Time-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skive kultur af embryonale mus hjernen ved hjælp af

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol indeholder instruktioner til direkte observation af radialt migrerende kortikale neuroner. I utero- elektroporering, organotypisk skivekultur og time-lapse konfokal billeddannelse kombineres for direkte og dynamisk undersøgelse af virkningerne af overekspression eller nedregulering af gener af interesse for migrerende neuroner og for at analysere deres differentiering under udvikling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I utero elektroporation er en hurtig og kraftfuld tilgang til at studere processen med radial migration i cerebral cortex for at udvikle musembryoer. Det har hjulpet med at beskrive de forskellige trin i radial migration og karakterisere de molekylære mekanismer, der styrer denne proces. Til direkte og dynamisk analyse af migrerende neuroner skal de spores over tid. Denne protokol beskriver en arbejdsgang, der kombinerer i utero- elektroporation med organotypisk skivekultur og time-lapse konfokal billeddannelse, som muliggør en direkte undersøgelse og dynamisk analyse af radialt migrerende corticale neuroner. Desuden er detaljeret karakterisering af migrerende neuroner, såsom migrationshastighed, hastighedsprofiler samt radiale orienteringsændringer mulig. Metoden kan let tilpasses til at udføre funktionelle analyser af gener af interesse i radialt migrerende cortical neuroner ved tab og gevinst for funktion samt redningseksperimenter. TidsforskydningBilleddannelse af migrerende neuroner er en state-of-the-art teknik, der en gang etableret er et kraftigt redskab til at studere udviklingen af ​​cerebral cortex i musemodeller af neuronal migrationsforstyrrelser.

Introduction

Neocortex er hovedstedet for kognitive, følelsesmæssige og sensorimotoriske funktioner. Den består af seks vandrette lag orienteret parallelt med hjernens overflade. Under udvikling fremkommer progenitorceller i lateralvæggen af ​​dorsal telencephalon til fremspringneuroner, som migrerer radialt mod pialoverfladen og erhverver en lagtype-specifik neuronal identitet. Efter at være blevet genereret i de ventrikulære / subventriculære zoner (VZ / SVZ) bliver disse neuroner transient multipolære og sænker deres migration. Efter et kort ophold i mellemzonen (IZ) skifter de til en bipolær morfologi, fastgøres til det radiale glialstillads og fortsætter radialt orienteret migration til den kortikale plade (CP). Efter at have nået deres endelige målprojektion, frigør neuroner fra de radiale glialprocesser og erhverver lagsspecifik identitet. Mutationer i gener, som påvirker forskellige trin i neuronal migration, kan forårsage alvorlig kortikal misdannelse, såsom lissencEphaly eller white matter heterotopia 1 , 2 .

I utero elektroporation er en hurtig og kraftfuld teknik til transfektion af neurale progenitorceller i den udviklende hjerne af gnaverembryoer 3 , 4 . Med denne teknik er det muligt at knockdown og / eller overudtrykke gener af interesse for at studere deres funktioner i udvikling af neuroner. Denne metode har specifikt bidraget til at beskrive de morfologiske detaljer og karakterisere de molekylære mekanismer i processen med radial migration 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radialt migrerende neuroner undergår dynamiske ændringer i celleform, migrationshastighed samt migreringsretning, som kræver direkte og kontinuerlig observation over tid. Organotypisk skivekultusRe og time-lapse konfokal billeddannelse af elektroporerede hjerner tillader direkte observation af migrerende neuroner over tid. Ved hjælp af denne kombinerede tilgang er det muligt at analysere særskilte egenskaber ved migrerende neuroner, der ikke kan undersøges i faste vævssektioner af elektroporerede hjerner.

Vi har for nylig anvendt konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i skivekulturer af elektroporerede hjerner for at studere rollen som transkriptionsfaktor B-celle CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal udvikling 10 . Bcl11a udtrykkes i unge migrerende kortikale neuroner, og vi brugte en betinget mutant Bcl11a allel ( Bcl11a flox ) 11 for at studere sine funktioner. Elektroporation af Cre recombinase sammen med grøn fluorescerende protein (GFP) i kortikale stamceller af Bcl11a flox / flox hjerner tillod os at skabe en mosaik mutant situation, hvor kun få celler muteres i enEllers vildtype baggrund. På denne måde var det muligt at studere celleautonomiske funktioner af Bcl11a på enkeltcellens niveau. Vi fandt, at Bcl11a-mutantneuroner viser reduceret hastighed, forskydninger i deres hastighedsprofiler samt tilfældige orienteringsændringer under deres migration 10 . I den skitserede protokol beskriver vi en arbejdsgang for vellykket elektroporering og skivekulturpræparation 12 af musehjerner, såvel som tidsforskydning af konfokal billeddannelse af kortikale skivekulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af dyrevelfærdsudvalget (Regierungspräsidium Tübingen) og udført i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslove og EU-direktiv 2010/63 / EU.

1. I Utero Elektroporation

  1. Mikroinjektionsnåle
    1. Træk borsilikatglaskapillærer (yderdiameter: 1,0 mm, indvendig diameter: 0,58 mm, længde: 100 mm) i mikroinjektionsnåle ved hjælp af en mikropipettraktor med en kassefilm (2,5 mm x 2,5 mm) og følgende program: VARME: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 og DELAY: 140. Bestem HEAT-værdien for hvert enkelt filament ved at udføre en RAMP-test (HEAT-værdi: RAMP + 25).
    2. Gevind nåle i en vinkel på 38 ° og mellemliggende til høj omdrejningshastighed med en mikrogrinder for at opnå en tipstørrelse på 20 til 30 μm til injektion på embryonal dag (E) 13,5 eller yngre og 30 til 40 μm til injektion ved ældre embryonaleniveauer. Til opbevaring fastgør nåle i en kasse eller petriskål med modellerings ler for at forhindre skader på spidserne.
  2. Plasmid DNA Solution
    1. Klargør plasmid-DNA-konstruktion indeholdende fluorescerende reporterprotein ( fx GFP) ved anvendelse af et endotoksinfri maksi-præparationssæt ifølge producentens instruktioner.
    2. Fortynd plasmid-DNA-opløsning til en slutkoncentration på 1 - 2 μg / μl i endotoksinfri Tris-EDTA-buffer indeholdende Fast Green i en slutkoncentration på 0,01%. Aliquot-opløsning og opbevar ved -20 ° C.
  3. Bakteriostatisk natriumchloridopløsning
    1. Forbered bakteriostatisk natriumchloridopløsning ved at tilføje benzylalkohol til en slutkoncentration på 0,9% til isotonisk 0,9% natriumchloridopløsning. Steril filteropløsning umiddelbart inden brug.
  4. Carprofen Injection Solution
    1. Forbered carprofen injektionsopløsning vedTilsætning af carprofen til en slutkoncentration på 0,5 mg / ml til steril isotonisk 0,9% natriumchloridopløsning. Opbevares ved 4 ° C i op til 28 dage.
  5. Anæstesi, DNA Injektion og Elektroporation
    1. Væg en E14.5 timed-pregnant mus og læg den i et gennemsigtigt bedøvelsesrum, der er forbundet med en fordamper og mættet med 5% isofluran. Når dyret er bevidstløs, overfør det til en bedøvelsesmaske fastgjort til en 37 ° C opvarmningsplade og hold den bedøvet med 1,8-2,2% isofluran.
      Bemærk: Vurder udviklingen af ​​kirurgisk anæstesi ved tab af halekniv og pedalreflekser (tåhinde).
    2. Til analgesi injicer 100 μl carprofen injektionsopløsning per 10 mg muskassevægt (5 mg / kg legemsvægt) subkutant. Drej musen med dens bagside ned og forsigtigt dække øjnene med olieolie for at forhindre dem i at tørre.
    3. Forsigtigt sprede lemmerne ud og rette demTil opvarmningspladen med kirurgisk tape. Steriliser abdomen med 70% ethanol efterfulgt af iodopløsning (7,5 mg / ml) ved anvendelse af cellulosepaber. Gentag denne procedure tre gange for at sikre en korrekt desinfektion.
    4. Dæk underlivet med sterilt gasbind, hvor et snit er blevet skåret for at spare et felt (diameter: 2 - 2,5 cm) til bukeskæringen. Fugt gasbindet med bakteriostatisk natriumchloridopløsning.
      Forsigtighed: Revurdere udviklingen af ​​kirurgisk anæstesi ved tab af pedalreflex.
    5. Ved hjælp af Micro Adson Forceps (serrated, længde: 12 cm) og fin saks (vinklet til side, længde: 9 cm) skæres huden ca. 1,5 cm langs bukets midterlinie. Skær den underliggende muskel langs linjen alba.
    6. Fjern et livmoderhorn med ringpinde (længde: 9 cm, ydre diameter: 3 mm, indvendig diameter: 2,2 mm) og læg det forsigtigt på den fugtede gasbind.
      Forsigtig: Hold livmoderhornet med ringpinde kun mellem embryoner anD forstyrrer ikke moderkagerne eller nogen forsyningsfartøjer. Hold livmoderen fugtig til enhver tid med bakteriostatisk natriumchloridopløsning.
    7. Anbring forsigtigt et embryo med ringpinde og lokaliser den laterale ventrikel, som præsenterer som en halvmåneformet skygge parallelt med sagittal sinus. Injektionsstedet ligger omtrent midt i en linje mellem det pigmenterede øje og sammenløbet af bihuler, hvor sagittal sinus grene til to tværgående bihuler. Skub mikroinjektionsnålen gennem livmoderen og ind i lateral ventrikel.
      Bemærk: Om nødvendigt kan dybden af ​​injektionen korrigeres ved nålens tilbagetrækning.
    8. Injicer 1 til 2 μl DNA-opløsning i lateral ventrikel med en mikroinjektor, der betjenes med en fodpedal ved hjælp af følgende indstillinger: 25 psi, 10 til 20 ms pr. Puls og 5 til 10 pulser. En vellykket injektion kan overvåges af den farvede DNA-opløsning, som skal fylde ventrikulærsystemet.
    9. Placer pincet-type elektroder (3 mm diameter for E13.5 eller yngre og 5 mm diameter for E14.5 eller ældre) på en sådan måde, at den "positive" terminal er på samme side som den injicerede ventrikel og den "negative" Terminal er på den modsatte side af den indsprøjtede ventrikel under øremærket af embryoets hoved.
    10. Fugt elektroporationsstedet med et par dråber bakteriostatisk natriumchloridopløsning, og anvend 5 elektriske strømpulser (35 V for E13.5 eller yngre og 40 V for E14.5 eller ældre) med 50 ms varighed med 950 ms intervaller.
      Bemærk: Strømninger på 60 til 90 mA er normalt tilstrækkelige til vellykket elektroporation. Nedre strømninger vil ikke effektivt transfektere neuroner, mens højere strømme kan føre til embryonal død.
    11. Gentag proceduren (se trin 1.5.7 til 1.5.10.) For hvert embryo i livmoderhornet og læg det forsigtigt tilbage i bukhulen.
    12. Fjern livmoderhornet fra den anden side og gentag proc procEdure beskrevet i trin 1.5.7. Til 1.5.11.
    13. Luk bukhulen ved at sutere muskellaget før suturing af huden ved hjælp af Micro Adson Forceps, Mathieu Needle Holder (wolframcarbid, længde: 14 cm) og ikke-absorberende kirurgisk sutur (3/8 cirkel, 13 mm, konisk punkt).
      Forsigtig: Pas på ikke at fange livmoderen eller andre organer under suturen.
    14. Sænk forsigtigt hudens sutur med iodopløsning (7,5 mg / ml), og fjern forsigtigt periokulært overskud af vaseline ved hjælp af cellulosestubber. Placer musen under en infrarød lampe, indtil den vågner op. Overhold nøje musen i løbet af de næste to dage. Gentag smertestillende behandling som beskrevet i trin 1.5.2 efter 12 til 24 timer.

2. Organotypisk skivekultur

  1. Laminin Stock Solution
    1. Opløs 1 mg lyofiliseret laminin i sterilt vand for at opnå en 1 mg / ml laminin stamopløsning. Forbered 50 μl alikvoter aNd butik ved -80 ° C.
  2. Poly-L-Lysin Stock Solution
    1. Opløs 50 mg poly-L-lysin i sterilt vand for at opnå en 1 mg / ml poly-L-lysin stamopløsning. Tilbered 0,5 ml alikvoter og opbevar ved -20 ° C.
  3. Komplet Hank Balanced Salt Solution (komplet HBSS)
    1. Forbered komplet HBSS ved at kombinere 50 ml 10x HBSS opløsning, 1,25 ml 1 M HEPES buffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glucose opløsning, 5 ml 100 mM calciumchloridopløsning, 5 ml 100 mM magnesiumsulfat Opløsning og 2 ml 1 M natriumhydrogencarbonatopløsning. Tilsæt sterilt vand op til 0,5 liter sterilt filter og opbevar ved 4 ° C.
  4. Slice Culture Medium
    1. Kombiner 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml komplet HBSS (jf. Afsnit 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-glucose, 0,25 ml 200 mM L-glutamin og 0,5 ml penicillin-streptomycin til Opnå 50 ml skivekulturmedium. Sterilt filter og tilsæt hesteserum til en slutkoncentration på 5%. Opbevares ved 4 ° C i op til 4 uger.
  5. Low Melting Point (LMP) Agarose Solution
    1. Forbered 3% LMP-agaroseopløsning ved at opløse 1,5 g LMP-agarose i 50 ml komplet HBSS ved opvarmning i en mikrobølgeovn i 1 til 2 minutter ved mellemproduktion.
      Bemærk: Overvåg varmen forsigtigt for at forhindre overløb under kogning.
    2. Anbring opløsningen i et vandbad ved 38 ° C indtil det er klar til brug. Opbevares ved 4 ° C og genbruges en gang.
  6. Coating af membranindsatser
    1. Tilsæt en alikvot af laminin stamopløsning (jf. Trin 2.1.1.) Og en alikvot af poly-L-lysin stamopløsning (jf. Trin 2.2.1) til 6 ml sterilt vand for at opnå belægningsløsning (nok til 6 indsatser) .
    2. Placer membranindsats i en 6-brønds plade indeholdende 2 ml sterilt vand i bunden af ​​hver brønd. Tilsæt 1 ml coatingopløsning(Se Trin 2.6.1.) Oven på hver membran og inkuber natten over ved 37 ° C og 5% carbondioxidatmosfære.
      Bemærk: Brug kun indsatser med optisk klare membraner, såsom polytetrafluorethylen (PTFE) membran.
    3. Vask membranerne tre gange med 1 ml sterilt vand og tør. Brug coatede membraner på samme dag eller opbevares i en ren 6-brønds plade ved 4 ° C i op til fire uger.
  7. Hjernedissektion og indlejring
    1. To dage efter elektroporation placeres musen i et gennemsigtigt kammer forbundet til en fordamper og mættet med 5% isofluran. Når dyret er bevidstløs, fjern det fra kammeret og ofre det ved cervikal dislokation.
    2. Fjern livmoderen, der indeholder embryoerne, og læg det i en 10 cm petriskål med iskold komplet HBSS.
      Bemærk: Fra dette tidspunkt behold alle løsninger, embryoner og hjerner på is.
    3. Brug et stereomikroskop, fint tippede tang (lige,11 cm) og et par Vannas Tübingen Spring Saks (vinklet op, længde: 9,5 cm) for at adskille hvert embryo fra livmoderen og overføre det til en anden petriskål, der indeholder iskold komplet HBSS.
    4. Lav et snit på niveauet af hjernestammen og skær langs den sagittale midterlinie. Skræl hud og brusk, der dækker hjernen. Skær derefter hjernestammen lige bag halvkuglerne og fjern hjernen fra kraniet. Overfør hjernen med en mikroske spatel (185 mm x 5 mm) til en 12-brønds plade indeholdende iskold komplet HBSS. Saml alle hjerner fra kuldet i 12-brøndspladen.
    5. Brug et fluorescerende stereomikroskop til at skærmhjerne i 12-brøndspladen for fluorescenslysstyrke såvel som størrelsen af ​​det elektroporerede område. Vælg 2 til 4 hjerner med lyse fluorescerende signaler i den presumptive somatosensory cortex for yderligere behandling.
    6. Hæld 3% LMP-agaroseopløsning, der holdes ved 38 ° C i afskallet engangsindlejringsform. aftE-hjernen fra 12-brøndspladen med en mikroske spatel og forsigtigt dræne overskydende komplet HBSS omkring hjernen ved brug af fint vævspapir.
    7. Placér hjernen forsigtigt i agaroseløsningen, skub den til bunden af ​​formen, og juster omhyggeligt dens position ved hjælp af en 20 gauge nål. For koronale sektioner, orienter hjernen med de olfaktoriske pærer pegende opad. Hold formen på is, indtil agaroseopløsningen er størknet og fortsæt med snitning af hjernen.
  8. Vibratome Sektion og Slice Culture
    1. Fjern agaroseblokken fra formen og læg den på låget på en steril petriskål. Trim væk overskydende agarose med et rent knivblad, der efterlader ca. 2 til 3 mm under olfaktoriske løg og 1 mm agarose på de andre sider. Fastgør den trimmede agaroseblok med de olfaktive pærer, der peger nedad til en prøvefase ved brug af cyanoacrylatlim.
      Bemærk: Steriliser instrumenter og udstyr med 70% ethanoL inden snitning.
    2. Overfør prøvefasen til skærekammeret i et vibrerende bladmikrotom indeholdende iskoldt komplet HBSS og position hjernen med sin dorsale side mod bladet. Skær 250 μm tykke hjerne skiver, der indeholder det elektroporerede område med en lav til moderat amplitude på 0,9 mm og en meget langsom snithastighed på 0,09-0,12 mm / s. Normalt opnås 4 til 6 skiver med lyse fluorescerende signal fra hver vellykket elektroporeret hjerne.
    3. Med en bøjet mikseskedspatel og fint tippet tænger overføres forsigtigt hjerneskiverne med den omgivende agarose til en 6-brønds plade indeholdende iskold komplet HBSS.
      Forsigtig: Pas på, at du ikke beskadiger hjernevævet ved kun at berøre agarosefeltet rundt om sektionerne med tangene under overførslen.
    4. Behandle alle valgte hjerner som beskrevet i trin 2.8.1. Til 2.8.3.
    5. Fugt membranindsatserne med 100 μl komplet HBSS, før du placerer hjernen slSkiver på membranerne for at lette placeringen af ​​skiverne. Op til 5 skiver kan placeres på 1 membranindsats.
    6. Overfør forsigtigt skiverne til membranerne ved hjælp af en bøjet mikseskelte spatel og fint tippet tang. Træk forsigtigt et stykke på spatelen ved kun at berøre agarosefeltet med tang og skub forsigtigt skiven fra spatelen på membranen. Placer skiven med tang og fortsæt med at overføre de resterende skiver. Fjern overskydende komplet HBSS med en pipette.
      Bemærk: Overlap ikke skiverne med hinanden.
    7. Placer membranindsatsen forsigtigt med skiverne i en 6-brønds plade indeholdende 1,8 ml skivekulturmedium (jf. Trin 2.4.1.) Og inkuber ved 37 ° C og 5% carbondioxidatmosfære indtil tidsforskydning billeddannelse.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Mikroskopopsætning
    1. Indstil et klimakammer anbragt på scenen af ​​enInverteret konfokalmikroskop til 37 ° C og 5% carbondioxidatmosfære. Brug en hybrid detektor til at reducere laserintensiteten og forbedre celle levedygtighed. For detaljeret analyse, brug en ekstra lang arbejdsstørrelse 40X tørt mål med en numerisk blænde på 0,6 eller højere.
      Bemærk: Alle mikroskopets komponenter skal forvarmes til 37 ° C i 2 - 3 timer før billeddannelse for at give et stabilt fokus under billedbehandling.
  2. Slice Imaging
    1. Vælg en hjerne skive til billeddannelse fra 6-brøndspladen indeholdende membranindsatsen ved anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop.
      Forsigtig: Undgå langvarig eksponeringstid for ultraviolet lys, da dette kan forårsage cellulær fotodamage.
      Bemærk: Vælg et skive med lyse enkeltneuroner i den øvre SVZ, der migrerer radialt mod skivefladen. Fine fluorescerende processer af radiale glialceller, der spænder over hele CP, indikerer et intakt radial glial-stillads, som er brugD ved radial migrering af kortikale neuroner.
    2. Overfør membranindsatsen med skiven, som blev valgt til time-lapse billeddannelse, i en 50 mm diameter glasbundsskål indeholdende 2 ml skivekulturmedium ved hjælp af pincet. Placer opskålen i klimakammeret i det konfokale mikroskop.
    3. Indstil opløsningen til 512 med 512 pixel og øg scanhastigheden fra 400 Hz til 700 Hz for at øge billedhastigheden fra henholdsvis ca. 1,4 til ca. 2,5 billeder pr. Sekund. Brug ikke mere end to gange gennemsnittet. Definer en z-stack gennem det elektroporerede område (sædvanligvis 400-100 μm) med en trinstørrelse på 1,5 μm. Samlet set giver disse indstillinger mulighed for en tilstrækkelig opløsning og lysstyrke af billedet, mens fotodamagen er lav under overtagelsen. Start time-lapse serien ved at tage en z-stack hver 30 min.
      Bemærk: Langvarig eksponering af skiven til laserlys vil fremkalde fotodamage, der reducerer cellernes levedygtighed. Juster ekspOsuretid til laserlys i overensstemmelse hermed.
    4. Analyser time-lapse-serien ved hjælp af ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/iij/) eller tilsvarende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere vist, at genetisk deletion af Bcl11a ved in utero elektroporation forringer radial migration af sene-fødte øvre lag projektion neuroner 10. Elektroporation af en DNA-plasmidvektor indeholdende Cre-IRES-GFP effektivt fjernet Bcl11a i betingede Bcl11a flox / flox- hjerner 11 . Da vi analyserede E14.5 elektroporerede hjerner tre dage efter elektroporationen, havde de fleste kontrolneuroner migreret ind i CP, mens mange Bcl11a mutante neuroner blev standset langs migreringsruten i IZ og VZ / SVZ. Derudover fandt vi en stigning i antallet af multipolære celler på bekostning af bipolære celler specifikt i IZ efter Bcl11a- deletion, der tyder på defekter ved polarisation 10 .

