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Une perle apparié et aimant tableau pour le moulage des micropuits avec des géométries variables Concave

Bioengineering

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Summary

Ce manuscrit présente une méthode robuste de fabrication micropuits concaves sans la nécessité d’installations complexes de desserte à coût élevé. En utilisant la force magnétique, billes en acier et un tableau d’à travers-trou, plusieurs centaines micropuits ont été formées dans un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) 3 cm x 3 cm.

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Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

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Abstract

Une culture de sphéroïde est un outil utile pour comprendre le comportement cellulaire qu’il fournit un en vivo-comme l’environnement en trois dimensions. Diverses méthodes de production de sphéroïde tels que les surfaces non adhésive, flacons de spinner, pendaison gouttes et micropuits ont été utilisés dans l’étude de l’interaction cellule-cellule, activation immunitaire, drogue, dépistage, tige la différenciation cellulaire et organoïde génération. Parmi ces méthodes, micropuits avec une géométrie concave en trois dimensions ont retenu l’attention de scientifiques et d’ingénieurs, compte tenus de leurs avantages de génération sphéroïde de taille uniforme et la facilité avec laquelle les réponses des sphéroïdes individuels peuvent être surveillé. Même si les méthodes rentables telles que l’utilisation des membranes flexibles et lithographie de glace ont été proposés, ces techniques encourent de graves inconvénients comme la difficulté à contrôler la taille du modèle, réalisation des allongements élevés et la production de grandes zones de micropuits. Pour résoudre ces problèmes, nous vous proposons une méthode robuste de fabrication micropuits concaves sans la nécessité d’installations complexes de desserte à coût élevé. Cette méthode utilise un tableau d’à travers-trou de 30 x 30, en acier plusieurs centaines micromètre-ordre perles et force magnétique pour fabriquer 900 micropuits dans un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) 3 cm x 3 cm. Afin de démontrer l’applicabilité de notre méthode pour applications biologiques cellulaires, nous mis en culture des cellules souches adipeuses pendant 3 jours et produit avec succès des sphéroïdes à l’aide de notre plateforme de microtitration. En outre, nous avons effectué une simulation de magnétostatique pour étudier le mécanisme, par lequel force magnétique a été utilisée pour piéger les billes en acier dans les trous. Nous croyons que le procédé de fabrication de microtitration proposé pouvait être appliquée à beaucoup d’études cellulaires axée sur le sphéroïde tels que le dépistage des drogues, la régénération tissulaire, différenciation des cellules souches et métastases cancéreuses.

Introduction

Les cellules cultivées dans une forme sphéroïde sont plus proches de tissu réel dans le corps à une culture plane à deux dimensions1. Compte tenu de cet avantage, l’utilisation des sphéroïdes a été adoptée afin d’améliorer l’étude de l’interaction d’une cellule à2,3, activation immunitaire4,5et6de la différenciation de dépistage de drogue. En outre, sphéroïdes intégrant plusieurs types de cellules ont récemment été appliquées à organoïdes (près-physiologique en trois dimensions (3D) de tissu), qui sont très utiles pour étudier le développement et la maladie humaine7. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour produire des sphéroïdes. La méthode la plus simple consiste à l’utilisation d’une surface non adhésive, telles que les cellules agrègent entre elles et sphéroïdes de forme. Une boîte de Pétri peuvent être traitées avec l’albumine sérique bovine, Pluronique F-127 ou un polymère hydrophobe (p. ex. le méthacrylate de 2-hydroxyethl poly) pour rendre sa surface non adhésive89. La méthode spinner-ballon est un autre moyen connu de produire de grandes quantités de sphéroïdes10,11. Dans cette méthode, cellules sont maintenues en suspension par agitation pour les empêcher de devenir attaché au substrat. Au lieu de cela, le flottement des cellules au total à sphéroïdes de forme. La méthode surface non adhésive et méthode du flacon toupie peuvent produire de grandes quantités des sphéroïdes. Cependant, ils sont sous réserve des limites, y compris les difficultés à contrôler la taille de sphéroïde, ainsi que le suivi et la surveillance de chaque sphéroïde. Comme un remède pour ce genre de problèmes, une autre méthode de production de sphéroïde, à savoir, la pendaison drop méthode peuvent être indépendants12. Cela consiste à déposer des gouttes de suspension cellulaire sur le dessous du couvercle d’une boîte de Petri. Ces gouttes sont généralement 15 à 30 µL en taille et contient environ 300 à 3000 cellules13. Lorsque le couvercle est inversé, les gouttes sont maintenus en place par la tension superficielle. La microgravité dans chaque goutte concentre les cellules, qui forment alors des sphéroïdes unique à l’interface liquide-air libre. Les avantages de la pendaison méthode drop sont qu’elle offre une distribution de taille bien contrôlées, s’il est facile de retracer et de surveiller chaque ellipsoïde, par rapport à des méthodes de fiole non-adhésifs surface et le cône. Toutefois, cette méthode entraîne un inconvénient en ce que la production massive de sphéroïdes et le processus de production lui-même est excessivement labor intensive.

Un tableau de microtitration est un plat plaque avec nombreux puits de taille micro, chacun ayant un diamètre allant de 100 à 1000 µm. Le principe de production de sphéroïde lors de l’utilisation des puits est similaire à celle de la méthode de surface non adhésive. Avantages incluent le fait que micropuits offrent des espaces entre les puits pour séparer les cellules ou les sphéroïdes, tel qu’il est facile de contrôler la taille de sphéroïde, tout en la rendant aussi facile à contrôler chaque ellipsoïde simple. Avec un grand nombre de puits, production de sphéroïde de haut débit est également possible. Un autre avantage de micropuits est la possibilité de puits de forme des formes différentes (hexaèdres, cylindrique, trigonale prismatique) selon des fins expérimentales uniques des utilisateurs. En règle générale, cependant, une forme tridimensionnelle (3D) concave (ou hémisphérique) est considérée comme étant les plus aptes à la production de taille uniforme unique sphéroïdes. Par conséquent, l’utilité de micropuits concaves a été signalée dans plusieurs études de biologie cellulaire comme celles examinant la cardiomyocyte la différenciation de cellules souches embryonnaires14, la sécrétion d’insuline des cellules des îlots pancréatiques grappes15, la activité enzymatique des hépatocytes16et la résistance aux médicaments de tumeur sphéroïdes17.

Malheureusement, la fabrication de micropuits souvent exige que les installations spécialisées microstructuration ; les méthodes classiques axées sur la photolithographie nécessitent l’exposition et des installations en voie de développement tandis que réactives ion-eau-forte-méthodes basées sur le besoin d’équipement plasma et faisceau d’ions. Cet équipement est coûteux qui, ainsi que le processus de fabrication complexe, présente une haute barrière à l’entrée pour les biologistes qui n’ont pas accès aux microtechniques. Pour résoudre ces problèmes, autres méthodes rentables tels que glace Lithographie18 (en utilisant les gouttelettes d’eau congelée) et la membrane souple méthode14 (à l’aide d’une membrane, substrat d’à travers-trou et un vide) ont été suggérés. Toutefois, ces méthodes subissez également sérieux inconvénients tels que qu’il soit difficile de contrôler les tailles de patron, la réalisation des allongements élevés et la production de micropuits de plus grande surface.

Pour surmonter ces problèmes, nous vous proposons une méthode de fabrication nouveaux micropuits concave utilisant un substrat d’à travers-trou, billes en acier et un tableau magnétique. En utilisant cette méthode, des centaines de puits sphériques concaves peuvent être fabriquées en profitant du mécanisme de force magnétique-assistée autobloquants perles métalliques (Figure 1). Le procédé de fabrication implique l’utilisation de très peu d’installations coûteuses et compliquées et n’exige pas beaucoup de compétences avancées. Ainsi, des personnes même non qualifiées peuvent entreprendre facilement cette méthode de fabrication. Pour illustrer la méthode proposée, l’homme adipeux-dérivées de cellules souches ont été cultivées dans des micropuits concaves pour produire des sphéroïdes.

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Protocol

1. préparation d’à travers-trou tableau aluminium plaque et aimant array

  1. Préparer deux 50 mm x 50 mm (ou plus) plaques d’aluminium. L’épaisseur de chaque plaque a été 300 µm qui est la moitié du diamètre de la perle.
  2. Forment un éventail d’à travers-trou de 30 x 30 sur une des plaques d’aluminium à l’aide d’un graveur rotatif CNC avec un peu de micro perceuse Φ550-µm avec 30 mm/s de taux de chute et 8000 tr/min de vitesse de broche. La distance entre chaque trou (Centre) était de 1 mm (Figure 1 et Figure 2 a, j’ai).
  3. Former un tableau de 30 x 30 de Φ750-µm à travers-trous sur l’autre plaque en aluminium, en utilisant la même procédure que celle décrite en 1.2 (Figure 1 et Figure 2 a, ii).
  4. Fixez les deux plaques entre eux à l’aide d’un ruban adhésif et forment des orifices d’alignement mm Φ3 à chacun des quatre coins des deux plaques d’aluminium.
  5. Faire tremper les plaques en aluminium à 15 % d’acide sulfurique pendant 12 h nettoyer leurs surfaces. Étant donné que la fine couche d’oxyde d’aluminium sur la surface de l’aluminium le rend résistant à la corrosion, le diamètre du trou et l’épaisseur de la plaque ne sont pas modifiées par ce traitement à l’acide.
  6. Former un tableau de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 aimants de néodyme de mm (avec une force magnétique de 0,363 N). Veiller à ce que chaque aimant est la polarité opposée à son voisin. Pour éviter la rupture ou la diffusion du tableau aimant, fixer une plaque d’aluminium de 30 x 30 mm au bas du tableau magnétique à l’aide de ruban double-face (Figure 2 a, iii et encart dans la Figure 2).

2. processus de piégeage perle

  1. Aligner et empiler les deux plaques d’aluminium (plaque supérieure : 750-µm-trou de la plaque, la plaque inférieure : 550-µm-trou de la plaque) en utilisant les trous préparés alignement aux quatre coins de chaque plaque (Figure 1 b).
  2. Verrouiller les deux plaques ensemble en insérant les boulons de M3 dans les trous de l’alignement et puis fixer les boulons et écrous (Figure 1 b).
  3. Empiler l’assemblage de plaque d’aluminium sur le tableau préparé aimant (Figure 1 b, 2 bet 2C). Aligner le tableau des aimants et le tableau des trous dans la plaque d’aluminium au cours du processus d’empilage. Puis utilisez un ruban adhésif pour fixer la position du tableau magnétique.
  4. Place un nombre suffisant de Φ600 mm SUJ2 acier perles sur la plaque et de manipuler les billes à l’aide d’un acrylique (ou non métalliques) plaque de tel qu’une perle se retrouve piégée dans chaque trou (Figure 1C, 1Det 1e) tout en même temps enlever les perles excès qui n’ont pas déposé dans les trous.
  5. Retirer délicatement la plaque supérieure pour éviter la diffusion non désirée et dislocation des perles piégés (Figure 1f).

3. concave microwell fabrication

  1. Déplacez le moule microwell concave, produit en étapes 2.1 à 2.5, ci-dessus, à une boîte de Pétri.
  2. Mélanger le polydiméthylsiloxane (PDMS) monomère et salaison selon instructions19 les directives du fabricant avec un monomère PDMS : ratio 10:1 agent de polymérisation.
  3. Dé-gaz le mélange PDMS en utilisant un dessiccateur et pompe à vide pour enlever les bulles pris au piège dans le mélange PDMS.
  4. Versez le mélange PDMS dans le moule de microtitration concave et dé-gaz à nouveau en utilisant la même procédure que celle décrite en 3.3 (Figure 1f).
  5. Faites cuire le mélange PDMS sur une plaque de cuisson à 80 ° C pendant 2 h former un substrat PDMS perle incorporé (Figure 1 g).
  6. Enlever le substrat PDMS guéri du moule (Figure 1 g). Dans le processus de suppression, vaporiser le méthanol à l’aide de bouteille de lavage pour détacher le substrat PDMS du moule.
  7. À l’aide d’un Φ15 mm x 2 mm aimant, enlever les billes en acier pris au piège du substrat de PDMS (Figure 1 h). Pour ce processus, un aimant qui est suffisamment fort pour extraire les perles du substrat de PDMS peut être utilisé.

4. la culture de sphéroïde

  1. Couper le substrat PDMS de microtitration à motifs concave à l’aide d’un poinçon de biopsie de mm Φ14 à être montés sur des plaques 24 puits dans cette étude.
  2. Stériliser le substrat PDMS mm de Φ14 qui en résulte dans un stérilisateur autoclave à 121 ° C et 15 lb/po2.
  3. Placez le substrat PDMS stérilisé dans une plaque 24 puits.
  4. Enduisez le substrat PDMS ensemble avec 4 % (p/v) Pluronique F-127 solution du jour au lendemain pour empêcher la fixation des cellules à la surface de microtitration. Pendant le procédé de revêtement, éliminez les bulles d’air piégés dans les puits concaves en pipettant également, ou en utilisant un nettoyeur à ultrasons.
  5. Rincer la solution F-127 trois fois à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  6. Graines de 1 mL de solution de cellule-milieu (Eagle modifié de Dulbecco milieu) (qui contient 2 x 106 cellules) sur le substrat PDMS. Notez que la densité de semis peut être changée selon la cible sphéroïde taille et/ou le type de cellule cible. Ici, cellules souches dérivées d’adipeux (ASC) ont été utilisés.
  7. Aspirer le 1 mL de milieu à l’aide d’une pipette de 1000 µL pour enlever toutes les cellules excédentaires qui n’étaient pas piégés dans les puits (Figure 3).
  8. Incuber les cellules à 36,5 ° C, humidité de > 95 % et 5 % CO2 condition. Dans le cas de l’ASCs utilisés dans notre étude, les cellules agrégées à un sphéroïde en 48 h.

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Representative Results

Un moule convexe et microwell modèle ont été fabriqués avec succès en suivant les étapes 2,1 à 3,7. (Figure 4). Les billes en acier commerciales ont été pris au piège dans le tableau d’à travers-trou de 30 x 30. Les perles ont été fermement maintenues sans aucun écart entre les perles et l’à travers-trous correspondants (Figure 4 a). La forme de préfabriqués microwell concave est concave hémisphérique, avec un diamètre de 600 µm, qui est la même que celle de la bille en acier (Figure 4 b). Un échantillon représentatif d’un micropuits concave (Figure 4C) montre que la distance entre le puits voisin était 1 mm (Centre), qui était la même que celle de l’à travers-trous. Le substrat de microtitration mm concave Φ14, qui a été placé dans la plaque 24 puits, contenait plus de 120 puits (Figure 4D).

Cellules souches dérivées d’adipeux ont été cultivés dans des micropuits concaves. Nous avons ensemencé 2 x 106 cellules sur le tableau de microtitration concave Φ14 mm. Après 24 h, les cellules étaient regroupées en sphéroïdes, tel qu’illustré à la Figure 4. Le diamètre moyen des sphéroïdes formé dans notre tableau de microtitration était 185.68 ± 22.82 µm (jour 1, Figure 5 a, 5C). Au 3e jour, les cellules étaient devenu plus agrégées, avec le diamètre moyen des sphéroïdes tombant à 147,00 ± 17,11 µm (Figure 5 b, 5D).

Figure 1
Figure 1 : Schéma du processus de fabrication de. (a) faire 30 x 30 Φ550 et tableau d’à travers-trou 750 µm en plaques d’aluminium à l’aide du graveur CNC. (b) en alignant les deux par le biais de plaques en utilisant les trous de l’alignement. Par la suite, les plaques alignées étaient empilées sur le tableau de l’aimant. (c) une quantité suffisante de billes en acier sur les plaques de l’ensemencement. (d) gratter les perles à l’aide d’une plaque d’acrylique pour piéger les perles dans le tableau d’à travers-trou. (e) perles ont été pris au piège dans le tableau d’à travers-trou. (f) la plaque supérieure (tableau d’à travers-trou Φ750-µm) a été supprimée et non polymérisée mélange PDMS a été versé dans le moule. (g) après que le PDMS a été cuit à 80 ° c pendant 2 h, le PDMS durci a été moulée. (h) le PDMS durci attrape les billes en acier. Les perles sont ensuite éliminés à l’aide d’un aimant néodyme (Φ15 mm avec une épaisseur de 2 mm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Procédé de fabrication. b préparer deux plaques à travers-trou et tableau de l’aimant. i) plaque en aluminium avoir 750 µm à travers-trou tableau. II) plaque en aluminium avoir 550 µm à travers-trou tableau. Tableau III) 30 x 30 de 1 mm x aimants 1 x 1 mm. (b) haut de la page vue des plaques empilés et alignés. (c) vue du dessous de plaques empilées et alignées et tableau d’aimant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Enlever les cellules excessives par le ménisque recul. En aspirant le milieu, la tension superficielle a été causée par l’interface air-liquide, puis la tension de surface mis au rebut excessives cellules sur la surface du substrat de microtitration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Moule convexe et tableau fabriqué microwell. a les perles piégé en tôle d’aluminium à travers-trou tableau. Les perles piégés agissent comme un moule pour fabriquer les micropuits concaves. La taille de la perle est de 600 µm. La barre d’échelle est de 1 mm (b) et images (c) SEM de micropuits fabriqués. Chaque micropuits fabriqué a une forme hémisphérique, 600 µm de diamètre. (d) tableau micropuits de Φ14 mm dans la plaque 24 puits. Le tableau contient plus de 120 micropuits concaves. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Culture des sphéroïdes dans des micropuits concave tableau. Le tableau de microtitration Φ14 mm a été ensemencé avec 2 x 106 ASC et cultivé pendant 3 jours. b cultivées sphéroïdes au jour 1 ; les cellules ont commencé à sphéroïdes de forme. La barre d’échelle est de 2 mm. (b) cultivées sphéroïdes à jour 3 ; les sphéroïdes formées sont plus serrés, tandis que leur diamètre moyen est passé de 185.68 ± 22.82 µm à 1 jour à 147,00 ± µm 17.11 au jour 3. La barre d’échelle est 2 mm. (c) grossissement des images de sphéroïde au jour 1. La barre d’échelle est 500 µm. (d) grossissement des images de sphéroïde au jour 3. La barre d’échelle est 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Résultat de la simulation pour vecteur d’induction magnétique. La densité du flux magnétique sur le tableau de l’aimant a été calculée en utilisant le module de magnétostatique. Le résultat de la simulation montre que la plus forte densité de flux magnétique est au centre de chaque aimant, causant les perles être pris au piège dans le centre de l’à travers-trous où ils sont devenus bien fixés. La barre d’échelle est 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Distribution de champ magnétique du tableau aimant. Chaque aimant est de la polarité opposée à son voisin. Le champ magnétique horizontal est dominant à l’interface entre les aimants voisines, tandis que le champ magnétique vertical est plus fort au centre de chaque aimant. Ces forces directionnelles guident une perle au centre d’un aimant. b champ magnétique du tableau de l’aimant. (b) vecteur du champ magnétique tel que déterminé par la simulation de la magnétostatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Limitation à l’aide du seul grand magnet et de taille de perle. b Contrairement au cas d’utiliser un tableau de petits aimants, quand un gros aimant est utilisé, la quasi-totalité des perles ont tendance à déplacer vers le bord ou le centre de l’aimant où le champ magnétique de haute densité est formé. En outre, les perles sont reliés pour former une forme de chaîne. La barre d’échelle est SEM image de 10 mm. (b) de microtitration liée qui a été fabriquée à l’aide de perles de Φ800 µm avec 1 x 1 mm x 1 tableau d’aimant de mm. À l’aide d’un cordon qui est trop grand taille par rapport à la taille de l’aimant peut créer un petit trou dans la paroi de puits adjacents. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : L’importance de choisir la taille de l’épaisseur et trou plaque supérieure appropriée dans le processus de piégeage perle. b si la plaque supérieure est trop épaisse, un double piège se produira. (b) à l’inverse, si la plaque supérieure est trop fine, il y a une tendance pour les perles à se détacher. (c) si la taille de l’à travers-trou est plus grande que le diamètre de la perle, double piège tant perle luxation peut se produire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le défi majeur de cette méthode de fabrication a été la fixation sûre des perles dans le tableau d’à travers-trou dans la plaque d’aluminium. Pour résoudre ce défi, la force magnétique sous la forme d’un tableau de 30 x 30 aimant servait à fixer les perles solidement, comme illustré dans les Figures 6 et 7. La densité du flux magnétique du tableau aimant, qui a la polarité opposée, est la plus forte au centre de chaque surface de l’aimant. Parce que les effectifs de la force magnétique dépend de la densité de flux, les perles ont été guidés vers le centre de la face supérieure de chaque aimant où ils étaient détenus au poste. Si un aimant unique de grande taille (5 cm × 5 cm × 1 cm) a été utilisé, les perles, en particulier ceux situés à l’extrême en dehors des trous, ont tendance à être attirés au champ magnétique intensité supérieur créé à l’extrémité de l’aimant. Un autre problème avec l’aide de gros aimants, c’est que les perles se collent spontanément pour créer des petites chaînettes (Figure 8 a).

Le rôle de la plaque supérieure (trou de 750 µm) était de servir la géométrie de la fosse pour intercepter les perles. Grâce à cette structure de fosse, il est possible de gratter les perles avec une plaque d’acrylique pour créer un grand nombre de tableaux de perle piégés à la fois (protocole 2.4 et Figure 1C et 1D). Si vous n’utilisez ne pas la plaque supérieure, chaque perle doit être inséré manuellement dans la base (550 µm trou) un à la fois.

Les limites de notre méthode comprennent la nécessité d’un graveur de commande numérique par ordinateur qui est le plus coûteux dispositif utilisé dans la méthode. Ces machines CNC sont au prix d’environ 3000 $. Ceci, cependant, est toujours beaucoup moins cher que les installations conventionnelles Lithographie douce. Une autre limitation inhérente de notre méthode est la nécessité pour les petits aimants, et l’écart entre les puits dépend de la taille de l’aimant, qui était de 1 mm à la manifestation décrite dans cet article. Il serait difficile de réduire cet écart beaucoup plus étant donné que les aimants inférieures à 500 µm ne sont pas facilement disponibles. En outre, la taille maximum du talon était également limitée. Les perles piégés ont été magnétisés par des aimants. Si l’écart entre les billes magnétiques était trop étroite, la probabilité de collées entre elles est plus élevée que certains des puits étaient connectés par des trous comme illustré en Figure 8b. Par conséquent, lorsqu’on utilise 1 x 1 mm x 1 aimants mm, perles d’un diamètre de 700 µm ou plus ne sont pas recommandés

Par rapport aux autres méthodes de fabrication tels que membrane souple14, lithographie de glace18 et deep reactive ion gravure20, cette méthode de fabrication ne nécessite pas d’installations spéciales de lithographie, permet la position de microtitration à être facile à contrôler et peut produire une forme standard microwell concave. En outre, gravure humide de PDMS21, en niveaux de gris Lithographie22et dos diffusée Lithographie lumière23 ont été proposées pour la production de géométries concaves. Cependant, gravure humide du PDMS nécessite une structure rectangulaire tout d’abord faire un micropuits concaves et rond et n’est pas adaptée pour la fabrication d’un puits ouvert. La méthode de lithographie de niveaux de gris a l’avantage d’utiliser les installations existantes de lithographie de photo, mais la nécessité des installations de prix élevées et niveaux de gris photo masque est un désavantage. Backside diffuse lumière Lithographie constitue une autre méthode récemment déclarée utile pour fabriquer des micropuits concaves avec divers rapports l / h, mais seulement à la faible résolution du plan de la densité.

L’étape critique dans la fabrication de microtitration concave est la sélection de l’épaisseur de l’et la taille à travers-trou de la plaque supérieure (étape 1.1 et 1.3). Si l’à travers-trou de la plaque est trop épais, perles multiples peuvent être pris au piège dans chaque à travers-trou (Figure 9 a) ; Si elle est trop mince, les billes ne seront pas fixés à l’étape 2.4 et donc rupture avec les trous (Figure 9 b). Dans le cas le plus grand à travers-trou, les multiples piège et luxation peuvent se produire (Figure 9c).

Comme guide pour la sélection de la taille de l’aimant et l’épaisseur de la plaque d’à travers-trou, il est recommandé que la taille de l’aimant et l’épaisseur de la plaque de « trous » se fonder sur la taille du talon. La taille de l’aimant doit être plus grande que le diamètre de la perle et l’épaisseur de la plaque d’à travers-trou ne doit pas dépasser le diamètre de la perle. Toutefois, étant donné que le choix d’aimants et épaisseur de la plaque est empirique, optimisation plus détaillée et des études paramétriques figurera dans de futures études.

Objectifs pour l’avenir de notre méthode comprennent la fabrication de cellules souches comme niche micropuits pour biomimétique in vitro follicule pileux24, micropuits personnalisés pour organoïde génération25et les divers tableaux de micropuits de taille différente pour étudier la dépendance à l’égard des cellules cancéreuses et les cellules immunitaires taille sphéroïde.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et les futur Planning (FRO-2014R1A1A2057527 et 2016R1D1A1B03934418-NRF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

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References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

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