Ex vivo oculomotor skive kultur fra embryonale GFP-udtrykker mus for tidsforskudt billeddannelse af oculomotor nerve outgrowth

Denne protokol giver os mulighed for at identificere axon vejledning veje aktive i oculomotor nerve og til at vurdere deres roller på forskellige punkter langs nerve bane i realtid. Denne teknik bevarer de lokale miljøer, hvorigennem axoner rejser og deres endelige mål. De voksende axoner skæres ikke, så indledende axon udvækst, snarere end regenerering, kan vurderes.

Denne metode giver indsigt i axon vejledning i det okulære motorsystem, men kunne tilpasses til studiet af axon vejledning af andre nerver. Denne teknik tager praksis at mestre, og arbejder hurtigt er yderst vigtigt. Når du prøver det for første gang, bruge blot et par embryoner, snarere end et helt kuld.

Før du begynder proceduren, først bekræfte graviditeten ved ultralyd på embryonale dag 10,5 fra en tidsdisk parring. Høst embryoner, spray maven af den gravide mus med 70% ethanol, og bruge en saks til at åbne bughulen til at udtrække livmoderen. Vask livmoderen i en petriskål af iskold HBSS, før du placerer orgelet i en anden petriskål med frisk iskold HBSS.

Under dissekering omfang, fjerne embryoner fra livmoderen horn og deres individuelle fostervandssække, placere hvert foster på undersiden af låget af en 12-brønd plade, på is, som de er høstet. Brug filterpapir til at fjerne væsker omkring hvert foster, uden at røre embryonerne selv, og nedsænkning embryonerne i flydende 4% lavsmeltende agarose. Læg pladelåget på is for at størkne agarose.

Når agarose er hærdet, flip over embryoner og dække den anden side af hver prøve med yderligere agarose. Når det andet bind af agarose er størknet, skal du bruge et fluorescensdekermikroskop til at trimme agarose omkring hvert foster, så hvert foster vil blive orienteret korrekt på vibratomestadiet. Den oculomotor kerner og tidlige axon udvækster bør fluorescerende.

Juster hvert foster, så kernen, outgrowing axoner, og øjet danner en linje, og bruge et barberblad til at trimme agarose parallelt med denne linje. Dernæst fylde vibratome kammer med iskold skive buffer, og superlim det første foster til vibratome fase, således at bladet vil være parallel med oculomotor kernen og øjne. Når superlimen er tør, nedsænkes vibratomstadiet, så fosteret vender mod væk fra klingen, og brug en ny vibratomkling for at opnå 400-til 450-mikrometerskiver.

Brug en steril overførselpipette til at overføre hver skive til kold udskæringsbuffer, som den er anskaffet, og brug fluorescensdekermikroskopet til at vælge den skive, der indeholder oculomotorkerner og øjne. Ved hjælp af en steril overførselpipette, overføre skiven på en cellekultur indsætte i en seks-brønd plade, der indeholder 1,5 milliliter kultur medium per brønd, og placere pladen i en 37-graders Celsius inkubator. Fjern den resterende agarose fra vibratome fase, og superlim det næste foster på scenen, fortsætter med at indsamle skiver, indtil alle embryoner er blevet opdelt og belagt.

Derefter tilsættes den passende koncentration af inhibitor eller rekombinant molekyle af interesse, fortyndet i et passende opløsningsmiddel, til medium for hver brønd. Opret en dosis-respons kurve. Billede skiverne hver 30 minutter efter fase kontrast og fluorescens mikroskopi i op til 72 timer.

Under normal i livmoderudvikling, den første grønne fluorescerende protein-positive oculomotor axoner nå kredsløbet ved embryonale dag 11,5 før forgrening til deres endelige mål, som observeret i denne repræsentative skive kultur. Skivens retning på vibratomestadiet er afgørende, da skiverne ikke kan fortolkes, hvis de ikke er orienteret korrekt. For eksempel, hvis fosteret vippes til sin side, vil kun én oculomotor kerne blive observeret i skiven.

Hvis det indlejrede foster vippes for langt mod ryggen, vil øjnene ikke være til stede i skiven, og i stedet kan overlestremnet og baghjernen eller rygmarven medtages. Det er også vigtigt at passe på, at under placeringen af skiven på kulturmembranen, at vævet ikke bliver foldet. Vær forsigtig, når du opløser hæmmere og vækstfaktorer i organiske opløsningsmidler.

For eksempel, i dette eksperiment, skiven døde efter tilsætning af ethanol til mediet. Husk at holde alt på is og minimere tiden mellem udvinding af embryoner og placere skiver i rugemaskinen. Ved hjælp af denne teknik er vi begyndt at identificere yderligere axonstyringsmekanismer på arbejdspladsen i det okulære motorsystem.

Husk at udvise forsigtighed, når du arbejder med barberblade, og at nogle inhibitorer kan være farlige og skal håndteres omhyggeligt i henhold til deres sikkerhedsprofiler.