At analysere migra direkte og dynamiskTory-opførsel af Bcl11a-mutantneuroner anvendte vi tid-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skivekultur fremstillet ud fra elektroporerede hjerner. Oversigt time-lapse-serien ved hjælp af et 10X objektiv med en numerisk blænde på 0,4 bekræftede vores resultater, at Bcl11a mutantprojektionsneuroner har defekter i radial migration. Inden for 36 timer havde mange kontrolneuroner migreret ind i CP, mens kun få Bcl11a-mutantneuroner havde forladt IZ og migreret ind i CP. Interessant syntes det, at mange Bcl11a mutante neuroner ikke vandrede direkte mod hjernefladen, men nedsatte migrationen og vendte tangentielt eller endda tilbage mod ventriklen (Movie 1). For yderligere at analysere disse fund har vi genereret time-lapse-serier ved en højere forstørrelse ved hjælp af et 40x objektiv med en numerisk blænde på 0,6. Vores data viser, at Bcl11a-mutantneuroner ikke effektivt polariserer og fortsætter radialt orienteret migratIon i CP. Inden for 12 timer mislykkedes mange Bcl11a- mutante neuroner at skifte fra en multipolar til en bipolær morfologi og projicerede og trak i stedet mange processer ind i det omgivende miljø (Film 2, Figur 1A ).

Derudover spores vi individuelle neurons migrationsstier i forskellige time-lapse-serier og brugte dem til at beregne specifikke parametre for migrerende neuroner. Vi fandt ud af, at Bcl11a-mutantneuroner gentagne gange gennemgår faser af flere timers varighed med reduceret migrationshastighed og tilfældige orienteringsændringer (Film 3, Figur 1B , Røde pilespidser). Specielt blev hastighedsprofilen af Bcl11a-mutantneuroner forskudt fra højere hastighed (25 μm / h) mod lavere hastighed (5 μm / h) i sammenligning med kontrolneuroner ( figur 1C ). I overensstemmelse hermed er den samlede migrationshastighed for Bcl11En mutant neuron blev signifikant reduceret fra 10,34 ± 0,34 μm / h i kontroller til 6 ± 0,54 μm / h (p = 2,4889E-05) ( figur 1D ). Endelig blev afvigelsen fra rettet migration mod hjernefladen over hjernen signifikant øget fra 17,15 ± 2,13 ° i kontrol til 40,16 ± 4,42 ° i Bcl11a-mutantneuroner (p = 0,0002) ( Figur 1E ). Sammen viser disse resultater, at tidsforskydning af konfokal billeddannelse af GFP-elektroporerede neuroner i organotypisk skivekultur er en værdifuld metode til at studere molekylære mekanismer, der styrer processen med neuronal migration.

Film 1
Film 1: Migration af GFP-mærket kontrol i sammenligning med Bcl11a Mutant Neurons i Cortical Skiver. Bcl11a flox / flox hjerner blev elektroporeret påE14.5 med en plasmidvektor indeholdende IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) og skivekulturer blev fremstillet ved E16.5. VZ / SVZ; Ventrikulære / subventriculære zoner; IZ, mellemzone; CP, kortisk plade. Målestang = 100 μm. Filmen består af 108 rammer med en hastighed på 5 billeder / s. Udskrivet fra Wiegreffe et al. 10 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Film 2
Film 2: Polarisering af en GFP-mærket kontrol i sammenligning med Bcl11a Mutant Neurons i Cortical Skiver. Bcl11a flox / flox hjerner blev elektroporeret ved E14.5 med en plasmidvektor indeholdende IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) og skivekulturer Blev fremstillet ved E16.5. Skalestang = 10 μm. Filmen består af 25 rammer med en hastighed på 5 billeder / s. Udskrivet fra Wiegreffe et al. 10 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Film 3
Film 3: Animerede spor med 1 h Intervalopløsning af repræsentativ kontrol og Bcl11a Mutant Neurons. Spor af migrerende neuroner blev opnået fra time-lapse-serien af ​​E16.5 skivekulturer af Bcl11a flox / flox- hjerner, der blev elektroporeret ved E14.5 med en plasmidvektor indeholdende IRES-GFP ( A ) eller Cre-IRES-GFP ( B ) . Skalbjælke = 20 μm. Udskrivet fra Wiegreffe et al.> 10 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

figur 1
Figur 1: Migrationsadfærd af Bcl11a Mutant Upper-Layer Cortical Neurons.
( A ) Repræsentative billeder af migrerende GFP-positive neuroner i E16.5 skivekulturer fra Bcl11a flox / flox- hjerner elektroporeret ved E14.5 med enten Cre-IRES-GFP eller en kontrolvektor over en total billedperiode på 12 timer. ( B ) Repræsentative spor med 1 timers intervallopløsning af migrerende GFP-positive neuroner i E16.5-skivekulturer fra Bcl11a- flox / flox- hjerner elektroporeret ved E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrolvektor over de samlede billeddannelsesperioder afOp til 22 timer. Bcl11a mutantneuroner gennemgår ofte gentagne faser med reduceret migrationshastighed og tilfældigt ændret orientering (markeret med røde pilespidser). ( C ) Hastighedsprofiler beregnet ud fra spor af migrerende neuroner som vist i B. ( DE ) Kvantificering af hastighed ( D ) og afvigelsesvinkel fra radial orientering ( E ) af migrerende GFP-positive neuroner i E16.5 skivekulturer fra Bcl11a flox / flox Hjerner elektroporeret ved E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrolvektor (n = 15). Mean ± sem; Studentens t-test; *** p <0,001. Skalestang = 10 μm. Udskrivet fra Wiegreffe et al. 10 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Radial migration er en nøgleproces i neocortex udvikling. Mutationer i gener, der påvirker forskellige trin i denne proces, kan forårsage alvorlige kortikale misdannelser, herunder lissencephaly og white matter heterotopia 1 , 2 . Vi viste for nylig, at Bcl11a, som udtrykkes i unge migrerende kortikale projektionsneuroner, spiller en rolle i radial migration. Vi anvendte tidsforskydning af konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i akutte kortikale skiver af elektroporerede hjerner for direkte at demonstrere, at genetisk deletion af Bcl11a i migrerende neuroner forårsager polarisations- og migrationsdefekter. Time-lapse-serier blev brugt til at spore migrationsveje for individuelle neuroner og beregne specifikke parametre for migrerende neuroner, herunder hastighedsprofiler, gennemsnitlig migrationshastighed og migrationsretning 10 .

Denne protokol beskriver en vigtig tilgang, når man studerer molekylerR mekanismer i radial migration. Ved at anvende kort hårnål RNA eller DNA ekspressionsplasmider kan næsten ethvert gen af ​​interesse slås ned eller overudtrykkes. Det er en kraftfuld tilgang til at kombinere elektroporation med Cre-LoxP systemet. Transfektion af hjerner af betingede mutantmus ("floxed") mus med Cre recombinase genererer en mosaikmutantsituation og muliggør selektiv analyse af enkeltmutante neuroner, der er omgivet af vildtype-celler. På denne måde kan celleautonome molekylære mekanismer i migrerende neuroner undersøges. Også funktionelle redningseksperimenter udføres let. Forberedelse af time-lapse-serien af ​​elektroporerede hjerne skiver muliggør dynamisk analyse af migrerende adfærd hos enkeltmigrerende neuroner, hvilket giver meget mere information, end der kan opnås fra faste hjerneafsnit. I utero elektroporation 3 , 4 kræver initial træning, men - en gang mestrer - er aHurtig og ligetil teknik til reproducerbar transfektion af cerebrale cortex-neuroner in vivo . I den her beskrevne protokol anvendte vi i utero elektroporation ved E14.5, når sen-fødte øvre lag neokortiske projektionsneuroner er født. Til undersøgelsen af ​​tidligfødt dyblagsprojektion skal neuroner i utero- elektroporation udføres på tidligere udviklingsstadium ( dvs. E12.5) 13 . Princippet kan i princippet også anvendes til at studere migration af andre neuronale subpopulationer i hjernen, der kan transficeres med elektroporation, herunder migrering af interneuroner 14 og cerebellære granulaceller 15 .

Den skivekulturprotokol, som vi beskriver, blev tilpasset fra Polleux og Gosh 12 og tidligere har vi brugt den til ex- electroporation 16 , 17 til stuDy hippocampal udvikling. Vigtigst er, at hjerneskiverne skal håndteres med omhu gennem hele proceduren for at opretholde deres levedygtighed. Vi bruger et inverteret mikroskop og optiske kvalitetsglasbundsborde til at skille skivekulturen på en cellekulturindsats. Denne konfiguration er meget nem at indstille og tillader sterile forhold, da objektivet aldrig kommer i kontakt med skivekulturen eller -mediet. Imidlertid kræves lange arbejdsafstandsmål (> 2 mm) med en tilstrækkelig høj numerisk blænde (0,6 eller højere). Andre undersøgelser har lagt hjerneskiven direkte på glasbunden og brugt en kollagenmatrix 18 , 19 til at fastsætte skiven på plads, hvilket gør brugen af ​​mål med en kortere fri arbejdsafstand mulig. Anvendelse af cellekulturindsatser giver imidlertid nem håndtering, reproducerbare resultater og giver forskeren mulighed for at billedet skiverne selv 1 til 2 dage efter deres forberedelse uden coMpromising levedygtigheden af ​​hjerneskiven (data ikke vist). Et andet kritisk problem vedrører beskadigelse af skiverne med laserlys. Vi har brugt en meget følsom hybriddetektor, som gjorde det muligt for os at reducere laserstyrken til et minimum, samtidig med at der opnås tilstrækkelige fluorescerende signaler til time-lapse-billeddannelse. Ved hjælp af multiphoton billeddannelse vil yderligere reducere fotodamage og muliggøre en dybere vævspennetrækning såvel som mere effektiv lysdetektering sammenlignet med konventionel konfokalmikroskopi.

På trods af dets anvendelighed til at studere neuronal migration har protokollen begrænsninger og kan ikke helt bevare situationen for migrerende neuroner i den intakte hjerne. Ekstracellulær matrix, de adhæsive intercellulære kontakter og vaskulaturen i migrationsområdet kan dynamisk påvirke radialt migrerende neuroner 20 , 21 . Specifikt afhænger øvre lagsneuroner af langstrakte radiale glialprocesser forDeres migration 22 . For vellykket billeddannelse er det derfor vigtigt at vælge hjerneskiver med GFP elektroporerede radiale glialceller, der udvider deres processer gennem hele kortikalbredden. "Skrå skiver", hvor den radiale glial stillads er blevet afskåret, før den når hjerneflokens overflade, bør kasseres fra yderligere analyse. Sommetider kan celledød forekomme ved hjernens overflade, som begrænser billedforetagelsen til dybere område i prøven. Elektroporerede neuroner i dyrkede hjerneskiver kan migrere mindre effektivt sammenlignet med elektroporerede neuroner in vivo , hvilket kan skyldes utilstrækkelig opsving fra præparation. Dette kræver analyser af flere skivekulturer til både eksperimentelle og kontrol situationer og kritisk fortolkning af repræsentative datasæt. I nogle tilfælde kan de fornærmelser, der er forbundet med udero elektroporation, forårsage embryonal død eller strukturelle ændringerIoner i hjernen, herunder forstørrede ventrikler, asymmetrisk tyndt cortex eller en glialær dannelse som følge af DNA-injektion. I disse tilfælde skal prøven kasseres fra yderligere analyse.

Mens hjerneskiver fra embryonale donorer overlever godt på membranindsatser 23 , er analyser begrænset til tidlige udviklingshændelser, herunder neuronal migration, og vi har ikke brugt det til at studere senere hændelser, såsom dendritudvikling eller synaptogenese. Sammenfattende giver vi en detaljeret protokol til direkte og dynamisk undersøgelse af neuronal migration af elektroporerede neuroner i skivekulturer, som let kan tilpasses til at analysere funktioner af gener involveret i neurodevelopmental lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Vi takker Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka og Matthias Toberer for fremragende teknisk assistance samt Victor Tarabykin til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29, (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23, (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49, (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87, (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139, (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14, (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29, (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21, (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics