития и болезней7сфероидов, включающий несколько типов клеток. Некоторые методы были использованы для производства сфероидов. Простейший метод предполагает использование поверхности без клея, таким образом, что клетки агрегировать друг с другом и формы сфероидов. Петри блюдо можно лечить с бычьим сывороточным альбумином, плюрониевого F-127 или гидрофобный полимер (например поли 2-hydroxyethl метакрилат) сделать его поверхности не клей89. Спиннер фляжка метод является еще одним известным средством производства большого количества сфероидов10,11. В этом методе клетки проходят в подвеска, помешивая, чтобы помешать им стать присоединяется к подложке. Вместо этого плавающей клетки агрегат в форме сфероидов. Поверхности метод non клей и паук фляжка метод может производить большое количество сфероидов. Однако они действуют ограничения, включая трудности в контролировать размер сфероида, а также отслеживание и мониторинг каждого сфероида. Как средство для таких проблем, другой метод производства сфероида, а именно, висит падение метод может быть занятых12. Это включает в себя хранение клеток подвеска капель на внутренней стороне крышки культуры блюдо. Эти капли обычно 15-30 мкл в размерах и содержит около 300 до 3000 клетки13. Когда крышка инвертируется, капли проводятся в месте поверхностного натяжения. Условия микрогравитации в каждой капле концентрируется клетки, которые затем образуют единый сфероидов на интерфейсе свободной жидкости воздух. Преимущества висит метод drop являются, что он предлагает хорошо контролируемых размер распределения, хотя это легко отслеживать и контролировать каждый сфероида, по отношению к не клей поверхности и spinner колбу методы. Однако, этот метод создает один недостаток в том, что массовое производство сфероидов и сам процесс производства является чрезмерно труда интенсивный.

В микрорезервуар массив является плоской пластины с многих микро размера скважин, каждый диаметром от 100 до 1000 мкм. Принцип производства сфероида при использовании microwells похож на поверхности метода non клей. Преимущества включают в себя тот факт, что microwells обеспечивают пробелы между microwells для разделения клетки или сфероидов, таким образом, что это легко контролировать размер сфероида, а также делает его легко контролировать каждый один сфероида. С большое количество microwells также возможна сфероида высок объём производства. Еще одним преимуществом microwells является возможность формы колодцы различной формы (шестигранные, цилиндрические, тригональная призматических) в зависимости от уникальных экспериментальных целей пользователей. Как правило однако, трехмерные (3D) вогнутые (полусферической) фигуру или рассматривается как наиболее подходящие для производства единообразного размера одного сфероидов. Таким образом, полезность вогнутые microwells было сообщено для многих исследований биологии клетки таких изучения cardiomyocyte дифференциация14эмбриональных стволовых клеток, секрецию инсулин островковых клеток кластеров15, Ферментативная активность гепатоцитов16и резистентности опухоли сфероидов17.

К сожалению изготовление microwells часто требует специализированных micropatterning услуги; обычные методы на основе фотолитографии требуют облучения и развивающихся объектов, в то время как реактивного ионного травления-методы, основанные нуждаются плазмы и ионно лучевого оборудования. Такое оборудование является дорогостоящим, вместе с процессом изготовления сложных представляет высокий барьер для вступления для биологов, которые не имеют доступа к микротехнологии. Для преодоления этих проблем, другие эффективные методы такие, как лед литографии18 (с использованием замороженных водных капель) и гибкой мембраны метод14 (с помощью мембраны, через отверстие субстрата и вакуума) было предложено. Однако эти методы также понести серьезные недостатки, такие как трудно контролировать размеры шаблона, достижение высокой пропорции и производство большей площади microwells.

