הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

Published 8/23/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Cancer Research
 

Summary

כאן, שיטה מתוארת עבור הכנת ספרואיד תלת-ממדי (3D) תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts, ואחריו מדידה של פונקציות מטבוליות באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

Cite this Article

Copy Citation

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סוגי סרטן רבים, לרבות סרטן הלבלב, יש של משתית שהותירה צפוף זה ממלא תפקיד חשוב ב התקדמות הגידול, הפלישה. מופעל סרטן הקשורים fibroblasts הם מרכיב מרכזי של stroma הגידול אינטראקציה עם תאים סרטניים ולתמוך שלהם וצמיחה של הישרדות. בדגמי לסכם את האינטראקציה של תאים סרטניים ומופעל fibroblasts הן כלי חשוב עבור לימוד הביולוגיה סטרומה, פיתוח של סוכנים antitumor. . הנה, שיטה מתואר לדור מהירה של תרבות משותפת חזקים ספרואיד תלת-ממדי (3D) של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts הלבלב מופעל יכול לשמש עבור מחקרים ביולוגיים מאוחרים יותר. בנוסף, תיאר השימוש spheroids 3D בביצוע מבחני מטבולית תפקודית כדי לחקור מסלולים ביואנרגיה הסלולר באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית מזווג עם microplate ספרואיד. תאי סרטן הלבלב (Patu8902) ואת תאי פיברובלסט הלבלב מופעל (PS1) היו תרבותי משותף, הממוגנטים באמצעות אסיפה nanoparticle מסתיימים. תאים magnetized היו במהירות bioprinted באמצעות כוננים מגנטי בתבנית טוב 96, בתקשורת הצמיחה כדי ליצור spheroids בקוטר הנע בין 400-600 מיקרומטר תוך 5-7 ימים של תרבות. פונקציונלי מבחני מטבולית באמצעות spheroids Patu8902-PS1 בוצעו מכן בטכנולוגיה השטף חוץ-תאית כדי לחקור הסלולר מסלולים אנרגטיים. השיטה בזאת היא פשוטה, מאפשר דור עקבית של סרטן התא-פיברובלסט ספרואיד תרבויות משותף, ניתן להתאים באופן פוטנציאלי סוגי תאים אחרים סרטן על אופטימיזציה של המתודולוגיה המתוארת הנוכחי.

Introduction

בעשור האחרון, רבים במבחנה דגמי תלת-ממד פותחו מסכם את הדברים ולחקור ויוו הגידול ביולוגיה, microenvironment וצמיחה התנאים של סרטן תאים1,2. מימדי חד שכבתי (2D) תא תרבות מערכות עם חשיפה אחידה גורמים ביוכימיים ותרכובות לניסויים קליניים להיכשל כדי לשכפל את האינטראקציות יליד הגידול-סטרומה 3D חשוף הדרגתי של תרכובות לשדר דרך חוץ-תאית מטריקס חלבונים (ECM)3,4. לפיכך, לעומת מודלים תרביות רקמה 2D, סרטן תלת-ממד מודלים יש בקע להראות טוב יותר פוטנציאל-המדמה את microenvironment הגידול ושימש כלי חשוב יותר להבין ויוו הגידול מאפיינים, כגון היפוקסיה, desmoplasia, תרדמה, סמים penetrance, רעילות, התנגדות טיפולית5,6. לשם כך, דגמי תלת-ממד יש פוטנציאל כדי לגשר על הפער בין תרבות תא 2D כל בבעלי חיים על ידי מחקה ויוו תכונות הגידול, בעת היותו זול יחסית, ממוטב עבור הדור מהירה ועקביות. יתרונות אלה אינן מנוצלות כדי להאיץ את המחקר translational בתחומים רבים, כולל סרטן ביולוגיה, מורפוגנזה רקמות הנדסה7,8.

נחשול של התפתחו שיטות של תרביות רקמה תלת-ממד, טכניקות ריחוף מגנטי יש לאחרונה פותחה, תיאר לצמיחה, assaying והדמיה של spheroids נגזר שונים תא סוגי9,10, 11 , 12. bioprinting 3D מגנטי מנצלת את השימוש כוחות מגנטיים להנדס רקמות magnetizing תאים עם חלקיקים מסתיימים, להדפיס אותן בתבניות רב טוב. דבר זה מאפשר ייצור מהיר של עקבי, ליד זהה spheroids 3D, אשר ניתן לרתום מועסק שפע של יישומים במורד הזרם החקירה הביוכימי, biophysical10. כאן אנחנו הסתגלו הטכניקה bioprinting מגנטי באמצעות מסתיימים חומר שנקרא Nanoshuttle (אן אס) המורכב של תחמוצת ברזל, פוליפוני L-ליזין, חלקיקי ננו זהב לסמן תאים סרטן הלבלב ו fibroblasts NS מייחס electrostatically את קרום פלזמה, לא ידוע להיקשר לקולטנים ספציפיים כלשהם, משחרר את התא על פני השטח תוך שבוע. זה דורש כוחות מגנטיים נמוך מאוד (30pN), מספיק כדי צבירה אבל לא לפגוע תאים, אינה משפיעה על יכולת הקיום תא בחילוף החומרים או התפשטות להצליח מאוד מסתיימים עבור תלת-ממד תרבויות10,13,14 ,15.

במחקר זה, באמצעות סרטן הלבלב כמו דוגמה ומודל, נתאר את הדור ואת וזמינותו מטבולית של סרטן 3D פיברובלסט תא spheroids. החל מ תאים תרבותי בכלי 2D, אנו ממחישים את התנאים גדילה והתרבות של הגידול בלבלב-פיברובלסט תרבות משותפת spheroids באמצעות bioprinting מגנטי. Spheroids בתרבית ואז שימשו פונקציונלי מבחני מטבולית באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית, טכנולוגיה הפגינו כדי למדוד בו זמנית את שני מסלולים בהפקת האנרגיה הגדולות, גליקוליזה, נשימה מיטוכונדריאלי, במגוון בשידור חי תאים ורקמות16,17,18,19,20. גליקוליזה נמדדה בשינוי קצב חוץ-תאית acidification (ECAR), ואילו נשימה מיטוכונדריאלי או זרחון חמצוני נמדדה כמו קצב צריכת החמצן (OCR). אנו מציעים כי שיטה זו פותחה עבור בלבלב spheroids יכול לשמש עמוד השדרה עבור מיטוב ותרגום הגידול 3D ספרואיד הדור ואת וזמינותו לסוגי תאים/רקמה אחרים.

Protocol

1. תרבות של סרטן הלבלב Spheroids תלת-ממד באמצעות מגנטיות Bioprinting

  1. רגיל באמצעות תרביות רקמה אספטי טכניקה, התרבות תאים עניין בבקבוקון T75 confluency של 70-80% בתקשורת צמיחה המתאים.
    הערה: בדרך כלל, 5-7 × 10 6 תאים מבקבוק 70-80% confluent T75 נבצרו. שני סוגי תאים שונים השתמשו במחקר זה - Patu8902 (תאים בלבלב) ותאים PS1 (שהופעל בתאי stellate הלבלב 21). שני הקווים תא היו תרבותי בתקשורת רוזוול פארק אנדרטת המכון 1640 (RPMI-1640) בתוספת 10% (v/v) העובר serum(FBS) שור, 1 × פניצילין-סטרפטומיצין (p/s).
  2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 5 מ של Dulbecco ' s פוספט buffered saline(DPBS).
  3. ניתוק תאים פלסטיק על פני השטח על-ידי trypsinizing עם 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 5-10 דקות ב 37 ° ג הסימון עבור ניתוק התא תחת מיקרוסקופ.
  4. טריפסין Deactivate על ידי תוספת של 8 מ ל מדיה הצמיחה כדי להתנתק תאים. הימנע מעל trypsinization, כמו זה יכול להשפיע לרעה על הבריאות/הכדאיות של תאים.
  5. לתאי pipet למעלה ולמטה כדי ליצור של תא בודד הבולם, ספירת תאים צפיפות באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית או hemocytometer.
  6. בינתיים, equilibrate בקבוקון NS לטמפרטורת הסביבה.
  7. לחשב את כמות התאים הדרושים עבור זריעה המספר הרצוי של spheroids (וולס) ו- aliquot כדי צינור חרוטי 15 מ"ל. לדוגמה, כדי זרע 96 כולו טוב צלחת עם 5,000 תאים/טוב, aliquot לפחות 5.5 × 10 5 תאים.
  8. התאים לאסוף על ידי צריך שתוציאו ב 500 x g עבור 3 מינימלית בקפידה מחוק לגמרי או decant את תגובת שיקוע, resuspend את התאים-ריכוז של 1.0 x 10 6 תאים למ"ל בתקשורת צמיחה. פיפטה בעדינות באמצעות טיפ pipet רחבים משועמם כדי למנוע הטיה. לדוגמה, resuspend 5.5 x 10 תאים 5 µl 550 של צמיחה מדיה.
  9. מגנט את הכמות הרצויה של תאים באמצעות את NS equilibrated (שלב 1.6).
    1. ישירות להוסיף NS התליה תא בתקשורת צמיחה, להתסיס בעדינות. עבור יעיל מגנטי תיוג של תאים, השתמש 10 µL NS לכל 100 תאי µL (resuspended-עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל).
      הערה: עבור ניסוי טיפוסי, תווית 5.5 × 10 5 Patu8902 תאי µL 550 עם 55 µL NS ו 1.1 × 10 תאים 6 PS1 1100 µL, (בנפרד) עם 110 µL NS-
    2. בעדינות ' היפוך ' צינור כמה פעמים כדי להבטיח תא ההשעיה. באופן זמני, להעביר את התמהיל תא-NS לבאר בודדת של צלחת 24-. טוב. לעשות את זה בנפרד עבור כל סוג התא להיות ממוגנט מכסה צלחת, דגירה תאים בטמפרטורת החדר במשך 2 h ברעידות עדין כדי לאפשר NS איגוד למשטח התא.
      הערה: התרבות ואת וזמינותו של spheroids מתחיל גם מתאי Patu8902 או PS1 לבד, בנוסף spheroids תרבות משותפת החל שניהם תא סוגי premixed לפני הדפסה בכוננים המגנטיים הושגה בהצלחה בשיטה זו בעצמאי ניסויים. שיטה ליצירת תרבות משותפת spheroids מתאי Patu8902 ו- PS2 זו מתוארת להלן והשלבים הבאים.
  10. Pipet למעלה ולמטה התאים magnetized בעדינות כדי לערבב באופן שווה להכין תערובת הבסיס המכיל את המספר הרצוי. עבור זריעה spheroids, השתמש סך של 15,000 תאים (5,000 Patu8902 + 10,000 PS1) ולהתאים את הנפח הכולל של 150 µL לכל טוב של צלחת 96-ובכן.
    הערה: הכרך האחרון בגליל לבאר כל חייב להיות זהה ללא קשר למספר תאים להשתמש.
  11. מניחים צלחת 96-ובכן תא דוחה על גבי הכונן ספרואיד מגנטי 96-ובכן, לוותר על 150 µL של תא לערבב כל טוב. לבחון את התאים לאט גוביינא למרכז של הבאר מעל המגנט. מכסה, דגירה את הצלחת לילה ב- 5% CO 2 מגשים להגדיר ב 37 ° C עם כונן מגנטי ספרואיד עדיין מחוברת. הסר את כונן מגנטי, דגירה לצמיחה נוספת עד 7 ימים-
    הערה: חיוני להשתמש לוחיות גדילה דוחה תא להדפסה ספרואיד באמצעות כוננים ספרואיד מגנטי. ודא כי הכונן ספרואיד עם מגנטים קטנים יותר רזה משמש, לא כונן מחזיק.
  12. לפקח על הגידול של spheroids כל יום. לחדש עם מדיה צמיחה חדשה כל שלושה ימים על ידי הצבת את הצלחת הגידול רכוב על מגנטי מחזיק נסיעה בזווית ושימוש pipet רב-ערוצי כדי למשוך מדיה בילה.
    הערה: תאים Patu8902 ו PS1 משותפת נזרע על תאים 15,000/טוב יגדל לכדי תלת-ממד spheroids בקוטר של 400-600 מיקרומטר תוך 5-7 ימים. בשלב זה spheroids מוכנים מטבולית איפיון, והערכת תרופות יישומים אחרים במורד הזרם.

2. Assay מטבולית של תלת-ממד Spheroids הגידול בלבלב עבור מסלולים ביואנרגיה שימוש במנתח השטף חוץ-תאית

הערה: בסעיף זה, הניתוח של פונקציות מטבוליות של spheroids השימוש של השטף חוץ-תאית מתואר מנתח עם microplates assay שתוכננה במיוחד עבור תלת-ממד spheroids.

  1. כביסה והעברה של spheroids של הצלחות הצמיחה כדי ספרואיד assay microplates.
    הערה: Spheroids עשוי לשמש עבור מבחני מטבולית כאשר הם מגיעים בקוטר של ~ 500 מיקרומטר.
    1. ביום שלפני ביצוע וזמינותו, מימה הדיו בדיקה או חיישן עם calibrant assay (200 µL טוב) בצלחת השירות שסופק, דגירה לילה (4-18 h) ב חממה humidified (הלא-CO 2) שוכן ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. להתכונן המדיום המתאים assay וזמינותו מטבולית הרצוי על-ידי שכשהם התקשורת הבסיס (ראה טבלה של החומרים) עם גם assay 2 מ מגלוטמין עבור בדיקת המאמץ גליקוליזה (GST) או עם 1 מ מ פירובט, 2 מ מגלוטמין ו 10 מ מ גלוקוזה למשך בדיקת המאמץ מיטוכונדריאלי (MST) assay.
      הערה: מודד במנתח השטף חוץ-תאית נשימה מיטוכונדריאלי (OCR) והן גליקוליזה (ECAR) של תאים חיים בתבנית צלחת 96-ובכן. המחירים הללו מספקים סקירה של פונקציה מטבולית הסלולר בדגימות תחת חקירה. נא עיין במדריך ערכות assay לקבלת הוראות מפורטות.
    3. לאחר assay הוספת תוספי מזון ספציפיים (עיין שלב 2.1.1), לחמם את המדיום assay שהושלם בתוך אמבט מים 37 ° C ולהתאים את ה-pH ל 7.4 ± 0.1 עם 0.1N NaOH. המדיום לחמם עד שימוש.
    4. לשקם assay ערכת ריאגנטים במדיום assay מכוילת ריכוזי המניה המומלצת.
      הערה: אלה נעשים ב 10 × הריכוז הסופי הרצוי תוך הבארות. מניות ריכוזי גלוקוז, oligomycin, 2-deoxy-גלוקוז (2-DG) הם 100 מ מ, 100 מיקרומטר ו 500 מ מ, בהתאמה.
    5. Spheroids להתבונן בצלחת גידול תחת אור מיקרוסקופ כדי לבדוק עבור ספרואיד מורפולוגיה ואחידות הכוללת; מבחינת הצורה של structurה' spheroids.
    6. להעביר את הצלחת הגידול על גבי כונן מחזיק מגנטי, בזהירות מחוק לגמרי ~ 120 µL הצמיחה מדיה. בעדינות לשטוף spheroids עם ~ 120 µL assay ומחוממת ו מראש מכוילת המדיה, תשאף וחזור לשטוף את פעמיים. בדוק את spheroids תחת המיקרוסקופ שוב על מנת לוודא כי spheroids לא נשטפו.
    7. להכין את microplate assay ספרואיד על-ידי הוספת 180 µL assay חמים מדיה מכל קידוח.
    8. מוגדר micropipette P20 10 µL ובכושר טיפ רחב משועמם אליו. אם טיפים רחב משועמם אינם זמינים, לחתוך את קצות טיפים פיפטה רגיל עם מספריים נקי או אזמל להרחיב נשא.
      הערה: זה צריך לצמצם הטיה, לשמר את המבנה הכללי של spheroids בעת מועבר assay צלחות.
    9. השתמש משטח חם (37 מעלות צלזיוס) כדי לבצע את ההעברה של spheroids. השתמש של רנטגן הסרט הצופה פני השטח להתחמם עם מנורה לבן-אור כדי לשפר את הניגודיות וסיוע ויזואליזציה של spheroids במהלך תהליך ההעברה.
    10. בקפידה וביופסיה ספרואיד טרום שטף יחיד מ הצלחת הגידול דוחה תא באמצעות micropipette P20 מצויד עם רחב נשא עצה ובעדינות ספרואיד העברה ישירות לתוך המרכז של כל טוב של צלחת assay ספרואיד שבצעתי את חילוף החומרים וזמינותו. לאפשר לכל ספרואיד ליפול בעדינות לתוך המיקרו-החדר המרכזי של כל טוב המשיכה טהור, כדי לאכלס את הצלחת assay.
      הערה: זה בדרך כלל לוקח 5-8 s עבור כל ספרואיד ליפול לתוך מרכז היטב על ידי הכבידה. אין למשוך את פיפטה עד spheroids יש התיישבו בבית הבליעה המיקרו. האם לא יבש spheroids בבארות בפינה של צלחת assay (A1, A12, H1, H12) מאז אלה ישמש בתור רקע בארות.
    11. לנטר את המורפולוגיה והמיקום של כל ספרואיד כדי להבטיח כי כל ספרואיד במרכז של כל טוב. במידת הצורך, התייצב במרכז היטב על ידי כ רפה בעברית החוצה ספרואיד שימוש רחב נשא pipet עצה, ומשקעים הבאים על ידי הכבידה.
    12. ברגע spheroids כל הועברו, למקם את הצלחת assay ב חממה humidified אוויר 37 ° C (הלא-CO 2) עבור שעה אחת לפני assay.
  2. טעינת מחסנית חיישן עם תרכובות וביצוע וזמינותו
    1. × הכן 10 מרוכזים ריאגנטים ספציפיים assay בתקשורת ספציפי assay שמתואר בשלב 2.1.2. לדוגמה, כדי לבצע GST, לשקם גלוקוז, oligomycin ו- 2-די. ג'י בכמויות המומלצות המכונה במדריך וזמינותו. מבחני GST והן MST בוצעו באמצעות Patu8902-PS1 spheroids.
    2. כראוי אוריינט הדיו חיישן עם שורות המסומנות א-H בצד שמאל והנח מדריך טעינת בראש המחסנית חיישן. להבטיח טעינת הנכונה של היציאה הרצוי על-ידי המכוונת המדריך טוען כך האות המתאימה ליציאה ייטענו נמצא בפינה השמאלית העליונה.
    3. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, לוותר על ריאגנטים ישירות ליציאות הזרקה. להחזיק בטעינה מדריכי בעמדה באמצעות קצות האצבעות לאורך כל ההליך.
      הערה: כל ריאגנט להיות מוזרק נמל המומלצת המכונה במדריך וזמינותו. הימנע מיצירת בועות אוויר אך לא הקש על כל חלק של מיכל הדיו כדי להסיר בועות אוויר.
    4. להסיר מדריך טעינת ומיקומם בגובה העיניים עם מחסנית לבחון באופן חזותי הזרקת יציאות עבור טעינת אפילו.
    5. ליצור פרוטוקול עיצוב/מכשיר ניסיוני assay באמצעות הבקר כלי תוכנה גל (מעתה ואילך, ניתוח תוכנה) כמתואר בסעיף 2.3.
  3. Assay עיצוב וביצוע שימוש בתוכנת ניתוח
    1. צור תבנית assay לניסוי
      1. פתח את תוכנת ניתוח ולחץ " תבניות " או לבחירה assay הקיים תבנית. לחץ פעמיים על " תבנית ריקה ".
      2. הגדרת קבוצות ניסיוני, תנאים.
        1. הזרקת להגדיר אסטרטגיות עבור יציאות A, B ו- C. להשאיר ריק port D.
          הערה: עבור GST assay, רק יציאות אלה ייטענו עם גלוקוז, Oligomycin ו- 2-די. ג'י. במקרה של MST assay, oligomycin, FCCP, rotenone ייטענו.
        2. קבע מראש טיפולים אם spheroids שטופלו תרכובות מבחן אחד או יותר של קבוצת הביקורת. הגדרת התקשורת assay לכלול מקור, תוספי תזונה ומידע נוסף-
        3. להגדיר אחד או יותר סוג התא (למשל Patu8902, PS1) את המידע מספר צפיפות ומעבר.
      3. לחץ על " ליצור קבוצות ".
      4. לחץ על " צלחת מפה " טאב ולהקצות קבוצות לצלחת assay המתאימים לעיצוב הניסיונית.
      5. בחר פינת ארבע הבארות בארות רקע. להבטיח כי אין spheroids בבארות האלה.
  4. לרוץ assay במנתח
    1. לחץ על הכרטיסיה כלי פרוטוקול לשמור על ברירת המחדל בפקודות הפרוטוקול על ידי בדיקת " כיול ", " Equilibrate " ו " בסיסית מדידה מחזור ".
    2. לחץ " זריקות " ולהגדיר מורכבים עבור כל יציאה. לערוך מדידה מחזורים עד 6 מחזורים מברירת המחדל 3 מחזורים עבור spheroids. להשאיר את ברירת המחדל 3 דקות לערבב, רגע 0 דקות ושעות 3 דקות מידה.
      הערה: ברירת המחדל מיקס-רגע-למדוד זמנים הם 3 דקות, 0 דקות, 3 דקות, בהתאמה. שלוש מדידות קצב הבסיס נלקחים בדרך כלל לפני הזרקת תרכובת הראשון וזמינותו. מדידות אלה יכולים להיות מכויל, והשתלב כמו לכל הנבחנים.
    3. לסקור את הפרוטוקול ואת סיכום קבוצה.
    4. שמור תבנית עיצוב assay.
    5. המשך כיול assay מראש לאחר הזרקת יציאות שנטענו עם מצעים וזמינותו. להעביר את המחסנית עם לוחית השירות במנתח השטף חוץ-תאית.
      הערה: זה בדרך כלל משלים בתוך 15-20 דקות, מכייל את החיישנים לערוך מדידות OCR, ECAR.
    6. לאחר כיול של המחסנית, להחליף את הצלחת השירות עם לוחית assay מראש ומחוממת המכיל 3D spheroids וליזום וזמינותו. לאחר השלמת את המידות, לייצא את הנתונים בגיליון האלקטרוני או תוכנה graphing וחישובים סטטיסטיים לניתוח הנתונים.

Representative Results

תהליך העבודה הכללי bioprinting מגנטי וניתוח חוץ-תאית השטף של spheroids תלת-ממד
איור 1 מציג סקירה של כל התהליך המתואר פרוטוקול זה. תאי סרטן הלבלב (Patu8902) ואת תאי stellate מופעל (PS1) היו תרבותי של תרביות רקמה מבחנות המכילות המדיה המתאימה צמיחה confluency של 70-80%. תאים היית מנותק מכלי הקיבול תרבות 2D ושטף, צפיפות התאים נקבע, תאים resuspended סוף סוף בתקשורת הצמיחה ב 1 × 106 תאים למ"ל. NS, אסיפה ננו-חלקיק של זהב, תחמוצת ברזל, פולי-L-ליזין השתמשו מגנט את התאים. תאים Patu8902 ו PS1 בנפרד magnetized היו לאחר מכן מעורב, מודפס על גבי לוחיות גדילה דוחה תא 96-ובכן רכוב על כונן ספרואיד מגנטי. לנו יש אופטימיזציה של 15,000 להיות המספר הכולל של תאים עבור זריעה לבאר בודדת (מעורבב עם 10,000 תאים PS1 ליצירת ספרואיד יחיד של תאים 5,000 Patu8902). לאחר דגירה בתנאים המתאימים תרביות רקמה במשך 5-7 ימים, התקבלו spheroids תלת-ממדי, אשר במהלכו הצמיחה של spheroids אלה היה פיקוח והקליט. אחרי כביסה עם מדיה assay, spheroids הועברו פיזית אל microplate ספרואיד לבצע מבחני מטבולית באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית למדידת בו זמנית נשימה מיטוכונדריאלי גליקוליזה.

תרבות, הצמיחה של סרטן הלבלב-פיברובלסט spheroids
כדי לקבל פונקציונליות וחזק spheroids, התא סרטן אפיתל קו Patu8902 ומופעל תאי stellate PS1 היו תרבותי ב RPMI-1640 בתוספת סרום שור בעובר. Pat8902 ותאים PS1 ממוגנט עם NS ואז מעורבבים יחדיו על יחס של 1:2, על מנת זרע סך של 15,000 תאים לכל טוב בצלחת צמיחה. בתוך 24 שעות להדפיס את התאים על גבי הכוננים מגנטי, תאים focalized למרכז של הבאר בדיוק על ראש כל סיכה מגנטי תחת כל טוב. הצמיחה של spheroids Patu8902-PS1 נוטרה על ידי הדמיה בימים 2, 4, 7 ו- 9 לאחר זריעה תאים. איור 2 מציג כימות של קוטר ממוצע של נציג spheroids בנקודות שונות בזמן הנ. הקוטר של spheroids עולה מ מיקרומטר 414 ביום 2 מיקרומטר 596 ביום 7 פוסט הדפסה. היה הבדל משמעותי בין צמיחה בימים 7 ו- 9, ולכן כל עוד ניסויים היה מוגבל ל- 7 ימים ספרואיד הצמיחה. שמנו לב כי spheroids לרכוש מורפולוגיה חדה במיוחד בקצוות החיצוניים, NS למחמיר באופן אחיד יותר מפוזרת בכל רחבי היקף ספרואיד עם עוד ימים בתרבות. אנחנו מעריכים גם את sphericity של spheroids 10 המבוססת על האורך של צירים ראשיים ומשניים שלהם. Sphericity הממוצע הוא 0.92 ± 0.04 Patu8902 לבד (הגידול), ± 0.95 0.04 עבור PS1 (סטרומה) לבד, 0.94 ± 0.02 עבור spheroids תרבות משותפת.

Assay מטבולית פונקציונלי של הלבלב spheroids תלת-ממד באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית
כדי לבדוק את הפונקציונליות של spheroids, אנחנו מועסקים מטבולית וניתוח ביואנרגיה כדי לחקור את המסלולים אנרגיה ב- spheroids. אנחנו ביצעו בדיקת מאמץ גליקוליזה על spheroids תרבותי כפי שתואר לעיל. למטרה זו, spheroids שנוצר מתאי Patu8902 או PS1 בנוסף לאלה הנובע תרבות משותפת של תא שני סוגי היו נענשים וזמינותו. מעניין, כל שלושה סוגים של spheroids, בין אם שמקורם תאים נפרדים או מעורבות, הציג בתגובה וזמינותו GST פונקציונלי ביולוגית. על הזרקת saturating ריכוז הגלוקוז, סוגי spheroids נבדק הצג מגביר מסלול glycolytic כפי שמעידים על עלייה ECAR (איור 3). כאשר, ייצור ATP מיטוכונדריאלי היה עכבות באמצעות oligomycin, הפקת אנרגיה נוטה גליקוליזה ודחפו תאים קיבולת glycolytic מקסימלי, רואים עלייה נוספת ECAR. עיכוב של גליקוליזה באמצעות 2-די. ג'י. גלוקוז אנלוגי המאגד והשמה הקסוקינאז גלוקוז, הביא לירידה ECAR, המאשר כי העלייה מוקדמת ECAR היה בשל פעילות glycolytic. שמנו לב כי spheroids שנבדקו במחקר זה הגיב בצורה כזאת, למרות spheroids לבד PS1 (קוטר ממוצע 250 מיקרומטר) היה אות נמוכה יותר יחסית, כנראה עקב שלהם גודל קטן יותר, נמוך יותר קיבולת glycolytic לעומת סרטן Patu8902 תאים (קוטר ממוצע 600 מיקרומטר). באופן כללי, ECAR גבוהה יותר אות מתא גידול נגזר spheroids לעומת אלה של פיברובלסט PS1 הקטן יחסית נגזר spheroids, אולי ניתן לייחס נטייה מטבולית הטבועה של התאים הסרטניים לכיוון גליקוליזה22, 23. שלושת סוגי spheroids נגזרו זריעה אותו מספר של תאים, למרות הבחנו ספרואיד וריאציה גודל בין כל סוג, עם spheroids לבד PS1 להיות הקטן ביותר, ואחריו spheroids תרבות משותפת, ולהיות spheroids לבד Patu8902 הגדול.

כדי לבדוק תפקוד מיטוכונדריאלי ב- spheroids תלת-ממד, אנחנו נענשים תרבות משותפת spheroids assay MST. MST מודד פרמטרים מרכזיים של פונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת ישירות OCR של תאים (איור 4A ו- 4B). זריקה סדרתי עם תרכובות (oligomycin FCCP, שילוב של rotenone antimycin A) שימש למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלי מרכזיים כגון, ייצור ATP, נשימה מקסימלי, נשימה מיטוכונדריאלי. אלה פרמטרים וקצבי נשימה הבזליים שימשו נוספת לחישוב פרוטון הדליפה וקיבולת הנשימה חילוף (איור 4C). ירידה ב- OCR, בתגובה oligomycin, מעכב של ATP סינתאז (V מורכבים) המתייחס הנשימה מיטוכונדריאלי הקשורים הסלולר ייצור ATP. Spheroids היו מודגרות עם oligomycin עבור משך זמן ארוך יותר לאפשר חדירה מקסימאלית ובזמן תגובה יעילה. זריקה שנייה עם uncoupler FCCP מעוררת את צריכת חמצן מירבית ואת וגידול מקביל OCR. OCR מגורה-FCCP שימש לחישוב לקיבולת בדרכי הנשימה, מידת היכולת של התא כדי להגיב על דרישה מוגברת של אנרגיה. הזריקה השלישית; בשילוב של rotenone, (מתחם אני מעכב), ו- antimycin A (מעכב השלישי מורכב) חוסם נשימה מיטוכונדריאלי, רואים ירידה חדה ב- OCR (איור 4Bאונג >).

בסך הכל, התצפיות שלנו מאשרים את הפונקציונליות של spheroids בתרבית באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית כאמצעי שלהם טביעת רגל/פעילותם המטבולית הן מבחינת הפוטנציאל glycolytic ו מיטוכונדריאלי כמתואר לעיל.

Figure 1
איור 1 . ייצוג סכמטי של המתודולוגיה עבור התרבות ואת וזמינותו של סרטן הלבלב תאים/פיברובלסט spheroids. Patu8902 PS1cells היו תרבותי, trypsinized, שטף, ספרתי. עבור זריעה כל ספרואיד, Patu8902 (5,000 תאים טוב) ו PS1 fibroblasts (10,000 תאים טוב) היו ממוגנטים באמצעות NS ולהדפסה על צלחת הגידול דוחה תא ביום 1. לאחר זריעה, הצלחת הגידול היה רכוב על כונן מגנטי ספרואיד (עם מגנט אחד תחת כל טוב של הגדילה פורמט טוב 96), יורשו תרבות 2-7 ימים לקבל spheroids תלת-ממד. Spheroids וכתוצאה מכך היו נשטפים, להעביר את microplates assay ספרואיד להוציא לפועל את מבחני המטבולית על הכלי השטף חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . הצמיחה של סרטן הלבלב-פיברובלסט spheroids. (א) תמונת הנציגה של Patu8902-PS1 תרבות משותפת ספרואיד המתאים ליום בתרבות מוצג על גבי, הגודל בקוטר של ספרואיד (מיקרומטר) הוא לכמת מתחת. עלייה הדרגתית ספרואיד הגודל של דיפוזיה של חלקיקים NS (נקודות כהה) לאורך כל הנפח שלה ניכרת בין ימים 2 ו- 7. Spheroids הוחזקו בתרבות במשך 2 ימים נוספים לאחר מכן, אשר לא לגרום לעליה משמעותית ספרואיד קוטר. (ב) תמונות נציג של spheroids שמקורם תאים סרטניים (Patu8902), תאי משתית (PS1) ותאים תרבותי משותף (Patu8902 + PS1) מוצג. (ג) Sphericity נתונים מתואר מ 10 spheroids בודדים מכל קבוצה. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . גליקוליזה בדיקת המאמץ (GST) עם הלבלב spheroids. (א) ייצוג סכמטי וזמינותו של פונקציה glycolytic טיפוסי עם פרמטרים שונים assay מתואר. (ב) דוגמה של מבחן GST לבצע spheroids הלבלב תרבותי באמצעות המתודולוגיה המתוארת. גלוקוז רמפות הזרקת למעלה גליקוליזה רואים עלייה ECAR, עם עלייה נוספת על תוספת של oligomycin לנתק מיטוכונדריאלי נשימה. ECAR נופל בתגובה 2 די. ג'י., אנלוגי תחרותי של גלוקוז, על ידי חסימת גליקוליזה. כל spheroids מצוינים שהפגינו בתגובה וזמינותו GST פונקציונלי. (ג) פלט של וזמינותו GST באמצעות מחולל דוחות של היצרן המתארים שלושה פרמטרים עיקריים של GST וזמינותו. קווי שגיאה מייצגים לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4מיטוכונדריאלי בדיקת המאמץ (MST) עם Patu8902-PS1 spheroids. (א) סכמטית ייצוג וזמינותו של טיפוסי מיטוכונדריאלי פונקציה עם פרמטרים שונים assay מתואר. (ב) דוגמה MST על spheroids הגידול בלבלב-פיברובלסט מוצג. (ג) תרבות משותפת spheroids 3D התערוכה מענה פונקציונאלי וזמינותו MST. כצפוי, הפונקציה מיטוכונדריאלי הנמדדת ירידה OCR היה לב כאשר spheroids לערער עם oligomycin, מעכב ATP סינתאז. שימוש FCCP כדי הגדלת זרימת אלקטרונים, גרמו OCR מקסימלי, שהתמוטטה מייד על עיכוב של נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות - קוקטייל של מעכבי מורכבים מיטוכונדריאלי. קווי שגיאה מייצגים לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

באמצעות סרטן הלבלב, 3רואד מוביל הגורם לסרטן מקרי מוות הקשורים בארצות הברית24, כגירסה מודל, שיטה מהירה ועקבית פותחה כדי לגדול ואת וזמינותו spheroids תלת-ממד באמצעות תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו הפעלת fibroblasts הלבלב. שימוש bioprinting מגנטי, spheroids החל בגודל של 400-600 מיקרומטר בקוטר התקבלו. אלה היו נענשים מבחני מטבולית לבחון בהצלחה את הפונקציונליות של spheroids תלת-ממד תרבותי. שיטה זו פשוטה, עקבית, ניתן להתאים בקלות סוגי תאים אחרים.

בעוד מתודולוגיה זו להאיץ ולהוסיף לערך translational של מבחני הופיעה עם spheroids תלת-ממד, ניתן לשפר על ידי פיתוח טכניקות המאפשרות ריבוב של מניפולציה ספרואיד וטיפול. זה אמור לצמצם עוד יותר את הזמן הכולל, עלות ועבודה הדרושים לביצוע וזמינותו. בנוסף, ניתן להשתמש ספרואיד כרכים לנרמל את אותות OCR כפי שדווח על-ידי אחרים6. נפח ספרואיד מנורמל לפי נפח ממוצע של תא יכול לשמש כדי לקבוע OCR בכל תא, אך כיוון הצמיחה של spheroids לא יהיו זהים, חישוב של OCR מוחלטת בכל תא עשויה להיות מאתגרת. כיום, מתודולוגיה זו מוגבל על ידי חוסר של כלי יעיל הטיפול ספרואיד מולטיפלקס, העברה של צלחות צמיחה assay סביבה.

השיטה המתוארת שונה, הותאם טכנולוגיה מגנטית bioprinting, קיבלו משנה תוקף, כדי להראות את הרלוונטיות פונקציונלי על-ידי החלת את spheroids בתרבית וזמינותו מטבולית במורד הזרם. השיטה מספקת כלי חשוב כדי ליצור spheroids חזקים, מעשית ופונקציונלית מכילים שני סוגי תאים עיקריים נמצאו ברוב גידול רקמות, תאים סרטניים, סרטן הקשורים fibroblasts, אשר יכול להיות מועסק על מבחני לניסויים קליניים אחרים, כגון מסכי סמים. בקלות יחסית והיעילות של המתודולוגיה NS היא שיפור משמעותי על פני שיטות אחרות25, כגון התליה זרוק שיטה2,26 ספרואיד הדור.

Spheroids חזקים שנוצר ככזה מספקים במבחנה הגידול מודל הכולל סטרומה תאים, אשר לעתים קרובות חסרים מחקרים 3D תרבות רבים. האפשרויות עבור יישום של דגמי תלת-ממד ספרואיד שנוצר ככזה עצומים. לדוגמה, מודל שכזה יכול להיות מועסק לחקור תא-תא אינטראקציות, ביואנרגיה משמרות וכדי לבדוק רגישות גנטית ואת התלות של משטרי טיפוליים שונים. Spheroids תלת-ממד זה מסכם את הדברים microenvironment הגידול ויוו לשמש כלי מאוד רלוונטי ושימושי עבור סמים הקרנת מחקרים ואלה חוקרים את מנגנוני הפעולה של הרפוי הנוכחי ואת הרומן. מבחני מטבולית בודק את המסלולים אנרגיה באמצעות spheroids תרבויות עם תאים המוטציות עשוי לעזור לשפוך אור חדש לתפקיד. של גנים אלה מסלולים הקשורים ב pathobiology של דגם תלת-ממד הרלוונטיים של סרטן, כמו את spheroids המתוארים במחקר זה.

יישום מוצלח של שיטה זו נשענת בראש ובראשונה על הבריאות של התאים הדרושה להדפסה מגנטי, ובגלל זה צריך להיות שנקטפו, הממוגנטים תא גדל בשלב לוגריתמי. חיוני להשתמש בכונן ספרואיד מגנטי כדי להדפיס תאים magnetized לא הכונן אחזקות, אשר אמור להיות מנוצל רק במהלך הכביסה ספרואיד ומדיה חידוש מדרגות השיטה המתוארת. ההיבט הכי קריטי אחרים לבדיקה מוצלחת של מבחני מטבולית היא לשמור על המורפולוגיה של spheroids במהלך תהליך ההעברה מהצלחת צמיחה לצלחת וזמינותו.

בסך הכל, פרוטוקול זה הוקם עבור הדור של תלת-ממד spheroids המכילים סרטן וגם תאי סטרומה, בעקבות וזמינותו מטבולית עוקבות של spheroids שימוש במנתח השטף חוץ-תאית. התכונות העיקריות של שיטה זו הן כי זה מהיר, להתאמה בקלות ולא עקבי, הרלוונטיים מחקה את microenvironment הגידול ויוו , זולה יחסית, עשוי לשמש כלי חדש עבור הלומדים ביולוגיה הגידול ופיתוח נגד סרטן סוכנים.

Disclosures

המחברים ג'ורג וו רוג'רס, אנדרו Neilson הם עובדי/בעלי המניות של Agilent טכנולוגיות מייצרת ריאגנטים, כלים המשמשים במאמר זה. כל מחברים אחרים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות זירבל שמואל לסיוע וניטור ספרואיד צמיחה של אופטימיזציה של תרבות תנאים. אנחנו אסירי תודה לטכנולוגיות Agilent למתןe96 מנתח את XF סוסון ים, ריאגנטים assay, תובנות טכני אנו מודים גם קוקר Hemant ד ר במכון הסרטן בארטס בבריטניה למתן התאים PS1. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי קרן Magowitz ראיתי עבור עמוד עד סרטן-סרטן בריטניה-: טיירגרטן קרן הלבלב סרטן החלום צוות מחקר במענק מחקר ומחקר סרטן הלבלב (גרנט המספר: SU2C-AACR-DT-20-16). לעמוד עד סרטן היא תוכנית של קרן תעשיית הבידור. מענקי מחקר מנוהלים על ידי האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, מדעית, שותפו של SU2C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Sigma 25300-054
96 well cell repellant plate USA Scientific/ Griener Bio-One 655970 spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002
D-Glucose Sigma D9434
DPBS Gibco 14190-144
Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103020-100
L-Glutamine Sigma 59202C
Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL  Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4 °C
Patu8902 cells Laboratory Stock pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells Laboratory Stock activated pancreatic stellate cells
RPMI1640 Gibco 11875-093 growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer Agilent Technologies extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate Sigma S8636
XF Base media Agilent Technologies 102365-100 base media for metabolic assays on XFe96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5, (3), 239-248 (2011).
  2. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  3. Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22, (2), 151-152 (2004).
  4. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
  5. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33, (4), 1837-1843 (2015).
  6. Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532, (7598), 255-258 (2016).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130, (4), 601-610 (2007).
  8. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  9. Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5, (4), 291-296 (2010).
  10. Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8, (10), 1940-1949 (2013).
  11. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
  12. Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
  13. Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19, (9), 665-675 (2013).
  14. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19, (5), 336-344 (2013).
  15. Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
  16. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
  17. Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20, (3), 422-429 (2015).
  18. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
  19. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
  20. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
  21. Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175, (2), 636-648 (2009).
  22. Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66, (18), 8927-8930 (2006).
  23. Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13, (3), 170-188 (2013).
  24. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67, (1), 7-30 (2017).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats