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Repetidos de muestras de sangre de vena de la cola de las ratas no anestesiados con un sistema de colección de sangre vacío

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Summary

Aquí, describimos un método de tomar muestras de sangre de la vena de cola simple en ratas no anestesiados mediante un sistema de tubo de aspiración. Este método reduce el riesgo de exposición directa a sangre y simplifica la toma de muestras múltiples de una sola venopunción.

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Zou, W., Yang, Y., Gu, Y., Zhu, P., Zhang, M., Cheng, Z., Liu, X., Yu, Y., Peng, X. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. J. Vis. Exp. (130), e55852, doi:10.3791/55852 (2017).

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Abstract

Sangre se puede recoger de ratas en un número de localizaciones de muestreo. Por ejemplo, la vena de la cola es una ubicación superior para tomar muestras de sangre. Sin embargo, la vena de la cola es delgada por lo que a veces es difícil de pinchar. Además, la vena de la cola tiene reducción del flujo sanguíneo y requiere un tiempo de muestreo largo para obtener suficiente sangre. El actual informe describe un método de muestreo de sangre simple, el método de recogida de la sangre del vacío, que generalmente se utiliza para obtener muestras de sangre de los pacientes, que aquí se utiliza para las ratas no anestesiados. La punta de la aguja de 22 G mariposa fue insertada en una de las venas laterales de la cola aproximadamente 2-3 cm de la punta de la cola en un ángulo de aproximadamente 20° y la sangre fue recogido en el tubo de la colección vacío insertando el extremo de la goma de la aguja de la mariposa en el va tubo de colección de sangre cuum. Los resultados experimentales muestran que la tasa de éxito fue 95% en el grupo experimental y el 90% en el grupo de principiantes. La tasa de éxito y tiempos de punción fueron similares entre los dos grupos. La duración del muestreo fue significativamente menor en el grupo experimental en comparación con el grupo de principiantes. En conclusión, este método de colección de sangre vacío para muestreo secuencial de la sangre de la vena de la cola de no - anestesiadas ratas es factible y fácil de aprender, que podría servir como una alternativa fiable al otro convencionalmente utiliza técnicas de muestreo de sangre para ratas.

Introduction

La muestra de sangre de las ratas es necesaria para una gran variedad de estudios experimentales. Técnicas para recolección de sangre de la rata, como punción del corazón, del plexo orbital retro, vena yugular, vena safena, vasos de cola, la arteria carótida, aorta abdominal y vena cava. Mayoría de las técnicas (excepto la vena safena y punción de vasos sanguíneos de la cola) requiere anestesia1,2. Rutinariamente se pinchan las venas de la cola de rata para tomar muestras de sangre y de la inyección vascular. Después de tratar la cola con agua caliente, los vasos sanguíneos son dilatados y adecuado para la manipulación, incluso cuando las ratas son anestesiados3.

A pesar del desarrollo de nuevas y mejores técnicas para obtener muestras de sangre en el laboratorio pequeños animales2, no siempre es fácil obtener suficiente sangre al muestreo de pequeños animales. La vena de la cola de las ratas es una excelente ubicación para el muestreo de sangre4. Sin embargo, la vena de la cola es delgada, así es a veces difícil de pinchar y tomaría un largo tiempo para conseguir suficiente sangre debido a la reducción del flujo sanguíneo. Colección de la sangre a través de un sistema de tubo de aspiración es un método típico en la práctica clínica diaria. Este sistema cerrado para recoger la sangre reduce el riesgo de exposición directa a sangre y ha hecho más fácil tomar muestras múltiples de una sola venopunción5. El actual informe describe un método de tomar muestras de sangre de la vena de cola simple en ratas no anestesiados mediante el sistema de tubo de aspiración. Este método es fácil de dominar y puede utilizarse para obtener un gran volumen de sangre repetidamente en las ratas.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Consejo de Universidad médica de Tongji en el Animal cuidado Comité de Huazhong University of Science y tecnología (Wuhan, China). El manuscrito fue preparado según llegan (investigación Animal: presentación de informes de experimentos In Vivo ) directrices6.

1. cría

  1. Utilizar ratas Sprague-Dawley (SD) (n = 20, 10 hombres, 8 semanas de edad, pesa 261 a 291 g, significan = 272.85 ±9.07 g) de la Universidad Experimental animales centro de Huazhong de la ciencia y la tecnología y mantener ratas según la guía para el cuidado y uso de Animales de laboratorio publicados por nosotros Instituto Nacional de salud (NIH publicación No.85-23, revisada en 1996)
  2. Casa bajo condiciones estándar con libre acceso a alimentos y agua potable. Manten a las ratas en jaulas de2 530 cm con madera-afeitado ropa de cama. Casa de dos ratas en cada jaula. Mantener jaulas todo abierto para el ambiente (no micro-aislamiento o jaulas ventiladas)
  3. Asegúrese de que el personal que participa en el protocolo experimental manejar regularmente las ratas.
  4. Mantener la temperatura entre 21 ° C y 23 ° C. Dar índices de una dieta normal de sal (0.3% NaCl) durante todo el estudio.

2. procedimiento de recogida de sangre

Nota: El sistema de colección de sangre vacío consiste en una aguja de doble punta [22 G (0,7 x 25 mm)], un soporte de plástico y una serie de tubos de vacío (2 mL) con tapones de goma (figura 1).

  1. Colocar la rata en un soporte plástico de retención y lavar la cola con agua tibia (20-30 ° C) para eliminar la suciedad visible o las heces. Mientras un asistente sostiene la cola en una posición extendida, limpie la cola con etanol al 70% y limpiar con una gasa para aclarar la vena.
  2. Inserte la punta de la aguja de 22 G mariposa en una de las venas laterales de la cola (alrededor de 5 mm) en una posición aproximadamente 2-3 cm de la punta de la cola en ángulo de aproximadamente 20 ° (figura 2). Recoja la sangre en el tubo de la colección vacío insertando el extremo de la goma de la aguja de la mariposa en el tubo de la colección de la sangre del vacío (figura 3).
    Nota: El volumen de sangre recogida máxima es 1,2 mL7.
  3. Después de la recolección de sangre, retire la aguja y suavemente aplique presión en el sitio de punción con una gasa por 15-30 s detener el flujo de sangre. Luego, suelte la rata del soporte de retención plástico y retomar su jaula de la rata.
  4. Utilizar tubos que contienen EDTA como anticoagulante para recolectar plasma de sangre. Invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar el anticoagulante en la sangre y coloque las muestras en hielo vertical.
  5. Centrifugar los tubos de colección de muestras de sangre en una centrífuga refrigerada a 2.000 x g por 10 min separar el suero o plasma.
  6. Extraer el plasma/suero, teniendo cuidado de no para molestar a las capas de la célula de sangre roja y blanca. Para recoger el suero de la sangre, se pueden utilizar tubos sin anticoagulante. Ambos tipos de muestra pueden utilizar inmediatamente o almacenadas a-80 ° C por hasta un año.
    Nota: Colección de sangre exitosa se definió como obtener 1,2 mL de sangre cada vez. Tiempo máximo de punción fue establecido en tres ensayos, si el volumen de sangre total fue inferior a 1,2 mL después de la tercera punción, se definió como una colección de sangre. La duración del muestreo se inicia desde la punción de la vena de la cola a la remoción de la aguja de la mariposa después de la recolección de sangre.
  7. Recoger la sangre dos veces en dos semanas7.
    1. Para comprobar y verificar la viabilidad de este método, tren de dos estudiantes de medicina (principiantes) por 2 h antes de realizar este protocolo de extracción de sangre. Utilizar veinte ratas y extraer la sangre de 10 ratas por compañeros experimentados 2 (grupo experimental) y de 10 ratas por los estudiantes de medicina 2 (grupo para principiantes).

3. estadístico análisis

  1. Expresar los datos como un valor medio ± desviación estándar y análisis con SPSS estadística 17. Un valor α de 0.05 fue elegido, por lo tanto p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Representative Results

Duración del muestreo, masa corporal y volumen de la colección de la sangre de los dos grupos
Se extrajo sangre de 10 ratas (5 varones) dos veces dentro de dos semanas en cada grupo. La masa corporal promedio en ambos grupos fue similar (272,00 g ±9.66 y g ±8.87 273.70). Duración de muestreo fue significativamente menor en el grupo experimental en comparación con el grupo de principiante (2,77 ±0.53 min vs 3.28 ±0.83 min, p < 0.05) (tabla 1).

Éxito la tarifa y de la puntura veces de dos grupos
La tasa de éxito fue 95% (19/20) en el grupo experimental y el 90% (18/20) en el grupo de principiante (p > 0.05). Tiempos de punción no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (1.50 min ±0.61 vs 1.85 ±0.75 min, p > 0.05) (tabla 2). Estos resultados indican que este método es fácil de aprender, y la técnica podría ser dominada después de un entrenamiento de 2 h.

Figure 1
Figura 1 : tubo de colección de sangre vacío 2 mL (izquierda), aguja de la mariposa de 22 G (centro), el soporte de retención plástico (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Punta de la aguja fue insertada en la vena lateral de la cola (alrededor de 5 mm) en la posición de la punta de la cola en ángulo de aproximadamente 20 ° aproximadamente 2-3 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Venopunción exitosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Grupo experimental Grupo principiante
Género Peso (g) Volumen de recogida de sangre (mL) duración del muestreo (min) Género Peso (g) Volumen de recogida de sangre (mL) duración del muestreo (min)
E1-1 hombre 291 1.2 3.12 B1-1 hombre 282 1.2 3.18
E1-2 hombre 291 1.2 2,73 B1-2 hombre 282 1.2 2.18
E2-1 hombre 276 1.2 2.3 B2-1 hombre 264 1.2 3.73
E2-2 hombre 276 1.2 2.37 B2-2 hombre 264 1.2 2.47
E3-1 hombre 267 1.2 2,73 B3-1 hombre 265 1.2 3.52
E3-2 hombre 267 1.0 3.88 B3-2 hombre 265 1.2 2.53
E4-1 hombre 263 1.2 2,41 B4-1 hombre 289 1.2 2.32
E4-2 hombre 263 1.2 2.52 B4-2 hombre 289 1.2 3.62
E5-1 hombre 265 1.2 3.61 B5-1 hombre 277 1.2 3.48
E5-2 hombre 265 1.2 2.42 B5-2 hombre 277 1.2 3.12
E6-1 mujer 285 1.2 3.33 B6-1 mujer 274 0,9 4.87
E6-2 mujer 285 1.2 3.03 B6-2 mujer 274 1.2 3.37
E7-1 mujer 271 1.2 2.82 B7-1 mujer 268 1.0 3.93
E7-2 mujer 271 1.2 2.42 B7-2 mujer 268 1.2 3.82
E8-1 mujer 268 1.2 1.93 B8-1 mujer 262 1.2 2.07
E8-2 mujer 268 1.2 3.05 B8-2 mujer 262 1.2 3.67
E9-1 mujer 273 1.2 2.52 B9-1 mujer 281 1.2 4.38
E9-2 mujer 273 1.2 3.17 B9-2 mujer 281 1.2 4.57
E10-1 mujer 261 1.2 1.82 B10-1 mujer 275 1.2 2.53
E10-2 mujer 261 1.2 3.25 B10-2 mujer 275 1.2 2.28
Promedio 2.77 3.28
En-1: número de serie de ratas en el grupo experimental de la primera colección de la sangre.
En-2: número de serie de ratas en el grupo experimental para la segunda colecta de sangre.
BN-1: número de serie de ratas en el grupo de principiantes para la primera colección de la sangre.
BN-2: número de serie de ratas en el grupo de principiantes para la segunda colecta de sangre.

Tabla 1: Resultados de sangre recogidos en el grupo experimental y el grupo de principiantes.

Tiempos de recogida de sangre Tiempos promedio de punción Una punción de tiempo Pinchar dos veces Tres veces de la puntura No se pudo Tasa de éxito
Grupo experimental 20 ±0.61 1.50 11 8 0 1 95%
Grupo principiante 20 ±0.75 1.85 7 9 2 2 90%
Una punción de tiempo: número de ratas con la colección de sangre exitosa después de la primera punción
Dos veces la punción: número de ratas con la colección de sangre exitosa después de la segunda punción
Tres veces la punción: número de ratas con la colección de sangre exitosa después de la tercera punción
Error: número de ratas con no recolección de la sangre después de la tercera punción

Tabla 2: Comparación de los tiempos de punción y las tasas de éxito del grupo experimental y el grupo de principiantes.

Discussion

El actual informe describe un método de colección de sangre fácil de aprender en ratas. Nuestros resultados mostraron que este método es viable para recoger repetidamente un volumen grande de sangre de las ratas. Además, este método podría ser dominado fácilmente con una curva de aprendizaje a corto plazo. Este procedimiento se puede realizar en las ratas no anestesiados y sólo produce mínimo estrés a los animales.

Sangre se puede recoger de ratas en varios lugares. La vena de la cola es una ubicación superior para toma de muestras de sangre4. Sin embargo, no siempre es fácil obtener suficiente volumen de sangre de la vena de la cola de flujo de sangre delgada y baja de las ratas. El sistema de colección de sangre vacío generalmente se utiliza para recoger muestras de sangre de pacientes en la práctica clínica diaria. Este sistema de colección de sangre vacío se ha utilizado en pacientes y animales de investigación por un tiempo8,9,10. Este sistema consiste en un tubo de colección de sangre vacío con aguja de pared y mariposa de tubo interior recubierto de silicona. Se basa en el principio de presión negativa del vacío y permite la elaboración continua de sangre sin el riesgo de la recogida de sangre, que también reduce la posibilidad de contaminación y hemólisis11. El volumen de muestra de sangre en el catéter es de unos 0,3 mL. Después de retirar la aguja de la vena de la cola, fluirá a la sangre en el catéter en el tubo colector de vacío por el vacío. Este método también es aplicable para la recogida de sangre de ratas que pesen menos de 100 g con el uso de una aguja de punción más pequeños.

Este método de colección de sangre tiene varias ventajas. Este procedimiento sólo provoca lesiones mínimas a las ratas y de muestras de sangre se pueden realizar sin el uso de anestésicos, así se puede evitar la influencia de la respuesta de estrés y anestésicos en la muestra de sangre. Nuestras observaciones demostraron que las ratas estaban en silenciosa en el soporte plástico de restricción durante el procedimiento y no había muertes durante estos experimentos. En segundo lugar, repetida de muestras de sangre cada uno o dos días es posible, que permite el muestreo frecuente de la sangre con un volumen adecuado para diversos fines de investigación. Por último, este método es fácil de aprender y domina fácilmente por los principiantes después de un período de aprendizaje corto (2 h), según lo indicado por las tasas de éxito similares y los tiempos de la punción entre los grupos experimentales y principiante en este informe. En un informe anterior, Lee et al demostraron un método similar de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata4. Nuestro método es más simple que el reportado por Lee et al. 4 en que directamente insertamos de la aguja de punción en la vena de la cola y el otro extremo del tubo está conectado directamente con el tubo de vacío para la recolección de la sangre, sin el uso de una jeringa extra y aspiración manual de la sangre y sin la necesidad de ' leche Ing' la vena para facilitar el flujo de sangre. Recolección de sangre con este sistema cerrado reduce el riesgo de contaminación de la sangre. Uso del soporte de retención plástico también reduce el estrés en la rata y facilita la fijación de la cola.

Los siguientes dos pasos son fundamentales para la aplicación exitosa de este método. 1) extender la cola y evitar el movimiento de la cola; 2) suavemente punción en la vena en un ángulo de 20 º para evitar la punción en la vena y mantener la aguja de punción en la vena.

En conclusión, el método de colección de sangre vacío adoptado en ratas es segura, factible y fácil de practicar. Este método permite frecuentes muestras de sangre con un volumen adecuado de sangre Obtenido de ratas no anestesiados.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Los autores no tienen ninguna agradecimientos para hacer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a double-pointed needle Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China 22G  (0.7×25mm)
vacuum tubes Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China 2 ml
rat restraining holder  Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China 250g rat hoder model
normal salt diet for rats Rats received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study
SPSS software for statistical analysis SPSS Inc,  Chicago; USA  Version 17.0. 

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References

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