Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra

Published 7/23/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

En modifiserings-sentrifugeringsgradientbasert metodikk ble benyttet for å isolere epitelceller fra Rhipicephalus microplus gut-vev. Overflatbundne proteiner ble biotinylert og renset gjennom streptavidinmagnetiske perler for utnyttelse i nedstrømsapplikasjoner.

Cite this Article

Copy Citation

Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rhipicephalus microplus - storfemarken - er den mest betydningsfulle ektoparasitten når det gjelder økonomisk innvirkning på husdyr som vektor av flere patogener. Arbeidet har vært dedikert til storfekontrollen for å redusere skadelige virkninger, med fokus på oppdagelsen av vaksinekandidater, som BM86, plassert på overflaten av tarmgassepitelceller. Nåværende forskning fokuserer på utnyttelsen av cDNA og genomiske biblioteker, for å skjerme for andre vaksine kandidater. Isoleringen av tarmkanalceller utgjør en viktig fordel ved å undersøke sammensetningen av overflateproteiner på tarmmuskulaturmembranen. Dette papiret utgjør en ny og mulig metode for isolering av epitelceller, fra tarmhullinnholdet til halvglasset R. microplus. Denne protokollen utnytter TCEP og EDTA for å frigjøre epitelceller fra subepitelial støttevev og en diskontinuerlig tetthets-sentrifugeringsgradieNt å separere epitelceller fra andre celletyper. Celleoverflateproteiner ble biotinylert og isolert fra epitelceller fra tarmgitt, ved bruk av streptavidin-bundet magnetiske perler som tillater nedstrømsapplikasjoner i FACS- eller LC-MS / MS-analyse.

Introduction

Rhipicephalus microplus , storfemarken, er den mest betydningsfulle ektoparasiten når det gjelder økonomisk innvirkning på storfeindustrien i tropiske og subtropiske regioner, da det vektorer oksekjøtt feber (babesiosis), anaplasmosis og equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Arbeidet har vært viet til tyrkekontroll, for å redusere skadelig effekt, men konvensjonelle metoder som bruk av kjemiske akaricider har implisitte ulemper, som for eksempel forekomst av kjemiske rester i melk og kjøtt, og økningen i utbredelsen av kjemisk resistente flått 5 , 6 , 7 . Følgelig har utviklingen av alternative metoder for tikkontroll blitt undersøkt, slik som bruk av naturlig resistenskveg, biologisk kontroll (biopesticider) og vaksineInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

I jakten på proteiner som kan benyttes som vaksine kandidater, er dagens forskning fokusert på tarmgutten. Midgutveggen er bygd av et enkelt lag av epitelceller som hviler på en tynn basal laminat, med utsiden av basallamina som danner et nettverk av muskler. Lys- og elektronmikroskopobservasjoner indikerer at midguten består av tre typer celler: reserve (utifferentiert), sekretorisk og fordøyelseskanal. Antall celletyper varierer vesentlig avhengig av den fysiologiske fasen. Sekretoriske og fordøyelsesceller oppstår begge fra reserveceller 18 , 19 , 20 .

Konstruksjonen av cDNA-bibliotekerFor å undersøke sammensetningen av tarmkanalen har ført til identifisering av antigeniske proteiner, slik som Bm86, som potensielle vaksinekandidater 2 , 3 , 4 . Glykoproteinet Bm86 er lokalisert på overflaten av tarmkanalceller og fremkaller en beskyttende immunrespons mot storfemarken ( R. microplus ) hos vaksinert storfe. Anti-Bm86 IgG produsert av den immuniserte verten inntas av tippen, gjenkjenner dette antigenet på overflaten av tarmgutceller, og forstyrrer deretter tarmgassvevsfunksjon og integritet. Vaksiner basert på Bm86 antigener har vist effektiv kontroll av R. microplus og Rhipicephalus annulatus ved å redusere antall, vekt og reproduksjonskapasitet hos engorging kvinner, noe som resulterer i redusert larveinfeksjon i etterfølgende kryssgenerasjoner 4 . Bm86-baserte vaksiner er imidlertid ikke effektive mot alle kryssfaser og harViste utilfredsstillende effekt mot noen geografiske stammer av R. microplus , og derfor har biff- og meieriindustrien dårlig tatt disse vaksinene 2 , 4 .

Evnen til å isolere epitelceller fra tarmgutten er en signifikant innovasjon som vil muliggjøre fremdriften av forskning for å bestemme proteinmembranblandingen, inkludert morfologi og fysiologi under forskjellige miljøforhold. Fremgangsmåten beskrevet her anvender chelateringsmiddeletylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og reduksjonsmiddelet tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) for å frigjøre epitelet fra dets subepiteliale støttevev 10 . Epitelet gjenvinnes etter mekanisk forstyrrelse av vevet ved risting, etterfulgt av diskontinuerlig gradient-sentrifugering i Percoll. Dette papiret beskriver en gjennomførbar og ny teknikk for isolering av tick gut epiTelleceller. Biotinylerte celleoverflateproteiner, isolert fra overflaten av disse epitelceller, kan deretter analyseres i nedstrømsapplikasjoner som FACS og / eller LC-MS / MS-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Disseksjon av Gut Epithelium fra R. microplus

  1. Samle semi-engorged flått fra storfe på eksperimentets dag. Dissekter flått innen 24 timer etter fjerning fra verten.
  2. Fest en bånd av duktape til bunnen av 92 mm x 16 mm petriskålen. Legg en dråpe super lim til båndet. Plasser krysset, ventralsiden ned på superlimet, la det tørke i 2 minutter.
  3. Hell 100 ml fosfatbuffert saltvann (PBS) i petriskålen, eller til krysset er helt nedsenket.
  4. Bruk en størrelse 11 skalpell, kutt fra toppen av øynene til bunnen festene, på begge sider av krysset.
  5. Ved hjelp av sterile pinsetter, fullstendig fjerne scutum og alloscutum, for å eksponere de indre organer.
  6. Fjern de fine, hvite trådlignende organene (luftrøret) og andre membraner for å unngå forurensning.
  7. Fjern tarmene med tau, ved å klemme den øvre regionen og trekke fraskrott. Fjern eventuelle gjenværende tarmvev, slik at ingen andre vev er blitt dissekert.
  8. Oppbevar tarm i iskall Hank Balanced Salt Solution (HBSS) uten kalsiumklorid og magnesiumsulfat med proteinaseinhibitor cocktail (PIC). Snap fresen i tørr isen og lagre ved -20 ° C.
    Merk: For å bistå med tarmdisseksjon og detaljering av tarmens indre organer, se kapittel 3.1 av D. Sonenshine, "Biology of Ticks" 19 .

2. Epitelcellerdissosiering

  1. Hell den dissekerte gutten på en 70 μm cellefil i et 50 ml rør.
  2. Skyll tarmvev med 50 ml iskald HBSS med PIC til løsningen løper klart, og tarmene får et hvitt / klart utseende.
  3. Re-suspender tarmene i 30 ml iskald HBSS med PIC, bland forsiktig og sentrifuger ved 500 xg ved 4 ° C i 10 minutter for å pellet tarmen. Fjern supernatanten og gjenta vaskeprosessen tre ganger.
  4. Filtrer suspensjonen gjennom en 250 μm cellefilter, vortex gjennomstrømningen og filtrer gjennom en 70 μm cellefilter som samler gjenværende gjennomstrømning.
  5. Sentrifuger suspensjonen ved 500 xg ved 4 ° C i 20 minutter for å pelletere enkeltcellene.

3. Isolering av enkle epitelceller ved bruk av en tetthetscentrifugeringsgradient

  1. Forbered tetthetscentrifugeringsgradienten ( f.eks . Percoll) ved å filtrere gjennom et AP15-forfilterpapir. Klargjør 40% og 20% ​​Percoll i mqH 20 (v / v) og avkjøl ved 4 ° C i 1 time før lagring av gradienten.
  2. Bruk av peristaltiskPumpe satt til laveste hastighet, lag 3 ml 40% densitets sentrifugeringsgradient i et 16 ml ultracentrifugerør, slik at det kan sette seg på is i 15 minutter. Hastigheten til pumpen skal føre til en strømningshastighet på <1 ml per minutt.
  3. Tiltning av røret i en 45 ° vinkel, bruk peristaltpumpen til å lagre sentrifugeringsgradienten på 20% på toppen av 40% lag. Hastigheten til pumpen skal føre til <1 ml per min strømningshastighet. La lagene legge seg på is i 15 minutter.
  4. Bruk peristaltisk pumpe ved <1 ml per min strømningshastighet til lag 3 ml DMEM medium inneholdende tarmgassceller over 20-40% densitets-sentrifugeringsgradienten.
  5. Programmér sentrifugen for maksimal akselerasjon og minimum retardasjon. Sentrifuge ved 600 xg i 10 minutter. Samle interfaser mellom DMEM: 20% tetthet sentrifugering gradient, og 20%: 40% tetthet sentrifugering gradienter å isolere epithelial enkeltceller. Oppbevar innsamlede interfaser ved 4 ° C for senere analyser.

4. Vurdering av cellisolasjon

  1. hemacytometer
    1. Rengjør hemacytometerlyset med alkohol.
    2. .Re-suspendere cellene ved forsiktig pipettering av cellene opp og ned. Pipetter 100 μl av cellesuspensjonen og sett i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Tilsett 400 μl 0,4% Trypan Blue. Bland forsiktig ved å flippe røret.
    4. Pipetter 100 μL av Trypan Blue-behandlet celle suspensjon for langsomt å fylle begge kamrene av hemocytometeret.
    5. Plasser hemocytometeret under et lysmikroskop, med fokus på gridlinjene i hemocytometeret med et 10X objektiv.
    6. Bruk en håndholdt tallyteller, teller de levende ufarvede cellene i et sett på 16 firkanter. Telle de blå døde cellene innenfor samme torg. Fortsett å telle inntil fire sett med 16 firkanter teller.
    7. Beregn de totale cellene per ml ved å bruke formelen:
      47eq1.jpg "/>
    8. Beregn prosentvis cellelevbarhet ved å bruke formelen:
      Ligning 2
  2. Cellisolere visualisering
    1. Fortynn 1 μl av de isolerte cellene i 9 μl HBSS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Smør mikrocentrifugerøret forsiktig for å blande.
    2. Pipetter 5 μl isolerte celler i HBSS inn i midten av en glidelåse. Påfør tre dråper monteringsmedium med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
    3. Inkubér lysbildet ved romtemperatur i 5 minutter. Legg forsiktig et deksel over preparatet, unngå luftbobler.
    4. Visualiser celler som er farget med DAPI ved ekspansjon 360 nm og emisjon ved 460 nm under et fluorescerende mikroskop.

5. Cell Surface Protein Biotinylation

  1. Biotinylat 100 μl enkeltcellepitelceller ved bruk av Biotin (Type A) -konjugeringKit, ved et molforhold på 1: 1 overflateprotein til konjugat, i henhold til produsentens instruksjoner
  2. Til cellelys, tilsett 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 μM oksidert glutation og PIC til de biotinylerte celler. Inkubér på is i 1 time med forsiktig blanding hver 10. minutt.
  3. Sentrifug de biotinylerte cellene ved 20.000 xg ved 4 ° C i 20 min til pellet uoppløselig materiale. Samle supernatanten som inneholder cytoplasmatiske og biotinylerte membranproteiner.
  4. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen.

6. Isolering av biotinylerte overflateproteiner

  1. Tilsett 50 μL streptavidinmagnetiske perler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Plasser røret i et magnetisk stativ, oppsamler perlene mot røret. Fjern og kast supernatanten.
  3. Tilsett 1000 μL TBS, 0,1% Tween-20 til røret. Bland forsiktig og samle perler med magnetisk stand. Fjern og kast supernatanten.
  4. Kombiner 40 μg biotinylerte celleoverflateproteiner, fortynnet til 300 μl i 1x PBS med vasket magnetiske perler. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur med omrøring.
  5. Samle perlene med et magnetisk stativ, fjern og kast supernatanten.
  6. Tilsett 300 μL TBS, 0,1% Tween-20 til røret, bland forsiktig for å suspendere perlene igjen. Samle perler, fjern og kast supernatanten. Gjenta dette vaske trinnet to ganger.
  7. Tilsett 100 μL av 0,1 M glycin pH 2,0 til de magnetiske perlene, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Samle perler og fjern supernatant som inneholder eluerte biotinylerte overflateproteiner.
  8. Visualiser isolerte overflateproteiner på en 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE gel.

7. Vurdering av biotinylert overflateprotein

  1. Dot Blot
    1. Klipp en 7 cm x 3 cm stripe av nitrocellulose membran.
    2. Påfør 10 μg total tick guT innhold (fra 1,8 over) og 10 ug biotinylert overflateprotein til membranen. Tillat tørking i 15 minutter ved romtemperatur.
    3. Overfør til en beholder og senk i 100 ml blokkeringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur med omrøring i en time. Kast blokkering buffer.
    4. Vask nitrocellulose-membran i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 5 minutter med omrøring. Kast vaskebufferen og gjenta vaskerne tre ganger.
    5. Inkubér i 1/5000 Streptavidin-pepperrotperoksidase (HRP) i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 2 timer med omrøring ved romtemperatur, og kast bort eventuell gjenværende løsning.
    6. Vask nitrocellulose-membran i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 5 minutter med omrøring. Kast vaskebufferen og gjenta vasken tre ganger.
    7. Til påvisning oppløses 1 tablett 4-klor-1-naftol i 10 ml iskald metanol. Tilsett 4 ml metanolmasse til 20 ml TBS. Tilsett 10 μl friskt 30% hydrogenperoksid og immediaTely gjelder for nitrocellulose membran.
    8. Inkuber med omrøring ved romtemperatur til substrat produserer et uoppløselig blått sluttprodukt. Dette kan ta mellom 2-15 minutter.
    9. Kast deteksjon løsning og vaske membranen tre ganger i 100 ul mqH 2 O.
  2. ELISA-analyse
    1. Fortynn 200 ng av hver prøve med 400 μl 100 mM karbonatbelegningsbuffer og frakk 2 baner i den første raden (A #) av ELISA-platen (flate bunnbrønner)
    2. Tilsett 100 μl 100 mM karbonatbeleggbuffer til alle andre tilsvarende brønner i rader (BH).
    3. Forbered serielle fortynninger av hver prøve ved pipettering 100 μL fra hver brønn i rad A, og overfør til rad B. Bland forsiktig ved pipettering og unngå å produsere bobler. Gjenta fortynninger ned hver rad, og kast den endelige 100 μL fra hver brønn i rad H.
    4. Dekk platen med parafilm og inkuber ved 4 ° C over natten.
    5. Vask platenE med 200 ul PBS, 0,05% Tween-20 per brønn tre ganger.
    6. Tilsett 200 μl blokkeringsbuffer til de belagte brønnene, dekk med Parafilm og inkuber ved 4 ° C over natten.
    7. Fortynn 1 / 15.000 Streptavidin-HRP i blokkeringsbuffer og tilsett 100 μL til hver brønn på platen. Dekk med parafilm og inkuber ved 4 ° C over natten.
    8. Vask platen i 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per brønn fem ganger.
    9. For å oppdage, tilsett 100 μL TMB reagens per brønn. Etter tilstrekkelig fargeutvikling, vanligvis mellom 10-15 minutter, tilsett 100 μL 1 M fosforsyre for å stoppe reaksjonen.
    10. Les absorbansen av hver brønn ved λ = 450 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitelceller ble isolert fra tarmvevene til R. microplus ifølge det skjematiske presentert i figur 1 . Representativ fluorescensmikroskopi av epitelceller med tarmgitt fremstilt ved bruk av denne protokollen er vist i figur 2A Og 2B. Da cellisolasjonen utføres på semi-engorged R. microplus, opptrer celler som singular, sfærisk, glatt overflatemorfologi og en konsistent størrelse gjennom hele prøven. Forskjeller i størrelse og type tarmcellepopulasjoner er mer tydelige når tippen fortsetter å bli fullstendig engorged voksne.

Fluorescerende farging av kjernen fra isolerte epitelceller med DAPI hjelper til å visualisere cellene. Dårlig isolasjon er visualisert for å inneholde ufullstendig dissociering av epithElialceller med varierende cellepopulasjoner identifisert gjennom de varierende cellestørrelsene og morfologiene ( figur 2C og 2D )

Ved anvendelse av denne protokollen ble ca. 1,2 x 10 7 celler per / ml fra 50 tarmdisseksjoner med 75-80% levedyktighet isolert med suksess fra R. microplus tick tarm. Kryss-forurensning fra vertsproteiner ( Figur 3A ) kan minimeres ved å skylles tynt nok til de har et hvitt utseende som resulterer i en hvit / klar Percoll-gradient ( Figur 3B ).

Overflate-bundne proteiner ble isolert gjennom biotinylering av overflatebundne proteiner, ødeleggelse av cellulære membraner og rensing av biotinylerte overflateproteiner med magnetiske streptavidinperler. Totalt 20-24 μg renset biotinLaterte overflateproteiner kan isoleres for nedstrømsapplikasjoner fra en innledende disseksjon av 50x tick guts ved bruk av denne protokollen. Sammenligning av proteiner ved SDS-PAGE ( figur 4A ), sølvflekke ( figur 4B ), punktblot ( figur 5 ) og ELISA ( figur 6 ) indikerer at den beskrevne metodologien vellykket renset biotinylerte overflateproteiner fra epitelceller isolert fra R. microplus tick mage.

Figur 1
Figur 1 : Skjematisk representasjon for å isolere biotinylerte proteiner tilstede i overflaten av R. microplus midgutceller . Vennligst clIck her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : Fluorescensmikroskop visualisering (100x) av R. microplus midgut epitelceller farget med DAPI. Programvaren ble brukt til å gjennomføre fluorescensoverlegget. A & B) Represent epithelialceller som er vellykket isolert fra R. microplus midgut . C / D) Epitelceller isolert fra R. microplus gut forurenset med større tippevev .

Figur 3
Figur 3 : Percollgradient inneholdende DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Epitelcellelagene ble dannet mellom DMEM: 20% PErcoll og 20: 40% percoll. ( A ) Merk av tarmdiseksjon uten tilstrekkelig vaskestrøm. ( B ) Merk av tarmdiseksjon med tilstrekkelig vaskestrøm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : Elektroforetiske separasjoner av biotinylerte overflateproteiner kjører på 4-20% Tris-MOPS gel, ved 140 V i 55 minutter med 10 μg prøve utnyttet. (L) PageRuler formerket protein stige (1) Umerket R. micro hele tarmprøve (2) Biotinylerte proteiner ekstrahert fra R. micro hele tarmen som i trinn 6. (3) Proteiner fra epitelceller hentet fra umerket R. micro gut (4- ) Biotinylerte proteiner ekstrahert fra R. microplusEpitelceller som i trinn 6. ( A ) SDS-PAGE farget med Comassie blå ( B ) sølvflekk.

Figur 5
Figur 5 : Dot blot analyse. Streptavidin-HRP konjugert fortynnet 1/5000. ( A ) I alt 10 μg råtteguttproteinekstrakt ( B ) Biotinylerte overflateproteiner ekstrahert fra rensede epitelceller (10 μg).

Figur 6
Figur 6 : Vurdering av biotinylert overflateprotein-levedyktighet ved bruk av ELISA. ELISA av overflateproteiner ble utviklet av Strep-HRP-konjugert antistoff fortynnet 1 / 15.000 mot forskjellige konsentrasjoner av biotinylert ticK-gut-proteiner (fra 0,7 ng til 100 ng). Ikke-merkede tikguttproteiner og bovint serumalbumin (BSA) ble brukt som negativ kontroll av ELISA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvegkreftinfeksjoner utgjør et stort problem for storfeindustrien i tropiske og subtropiske regioner i verden, med den vanligste kontrollmetoden som er avhengig av bruk av akaricider 1 , 4 . Bm86 ble tidligere identifisert innenfor epitelflaten til tarmgutten som et beskyttende antigen mot R. microplus infestation 10 , med begrenset suksess som en vaksine strategi på grunn av Bm86 geografisk sekvensvariasjon og kravet om regelmessig boosting 4 .

Tidligere publikasjoner med fokus på epitel isolasjonsmetoder var hovedsakelig fokusert på vertebrater eller insekter artene 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . For eksempel forsøker tidlig fraksjonering å isolere midgutUtnytte pattedyrsteknikker, fant at den samme metoden ikke kunne brukes på insekter på grunn av den forskjellige cellestruktur og organisasjoner 12 . Videre baserer pattedyrsteknikker på bruk av enten dipase eller kollagenase, for enzymatisk å fordøye cellecelleforbindelsesproteinene 9 , 13 . Dipase og kollagenase påvirker signifikant celleoverflatede proteiner, og derfor er teknikker som er avhengige av deres bruk ikke egnet for celleoverflateproteinstudier 15 . Insekt midgutcelleisolasjoner fokuserer for tiden på to teknikker. Den første bruker mekanisk forstyrrelse av midgut gjennom ultralyd etterfulgt av separasjon over en kontinuerlig lineær sukrose gradient 8 , 11 , 12 , 14 . Denne mekaniske teknikken produserer en prøve som er nesten ikke klar over forurensningerVer produserer et lavt utbytte av mikrovillarmembraner 14 . Den andre teknikken er avhengig av Tris forstyrrelser av membraner for å frigjøre mikrovillar membraner 8 .

Teknikken som er skissert i dette papiret muliggjør isolering av epitelceller, biotinylering av overflateproteiner og deres isolasjon 16 , som tillater videre studier gjennom nedstrømsapplikasjoner som massespektrometri eller FACS. Fremgangsmåten beskrevet her anvender chelateringsmiddelet EDTA og reduksjonsmiddelet TCEP. EDTA-funksjoner for å sekvestrere kalsiumioner, hemme kadheriner, bryte cadherin-medierte celle-celleforbindelser mens TCEP reduserer disulfidbindingene som gir viskositet av den glykanrike slemlignende peritrofiske matriksen som separerer tarmluften fra epitelet. Epitelet gjenvinnes etter mekanisk forstyrrelse av vevet ved risting, etterfulgt av diskontinuerlig gradient-sentrifugering i densittenY sentrifugeringsgradient. Epitelceller er isolert mellom DMEM: 20% densitets-sentrifugeringsgradienten og 20%: sentrifugeringsgradientlag med 40% tetthet.

Utnyttelse av en høyere temperatur under epitelcellerdissociasjon vil føre til at store vev dissocieres fra tarmen, noe som fører til manglende isolasjon av epitelceller. Sikre at epitelcelledissociering utføres umiddelbart etter kryssdisseksjon; Bruk av iskalde buffere og unngåelse av høye sentrifugeringshastigheter er avgjørende for å beholde levende levedyktige celler. Til tross for dette kan løsningen av større celler fra basallamina gi litt forurensning. Videre endrer tarmens midguttepitel dramatisk avhengig av tiden fra det siste blodmelet 18 , 19 , 20 .

Som sådan har denne protokollen blitt designet og åpnet på R. microplus Figur 1 ) av ensartet natur.

Til slutt konkluderte metodene som ble benyttet i denne studien vellykkede isolerte epitelceller fra hele tarmene av R. microplus . Proteiner fra overflaten av R. microplus epitelceller ble oppnådd for videre analyse og studier. Endelig har den utviklede protokollen vist det potensielle utbyttet av epitelceller fra tarmkanalen, og effektiviteten av biotinylerte overflateproteiner av cellen. Den utviklede protokollen kan benyttes i alle kryssarter av økonomisk betydning i et forsøk på å undersøke kryss: vertsinteraksjoner ved å studere membranprotein comTarmens stilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australia) for levering av Rhipicephalus microplus ticks brukt til denne studien, og Lucas Karbanowicz for hjelp med videoopptak.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. AgNote No. K58. (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13, (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. Pergamon Press. 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats