Avanceret Konfokal mikroskopi-teknikker til at undersøge Protein-protein interaktioner og kinetik ved DNA læsioner

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Laser microirradiation er et nyttigt værktøj for studier af DNA reparation i levende celler. En metodisk tilgang til brug af UVA lasere til at fremkalde forskellige DNA læsioner er vist. Vi har optimeret en metode for lokale microirradiation, der opretholder den normale cellecyklus; således fortsætte bestrålede celler gennem mitosen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lokale microirradiation med lasere repræsenterer et nyttigt redskab for studier af DNA-repair-relaterede processer i levende celler. Her, beskriver vi en metodisk tilgang til at analysere protein kinetics på DNA læsioner over tid eller protein-protein interaktioner på lokalt microirradiated kromatin. Vi viser også hvordan man genkender enkelte faser i cellecyklus bruger Fucci cellular system til at studere celle-cyklus-afhængige protein kinetics på DNA læsioner. En metodologisk beskrivelse af brugen af to UV lasere (355 nm og 405 nm) til at fremkalde forskellige typer af DNA-skader er også præsenteret. Kun celler microirradiated ved 405-nm diodelaser fortsatte gennem mitosen normalt og var blottet for cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Vi viser også, hvordan microirradiated celler kan fastsættes på et givet tidspunkt at udføre immunodetection af de endogene proteiner af interesse. DNA reparation undersøgelser, vi derudover beskrive brugen af biofysiske metoder herunder FRAP (Fluorescens opsving efter Photobleaching) og FLIM (Fluorescens levetid Imaging mikroskopi) i celler med spontant forekommende DNA skader foci. Vi viser også en ansøgning af FLIM-FRET (Fluorescens resonans energi Transfer) i eksperimentelle undersøgelser af protein-protein interaktioner.

Introduction

DNA-skader fører til fremkomsten af DNA læsioner består af cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine og single-strand eller dobbelt-strenget pauser1,2. Γ-stråler er formen for ioniserende stråling med den højeste energi og høj penetrans, således denne kilde af stråling er meget udbredt i strålebehandling3. På den anden side inducerede eksperimentelt DNA skader forårsaget af UV-lasere efterligner naturlig eksponering for UV-lys. UVA microirradiation, repræsenterer som en mikroskopisk metode, en eksperimentel værktøj til at studere DNA skader i enkelte levende celler. Microirradiation blev anvendt for første gang 40 år siden for at afsløre organisation af kromosom regioner4,5. Denne teknik er meget afhængige af enten de funktionelle egenskaber af Konfokal mikroskoper eller de tekniske begrænsninger af moderne nanoscopy. For at fremkalde DNA læsioner, kan celler være presensitized af 5' bromodeoxyuridine (BrdU) eller Hoechst 33342 før UV-bestråling. Bártová et al. 6 tidligere beskrevet de presensitization trin, og for nylig vi optimeret denne microirradiation teknik for at undgå celledød, eller apoptose. For eksempel, fører brug af en 405-nm UV laser (uden Hoechst 33342 presensitization) til induktion af 53BP1-positive dobbelt-strenget pauser (DSBs) på bekostning af cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). På den anden side presensitization trin kombineret med UV microirradiation fremkalde meget høje niveauer af CPDs og DSBs samtidig7,8. Denne metode er vanskelig at anvende til undersøgelse af et enkelt DNA reparation pathway.

Med microirradiation er det muligt at analysere protein rekruttering, kinetik og interaktion på DNA læsioner i levende celler. Et eksempel på denne metode blev udgivet af Luijsterburg et al. 9 for heterochromatin protein 1β, og vi for nylig viste for første gang, at pluripotency faktor Oct4 og et protein associeret med Cajal organer, Merete, rekrutteres til UV-induceret DNA læsioner6,10. Protein kinetics på disse DNA læsioner kan også studeres ved hjælp af FRAP (Fluorescens opsving efter Photobleaching)11,12,13 eller ÆRGRE (Fluorescens resonans energi Transfer) teknikker14 ,15. Disse metoder har potentiale til at afsløre simpel diffusion af proteiner på DNA læsioner eller protein-protein interaktioner. Et nyttigt redskab for yderligere karakterisering af proteiner er FLIM (Fluorescens levetid Imaging mikroskopi) eller kombination med FRET teknologi (FRET-FLIM)16. Disse metoder giver studiet af processer i levende celler, der er stabilt eller forbigående udtrykker protein af interesse markeret ved en fluorescerende molekyle17. Her er vist et eksempel på eksponentiel henfald tid (τ) til normal god landbrugspraksis-tagged p53 protein og dens interaktion partner, mCherry-mærket 53BP1, spiller en vigtig rolle i DNA skader svar18,19 . Parameter τ, er levetiden for fluorokrom leveres af FLIM beregninger, specifikke for en given fluorescens dye, dets bindende evner, og dets cellulære miljø. Derfor, denne metode kan vise os sondringer mellem protein delpopulationer, deres bindende evner og deres funktionelle egenskaber efter, for eksempel DNA-skader.

Her, en oversigt over de metodiske tilgange til avancerede mikroskopi-teknikker, som bruges i vores laboratorium til at studere time-specifik protein rekruttering, kinetik, diffusion og protein-protein interaktioner på stedet af microirradiated kromatin præsenteres. Den trinvise metode for induktion af lokale DNA læsioner i levende celler, og beskrivelse af metoder, der er nyttige for studier af DNA-skader-relaterede begivenheder på lokalt induceret DNA læsioner forårsaget af UV-lasere er fastsat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dyrkning af cellelinjer

  1. HeLa-afledte cellelinjer
    Bemærk: Brug HeLa cervikal karcinom celler: enten HeLa celler stabilt udtrykker Histon H2B markeret med normal god landbrugspraksis eller HeLa-Fucci celler, der udtrykker RFP-Cdt1 i den G1 og tidlige faser når S og normal god landbrugspraksis-geminin i S/G2-M faser ( figur 1).
    1. Til dyrkning af alle HeLa-afledte cellelinjer, bruge Dulbecco ' s ændret Eagle ' s medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum og passende antibiotika ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2. Erstatte medium 2 - 3 gange om ugen.
    2. Fjerne næringssubstrat, og skyl celler ved hjælp af 1 x PBS til at fjerne alle spor af serum, der indeholder trypsin hæmmer. Udføre dette trin i en biohazard hood stuetemperatur.
    3. Tilsættes 1 mL af forvarmet Trypsin-EDTA-opløsning til at dække cellelag, og holde celler på 37 ° C. Trypsinize celler, indtil cellelag er spredt (normalt 3-5 min).
    4. Tilsættes 3 mL af forvarmet komplet vækstmedium til at inaktivere Trypsin-EDTA, og sprede medium af forsigtigt pipettering flere gange.
      Bemærk: Denne procedure skal udføres i en biohazard hætte, for at beskytte operatøren mod forurenende stoffer og for at bevare optimal celle dyrkning betingelser.
    5. Tælle celler ved hjælp af en automatisk celle counter eller Bürker kammer. Fortyndet cellesuspension til 1 × 10 5 celler/mL og med pipette overfoeres 5 mL til en ny parabol. Inkuber celler ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Dyrkning af musen embryonale stamceller (mESCs), D3 cellelinie
    1. kultur mESCs på celle kultur retter belagt med 0,2% gelatine og mESC vedligeholdelse medium. Inkuber celler ved 37 ° C og 5% CO 2.
      Bemærk: Forbereder mESCs dyrkning/vedligeholdelse medium i 50 mL alikvoter og opbevare det ved 2-8 ° C i op til 2 uger anbefales. MESC medium indeholder 75 mL ES celle FBS, 5 mL Penicillin G og Streptomycin, 5 mL Non-essentielle aminosyrer (10 mM) (endelig koncentration 0,1 mM), 50 µL mus leukæmi hæmmer faktor (mLIF; 100 µg/mL) (slutkoncentration 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; 1: 100 fortynding i DMEM) (slutkoncentration 100 µM) og høje glukose DMEM medium op til 500 mL.
    2. Opsug mESC dyrkning medium fra kultur parabol og skyl cellerne en gang med 1 x PBS.
    3. Tilsættes 0,5 mL Trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C, lige indtil cellerne begynder at løsne sig fra fadet. Derefter, inaktivere Trypsin ved at vaske cellerne med 2 mL af mESC dyrkning medium suppleret med 15% føtal bovint serum.
    4. Bruge en pipette til at løsne de resterende celler fra kultur parabol.
      Bemærk: Det er vigtigt at få enkelt celler, fordi celle klumper fremme differentiering af celler.
    5. Opdel celler 1:10 på forklistres retter med mESC vedligeholdelse medium.
      Bemærk: Hvis tætheden af mESC celler er for lavt, de vokser ikke godt; Hvis tætheden er for høj, differentiering er forfremmet.
    6. Sikre at mESCs er opretholdt i udifferentierede tilstand ved at udføre mESC passage hver anden dag ved at opdele celler fra en petriskål i fire nye retter. Inspicere mESC kolonierne med en inverteret mikroskop under 100 X eller 200 X forstørrelse, og hvis der er tegn på spontan mES Celledifferentiering, udføre Western blotting for at vurdere Oct4 protein nedbrydningen.
      Bemærk: Med optimal celle passaging, spontane differentiering af mESCs in vitro- kan reduceres.

2. Celle Transfektion

  1. frø celler 48 h før eksperimenter på inddelte mikroskopi retter (diameter 35 mm) for at finde microirradiated celler efter deres koordinater på petriskålen.
    Bemærk: Dette er et eksempel, i hvilken microirradiation er de første eksperimenterende trin og immunfarvning er andet ( figur 2A).
    1. For såning, bruge en koncentration på 5 × 10 4 celler/mL for HeLa-afledte cellelinjer (eller 1 × 10 4 celler/mL for D3 mES celler). Bruge op til 2 mL komplet medium pr. fad. Under dyrkning og microirradiation, opretholde celler i en termostat eller dyrkning kammer ved 37 ° C og 5% CO 2.
    2. Tælle celler ved hjælp af en automatisk celle counter.
      Bemærk: Brug ikke en højere koncentration af celler. Især i forbindelse med tætpakkede kolonier af D3 mESCs, høj celle tæthed forhindrer en identifikation af lokalt microirradiated celler efter immunfarvning.
  2. Forberede plasmid DNA og Transfektion reagens valg som følger. Forberede opløsning A ved hjælp af 2-3 µg af valgte plasmid DNA (Se Tabel af materialer for detaljer) og 150 µL 1 x PBS. Forberede Løsning B bruger 3,5 µL Transfektion reagens i 150 µL 1 × PBS. Sikre, at hver løsning er godt blandet ved omhyggelig pipettering.
    Bemærk: Optimale forholdet mellem DNA og Transfektion reagens skal være empirisk bestemmes for hver cellelinje og individuelle plasmid.
  3. På 24 timer før eksperimentelle observation af forbigående transfekteret levende celler, kombinere opløsning A og løsning B uden vortexing. Inkuber de kombinerede løsninger ved stuetemperatur i 15-20 min. I bred dråbevis administrationsprocedurerne sprede dette komplet Transfektion blanding (300 µL, som beskrevet i punkt 2.2) på cellelag vokser i mikroskopi parabol.
  4. Incubate celler ved 37 ° C og 5% CO 2 til 4-6 h, derefter erstatte Transfektion blanding med frisk medium. Dyrke celler under standardbetingelser.
    Bemærk: Når du bruger en 405-nm laser, ikke presensitize celler med et reagens, men når du bruger en 355-nm laser, udføre celle presensitization med 10 µM 5-bromo-2 ' - deoxy - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization tid afhænger celletype og længden af cellecyklus. HeLa celler, tilføje BrdU 16 til 20 h før lokale microirradiation. I forbindelse med mESCs, tilføje BrdU 6 til 8 h før microirradiation.

3. Induktion af lokale DNA læsioner og konfokalmikroskopi

  1. Placer skålen på stadiet mikroskop og registrere placeringen af de markerede celler på fadet; celle koordinater vil være behov for yderligere analyse ( figur 2A a-c).
  2. Finde transfekteret celler i et kvadrat, der er mærket med et tal eller bogstav ( figur 2A d-f, pile i annonce viser placeringen af cellen forstørret i paneler Ae og Af). Få et billede af celler ved hjælp af lysfelt mikroskopi og erhverve en fluorescens billede for at identificere placeringen af både cellerne og mærket-pladsen ( figur 2A).
  3. Til billede erhvervelse inden bestråling, bruge en hvid-lys laser (WLL) (470-670 nm i 1-nm intervaller) tilsluttet Konfokal mikroskop (eller en anden tilgængelig tilsluttet confocal mikroskop).
  4. Bruger følgende indstillinger: 512 × 512 pixel opløsning, pixel størrelse 64 nm, 400 Hz, torettede tilstand (scanning i to retninger), line gennemsnitlige sæt til 8, zoom 8 x 12 x.
    Bemærk: Linje gennemsnit repræsenterer et givet antal scanninger; samme linje er scannet flere gange før du fortsætter til næste linje. Gentaget scanninger af alle linjer producerer den sidste ramme i billedet.
  5. Billede observation og erhvervelse, bruge en 63 × olie mål med en numerisk blænde 1.4 og sekventielt erhverve fluorescens billeder. Fjerne cross-talk mellem de to fluorokromer ved hjælp af den sekventielle scannetilstand af den relevante software.
    Bemærk: Alle mikroskop software giver mulighed for fastsættelse af en såkaldt sekventiel scanningstilstand. Operatøren kan vælge at erhverve fluorokromer ' oplysninger samtidigt (f.eks. i rød-grøn-blå fluorescens) eller, som nævnt her, individuelt (fortløbende), fluorokrom af fluorokrom. Tage hensyn til de generelle oplysninger, den maksimale excitation/emission for normal god landbrugspraksis er 395/509 nm og den maksimale excitation/emission for mCherry er 587/610 nm (Se fluorokromer bruges her i figur 2B). Baseret på disse oplysninger, Vælg egnet excitation og emission filtre til de ønskede fluorokromer. Filtervalg og scanning procedurer skal optimeres for hvert Konfokal mikroskop.
  6. For induktion af DNA læsioner, brug 64 linie scannetilstand, sluk WLL (i ' erhvervelse ' mode), skifte på den eksterne UV kilde (på " UV laser " knap), indstille region af interesse (ROI) (i ' erhvervelse ' mode), og indstille 355-nm laser til 100% strøm, eller alternativt bruge en 405-nm Laserkilde.
    Bemærk: Generelt, laser power er justeret med passende laser justering knappen i erhvervelse billedtilstand.
  7. For lokale microirradiation, bruge lasere, der udsender i den i nærheden af UVA spektrum. For microirradiation af ROI i kernen og Screendump, indstille baggrunden til nul i image erhvervelse mode at regulere laser intensitet uden for ROI; Hvis cellen er bestrålet ordentligt, signal af normal god landbrugspraksis-Histon H2B forsvinder og for eksempel, mCherry-mærket PCNA protein vil ansættes til DNA læsioner umiddelbart efter bestråling ( figur 2B og Video 1 ).
    Bemærk: En DNA-skader induceret i ROI af en Konfokal afsnit vises også i tre-dimensionelle (3D) projektion (se 3D rotation og x-y, x-z, y-z fremskrivninger i figur 2 c og Video 2). Beskrivelser af de komplette tekniske parametre for 355-nm og 405-nm lasere, se Stixová et al. 7
  8. efter ROI er blevet bestrålet, sluk eksterne UV kilden, slukke ROI, Tænd WLL, ændre linje scanning til 8, og finde en anden celle for bestråling. For ROI markering, skal du bruge knappen gældende i softwaren ' s erhvervelse billedtilstand.
    Bemærk: mCherry-PCNA har en maksimal ophobning peak på DNA læsioner mellem 2 og 20 min ( figur 2B). Du kan kontrollere resultatet på eksogene protein niveauer, fortsætte med immunofluorescens farvning umiddelbart efter lokale microirradiation. Vælg tidsinterval bestråling ifølge interesse.
  9. Bekræft at en ophobning af eksogene proteiner kan påvises i fleste af microirradiated celler. For denne kontrol bruge kriterier i følgende trin.
    1. Check at der er ingen overekspression af eksogene protein i forbigående transfekteret celler. Som en mulig løsning, vælge celler med kun en svag udtryk af fluorescerende proteiner (f.eks., mCherry-PCNA eller mCherry-53BP1).
    2. Vurdere fototoksicitet WLL eksponering bruges til billede erhvervelse.
      Bemærk: For fototoksicitet test, udsætte transfekteret celler til langvarig laser microirradiation og kontrollere, at celler videre til mitosen som vist i figur 3A -B. Som en mulig løsning, reducere scanning tid og antallet af Konfokal skiver pr. celle, optimere 3D scanning ved valg af den optimale aksial trin (0,3 µm anbefales) og indstille laseren ' s magt på sit minimum. Fototoksicitet kan alternativt fjernes ved hjælp af Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic syre, en vandopløselig analog af E-vitamin) opløst i dyrkning medium. For DNA-skader-relaterede eksperimenter, er det ikke anbefales at bruge af Trolox på grund af dens beskyttende effekt mod UV-stråling.
    3. Ved bestråling med en 355-nm laser, kontrollere tilstrækkelig indarbejdelse af BrdU ved hjælp af en passende BrdU påvisning antistof fra BrdU indarbejdelse kit (Se Tabel af materialer). Da BrdU er indarbejdet i DNA i S fase af cellecyklus, skal hovedparten af cellerne fortsætte gennem S-fase under presensitization. Som en mulig løsning, mener længden af cellecyklus, som er celletype specifikke.
    4. Analyser om DNA reparere proteiner af interesse har en evne til at genkende DNA læsioner i specifikke cellecyklus forsøgssted. En mulig løsning: Du kan kontrollere, at rekruttering af udvalgte proteiner til DNA læsioner er begrænset til specifikke cellecyklus faser (G1/S/G2), bruge HeLa-Fucci celler. Disse celler express RFP-Cdt1 i den G1 og tidlige faser når S og normal god landbrugspraksis-mærket geminin i S/G2-M cellecyklus faser 22 ( figur 1).
    5. At undgå apoptose, celledød, vælge en passende Laserkilde og laser power indstilling 23. Husk, at bestrålede celler bør fortsætte til mitosen ( figur 3A -B, Video 3).
      Bemærk: Uønskede apoptose kan registreres af Annexin V positivitet, caspase 3 eller lamin B kavalergang. På niveauet morfologiske celle detachment og dannelsen af apoptotiske organer vil blive synlige.

4. Immunfluorescens farvning

  1. skylles cellelag (vokser i mikroskop retter) kort med 1 × PBS og efter skylning, løse celler ved hjælp af 4% formaldehyd i 10 min (for HeLa-afledte cellelinjer) eller 20 min (for D3 ES-celler) ved stuetemperatur. Skyl skål med 1 × PBS.
    Forsigtighed: Formaldehyd forårsager alvorlige øjenskader, kan forårsage en allergisk hudreaktion, og er også en potentiel kræftfremkaldende; således alle eksperimenterende trin med formaldehyd bør udføres i en emhætte.
    Bemærk: For at undgå unødvendige blegning af fluorescens signaler, gemmer skålen i et mørkt kammer under den nødvendige for immunofluorescens farvning inkubationstiden.
  2. Permeabilize celler med 0,1% Triton X-100 opløst i H 2 O for 8 min, og derefter inkuberes celler i 12 min. med 1 × PBS, som indeholder 0,1% saponin og 0,1% Triton X-100. Efter inkubationen vaske cellerne i 1 × PBS to gange i 15 min.
  3. Incubate celler med 1% BSA i 1 × PBS for 60 min. at blokere uspecifik binding af udvalgte antistoffer. Vaske cellerne i 1 × PBS for 15 min efter inkubation.
  4. Dilute primære antistof i forholdet 1: 100 (eller 1:200) (dette trin skal være optimized for individuelle antistoffer) i 1% BSA i 1 × PBS, ved hjælp af 25 µL af denne løsning pr parabol, og dække cellerne med en coverslip. Inkuber i celler med den løsning, der indeholder den primære antistof i en fugtig kammer natten over ved 4 ° C.
  5. Den følgende dag, vaske cellerne i 1 × PBS to gange i 5 min.
  6. Fortyndes den sekundær antistof i forholdet 1: 100 (eller alternativt 1:200) i 1% BSA i 1 × PBS, ved hjælp af 100 µL af denne løsning pr parabol, og dække cellerne med en coverslip. Inkuber i celler med den løsning, der indeholder den sekundær antistof til 60 min. Efter inkubationen vaske cellerne i 1 × PBS tre gange i 5 min.
  7. Montere coverslip med en dråbe af montering medium, og forsegle coverslip med neglelak eller lim til at forhindre udtørring og bevægelse under mikroskopisk observation. Opbevar fadet i mørke ved 4 ° C.

5. Fluorescens levetid billede (FLIM) mikroskopi

  1. Start FLIM software. Åbn den " Application Suite " af softwaren og skifte det til den " FLIM " tilstand. Sørg for, at WLL opererer i pulserende tilstand.
    Bemærk: Erhvervsdrivende skal skifte en hardwareknap til at nå puls tilstand.
  2. Placere skålen med de farvede celler (farves i afsnit 4) på mikroskop scene i den samme retning som under lokale microirradiation, og find de bestrålede celler efter gitre på petriskålen. Udføre image erhvervelse af Konfokal mikroskop.
    Bemærk: Brug følgende indstillinger: 1024 × 1024 pixel, 400 Hz, torettede tilstand, 16 linjer, zoom 8 x 12 x.
  3. Før du begynder FLIM måling, udfører en indledende test for at vise en real-time rekord eksponentiel henfald, ved at klikke på " Setup FLIM " og " erhvervelse " og trykke på " køre FLIM test ". Optimere FLIM parametre for prøven ved vurderingen af de to vigtigste parametre som følger.
    1. Optimer gentagelseshyppighed af WLL med excitation bølgelængde tunet til levetid af prøven (Se bemærkningen nedenfor). I Konfokal mikroskop software, justere laser intensitet med den relevante knap, som generelt kaldes " laser justering indstillingen " i den ' billed tilegnelse ' menu. Derefter beregne et henfald kurve (- eller histogramvisning viser alle photon tæller) ved hjælp af FLIM software (Se figur 4A -B).
      Bemærk: Brug WLL i pulse mode for excitation. Softwaren skal være forsynet med en puls picker WLL, som tillader valg af en gentagelseshyppighed (80, 40, 20 eller 10 MHz). Excitation bølgelængden for donor-fluorescens, normal god landbrugspraksis, er 488 nm. Henfald kurve er indspillet ved hjælp af arbejdsområdet FLIM software. Parameteren (τ D, τ DA) viser eksponentiel henfald gange (fx, fluorokrom levetid); parameter (A) repræsenterer amplitude af fluorokrom forfald (se eksempler på FLIM data for normal god landbrugspraksis-tagged p53 og mCherry-mærket 53BP1 i figur 4A -B).
    2. Check Greven gentagelseshyppighed ved hjælp af værktøjet software erhvervelse (Vælg gentagelse sats tilstand). Vælg de lyseste pixels i stikprøven; kurven for den lyseste pixel skal være under 10% af den samlede fluorescens-intensiteten.
  4. Klik på " måling " og tryk på " køre FLIM ".

6. donor levetid ved hjælp af en FLIM Script og beregning af FRET effektivitet

  1. starter FRET-FLIM-softwaren og åbne den ' Donor ' arbejdsområde.
  2. Vælg den " analyse " / " Imaging " fanen i menuen, og starte scriptet FLIM ved at klikke på " Start ". For optimal FRET-FLIM indstillinger, bruge velkendte interagerende protein partnere.
    Bemærk: FRET-FLIM effektivitet for velkendte interagere partnere normal god landbrugspraksis-p53 og mCherry-53BP1 var (34.1 ± 2.3) % ( fig. 4 c).
  3. Bruger kun Donor emission channel (kanal 1 eller 2) og tryk på " Beregn hurtigt FLIM ".
    Bemærk: Billedet grafen begge opdateres og.
  4. i the FRET-FLIM software, indstille intensitet skala (0 - 4000 tæller) og levetid skala (0 - 5 ns) manuelt i softwaren. Med denne tilgang, visualisere celle af interesse og indstille FRET-FLIM måling.
    Bemærk: Denne indstilling fjerner forskelle i fluorescens intensitet blandt individuelle celler i celle population.
  5. i formen henfald Vælg passende model.
    Bemærk: Vi anbefaler n-eksponentiel reconvolution og valg af model parameter " n ". En optimal pasform har følgende kriterier: det monterede kurve overlays henfald kurven godt og χ 2 - værdien er lig med 1 ( figur 4B).
  6. Vælg den " tærskel " / " brug tærskel " og sat tærsklen til 75. Start " indledende Fit ".
    Bemærk: SPT64 softwaren beregner den gennemsnitlige donor levetid i mangel af FRET (" Amplitude vejede gennemsnitlige levetid ", τ Av.Amp)

7. FRET effektivitet ved hjælp af scriptet FLIM-FRET

  1. Vælg arbejdsområdet Donor/Acceptor og derefter åbne " analyse " | " Imaging " | " levetid ÆRGRE billede ".
  2. Vælg kun Donor som den aktive kanal og justere Pixel Binning afhængigt af photon nummer/pixel. Derefter køre software tilstand kaldet " beregne FastFLIM ". Hvis photon nummer/pixelen i billedet er lav, øge Pixel Binning til at 4 point.
  3. Angive intensiteten på 0 - 200 tæller og levetid til 0 - 5 ns.
  4. Aktivering " brug tærskel " og angive en tærskel på 75.
  5. Angive montering-modellen til " Multi-Exp. Donor ", Angiv parameteren model " n ", Angiv τ Av.Amp (trin 6.6) som en τ D, og aktivere " indledende passer ".
  6. Angive parametre Bkgr Dec, Skift IRF, og Bkgr IRF til konstante værdier ved at fjerne mærket.
    Bemærk: Indstille størstedelen af parametre til at forblive konstant så meget som muligt. Denne fremgangsmåde reducerer statistiske udsving. I dette tilfælde ikke Tryk på " indledende fit " igen. Beskrivelser af de nævnte parametre følge: IRF = Instrument svar funktion, BkgrDec = baggrund fra den eksponentielle pasform, ShiftIRF = IRF Skift fra eksponentiel reconvolution fit, BkgrIRF = IRF baggrund fra eksponentiel reconvolution passer. Alle tre parametre beregnes og kan fastgøres ved hjælp af software for yderligere analyse.
  7. Tryk " beregne FRETŔ en FRET billede (afbildet i området FLIM billede) og FRET effektivitet histogrammet er beregnet, og en FRET afstand histogrammet er afbildet ( figur 4 c). Når billedanalyse er færdig, skal du trykke på " gemme resultatet ".
    Bemærk: Under FRET eksperimenter, det er nødvendigt at overveje at fluorescerende proteiner udviser reversible overgange mellem fluorescerende (lyse) og ikke-fluorescerende (mørk). Denne egenskab kaldes " blinkende ", og FRET effektivitet påvirkes af dette fænomen (en forklaring af denne effekt blev leveret af Vogerl et al. 24).

8. FRAP analyse

  1. sted dish på stadiet mikroskop finde de transfected celler, der udtrykker den fluorescently mærkede protein af interesse, og udføre image erhvervelse ved hjælp af lysfelt mikroskopi med standard mikroskop lampe (Se figur 2Aa-b) og Fluorescens mikroskopi tilstande.
    1. For image erhvervelse, bruge hvid-lys laser (WLL) tilsluttet Konfokal mikroskop (eller en laser af valg, ifølge den valgte fluorokrom). Brug følgende indstillinger: 512 × 512 pixel, 1000 Hz, torettede tilstand, linje gennemsnit 1, zoom 8 x 12 x.
    2. Erhverve mindst 15 prebleaching billeder (på ~ 10% laser power) og definere region af interesse (ROI) i menuen image erhvervelse.
  2. For photobleaching eksperimenter, bruge en argon laser (488 nm). Anvende følgende indstillinger: ramme opløsning 512 × 512 pixel, 1000 Hz, torettede tilstand, zoom 8 x 10 x.
    Bemærk: Fluorokromer herunder normal god landbrugspraksis, mCherry og RFP kan blive ophidset af en argon laser arbejder på 488 nm og 514 nm.
  3. Bruge FRAP software tilstand af mikroskop af valg. Under photobleaching, indstille argon laser ' s magt til maksimum ved hjælp af laser justering knappen. Udføre image erhvervelse på 0.256 s intervaller på 10% laser power.
    Bemærk: For postbleaching trin, bruge tilstanden standard billede erhvervelse af en Konfokal mikroskop af valg.
    1. Skærm fluorescens restitutionstid efter photobleaching (op til 45-50 s efter proceduren for blegning).
      Bemærk: Som vist i figur 4D, restitutionstid efter photobleaching for mCherry-mærket 53BP1 er tydelig på spontan DNA læsioner og UVA-bestråling-induceret foci. mCherry-53BP1 på UVA læsioner inddrives hurtigt i forhold til mCherry-53BP1 ophobninger på spontant forekommende DNA reparation foci; Se figur 4D og Foltankova et al. 25
  4. eksportere data fra mikroskop software (eller software valg) til et regneark og statistisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af avancerede Konfokal mikroskopi, observeret vi en ophobning af mCherry-mærket 53BP1 og mCherry-PCNA proteiner på DNA læsioner. Analyser blev udført af lokale microirradiation af levende celler. For at genkende de nukleare spredningsmønstre for DNA-reparation-relaterede proteiner i individuelle cellecyklus faser, vi brugte Fucci cellular system, hvorved det er muligt at bestemme G1, tidlig S, og G2 faser af cellen cyklus (figur 1). Den biologiske anvendelse af den Fucci cellular model, som vi offentliggjorde i Suchankova et al. 26 viser, at 53BP1 blev ansat til lokalt induceret DNA læsioner i G1, S og G2 faserne i cellecyklus, som var knyttet til funktionen af dette protein under ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ), en af de vigtigste mekanismer, der fører til dobbelt-strenget pause reparation. På den anden side, viste denne eksperimentelle system os den enkelte cellulært niveau, PCNA protein, som er knyttet til den homologe rekombination reparation pathway (HRR), genkender DSBs i de sene S og G2 faser i cellecyklus 27. For studier på DNA reparation maskiner optimeret vi også bestråling betingelser for at sikre, at cellekulturer fortsatte med at gennemgå mitosen efter eksponering for UV-lasere (figur 3). Microirradiated celler under mitosen bevise, at i disse forsøgsbetingelser, DNA reparation provenuet i en relativt fysiologiske måde og celler ikke er blevet såret af lasere, der ved højere intensitet inducerer apoptose. Her, vise vi også hvordan man anvender FRET-FLIM analyser til karakterisering af DNA reparation proteiner. Denne avancerede teknologi gør det muligt for os at studere lokal protein-protein interaktioner i cellekernen eller, alternativt, protein interaktioner i nucleolar regioner såsom nucleolus, nuclear lamina eller klynger af heterochromatin. For begyndere i denne teknologi, vil vi gerne anbefale optimere dette FRET-FLIM teknik ved hjælp af velkendte interagerende protein partnere såsom p53 og 53BP1 (figur 4A-C). Generelt fører kendskab til protein-protein interaktion til forståelsen af hvordan proteinkomplekser regulere processer som replikering, genaktivering, hæmning eller DNA reparation. Derudover er et meget nyttigt værktøj for studier af protein kinetik metoden FRAP, som viser karakteristika af lokale protein diffusion og mobilitet (figur 4D). Taget sammen, give her vi metodiske anvisninger for anvendelse af avancerede Konfokal mikroskopi-teknikker i DNA reparation undersøgelser.

Figure 1
Figur 1: dannelsen af DNA reparation foci kan studeres i HeLa-Fucci celler, der udtrykker RFP-cdt1 (rød) i den G1/tidlig S faser og normal god landbrugspraksis-geminin (grøn) i S/G2 faserne i cellecyklus. Spontant forekommende DNA læsioner positiv for 53BP1 protein (blå; Alexa 405 farvning), blev undersøgt i den G1 (rød), tidlige Sørensen (orange, udtryk for både RFP-cdt1 og normal god landbrugspraksis-geminin) og G2 (grøn) faser af cellecyklus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ansættelse af mCherry-mærket PCNA på DNA læsioner over tid. (A) celler, der udtrykker mCherry-PCNA (rød), blev placeret på en inddelte mikroskop parabol i udvalgte regioner (grå). Efter fiksering og immunfarvning, bestrålede celler (gule pile) blev placeret efter registrerede koordinater (Se grå bogstavet K som eksempel) (Aa-c). Den gule ramme og pile (annonce) vise den celle, der var microirradiated og forstørret i paneler Ae-f. (B) akkumulering af mCherry-PCNA (rød) blev studeret i HeLa celler stabilt udtryk for normal god landbrugspraksis-tagged Histon H2B (grøn). Celler blev overvåget umiddelbart efter lokale microirradiation for op til 35 min. (Se Video 1). (C) Microirradiated celler blev analyseret af 3D Konfokal mikroskopi og protein ophobning på DNA læsioner (fx, mCherry-53BP1) blev fundet i alle tre dimensioner (x-y, x-z, og y-z), dog kun Midtersektionen af cellekernen var microirradiated (se 3D-celle rotation i Video 2 3D fremskrivninger i figur 2 c). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: celler microirradiated af en 405-nm laserdiode fortsætte normalt gennem cellecyklus. (A) efter bestråling ved hjælp af en 405-nm diodelaser, HeLa celler (stabilt udtrykker normal god landbrugspraksis-Histon H2B; grøn) gennemgå mitosen (Se også Video 2). Gule pile og rammer angiver bestrålede ROI i markerede celler. Hvide rammer Vis mitosen. (B) Under de samme forsøgsbetingelser, mitosen i bestrålede celler blev også observeret af tid bortfalder mikroskopi i HeLa celler stabilt udtryk for normal god landbrugspraksis-H2B (grøn) og forbigående udtrykker mCherry-PCNA (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: FLIM og FRET-FLIM analyse af normal god landbrugspraksis-p53 og mCherry-53BP1. Fluorescens resonans energi overføre (FRET) opdaget af FLIM og anvendelsen af fluorescens opsving efter Photobleaching(FRAP) på forskellige DNA læsioner. ( A-C) Gennemsnit (n = 10) levetid for normal god landbrugspraksis-tagged p53 i fravær og tilstedeværelsen af acceptoren (mCherry-53BP1), målt i hele nonreplicating HeLa cellekerner. (A) repræsentative fluorescens henfald kurver og residualer studerede i HeLa celler forbigående udtryk for normal god landbrugspraksis-p53 (donor-only, τD) eller normal god landbrugspraksis-p53 og mCherry-53BP1 (donor-acceptor, τDA). (B) Averaged levetid (τ1 - τ3) og amplituder (en1 - et3) af (en) NGL-p53 og (b) mCherry-53BP1 målt i hele HeLa cellekerner. Χ2 værdier blev også beregnes og vises. (C) Resumé af FRET effektivitet for de velkendte interagerende partnere normal god landbrugspraksis-p53 og mCherry-53BP1. Skalere barer = 4-5 µm. FRET-FLIM resultat viser ~ 35% FRET effektivitet for velkendte interagere partnere normal god landbrugspraksis-tagged p53 og mCherry-mærket 53BP1. (D) Recovery kinetik af mCherry-53BP1 studerede ved spontant forekommende DNA læsioner (grøn kurve) og UVA-induceret DNA læsioner (blå kurve). mCherry på DNA læsioner blev bleget til niveauet af baggrunden (dispergeret form af protein af mCherry-53BP1 protein), og baggrunden fluorescens blev trukket fra hver værdi. DATA, vist som relative fluorescens intensiteten af mCherry-53BP1, præsenteres som middel ± standardafvigelse. Student's t-test viste en statistisk signifikant forskel mellem to typer af DNA læsioner (* viser p ≤0.05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: ansættelse af mCherry-mærket PCNA protein (rød fluorescens) til DNA læsioner induceret af lokale microirradiation i HeLa celler stabilt udtrykker normal god landbrugspraksis-tagged Histon H2B (grøn fluorescens). Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 2
Video 2: ophobning af mCherry-mærket 53BP1 protein (rød fluorescens) ved DNA læsioner induceret af lokale microirradiation i HeLa celler. Cellekernen er vist i 3D-rum ved hjælp af en software-mode, der giver mulighed for visualisering af celle rotation i rummet. Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 3
Video 3: Microirradiated HeLa celler stabilt udtryk for normal god landbrugspraksis-tagged Histon H2B (grøn fluorescens) fortsætte gennem mitosen. Det bestrålede område er kendetegnet ved nedbrydningen af normal god landbrugspraksis-H2B (sort regioner er bestrålet strimler inde cellekerner). Venligst klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroskopi-teknikker repræsenterer grundlæggende værktøjer i forskningslaboratorier. Her en kort beskrivelse af metoderne, der anvendes til undersøgelse af protein rekruttering og kinetik ved DNA læsioner er præsenteret. Vi bemærkede især vores eksperimentelle erfaringer inden for lokale microirradiation af levende celler, og vi diskuterer studiet af protein kinetik af FRAP og protein-protein interaktion på DNA læsioner af acceptoren-blegning FRET28 og dens avancerede ændring FRET-FLIM (figur 4A-D). De metoder, der er vist her er uundværlige redskaber til en ægte forståelse af DNA reparationsprocesser, især protein kinetik i levende cellulære systemer, som inspiceres af avancerede Konfokal mikroskoper6,7,8, 28. Disse metoder er af enorm nytte hen til fremtidige medicin i forbindelse med virkningerne af strålebehandling på væv eller kendetegner tumor celle morfologi. For at optimere denne metode, gerne vi anbefaler at starte med velkendte interagerende protein partnere, som vist i figur 4 c.

Det er velkendt, at protein rekruttering til DNA læsioner er meget dynamisk og tidsafhængig; anvendelse af time-lapse Konfokal mikroskopi efter celle bestråling er således påkrævet, ikke kun inden for grundforskning, men også i klinikker26. Lokalt induceret DNA læsioner på grund af laser microirradiation9,28,29 repræsenterer genomisk områder hvor det er muligt at studere protein rekruttering, protein-protein eller protein-DNA bindende og interaktion. Udgangspunktet for disse metoder er, at rekruttering af udefrakommende proteiner skal kontrolleres ved passende antistoffer på det endogene niveau. Næste, den kritiske trin i sådanne forsøg er, at over transfekteret celler kan give falsk-positive resultater; den bedste beslutning er således at etablere cellelinjer stabilt udtrykker de fluorescently tagged proteiner af interesse. Desuden, på grund af de fototoksiske effekter lasere anvendes til billede erhvervelse, enten betingelserne for scanning skal optimeres eller Trolox sammensatte skal opløses i celle dyrkning medium. Desuden eliminering af de presensitization skridt, før bestråling anbefales. Efter lokale microirradiation, DNA reparation skal fortsætte sådan, at cellerne gennemgå mitosen ()figur 3A-B og Video 3). Induktion af apoptose efter laser bestråling er en mindre værdifulde proces fra visningen af optimale DNA reparation23. Det fremgår også, at nogle DNA reparation proteiner genkende DNA-skader kun i specifikke cellecyklus faser (fx, Bártová et al. 30). således brug af HeLa-Fucci cellular system, viser cellerne i de enkelte faser af interfase, er et nyttigt værktøj for studier af DNA skade svar. Derudover kan cellecyklus faser anerkendes efter nukleare fordeling mønster af PCNA protein31.

Det er velkendt, at metoderne FRAP og FRET repræsenterer meget nyttige værktøjer til at undersøge egenskaber af proteiner, der er rekrutteret til DNA læsioner7,8,32. Derudover kan FLIM teknik32 afsløre oplysninger om de dynamiske konformationelle ændringer af de proteiner, der ophobes på DNA læsioner. Brug af denne metode er vigtigt fordi FLIM måler dynamisk cellulære processer direkte; således er steady-state fluorescens intensitet målt over tid. FLIM tilgange øge billedets kontrast ved at fjerne baggrunden fluorescens. Det er en fordel i forhold til konventionelle acceptor-blegning FRET bruges af FRET-FLIM. Fluorescens levetid målt af FLIM indeholder oplysninger om brøkdele af fluorescently mærket proteiner og vise hvordan heterogenic sonder er på grund af miljøforhold. FLIM er også bedst og mest pålidelige biofysiske tilgang til udfører FRET for protein-protein interaktion i levende celler32,33.

Taget sammen, har alle de beskrevne metoder potentiale til at afsløre nye mekanismer af DNA skade svar i humane celler, hvilket er vigtigt især for stråleterapeutiske tilgange. For eksempel, er multiphoton FLIM blevet anvendt for at opnå høj opløsning billeder i medicin, hvor det hedder multiphoton tomografi34. Denne meget avancerede mikroskopiske metode kan anvendes på klinikker for kræftdiagnose ved hjælp af histokemiske prøver og analyseret med høj opløsning. FLIM metoder kan desuden give en præcis analyse af tumor celle overflader efter deres autofluorescence. En ulempe ved metoden FLIM-FRET er meget sofistikeret software baggrunden, som skal være fuldt forstået af operatoren mikroskop. Yderligere vil biologisk relevans af FLIM data, i almindelighed og i DNA reparationsprocesser, helt sikkert blive afsløret i den nærmeste fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud agenturet af Den Tjekkiske Republik, projekt P302-12-G157. Forsøg blev også støttet af Tjekkisk-Norsk forskning programmet CZ09, som er overvåget af norske midler og af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og Sport i Tjekkiet (giver nummer: 7F14369).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88, (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280, (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7, (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74, (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35, (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6, (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7, (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185, (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5, (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22, (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235, (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3, (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20, (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23, (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8, (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160, (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15, (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6, (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7, (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19, (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107, (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116, (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227, (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188, (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9, (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66, (2), 230-236 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics