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Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

Bioengineering

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Summary

Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

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Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

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Abstract

Eine Sphäroid-Kultur ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der zellulären Verhalten, dass es eine in Vivobietet-wie dreidimensionalen Umgebung. Verschiedenen Sphäroid Produktionsmethoden stammen wie z. B. in Studien der Zell-Zell-Interaktion, immun-Aktivierung, Drogen-screening, nicht klebende Oberflächen, Spinner Fläschchen und hängenden Tropfen Mikrovertiefungen verwendet wurden Zelldifferenzierung und organoide Generation. Unter diesen Verfahren haben Mikrovertiefungen mit einer dreidimensionalen konkave Geometrie gewann die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler und Ingenieure, die aufgrund ihrer Vorteile Sphäroid Uniform mittlere Generation und die Leichtigkeit, mit der die Reaktionen der einzelnen Sphäroide werden kann überwacht. Obwohl kostengünstige Methoden wie der Einsatz von flexiblen Membranen und Eis Lithographie vorgeschlagen wurden, entstehen diese Verfahren gravierende Nachteile wie Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Muster-Größen und Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und Produktion von größere Bereiche der Mikrovertiefungen. Um diese Probleme zu überwinden, schlagen wir eine robuste Methode zur Herstellung von konkaver Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Diese Methode nutzt eine 30 x 30 Durchgangsbohrung Array, mehrere hundert Mikrometer-Bestellung Stahl Perlen und Magnetkraft, 900 Mikrovertiefungen in einem 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat zu fabrizieren. Um die Anwendbarkeit der unsere Methode, um Anwendungen in der Zelle Biologie demonstrieren, wir Fettgewebe Stammzellen für 3 Tage kultiviert und Sphäroide Nutzung unserer Microwell-Plattform erfolgreich produziert. Darüber hinaus führten wir eine magnetostatischen Simulation, um den Mechanismus zu untersuchen, wobei Magnetkraft Stahlkügelchen in die Durchgangsbohrungen auffangen verwendet wurde. Wir glauben, dass die vorgeschlagenen Microwell Herstellungsverfahren auf viele Sphäroid-basierten zellulären Studien wie Drogen-Screening, Geweberegeneration, Stammzelldifferenzierung und Krebsmetastasen angewandt werden könnte.

Introduction

Zellen in einem Sphäroid Form gewachsen sind vergleichbar mit echten Gewebe im Körper als eine zweidimensionale planare Kultur1. Angesichts dieser Vorteil, ist die Verwendung von Sphäroide angenommen worden, um die Untersuchung von Zelle zu Zelle Interaktion2,3, immun-Aktivierung4, Drogen-screening-5und Differenzierung6zu verbessern. Darüber hinaus wurden Sphäroide Einbeziehung mehrerer Zelltypen vor kurzem auf Organellen (in der Nähe von physiologischen dreidimensionale (3D) Gewebe) angewendet, die sehr nützlich für das Studium der menschlichen Entwicklung und Krankheit7sind. Verschiedene Methoden wurden zur Sphäroide zu produzieren. Die einfachste Methode beinhaltet die Verwendung einer nicht klebenden Oberfläche, so dass die Zellen untereinander und Form Sphäroide aggregieren. Eine Petrischale können mit Rinderserumalbumin, Pluronic F-127 oder eine hydrophobe Polymer (z.B. Poly-2-Hydroxyethl-Methacrylat) zu seiner Oberfläche nicht klebend89behandelt werden. Die Spinner-Kolben-Methode ist eine weitere bekannte Mittel zur Herstellung großer Mengen an Sphäroide10,11. Bei dieser Methode werden Zellen von rühren zu verhindern, dass sie immer auf dem Untergrund befestigt in der Schwebe gehalten. Stattdessen, den schwimmenden Zellen Aggregat Form Sphäroide. Sowohl der nicht klebenden Oberfläche Methode und Spinner Kolben produzieren große Mengen an Sphäroide. Sie unterliegen jedoch Einschränkungen einschließlich Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Sphäroid-Größe sowie die Verfolgung und Überwachung der einzelnen Sphäroid. Als Heilmittel für solche Probleme, eine andere Sphäroid Produktionsmethode, nämlich die hängenden drop-Methode beschäftigt12sein können. Dies beinhaltet Hinterlegung Zelle Suspension Tropfen auf der Unterseite des Deckels einer Kulturschale. Diese Tropfen sind in der Regel 15 bis 30 µL in Größe und enthalten ca. 300 bis 3000 Zellen13. Wenn der Deckel umgekehrt wird, werden die Tropfen durch Oberflächenspannung gehalten. Der Schwerelosigkeit in jedem Tropfen konzentriert sich die Zellen, die bilden dann einzelne Sphäroide an der freien Flüssigkeit-Luft-Schnittstelle. Die Vorteile des Behangs Drop-Methode sind, dass es eine gut kontrollierte Größenverteilung bietet, während es ist leicht zu verfolgen und überwachen jede Sphäroid, bezogen auf die nicht klebende Oberfläche und Spinner Kolben Methoden. Jedoch verursacht diese Methode einen Nachteil, dass die massive Produktion von Sphäroide und des Produktionsprozesses selbst übermäßig Labor ist intensiver.

Ein Microwell-Array ist eine flache Platte mit vielen Mikro-Größe Brunnen, jeweils mit einem Durchmesser von 100 bis 1000 µm. Das Sphäroid Herstellungsprinzip Mikrovertiefungen Verwendung ist ähnlich dem der nicht klebenden Oberfläche Methode. Vorteile sind die Tatsache, dass die Mikrovertiefungen bieten Räume zwischen Mikrovertiefungen zur Abtrennung der Zellen oder Sphäroide, so dass es leicht zu Steuern der Sphäroid-Größe und gleichzeitig soll es einfach, jede einzelne Sphäroid zu überwachen. Mit einer großen Anzahl von Mikrovertiefungen ist Hochdurchsatz-Sphäroid Produktion auch möglich. Ein weiterer Vorteil des Mikroschälchen besteht die Möglichkeit, Form-Brunnen in verschiedenen Formen (hexaedrischen, zylindrisch, trigonal prismatisch) abhängig von den Benutzern einzigartige experimentelle Zwecke. In der Regel jedoch eine dreidimensionale (3D) konkave (oder halbkugelförmige) Form gilt als am besten geeignet für die Herstellung von einzelnen Sphäroide Uniform-Größe. Deshalb die Nützlichkeit der konkaven Mikrovertiefungen berichtet für viele Zelle Biologie Studien wie die Prüfung der Cardiomyocyte Differenzierung von embryonalen Stammzellen14, die Insulinsekretion von Inselzelle Cluster15, die enzymatische Aktivität von Hepatozyten16und die Resistenz des Tumors Sphäroide17.

Leider erfordert die Herstellung von Mikrovertiefungen oft spezialisierten Micropatterning Einrichtungen; konventionellen Fotolithografie basierenden Methoden erfordern Belichtung und Entwicklung Einrichtungen während reaktive Ionen-Ätzen-basierte Methoden Plasma und Ionenstrahl-Ausrüstung benötigen. Solcher Geräte ist kostspielig, die zusammen mit der komplizierten Fertigung eine hohe Eintrittsbarriere für Biologen präsentiert, die keinen Zugang zu Mikrotechnik. Um diese Probleme zu überwinden, andere kostengünstige Methoden wie z. B. Eis Lithografie18 (mit gefrorenen Wassertropfen) und der flexiblen Membran Methode14 (mit einer Membran, Durchgangsbohrung Substrat und ein Vakuum) vorgeschlagen worden. Diese Methoden entstehen jedoch auch gravierende Nachteile wie es schwierig, die Muster-Größen, die Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und die Produktion von größeren Bereich Mikrovertiefungen zu kontrollieren.

Um die oben genannten Probleme zu überwinden, schlagen wir eine neuartige konkave Microwell Herstellungsverfahren unter Verwendung einer Durchgangsbohrung Substrat, Stahlkügelchen und ein Magnet-Array. Mit dieser Methode können Hunderte von konkaven sphärischen Mikrovertiefungen hergestellt werden, unter Ausnutzung des Mechanismus der magnetischen Kraft unterstützt Selbsthemmung metallischen Perlen (Abbildung 1). Der Produktionsprozess beinhaltet die Verwendung von sehr wenige teure und komplizierte Einrichtungen und verlangt nicht viele fortgeschrittene Fähigkeiten. Als solche können auch ungelernte Personen dieses Herstellungsverfahren leicht durchführen. Um die vorgeschlagene Methode zu demonstrieren, wurden menschliche Fettgewebe-Stammzellen in konkaven Mikrovertiefungen Sphäroide produzieren kultiviert.

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Protocol

1. Vorbereitung der Durchgangsbohrung Array Aluminium-Platte und Magnet-array

  1. Bereiten Sie zwei 50 mm x 50 mm (oder größer) Aluminium-Platten. Die Dicke jeder Platte war 300 µm, die Hälfte des Durchmessers Perle ist.
  2. Bilden Sie ein 30 x 30 Durchgangsbohrung Array auf einem Aluminium-Platten mit einer CNC-Dreh Stecher mit einem Φ550-µm Mikro Bohrer mit 30 mm/s Sprung und 8000 u/min der Spindeldrehzahl. Der Abstand zwischen jedem Loch (Mitte zu Mitte) war 1 mm (Abb. 1a und Figur 2a, ich).
  3. Bilden Sie ein 30 x 30-Array von Φ750-µm Durchgangsbohrungen auf andere Aluminium-Platte, mit dem gleichen Verfahren wie in 1.2 (Abbildung 1a und Figur 2a, Ii) beschrieben.
  4. Befestigen Sie den beiden Platten aufeinander mit einem Klebeband und bilden Sie Φ3 mm Achse Löcher an jeder der vier Ecken der beiden Aluminiumplatten.
  5. Genießen Sie die Aluminiumplatten in 15 % Schwefelsäure für 12 h zu ihren Oberflächen zu reinigen. Da die dünne Schicht aus Aluminiumoxid auf die Oberfläche des Aluminiums machen es korrosionsbeständig, werden der Lochdurchmesser und der Dicke der Platte durch diese Säurebehandlung nicht geändert.
  6. Bilden Sie eine 30 × 30 Array von 1 x 1 x 1 mm-Neodym-Magneten (mit einer Magnetfeldstärke von 0.363 N). Sicherstellen Sie, dass jeder Magnet entgegengesetzter Polarität zu seinen Nachbarn. Zur Vermeidung von Bruch oder Streuung des Arrays Magnet befestigen Sie eine 30 x 30 mm Alu-Platte an der Unterseite des Magnet-Arrays mit doppelseitigem Klebeband (Abb. 2a, Iii und Einschub in Abbildung 2).

(2) Perle Trapping Prozess

  1. Ausrichten und Stapeln zwei Aluminiumplatten (top-Platte: 750-µm-Lochscheibe, Bodenplatte: 550-µm-Lochplatte) mit den vorbereiteten Ausrichtung Löcher an den vier Ecken der jede Platte (Abbildung 1 b).
  2. Sperren Sie die beiden Platten zusammen durch Einfügen von M3 Schrauben in die Löcher der Ausrichtung, und befestigen Sie die Schrauben mit Muttern (Abbildung 1 b).
  3. Stapeln Sie die Aluminium Platte Versammlung auf dem vorbereiteten Magnet-Array (Abbildung 1 b, 2 bund 2 c). Das Array von Magneten und das Array von Durchgangsbohrungen in die Aluminiumplatte während des stacking-Prozesses ausrichten. Verwenden Sie ein Klebeband, um die Position des Magneten Arrays zu fixieren.
  4. Ort, eine ausreichende Anzahl von Φ600 mm SUJ2 Stahl Perlen auf der Platte-Versammlung und manipulieren die Perlen mit einem Acryl (oder nicht-metallischen) Platte so, dass eine Perle in jedes Loch (Abbildung 1 c, 1Dund 1e) während gleichzeitig gefangen wird Entfernen der überschüssigen Perlen, die nicht in die Löcher gestellt haben.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die obere Platte zur Vermeidung unerwünschter Streuung und Dislokation der eingeschlossenen Perlen (Abb. 1f).

(3) konkav Microwell-Fertigung

  1. Verschieben Sie die konkave Microwell Form, produziert in Schritte 2.1 bis 2.5, oben auf einer Petrischale.
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) Monomer und Härtemittel gemäß des Herstellers Anweisungen19 mit einem PDMS-Monomer mischen: Heilung von Agent-Verhältnis von 10:1.
  3. De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator und Vakuumpumpe, um gefangen in der PDMS-Mischung Bläschen zu entfernen.
  4. Die PDMS Mischung in die konkave Microwell-Form und de-Gas wieder mit dem gleichen Verfahren wie in 3.3 (Abb. 1f) beschrieben.
  5. Backen Sie die PDMS-Mischung auf einer Herdplatte bei 80 ° C für 2 h um eine Perle eingebettet PDMS Substrat (Abbildung 1 g) zu bilden.
  6. Entfernen Sie das ausgehärtete PDMS-Substrat aus der Form (Abbildung 1 g). Sprühen Sie entfernen dabei Methanol mit waschen Flasche PDMS Substrat aus der Form lösen.
  7. Mit einem Φ15 mm x 2 mm Magnet eingeschlossenen Stahlkügelchen von PDMS-Substrat (Abbildung 1 h) entfernen. Dabei kann jeder Magnet, die ausreichend stark, extrahieren Sie die Perlen aus dem PDMS-Substrat verwendet werden.

4. Sphäroid Kultur

  1. Schneiden Sie das konkave Microwell-gemusterten PDMS Substrat mithilfe einen Φ14-mm-Biopsie-Punch in 24-Well-Platte in dieser Studie eingesetzt werden.
  2. Das daraus resultierende Φ14 mm PDMS Substrat in einem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C und 15 Psi zu sterilisieren.
  3. Legen Sie die sterilisierte PDMS-Substrat in einer 24-well-Platte.
  4. Bestreichen Sie das gesamte PDMS-Substrat mit 4 % (w/V) Pluronic F-127 Lösung über Nacht Zellhaftung an die Microwell-Oberfläche zu verhindern. Während des Beschichtungsprozesses entfernen Sie Luftblasen eingeschlossen in der konkaven Mikrovertiefungen durch Pipettieren oder mithilfe eines Ultraschall-Reinigers.
  5. Spülen Sie die F-127-Lösung dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  6. Samen Sie 1 mL der Lösung (enthält 2 x 106 Zellen) Zelle-Medium (Dulbeccos geändert Eagle Medium) auf dem PDMS-Substrat. Beachten Sie, dass die Aussaatdichte je nach Zielgröße Sphäroid und/oder Ziel-Handy-Typ geändert werden kann. Hier wurden Fettgewebe Stammzellen (ASC) verwendet.
  7. Aspirieren Sie 1 mL des Mediums mit einer 1000 µL Pipette, entfernen alle überschüssigen Zellen, die nicht gefangen wurden in Mikrovertiefungen (Abbildung 3).
  8. Inkubation der Zellen bei 36,5 ° C, Luftfeuchtigkeit von > 95 % und 5 % CO2 Zustand. Im Falle der ASC in unserer Studie verwendeten aggregieren die Zellen auf ein Sphäroid in 48 h.

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Representative Results

Eine konvexe Form und Microwell Muster wurden erfolgreich von folgenden Schritte 2.1 bis 3.7 hergestellt. (Abbildung 4). Die kommerzielle Stahlkügelchen wurden in 30 x 30 Durchgangsbohrung Array gefangen. Die Perlen waren dicht ohne Lücken zwischen den Perlen und den entsprechenden Durchgangsbohrungen (Abb. 4a) statt. Die Form des vorgefertigten konkave Microwell ist konkav halbkugelförmigen, mit einem Durchmesser von 600 µm, die ist identisch mit dem der Stahl Wulst (Abbildung 4 b). Ein Querschnitt durch eine konkave Microwell (Abb. 4 c) zeigt, dass der Abstand zwischen den benachbarten Microwell 1 mm (Mitte zu Mitte), war identisch mit dem durch die Löcher. Das Φ14 mm konkav Microwell Substrat, das in der 24-well-Platte gelegt wurde, enthielt mehr als 120 Mikrovertiefungen (Abbildung 4D).

Fettgewebe Stammzellen wurden in der konkaven Mikrovertiefungen kultiviert. Wir entkernt 2 x 106 Zellen auf dem Φ14 mm konkav Microwell Array. Nach 24 Stunden hatten die Zellen zu Sphäroide, zusammengefasst, wie in Abbildung 4dargestellt. Der mittlere Durchmesser der Sphäroide gebildet in unserem Microwell-Array wurde 185.68 ± 22.82 µm (Tag 1, Abb. 5a, 5 c). Am 3. Tag hatten die Zellen mehr mit der mittlere Durchmesser der Sphäroide auf 147.00 ± 17,11 µm (Abb. 5 b, 5 d) aggregiert, geworden.

Figure 1
Abbildung 1 : Schaltplan der Fertigungsprozess. (a) Herstellung von 30 x 30 Φ550 und 750 µm Durchgangsbohrung Array in Aluminiumplatten mit CNC-Graveur. (b) die beiden durch Platten mit der Ausrichtung Löcher ausrichten. Anschließend wurden die ausgerichteten Platten auf dem Magnet-Array gestapelt. (c) Aussaat eine ausreichende Menge an Stahlkügelchen auf die Teller. (d) Schaben die Perlen mit einer Acryl-Platte, um die Perlen im Array durch-Loch zu fangen. (e) Perlen wurden in der Durchgangsbohrung Array gefangen. (f) die obere Platte (Φ750-µm Durchgangsbohrung Array) entfernt wurde und noch nicht ausgehärteten PDMS-Mischung in die Form gegossen wurde. (g) nach dem PDMS auf 80 ° c 2 h gebacken wurde, war der ausgehärteten PDMS ungeformt. (h) die ausgehärtete PDMS packt die Stahlkügelchen. Die Perlen werden dann mit einem Neodym-Magneten (Φ15 mm mit einer Dicke von 2 mm) entfernt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Fertigungsprozess. (a) Vorbereitung zwei Durchgangsbohrung Platten und Magnet-Array. (i) Aluminium-Platte mit 750 µm Durchgangsbohrung Array. (II) Aluminium-Platte mit 550 µm Durchgangsbohrung Array. III) 30 x 30-Array von 1 mm x 1 mm x 1 mm Magnete. (b) Draufsicht ausgerichtet und gestapelten Platten. (c) Ansicht von unten ausgerichtet und gestapelten Platten und Magnet-Array. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Übermäßige Zellen durch zurückgehende Meniskus entfernt. Mit dem Anspruch des Mediums, die Oberflächenspannung von Air-Liquid-Schnittstelle verursacht wurde, dann die Oberflächenspannung verschrottet übermäßige Zellen auf der Oberfläche des Substrats Microwell. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Konvexe Form und fabrizierte Microwell Array. (a) eingeschlossene Perlen in Durchgangsbohrung Array Aluminiumplatte. Die eingeschlossenen Perlen wirken als eine Form, konkaven Mikrovertiefungen zu fabrizieren. Die Größe der Perle war 600 µm. Der Maßstab ist 1 mm. (b) und (c) SEM Bilder von vorgefertigten Mikrovertiefungen. Jedes gefertigte Microwell hat eine halbkugelförmige Form, 600 µm im Durchmesser. (d) Φ14-mm Microwell Array in 24-Well-Platte. Das Array enthält über 120 konkave Mikrovertiefungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Kultur Sphäroide in konkaven Microwell Array. Das Φ14-mm-Microwell-Array wurde mit 2 x 106 ASCs entkernt und für 3 Tage kultiviert. (a) kultivierten Sphäroide bei Tag1; die Zellen haben Form Sphäroide. Der Maßstab ist 2 mm. (b) kultivierten Sphäroide am 3. Tag; gebildeten Sphäroide sind stärker strukturiert, während ihre durchschnittlichen Durchmesser von 185.68 ± 22.82 µm bei Tag1 bis 147.00 ± 17,11 μm an Tag3 gesunken ist. Der Maßstab ist 2 mm. (c) Vergrößerung Bilder der Sphäroid an Tag1. Der Maßstab ist 500 µm. (d) Vergrößerung Bilder der Sphäroid an Tag3. Der Maßstab ist 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Simulationsergebnis für Vektor der magnetischen Flussdichte. Die Dichte des magnetischen Flusses auf dem Magnet-Array wurde berechnet, mit dem magnetostatischen-Modul. Das Simulationsergebnis zeigt, dass die stärkste magnetische Flussdichte in Mittelpunkt jeder Magnet, wodurch die Perlen in der Mitte des die Durchgangsbohrungen gefangen zu sein wo sie befestigt wurde. Der Maßstab beträgt 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Magnetische Feldverteilung Magnet Arrays. Jeder Magnet ist der entgegengesetzten Polarität zu seinen Nachbarn. Das horizontale Magnetfeld ist dominant an der Schnittstelle zwischen benachbarten Magneten, während das vertikale magnetische Feld in der Mitte jeder Magnet am stärksten ist. Diese gerichtete Kräfte führen eine Perle in die Mitte eines Magneten. (a) Magnetfeld des Magneten Array. (b) Vektor des Magnetfeldes durch statische Simulation bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Einschränkung mit einzelnen großen Magneten und Perle Größe. (a) anders als bei der Verwendung eines Arrays von kleinen Magneten, bei einem großen Magneten dient, fast alle der Perlen sind in der Regel bewegen an den Rand oder Mitte des Magneten wo das Magnetfeld mit hoher Dichte entsteht. Darüber hinaus sind die Perlen verbunden, um eine Kette-Form zu bilden. Der Maßstab ist 10 mm. (b) SEM Bild der verlinkten Microwell, hergestellt wurde, indem Φ800 µm Perlen mit 1 x 1 mm x 1 mm-Magnet-Array. Mit einer Perle, die im Verhältnis zur Größe des Magneten zu groß ist können ein kleines Loch in der Wand zwischen benachbarten Mikrovertiefungen erstellen. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9 : Die Bedeutung der Wahl der entsprechenden oberen Platte Dicke und Loch Größe dabei Trapping Wulst. (a) wenn die obere Platte zu dick ist, wird eine doppelte Falle auftreten. (b) hingegen, wenn die obere Platte zu dünn ist, gibt es eine Tendenz für die Perlen kommen aus. (c) kann durch das Loch größer als der Durchmesser der Perle ist, doppelte Falle sowohl Wulst Luxation kommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die größte Herausforderung für dieses Herstellungsverfahren wurde die sichere Befestigung der Perlen in der Durchgangsbohrung-Array in der Aluminiumplatte. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde Magnetkraft in Form eines Arrays von 30 x 30 Magnet verwendet, um die Perlen fest, wie in Abbildung 6 und 7zu beheben. Die magnetische Flussdichte des Magnet-Arrays, die entgegengesetzten Polarität hat, ist am stärksten in der Mitte der einzelnen Magnetoberfläche. Da die Stärke der magnetischen Kraft auf die Flussdichte abhängt, wurden die Perlen in die Mitte der oberen Fläche des jeden Magneten geführt wo sie in Position gehalten wurden. Wenn ein einzelner großes Magnet (5 × 5 cm × 1 cm) verwendet wurde, tendenziell die Perlen, vor allem diejenigen, die im Extremfall außerhalb Löcher, höhere Intensität Magnetfeldes erstellt am Rande Magnet angezogen werden. Ein weiteres Problem bei der Verwendung von großen Magneten ist, dass die Perlen aneinander kleben spontan auf kleine Perle Ketten (Abb. 8a) zu bilden.

Die Rolle der oberen Platte (750 µm Loch) war die Grube Geometrie zu Perlen fangen dienen. Durch diese Grube Struktur ist es möglich, die Perlen mit einer Acrylplatte erstelle ich eine große Anzahl von Gefangenen Wulst Arrays auf einmal (Protokoll 2.4 und Abbildung 1 c und 1D) kratzen. Wenn nicht mit die obere Platte, muss jede Perle in der Basis (550 µm Loch) manuell eingefügt werden einzeln nacheinander.

Die Grenzen unserer Methode sind die Notwendigkeit für eine CNC-Stecher, die das teuerste Gerät in der Methode ist. Diese CNC-Maschinen sind von rund 3000 $ festgesetzt. Dies ist jedoch immer noch viel billiger als konventionelle weiche Lithographie Einrichtungen. Eine weitere innewohnende Einschränkung unserer Methode ist die Notwendigkeit für kleine Magnete, und die Kluft zwischen Mikrovertiefungen ist abhängig von der Magnetgröße, die 1 mm an der Demonstration in diesem Papier beschrieben wurde. Es würde schwierig sein, diese Lücke viel mehr reduzieren, da Magnete kleiner als 500 µm nicht verfügbar sind. Darüber hinaus war die maximale Größe der Perle auch begrenzt. Die eingeschlossenen Perlen wurden durch Magneten magnetisiert. Wenn die Lücke zwischen magnetischen Beads zu schmal waren, ist die Wahrscheinlichkeit von zusammenkleben höher als einige der Mikrovertiefungen durch Löcher verbunden waren, wie in Abbildung 8bdargestellt. Daher, wenn 1 x 1 mm x 1 mm Magnete verwendet werden, sind Perlen mit einem Durchmesser von 700 µm oder mehr nicht empfohlen

Im Vergleich zu anderen Herstellungsmethoden wie flexible Membran14, Eis Lithografie18 und tief reaktive Ionen Ätzen20, dieses Herstellungsverfahren erfordert keine spezielle Lithographie Einrichtungen, kann die Microwell-Position zu leicht zu kontrollieren, und kann eine standardisierte konkave Microwell-Form. Darüber hinaus wurden für die Herstellung von konkaven Geometrien Nassätzen PDMS21, Graustufen Lithographie22und Rückseite verbreitet Licht Lithographie23 vorgeschlagen. Allerdings Nassätzen PDMS erfordert eine rechteckige Struktur zunächst, eine konkave und Runde Microwell, und eignet sich nicht für die Herstellung einer offenen Microwell. Die Graustufen Lithografie Methode hat den Vorteil der Nutzung bestehender Foto-Lithografie-Anlagen, aber die Notwendigkeit von hohen Preisen Einrichtungen und Graustufen-Foto-Maske ist ein Nachteil. Rückseite verbreitet Licht Lithographie wurde eine andere kürzlich berichtet Methode nützlich, konkave Mikrovertiefungen mit verschiedenen Seitenverhältnissen, sondern nur auf die niedrige Auflösung der Muster-Dichte zu fabrizieren.

Der entscheidende Schritt in der konkaven Microwell-Herstellung ist die Auswahl der Dicke und der Durchgangsbohrung Größe der oberen Platte (Schritt 1.1 und 1.3). Wenn die durch-Loch-Platte zu dick ist, können mehrere Perlen in jeder Durchgangsbohrung (Abbildung 9a); gefangen Wenn sie zu dünn ist, werden die Perlen nicht im Schritt 2.4 fixiert und so ausgerenkt von Durchgangsbohrungen (Abbildung 9). Bei den größeren Durchgangsbohrung können mehrere Trap und Dislokation (Abbildung 9 c) auftreten.

Als Leitlinie für die Auswahl der Größe des Magneten und die Dicke der Platte Durchgangsbohrung empfiehlt es sich, dass die Größe des Magneten und die Dicke der Platte"through-Hole" auf die Größe des Wulstes beruhen. Die Größe des Magneten muss größer sein als der Durchmesser des Wulstes, und die Dicke der Durchgangsbohrung Platte sollte nicht mehr als des Durchmessers der Perle. Jedoch da die Wahl von Magneten und Blechdicke empirische ist, werden weitere Optimierung und Parameterstudien in zukünftigen Studien enthalten.

Zukünftige Ziele unserer Methode gehören die Herstellung von Stammzellen Nische-wie Mikrovertiefungen für biomimetische in Vitro Haarfollikel24, maßgeschneiderte Mikrovertiefungen für organoide Generation25und diverse Anordnungen von unterschiedlich großen Mikrovertiefungen für das Studium die Abhängigkeit von Krebszellen und Immunzellen Sphäroid Größe.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen (NRF-2014R1A1A2057527 und NRF-2016R1D1A1B03934418) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

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References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

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