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Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

Bioengineering

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Summary

Este manuscrito presenta un método robusto de la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Usando la fuerza magnética, granos de acero y una matriz a través del agujero, varios cientos los micropocillos fueron formados en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm.

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Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

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Abstract

Un esferoide es una herramienta útil para comprender el comportamiento celular en que proporcione un en vivo-como el entorno tridimensional. Métodos de producción de varios esferoide como superficies no-adhesiva, frascos de spinner, gotas colgantes y micropocillos se han utilizado en estudios de interacción de célula a célula, activación inmune, de detección de drogas tallo diferenciación celular y la generación de organoide. Entre estos métodos, los micropocillos con una geometría cóncava tridimensional han ganado la atención de científicos e ingenieros, dados sus ventajas de generación esferoide de tamaño uniforme y la facilidad con que pueden ser las respuestas de los esferoides seguimiento. Aunque se han propuesto métodos rentables como el uso de membranas flexibles y litografía de hielo, estas técnicas incurren en graves inconvenientes como la dificultad para controlar el tamaño del patrón, logro de proporciones de alto y la producción de áreas más grandes de los micropocillos. Para superar estos problemas, proponemos un método robusto para la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Este método utiliza una matriz de 30 x 30 por-agujero, varios acero cien micrómetros-orden granos y la fuerza magnética para fabricar 900 micropocillos en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm. Para demostrar la aplicabilidad de nuestro método para aplicaciones biológicas de la célula, se cultivan células madre adiposas para 3 días y producido con éxito utilizando nuestra plataforma de micropocillos de esferoides. Además, se realizó una simulación de magnetostática para investigar el mecanismo, por el que se utilizó fuerza magnética para atrapar los granos de acero en los agujeros. Creemos que el método de fabricación de micropocillos propuesto puede aplicarse a muchos estudios celulares basado en el esferoide como screening de drogas, regeneración de tejidos, diferenciación de la célula de vástago y metástasis del cáncer.

Introduction

Las células cultivadas en forma de esferoide son más similares a real tejido en el cuerpo de un plano bidimensional de la cultura1. Teniendo en cuenta esta ventaja, el uso de esferoides se ha adoptado para mejorar el estudio de la interacción de célula a célula2,3, activación inmune4,5y6de la diferenciación de la detección de drogas. Además, esferoides con múltiples tipos de células se han aplicado recientemente a organoides (cerca de-fisiológico tridimensional (3D) el tejido), que son muy útiles para estudiar el desarrollo y la enfermedad humana7. Varios métodos se han utilizado para producir esferoides. El método más simple consiste en la utilización de una superficie no adhesiva, que las células se agregan entre sí y esferoides de forma. Un plato de Petri pueden tratarse con albúmina de suero bovino, pluronic F-127 o un polímero hidrofóbico (por ejemplo metacrilato de 2-hydroxyethl de poly) para hacer su superficie no adhesiva89. El método de frasco de spinner es otra forma bien conocida de producir grandes cantidades de esferoides10,11. En este método, las células se llevan a cabo en suspensión agitando para evitar de ser unido al sustrato. Por el contrario, la flotación células agregado esferoides de forma. El método superficie no adhesiva y el método de frasco de spinner pueden producir grandes cantidades de esferoides. Sin embargo, están sujetas a limitaciones incluyendo dificultades en controlar el tamaño del esferoide, así como el seguimiento y monitoreo de cada esferoide. Como un remedio para este tipo de problemas, otro método de producción del esferoide, a saber, el colgante gota método pueden ser empleados12. Se trata de depositar las gotas de la suspensión de células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo. Estas gotas son generalmente 15 a 30 μL en tamaño y contienen aproximadamente de 300 a 3000 células13. Cuando se invierte la tapa, las gotas se llevan a cabo en lugar por la tensión superficial. El ambiente de microgravedad en cada gota concentra en las células, que entonces forman esferoides solo en la interfase líquido aire libre. Los beneficios de colgar el método de caída son que ofrece una distribución de tamaño bien controlados, si bien es fácil de rastrear y monitorear cada esferoide, en relación con los métodos de matraz superficie y spinner no adhesiva. Sin embargo, este método tiene una desventaja en que la producción masiva de esferoides y el propio proceso de producción es excesivamente trabajo intensivo.

Un conjunto de micropocillo es un plano de la placa con muchos pozos de tamaño micro, cada uno con un diámetro que van desde 100 hasta 1000 μm. El principio de producción del esferoide cuando utilice micropocillos es similar a la del método de superficie no adhesiva. Los beneficios incluyen el hecho de que los micropocillos proporcionan espacios entre los micropocillos para separar las células o esferoides, que es fácil controlar el tamaño del esferoide, mientras que también hace fácil supervisar cada esferoide sola. Con un gran número de los micropocillos, producción de esferoide alto rendimiento también es posible. Otra ventaja de los micropocillos es la opción a los pozos de la forma de diferentes formas (hexaedros, cilíndricos, trigonal prismático) dependiendo de propósitos experimentales únicas de los usuarios. En general, sin embargo, una forma tridimensional (3D) de cóncavo (o hemisférica) se considera el más adecuado para la producción de esferoides solo tamaño uniforme. Por lo tanto, la utilidad de los micropocillos cóncavos se ha divulgado para muchos estudios de Biología de la célula tales como examinar la diferenciación de cardiomiocitos de células madre embrionarias de14,15, racimos de la secreción de insulina de la célula del islote la actividad enzimática de los hepatocitos16y la resistencia a los medicamentos de tumor esferoides17.

Desafortunadamente, la fabricación de los micropocillos a menudo requiere instalaciones especializadas micropatterning; métodos de fotolitografía convencionales requieren exposición e instalaciones en vías de desarrollo mientras que los reactivos ion-aguafuerte-métodos necesitan equipo de plasma y viga de ion. Ese equipo es costoso que, junto con el proceso de fabricación complicado, presenta una alta barrera de entrada para los biólogos que no tienen acceso a la microtecnología. Para superar estos problemas, otros métodos rentables como hielo litografía18 (usando las gotas de agua congeladas) y el método de membrana flexible14 (usando una membrana, sustrato por-agujero y un vacío) se han sugerido. Sin embargo, estos métodos también conllevan graves inconvenientes como que es difícil controlar el tamaño del patrón, el logro de altos cocientes de aspecto y la producción de micropocillos de área más grande.

Para superar estas cuestiones, proponemos un método de fabricación de novela micropocillos cóncavo utilizando un substrato a través del agujero, bolas de acero y una variedad de imán. Usando este método, se pueden fabricar cientos de micropocillos esféricos cóncavos aprovechando el mecanismo de cuentas metálicas autobloqueantes asistida de fuerza magnética (figura 1). El proceso de fabricación implica el uso de muy pocas instalaciones costosas y complicadas y no requiere de muchas habilidades avanzadas. Como tal, personas aún pueden realizar fácilmente este método de fabricación. Para demostrar el método propuesto, humanos-adiposo-derivados de las células madre fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos para producir esferoides.

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Protocol

1. elaboración de matriz de imán y placa de aluminio por-agujero matriz

  1. Preparar dos de 50 x 50 mm (o mayor) placas de aluminio. El espesor de cada placa fue 300 μm que es la mitad del diámetro del grano.
  2. Forman una matriz de 30 x 30 a través del agujero en una de las placas de aluminio utilizando un CNC grabador rotatorio con una Φ550-μm micro broca de 30 mm/s de tasa de penetración y 8000 RPM de velocidad del huso. La distancia entre cada agujero (de centro a centro) fue de 1 mm (Figura 1a y Figura 2a, ).
  3. Formar una matriz de 30 x 30 de Φ750 μm a través de agujeros en la otra placa de aluminio, utilizando el mismo procedimiento que se describe en 1.2 (Figura 1a y Figura 2a, ii).
  4. Coloque las dos placas entre sí utilizando una cinta adhesiva y formar los agujeros de alineación de Φ3 mm en cada una de las cuatro esquinas de dos placas de aluminio.
  5. Remojar las placas de aluminio en ácido sulfúrico de 15% durante 12 h para limpiar sus superficies. Ya que la fina capa de óxido de aluminio sobre la superficie del aluminio que sea resistente a la corrosión, el diámetro de agujero y el grosor de la placa no cambia este tratamiento con ácido.
  6. Forman una matriz de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 mm neodimio imanes (con una fuerza magnética de 0.363 N). Asegúrese de que cada imán es la polaridad opuesta a su vecino. Para evitar la ruptura o la dispersión de la matriz de imán, fije una placa de aluminio de 30 x 30 mm en la parte inferior de la matriz de imán usando cinta de doble cara (Figura 2a, la iii y la inserción en figura 2).

2. proceso de captura de grano

  1. Alinear y apilar las dos placas de aluminio (top placa: placa de orificio de 750 μm, placa inferior: placa de orificio de 550 μm) usando los orificios de alineación dispuestos en las cuatro esquinas de cada placa (Figura 1b).
  2. Traben las dos placas mediante la inserción de los tornillos M3 en los agujeros de alineación y luego fije los tornillos con tuercas (Figura 1b).
  3. Coloque el ensamblaje de placa de aluminio en el arreglo de imán preparado (Figura 1b, 2by 2C). Alinee el conjunto de imanes y la matriz de agujeros en la placa de aluminio durante el proceso de apilado. Utilizar una cinta adhesiva para fijar la posición de la matriz de imán.
  4. Lugar un número suficiente de acero de Φ600 mm. SUJ2 granos en el conjunto de placa y manipular los granos con un acrílico (o no metálico) de la placa tal que un grano queda atrapado en cada orificio (figura 1C, 1Dy 1e) mientras que al mismo tiempo quitar el exceso granos que no han presentado en los agujeros.
  5. Retire con cuidado la placa superior para evitar la dispersión no deseada y la dislocación de los granos atrapados (figura 1f).

3. cóncavo micropocillos fabricación

  1. Mover el molde cóncavo micropocillos, producido en pasos 2.1 a 2.5, arriba, a una placa Petri.
  2. La mezcla de monómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente endurecedor según las instrucciones de los fabricantes19 con un monómero PDMS: cociente de 10:1 del agente de curado.
  3. Gas de la mezcla PDMS utilizando un desecador y una bomba de vacío para eliminar las posibles burbujas en la mezcla PDMS.
  4. Vierta la mezcla PDMS en el molde cóncavo micropocillos y gas de nuevo utilizando el mismo procedimiento que se describe en 3.3 (figura 1f).
  5. Cueza al horno la mezcla PDMS en la placa caliente a 80 ° C por 2 h para formar un sustrato PDMS integrado de grano (figura 1 g).
  6. Quite el sustrato PDMS curado del molde (figura 1 g). En el proceso de extracción, pulverización metanol con botella de lavado para separar el sustrato PDMS del molde.
  7. Con un Φ15 x imán de 2 mm, retire los granos de acero atrapados el sustrato PDMS (figura 1 h). Para este proceso, puede utilizarse cualquier imán que es suficientemente fuerte para extraer los granos del substrato de PDMS.

4. cultura de esferoide

  1. Corte cóncavo sustrato PDMS micropocillos-patrón utilizando un punzón de biopsia Φ14 mm para montarse en placa de 24 pozos en este estudio.
  2. Esterilizar el sustrato resultante de PDMS de mm Φ14 en un esterilizador de la autoclave a 121 ° C y 15 psi.
  3. Coloque el sustrato esterilizado de PDMS en una placa bien 24.
  4. La capa del sustrato PDMS todo con pluronic F-127 solución al 4% (w/v) durante la noche para evitar la fijación de células a la superficie de los micropocillos. Durante el proceso de capa, eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en los micropocillos cóncavos mediante pipeteo o utilizando un limpiador ultrasónico.
  5. Descargue la solución de F-127 tres veces mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  6. Sembrar 1 mL de solución de medio celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco) (que contiene 2 x 106 células) en el sustrato PDMS. Tenga en cuenta que la densidad de siembra puede cambiar según el tamaño del esferoide de destino o tipo de celda de destino. Aquí, se utilizaron células madre procedentes de adiposo (ASC).
  7. Aspirar 1 mL del medio usando una pipeta de 1000 μL para quitar cualquier exceso células que no fueron atrapadas en los pocillos (figura 3).
  8. Incubar las células en 36,5 ° C, humedad de > 95% y 5% CO2 condición. En el caso de la ASC en nuestro estudio, las células se agregan a un esferoide en 48 h.

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Representative Results

Un molde convexo y un patrón de micropocillos fueron fabricados con éxito siguiendo los pasos 2.1 a 3.7. (Figura 4). Los granos de acero comerciales quedaron atrapados en la matriz por-agujero de 30 x 30. Los granos se mantuvieron firmemente sin espacios entre los granos y los correspondientes agujeros (figura 4a). La forma de micropocillos cóncava fabricado es cóncavo semiesférico, con un diámetro de 600 μm, que es lo mismo que el de las bolas de acero (Figura 4b). Una sección transversal de un pocillo cóncavo (figura 4 c) muestra que la distancia de los micropocillos vecinos era 1 mm (centro a centro), que era el mismo que el de los agujeros. El sustrato de micropocillos mm cóncava de Φ14, que fue colocado en la placa de la pozo 24, contiene más de 120 pocillos (figura 4 d).

Células madre procedentes de adiposo fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos. Siembran 2 x 106 células en la matriz de micropocillos cóncava de Φ14 mm. Después de 24 h, las células habían agregado en esferoides, como se muestra en la figura 4. El diámetro promedio de los esferoides en nuestra gama de micropocillos fue 185.68 ± 22.82 μm (día 1, figura 5a, 5C). En día 3, las células habían convertido en más agregadas, con el diámetro promedio de los esferoides a 147.00 ± 17.11 μm (figura 5b, 5 d).

Figure 1
Figura 1 : Esquema del proceso de fabricación de. (a) hacer 30 x 30 Φ550 y 750 μm por-agujero variedad en placas de aluminio con CNC grabador. (b) alineación de los dos a través de placas usando los agujeros de alineación. Posteriormente, las placas alineadas fueron apiladas en el arreglo de imán. (c) una cantidad suficiente de granos de acero sobre las placas de la siembra. (d) raspar los granos usando una placa de acrílico para atrapar los granos de la matriz a través del agujero. (e) los granos quedaron atrapados en la matriz a través del agujero. (f) la placa superior (matriz a través del agujero de Φ750 μm) fue quitada y mezcla PDMS se vierte en el molde. (g) después de que el PDMS fue cocido al horno a 80 ° c por 2 h, el PDMS curado era refractarios sin forma. (h) el PDMS curado agarra las bolas de acero. Los granos entonces se quitan usando un imán de neodimio (Φ15 mm con un espesor de 2 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Proceso de fabricación. (a) preparación de dos platos por-agujero y arreglo de imán. i) placa aluminio 750 μm matriz de por-agujero. II) placa aluminio 550 μm matriz de por-agujero. III) 30 x 30 matriz de 1 x imanes de 1 mm x 1 mm. (b) vista superior de placas apiladas y alineadas. (c) Vista inferior de placas apiladas y alineadas y arreglo de imán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Eliminar células excesiva por menisco retroceso. Por aspirar el medio, la tensión superficial fue causada por la interfaz aire-líquido y, a continuación, la tensión superficial desechar células excesiva en la superficie del substrato de micropocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Molde convexo y matriz de micropocillos fabricado. (a) granos atrapados en placa de aluminio de la matriz a través del agujero. Atrapados los granos actúan como un molde para fabricar los micropocillos cóncavos. El tamaño de grano fue de 600 μm. La barra de escala es 1 mm. (b) y (c) SEM imágenes de micropocillos fabricados. Cada micropocillo fabricado tiene forma semiesférica, 600 μm de diámetro. (d) matriz de micropocillos Φ14-m en placa de 24 pozos. La matriz contiene más de 120 pocillos cóncavas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Cultura esferoides en matriz de micropocillos cóncava. La matriz de pocillos Φ14-mm fue sembrada con 2 x 106 ASCs y cultivada por 3 días. (a) cultos esferoides en 1 día; las células han comenzado a esferoides de forma. La barra de escala es 2 mm. (b) cultivados esferoides en día 3; los esferoides formados se estructuran más firmemente, mientras su diámetro promedio ha descendido de 185.68 ± 22.82 μm, día 1 a 147.00 ± 17.11 μm, día 3. La barra de escala es 2 mm. (c) Ampliación imágenes del esferoide en 1 día. La barra de escala es de 500 μm. (d) aumento las imágenes del esferoide en día 3. La barra de escala es 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Resultado de la simulación para el vector de densidad de flujo magnético. La densidad del flujo magnético en el arreglo de imán se calcula utilizando el módulo de la magnetostática. El resultado de la simulación muestra que la densidad de flujo magnético más fuerte es en el centro de cada imán, causando los granos a ser atrapados en el centro de los agujeros donde con seguridad se convirtió en fijo. La barra de escala es 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Distribución del campo magnético de matriz imán. Cada imán es de la polaridad opuesta a su vecino. El campo magnético horizontal es dominante en la interfaz entre los imanes vecinos, mientras que el campo magnético vertical es más fuerte en el centro de cada imán. Estas fuerzas direccionales guían una tira para el centro de un imán. (a) campo magnético de la matriz de imán. (b) el vector de campo magnético según lo determinado por simulación de magnetostática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 : Limitación usando solo imán grande y de tamaño de grano. (a) a diferencia del caso de la utilización de un conjunto de pequeños imanes, cuando un imán grande se utiliza, casi todos los granos tienden a moverse al borde o centro del imán donde se forma el campo magnético de alta densidad. Además, los granos están conectados para formar una cadena. La barra de escala es 10 mm. (b) imagen de SEM de micropocillos vinculados que se fabricaron utilizando Φ800 μm de 1 mm x 1 mm x matriz de imán de 1 mm. Con una tira que es demasiado grande en tamaño en relación con el tamaño del imán puede crear un pequeño agujero en la pared entre pocillos adyacentes. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : La importancia de elegir el tamaño apropiado de la placa superior espesor y agujero en el proceso de captura de cuentas. (a) si la placa superior es demasiado gruesa, se producirá una doble trampa. (b) por el contrario, si la placa superior es demasiado fina, hay una tendencia para los granos que salen. (c) si el tamaño por-agujero es más grande que el diámetro de grano, puede ocurrir dislocación doble trampa tanto grano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El reto principal de este método de fabricación era la segura fijación de los granos de la matriz a través del agujero en la placa de aluminio. Para resolver este desafío, la fuerza magnética en la forma de una matriz de 30 x 30 imán fue utilizada para fijar los granos con seguridad, como se muestra en las figuras 6 y 7. La densidad de flujo magnético de la matriz de imán, que tiene la polaridad opuesta, es más fuerte en el centro de cada superficie del imán. Porque la fuerza de la fuerza magnética depende de la densidad de flujo, los granos fueron guiados al centro de la superficie superior de cada imán donde se mantuvieron en posición. Si se usó un solo imán de gran tamaño (5 × 5 cm × 1 cm), los granos, especialmente los que en el extremo exterior agujeros, tienden a ser atraídos por el mayor campo magnético de intensidad en el borde del imán. Otro problema con el uso de grandes imanes es que los granos se pegan espontáneamente para crear cadenas de grano pequeño (figura 8a).

El papel de la placa superior (orificio de 750 μm) fue servir a la geometría del hoyo para atrapar los granos. Debido a esta estructura del hoyo, es posible raspar los granos una placa de acrílico para crear un gran número de arreglos de discos de grano atrapados a la vez (protocolo 2.4 y figura 1C y 1D). Si no utiliza la placa superior, cada grano debe introducirse manualmente en la base (550 μm agujero) uno a la vez.

Las limitaciones de nuestro método son la necesidad de un grabador CNC que es el dispositivo más caro usado en el método. Tales máquinas CNC tienen un precio de alrededor de $3000. Esto, sin embargo, es todavía mucho más barato que las instalaciones convencionales de litografía blanda. Otra limitación inherente de nuestro método es la necesidad de pequeños imanes, y la brecha entre los micropocillos es dependiente en el tamaño del imán, que fue de 1 mm en la demostración que se describe en este documento. Sería difícil reducir esta brecha mucho más ya que imanes más pequeños que 500 μm no son fácilmente disponibles. Además, el tamaño máximo de grano también fue limitado. Los granos atrapados fueron magnetizados por imanes. Si el espacio entre granos magnéticos era demasiado estrecho, la probabilidad de pegar juntas es mayor que algunos de los micropocillos fueron conectados por los agujeros como se muestra en la figura 8b. Por lo tanto, cuando se utilizan 1 mm x 1 mm x imanes de 1 mm, cuentas con un diámetro de 700 μm o más no se recomiendan

En comparación con otros métodos de fabricación como de membrana flexible14, litografía de hielo18 y deep reactive ion grabado20, este método de fabricación no requiere servicios de litografía especial, permite la posición de micropocillos que fáciles de controlar y puede producir una forma de micropocillos cóncava estandarizados. Además, aguafuerte mojada de PDMS21, escala de grises litografía22y parte trasera difusa luz litografía23 se han propuesto para la producción de geometrías cóncavas. Sin embargo, aguafuerte mojada de PDMS requiere una estructura rectangular para hacer un pocillo redondo y cóncavo y no es conveniente para hacer un pocillo abierto. El método de litografía en escala de grises tiene la ventaja de utilizar las instalaciones existentes de litografía de foto, pero la necesidad de instalaciones a un precio alto y máscara de foto en escala de grises es una desventaja. Parte trasera difusa luz litografía fue otro método reciente para fabricar los micropocillos cóncavos con diversos cocientes de aspecto, pero sólo en la baja resolución de la densidad del patrón.

El paso crítico en la fabricación de micropocillos cóncava es la selección del espesor y el tamaño a través del agujero de la placa superior (paso de 1.1 y 1.3). Si la placa por el agujero es demasiado gruesa, múltiples cuentas pueden quedar atrapadas en cada hueco (Figura 9a); Si es demasiado fino, los granos no se fija en el paso 2.4 y así dislocados de los agujeros (Figura 9b). En el caso de lo mayores por-agujero, trampa múltiple y dislocación pueden ocurrir (figura 9C).

Como una guía para seleccionar el tamaño del imán y el espesor de la placa a través del agujero, se recomienda que el tamaño del imán y el espesor de la placa de"hueco" se basa en el tamaño del grano. El tamaño del imán debe ser mayor que el diámetro del grano y el espesor de la placa a través del agujero no debe exceder el diámetro del grano. Sin embargo, puesto que la elección de los imanes y el grueso de la placa es empírica, estudios paramétricos y optimización más detallada se incluirán en futuros estudios.

Metas para el futuro de nuestro método incluyen la fabricación de los micropocillos de nicho-como la célula de vástago de biomimética en vitro folículos24, pocillos personalizados organoide generación25, y diversas matrices de diferentes tamaños de los micropocillos para estudiar la dependencia de las células cancerosas y las células inmunes de tamaño esferoidal.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro (NRF-2014R1A1A2057527 y NRF-2016R1D1A1B03934418).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

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