Для преодоления вышеуказанных вопросов, мы предлагаем метод изготовления Роман вогнутой микрорезервуар использованием подложке через отверстие, стальные шарики и массив магнит. С помощью этого метода, сотни вогнутой сферических microwells могут быть изготовлены, используя механизм магнитной силы оказали помощь самоблокирующихся металлические бусины (рис. 1). Процесс изготовления предполагает использование очень мало дорогих и сложных объектов и не требует многих передовых навыков. Таким образом даже неквалифицированных лиц можно легко провести этот метод изготовления. Для демонстрации использования предложенного метода, человека жировой производные стволовые клетки были культивировали в вогнутые microwells производить сфероидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка через отверстие массив алюминиевые пластины и магнит массива

  1. Подготовить два 50 мм x 50 мм (или более) алюминиевых пластин. Толщина каждого листа был 300 мкм, что составляет половину диаметра шарика.
  2. Формируют массив через отверстие 30 x 30 на одном из алюминиевых пластин с помощью CNC вращающихся гравер с Φ550-мкм микро сверло с 30 мм/сек скорость окунуться и 8000 об/мин, скорость вращения шпинделя. Расстояние между каждой дыры (центр) был 1 мм (рис. 1a и 2a рисунок, я).
  3. Формируют массив 30 х 30 мкм Φ750 через отверстия на алюминиевой пластине, используя ту же процедуру, что и описанные в 1.2 (рис. 1a и 2a рисунок, ii).
  4. Приложите две пластины друг друга с помощью клейкой ленты и образуют Φ3 мм выравнивание отверстий на каждом из четырех углов двух алюминиевых пластин.
  5. Замочите алюминиевых пластин в 15% серной кислоты для 12 h для очистки их поверхностей. Так как тонкий слой оксида алюминия на поверхности алюминия делают коррозии, диаметр отверстия и Толщина пластины этой кислоты лечения не изменяются.
  6. Формируют массив 30 × 30 1 x 1 x 1 мм неодимовые магниты (с магнитной силой 0,363 N). Убедитесь, что каждый магнит противоположной полярности для своего соседа. Для предотвращения взлома или рассеяния магнит массива, прикрепите алюминиевой пластины 30 x 30 мм в нижней части магнита массива с помощью двухсторонней ленты (рис. 2a, iii и врезные в Рисунок 2).

2. шарик процесс треппинга

  1. Выравнивание и укладывают два алюминиевых пластин (Топ пластины: плита 750-мкм отверстие, Нижняя пластина: 550-мкм отверстие пластины) с использованием подготовленных выравнивание отверстий в четырех углах каждой пластины (рисунок 1b).
  2. Блокировки две пластины вместе, вставив м3 болты в отверстия выравнивание, а затем закрепите болты с гайками (рис. 1b).
  3. Стек алюминиевой пластины Ассамблеи на массиве подготовленный магнит (рис. 1b, 2bи 2 c). Совместите массив магнитов и массив через отверстия в алюминиевых пластин во время процесса укладки. Затем используйте Скотч исправить положение магнита массива.
  4. Место достаточное количество Φ600 мм SUJ2 стали бисер на собрании пластины и манипулировать бисер с помощью акрила (или неметаллические) пластины такой шарик будет поглощенной в каждое отверстие (рис. 1 c, 1 dи 1e) при одновременно Удаление избыточного бусы, которые не подали в отверстия.
  5. Осторожно снимите верхнюю крышку во избежание нежелательных рассеяния и вывих захваченных бусы (Рисунок 1f).

3. вогнутые микрорезервуар изготовление

  1. Переместите вогнутой микрорезервуар плесень, производимых в шагах 2.1-2.5, выше, в чашке Петри.
  2. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) мономера и отвердителя согласно инструкции производителя19 с мономером PDMS: лечить агента в соотношении 10:1.
  3. Де газ PDMS смесь с помощью эксикаторе и вакуумный насос удалить любые пузыри в ловушку в смеси PDMS.
  4. Вылейте смесь PDMS в вогнутое микрорезервуар плесень и де газ снова, используя ту же процедуру, что описано в 3,3 (Рисунок 1f).
  5. Выпекать PDMS смесь на конфорку при 80 ° C 2 h сформировать шарик встроенный PDMS субстрата (рис. 1 g).
  6. Удаление вылечить PDMS субстрат из формы (рис. 1 g). В процессе удаления спрей метанола с помощью стиральные бутылки для отсоединения PDMS субстрата от плесени.
  7. С помощью Φ15 мм х 2 мм магнит, удалите захваченных стальные шарики из PDMS субстрата (рис. 1 h). Для этого процесса может использоваться любой магнит, который является достаточно сильным, чтобы извлечь бусы из субстрата PDMS.

4. сфероида культура

  1. Вырежьте вогнутой микрорезервуар узорные PDMS субстрат с помощью удар биопсия Φ14 мм для установки в 24-ну пластины в этом исследовании.
  2. Стерилизация полученный субстрат PDMS мм Φ14 в стерилизатор-автоклав при 121 ° C и 15 psi.
  3. Место стерилизованные PDMS субстрата в 24 хорошо плиту.
  4. Покройте весь субстрат PDMS раствором 4% (w/v) плюрониевого F-127 на ночь для предотвращения клетки привязанность к поверхности микрорезервуар. Во время процесса покрытия удалите все пузырьки воздуха, захваченного в вогнутые microwells закупорить или с помощью ультразвуковой очистки.
  5. Очистить решение F-127 три раза с помощью фосфат амортизированное saline (PBS).
  6. 1 мл раствора клеток средний (Дульбекко изменение орел средняя) (которая содержит 2 х 106 клеток) на подложке PDMS семян. Обратите внимание, что плотность посева может быть изменена согласно целевой сфероида размер и/или целевой тип ячейки. Здесь были использованы жировой производные стволовые клетки (ASC).
  7. Аспирационная 1 мл среды, используя 1000 мкл пипетки для удаления любой избыток клетки, которые не попали в microwells (рис. 3).
  8. Инкубировать клетки на 36,5 ° C, влажность > 95% и 5% CO2 состояния. В случае ИСС, используемые в нашем исследовании клетки совокупные на сфероиде в 48 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выпуклая форма и шаблон микрорезервуар успешно были сфабрикованы, выполните шаги 2.1 до 3,7. (Рис. 4). Коммерческие стальных бусины попали в массиве 30 x 30 через отверстие. Бусины были проведены плотно без каких-либо пробелов между бусины и соответствующие сквозные отверстия (рис. 4a). Формы изготовлены вогнутой микрорезервуар является вогнутой полусферической, с диаметром 600 мкм, который является таким же, как из стальной шарик (рис. 4В). Сечение вогнутой микрорезервуар (рис. 4 c) показывает, что расстояние от соседних микрорезервуар 1 мм (в центр), который был таким же, как и через отверстия. Φ14 мм вогнутым микрорезервуар субстрат, который был помещен в 24 хорошо пластины, содержится свыше 120 microwells (рис. 4 d).

Стволовые клетки жировой производные были культивировали в вогнутые microwells. Мы семенами 2 х 106 клеток на Φ14 мм вогнутым микрорезервуар массива. После 24 часов клетки объединены в сфероидов, как показано на рисунке 4. Средний диаметр сфероидов, образованная в массиве наших микрорезервуар был 185.68 ± 22.82 мкм (день 1, Рисунок 5a, 5 c). На 3 день клетки стать более агрегированных, со средним диаметром сфероидов падения 147.00 ± 17.11 мкм (Рисунок 5b, 5 d).

Figure 1
Рисунок 1 : Схема изготовления процесса. a обеспечения 30 x 30 Φ550 и 750 мкм через отверстие массив в алюминиевых пластин с помощью CNC гравер. b согласование двух через пластины с помощью выравнивания отверстий. Впоследствии соответствие пластины были уложены на массиве магнит. (c) посева достаточное количество стальных шариков на пластины. (d) соскоб с использованием акриловой пластины поймать шарики в массиве через отверстие бусины. (e) бисер попали в массиве через отверстие. (f плиту (массив через отверстие Φ750-мкм) был удален и неотвержденных PDMS смесь сливали в плесени. (g) после PDMS пекли на 80 градусов за 2 ч, неформованные вылечить PDMS. (h вылечить PDMS хватает стальных шариков. Бисер, затем удаляются с помощью неодимового магнита (Φ15 мм с толщиной 2 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Процесс изготовления. a подготовка двух пластин через отверстие и магнит массив. i) алюминиевой пластине с 750 мкм через отверстие массив. II) алюминиевой пластине с 550 мкм через отверстие массив. III) 30 x 30 массив 1 мм x 1 мм x 1 мм магнитов. (b) сверху штабелироваться и соответствие плит. (c) снизу вид штабелироваться и соответствие пластины и магнит массив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Удаление чрезмерного клетки с отступающей мениска. Стремясь среднего, поверхностное натяжение было вызвано воздуха жидкость интерфейс, то поверхностное натяжение слом чрезмерное клеток на поверхности субстрата микрорезервуар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Выпуклой формы и сфабрикованных микрорезервуар массив. () захваченных бисер в массив через отверстие алюминиевой пластине. Ловушке бусины выступать в качестве пресс-формы для изготовления вогнутой microwells. Размер бисера был 600 мкм. Линейки шкалы — 1 мм. (b) и (c) SEM изображения изготовлены microwells. Каждый сфабрикованные микрорезервуар имеет полусферической формы, 600 мкм в диаметре. (d) Φ14-мм микрорезервуар массив в 24-ну пластины. Массив содержит более чем 120 вогнутые microwells. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Культура сфероидов в массиве вогнутой микрорезервуар. Φ14-мм микрорезервуар массив был посеян с 2 х 106 ИСС и культивировали в течение 3 дней. (a) культивировали сфероидов на 1 день; клетки начали формы сфероидов. Линейки шкалы — 2 мм. (b) культивировали сфероидов на 3 день; сформированные сфероидов более жестко структурированы, в то время как их средний диаметр упал с 185.68 ± 22.82 мкм на 1 день до 147.00 ± 17.11 мкм в день 3. Линейки шкалы — 2 мм. (c) масштаб изображения сфероида на 1 день. Линейки шкалы — 500 мкм. (d) масштаб изображения сфероида на 3 день. Шкалы бар-500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Результат моделирования для вектора плотности магнитного потока. Плотности магнитного потока на массиве магнит был рассчитан с использованием модуля магнитостатических. В результате моделирования показывает, что сильные плотности магнитного потока в центре каждого магнита, вызывая шарики в ловушке в центре через отверстия, где они стали надежно зафиксирован. Шкалы бар-2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Распределение магнитного поля магнита массива. Каждый магнит является противоположной полярности для своего соседа. Горизонтальное магнитное поле является доминирующей на стыке между соседними магниты, при сильных вертикального магнитного поля в центре каждого магнита. Эти направления силы руководство шарик в центре магнита. (a) магнитное поле магнита массива. (b) вектор магнитного поля определяется магнитостатических моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Ограничение, используя единый большой магнит и размер бисера. (a) в отличие от использования массива небольших магнитов, когда один большой магнит используется, почти все из бисера, как правило, перейти к краю или центр магнита, где образуется высокой плотности магнитного поля. Кроме того бисер подключены к форму цепи. Линейки-10 mm. (b) SEM изображение связанных микрорезервуар, которая производилась с помощью Φ800 мкм бусы с 1 x 1 мм x 1 мм магнит массива. С помощью шарик, который слишком большой размер относительно размера магнита можно создать небольшое отверстие в стене между смежными microwells. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9 : Важность выбора соответствующей плиту толщины и размера отверстия в процессе улавливания шарик. a если верхней пластине нанесена слишком толстым слоем, двойной ловушка будет происходить. (b) и наоборот если Верхняя пластина слишком тонкий, существует тенденция для бисера оторваться. (c) Если размер через отверстие больше, чем диаметр бисера, как двойной ловушки и шарик дислокации может произойти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основная задача этого метода изготовления был безопасной фиксации бусины в массиве через отверстие в алюминиевой пластине. Для решения этой задачи, исправить бисер надежно, как показано на рисунках 6 и 7был использован магнитная сила в виде массива магнит 30 x 30. Магнитная индукция магнит массива, который имеет противоположной полярности, сильных в центре каждой поверхности магнита. Потому что сила магнитной силы зависит от плотности потока, бисер руководствовались в центр верхней поверхности каждого магнита, где они содержались в положении. Если использовался один большой магнит (5 × 5 см × 1 см), бусы, особенно те, расположен на крайнем вне отверстия, склонны быть привлечены к выше интенсивность магнитного поля, созданные на краю магнит. Еще одна проблема с использованием крупных магнитов является, что бисер склеивают спонтанно для создания небольшой шарик цепи (рис. 8a).

Служить яму геометрии в ловушку бусины роль верхней пластины (750 мкм отверстие). Благодаря этой структуре ямы можно поцарапать бусины с акриловой пластины для создания большое количество захваченных шарик массивов сразу (протокол 2.4 и Рисунок 1 c и 1 d). Если не используется верхняя пластина, каждый шарик должен вставляться вручную в базу (550 мкм отверстие) одно одновременно.

Ограничения нашего метода включают в себя необходимость CNC гравер, который является самым дорогим устройством используется в методе. Такие станки с ЧПУ, стоят около $ 3000. Это, однако, по-прежнему намного дешевле, чем обычные мягкие литографии зал. Другое ограничение, свойственное нашего метода является необходимость для небольших магнитов, и разрыв между microwells зависит от размера магнита, который был 1 мм в демонстрации, описанных в данном документе. Было бы трудно сократить этот разрыв гораздо больше, поскольку магниты меньше, чем 500 мкм не доступны. Кроме того максимальный размер бисера также был ограничен. Ловушке бусины были намагничены магнитов. Если разрыв между магнитные шарики являются слишком узкими, склеивая вероятность выше, чем некоторые из microwells были соединены отверстий, как показано на рисунке 8b. Поэтому когда 1 мм x 1 мм x 1 мм магниты используются, бусы с диаметром 700 мкм или более не рекомендуются

По сравнению с другими методами изготовления гибкой мембраны14, льда литографии18 и глубоко реактивного ионного травления20, этот метод изготовления не требует специальных литографии зал, позволяет микрорезервуар положение, чтобы быть легко контролировать и может производить стандартизированных вогнутой микрорезервуар фигуры. Кроме того влажный травления PDMS21, серого литографии22и зад рассеянный свет литографии23 были предложены для производства вогнутой геометрий. Однако мокрый травления PDMS требуется прямоугольная структура сначала сделать вогнутые и круглых микрорезервуар и не подходит для изготовления открытым микрорезервуар. Greyscale литографии метод имеет преимущество использования существующих объектов литографии фото, но недостатком является необходимость высокой цене услуги и серого Фото Маска. Зад рассеянный свет литографии был еще недавно сообщили метод полезным для изготовления вогнутой microwells с различными пропорциями, но только с низким разрешением плотности шаблона.

Важным шагом в изготовления вогнутой микрорезервуар является выбор толщины и размера через отверстие верхней пластины (шаг 1.1 и 1.3). Если плита через отверстие слишком толстая, несколько бусины можно перехватить в каждом через отверстие (рис. 9а); Если она слишком тонкая, бисер не быть исправлена на шаге 2.4 и таким образом вывихнул от через отверстия (рис. 9b). В случае более крупных через отверстие несколько ловушки и дислокации может произойти (рис. 9 c).

Ориентиром для выбора размера магнита и толщина листа через отверстие рекомендуется, чтобы размер магнита и толщина пластину «сквозного» основываться на размер бисера. Размер магнита должен быть больше диаметра шарика, и толщина листа через отверстия не должен превышать диаметр шарика. Однако, поскольку выбор магнитов и толщина плиты эмпирические, более подробные оптимизации и параметрические исследования будут включены в будущих исследованиях.

Будущих целей нашего метода включают изготовление ниши как microwells стволовых клеток для biomimetic в vitro волосяных фолликул24, индивидуальные microwells органоид поколения25, и различные массивы разного размера microwells для изучения зависимость от раковых клеток и иммунных клеток сфероида размер.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2014R1A1A2057527 и СР 2016R1D1A1B03934418).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics