Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Published 8/23/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Cancer Research
 

Summary

Her er en metode beskrevet for utarbeidelse av 3-dimensjonale (3D) spheroid co kultur av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster, etterfulgt av måling av metabolske funksjoner bruker en ekstracellulære flux analyserer.

Cite this Article

Copy Citation

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mange typer kreft, inkludert bukspyttkjertelkreft, har en tett fibrotiske stroma som spiller en viktig rolle i svulst progresjon og invasjonen. Aktivert kreft tilhørende fibroblaster er en nøkkelkomponent i det svulst stroma som samhandler med kreftceller og støtter deres vekst og overlevelse. Modeller som recapitulate samspillet av kreftceller og aktivert fibroblaster er viktige redskaper for å studere stromal biologi og for utvikling av antitumor midler. Her er en metode beskrevet for rask generasjon av robust 3-dimensjonale (3D) spheroid co kultur av kreft i bukspyttkjertelen celler og aktivert bukspyttkjertelen fibroblaster som kan brukes for biologiske studier. I tillegg er beskrives bruk av 3D spheroids utfører funksjonelle metabolske analyser å undersøke mobilnettet bioenergi veier med en ekstracellulære flux analyserer sammenkoblet med en spheroid-microplate. Kreft i bukspyttkjertelen celler (Patu8902) og aktivert bukspyttkjertelen fibroblast celler (PS1) var co kultivert og magnetisert bruker en biokompatible hydrogenion samling. Magnetisert celler var raskt bioprinted bruker magnetisk stasjoner i 96 godt format, i vekst medier til å generere spheroids med diameter varierer mellom 400-600 µm innen 5-7 dager etter kultur. Funksjonelle metabolske analyser ved hjelp av Patu8902-PS1 spheroids var deretter gjennomført med den ekstracellulære flux teknologien for å undersøke mobilnettet energisk veier. Metoden her er enkel, tillater konsekvent generering av kreft celle-fibroblast-formet co kulturer og kan potensielt tilpasset andre kreft celletyper på optimalisering av gjeldende beskrevet metodikken.

Introduction

I det siste tiåret, er mange i vitro 3D modeller utviklet for å recapitulate og undersøke i vivo svulst biologi, microenvironment og vekst betingelsene av kreft celler1,2. Todimensjonal (2D) monolayer celle kultur systemer med uniform eksponering biokjemiske faktorer og investigational stoffer ikke replikere innfødt 3D svulst-stromal samhandlingene utsatt til en gradient forbindelser spre gjennom den ekstracellulære Matrix proteiner (EFM)3,4. Således, i forhold til 2D vev kultur modeller, 3D kreft modeller har dukket opp for å vise bedre potensielle på simulere svulst microenvironment og tjente som viktige redskaper for å bedre forstå i vivo svulst egenskaper, for eksempel hypoksi, desmoplasia, dormancy, narkotika penetrance, giftighet og terapeutiske motstand5,6. Dette har 3D modeller potensial til å bygge bro over gapet mellom 2D cellekultur og hele dyremodeller mimicking i vivo svulst funksjoner, samtidig er relativt billig og optimalisert for rask generasjon og konsistens. Disse fordelene er utnyttet for å akselerere translasjonsforskning i mange områder, inkludert kreft biologi, morphogenesis og vev engineering7,8.

I en bølge av utvikling 3D vev kultur metoder, Maglev teknikker har nylig blitt utviklet og beskrevet for vekst, assaying og imaging av spheroids avledet fra ulike cellen typer9,10, 11 , 12. magnetiske 3D bioprinting utnytter bruk av magnetiske ingeniør vev av magnetizing celler med biokompatible nanopartikler og skrive dem i flere godt formater. Dette gir rask produksjon av konsekvent, nær identisk 3D spheroids, som kan bli brukt og ansatt for en mengde nedstrøms programmer for biokjemisk og Biofysiske etterforskning10. Her har vi tilpasset magnetiske bioprinting teknikken bruker en biokompatible materiale kalt Nanoshuttle (NS) består av jernoksid, poly L-lysine og gull nano-partikler merke kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster. NS festes elektrostatisk plasma membranen, er ikke kjent binde seg til noen bestemt reseptorer og utgivelser av cellen overflaten innen en uke. Det krever svært lavt magnetisk styrker (30pN), nok til ett, men ikke skade celler og påvirker ikke cellen levedyktighet, metabolisme eller spredning å gjøre det ekstremt biokompatible for 3D kulturer10,13,14 ,15.

I denne studien beskriver bruker bukspyttkjertelkreft som et eksempel og modell, vi generasjon og metabolske analysen av 3D kreft celle-fibroblast spheroids. Fra celler kultivert i 2D skip, illustrere vi kultur og vekst forholdene i bukspyttkjertelen svulst-fibroblast co kultur spheroids bruker magnetisk bioprinting. Kultivert spheroids ble da brukt i funksjonelle metabolske analyser ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer, en teknologi vist å samtidig måle to store energi produserende veier, Glykolysen og mitokondrie åndedrett, i en rekke live celler og vev16,17,18,19,20. Glykolysen ble målt som en endring i ekstracellulære forsuring rate (ECAR), mens mitokondrie åndedrett eller oxidative fosforylering ble målt som oksygen forbruksraten (OCR). Vi foreslår at denne metoden utviklet for bukspyttkjertelen svulst spheroids kan tjene som en ryggrad for optimalisering og 3D svulst spheroid generasjon og analysen til andre cellen/vev-typer.

Protocol

1. kultur av bukspyttkjertelkreft 3D Spheroids bruker magnetisk Bioprinting

  1. ved hjelp av standard steril vev kultur technique, kultur cellene rundt i en MT75 bolle til en confluency på 70-80% i riktig vekst medier.
    Merk: Vanligvis 5-7 × 10 6 celler fra en 70-80% confluent MT75 kolbe ble høstet. To forskjellige celletyper ble brukt i denne studien - Patu8902 (bukspyttkjertelen tumorceller) og PS1 celler (aktivert bukspyttkjertelen stellate celler 21). Begge linjer ble kultivert i Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) med 10% (v/v) fetal bovin serum(FBS), 1 × penicillin-streptomycin (p/s).
  2. Vask celler når med 5 mL av Dulbecco ' s fosfat bufret saline(DPBS).
  3. Koble celler fra plast overflaten av trypsinizing med 2 mL 0,05% Trypsin-EDTA i 5-10 min på 37 ° C. Sjekk for cellen avdeling under et mikroskop.
  4. Deaktivering trypsin ved tillegg av 8 mL vekst medier frittliggende celler. Unngå over trypsinization, da dette kan påvirke helse/levedyktigheten til celler.
  5. Pipetter celler opp og ned for å generere en enkeltcelle suspensjon og telle celle tetthet med en automatisert celle teller eller en hemocytometer.
  6. i mellomtiden equilibrate ampuller med NS til omgivelsestemperaturen.
  7. Beregne mengden celler kreves for såing ønsket antall spheroids (wells) og aliquot til en ny 15 mL konisk tube. For eksempel til frø en hele 96 godt plate med 5000 celler/Vel, aliquot minst 5.5 × 10 5 celler.
  8. Samle celler av sentrifugering 500 x g for 3 min. nøye Sug opp eller Dekanter nedbryting og resuspend cellene i en konsentrasjon av 1.0 x 10 6 celler/mL i vekst medier. Pipetter forsiktig med et bredt lei Pipetter tips unngå klipping. For eksempel resuspend 5.5 x 10 5 celler i 550 µl av veksten medier.
  9. Magnetize ønsket antall celler ved hjelp av equilibrated NS (trinn 1.6).
    1. Direkte legge NS til celle suspensjon i vekst medier og agitere forsiktig. For effektiv magnetiske merking av celler, bruke 10 µL NS per 100 µL celler (resuspended på 1 x 10 6 celler/mL).
      Merk: For en typisk eksperiment, etiketten 5.5 × 10 5 Patu8902 celler i 550 µL med 55 µL NS og 1.1 × 10 6 PS1 celler i 1100 µL, (separat) med 110 µL NS.
    2. Forsiktig Inverter tube noen ganger å sikre celle suspensjon. Midlertidig, overføre celle-NS blandingen inn i en enkelt brønn av en 24-vel plate. Gjøre separat for hver celle type til magnetized. Dekkramme og Inkuber celler ved romtemperatur for 2t med mild risting for å tillate NS binde seg til celleoverflaten.
      Merk: Kultur og analysen av spheroids starter fra Patu8902 eller PS1 alene celler, i tillegg til co kultur spheroids starter med både celle typer Forhåndsblandet før utskrift på magnetiske disker var oppnådd med denne metoden i selvstendig eksperimenter. En metode for å generere co kultur spheroids fra Patu8902 og PS2 celler er beskrevet nedenfor i de etterfølgende trinnene.
  10. Pipetter opp og ned magnetisert cellene forsiktig å blande jevnt og forberede en master blanding som inneholder ønsket celle nummer. Bruker totalt 15 000 celler (5000 Patu8902 + 10.000 PS1) og justere til et totalt volum på 150 µL per brønn av en 96-brønns plate seeding spheroids,.
    Merk: Det siste bindet utlevert i hver brønn må være den samme uavhengig av antall celler brukes.
  11. Plasserer en celle frastøtende 96-brønns plate på 96-brønns magnetiske spheroid stasjonen og dispensere 150 µL av cellen i hver brønn. Observere cellene sakte samle til midten av godt over magnet. Dekk og ruge platen overnatter i en 5% CO 2 inkubator satt på 37 ° C med magnetiske spheroid stasjonen fortsatt festet. Fjern magnetiske stasjonen og ruge for videre vekst i opptil 7 dager.
    Merk: Er det avgjørende å bruke celle frastøtende vekst plater for spheroid utskrift via magnetisk spheroid stasjoner. Sikre at brukes spheroid stasjonen tynnere mindre magneter, ikke holde stasjonen.
  12. Overvåke veksten av spheroids hver dag. Fylle med fersk vekst medier hver tre dager ved å plassere vekst plate montert på magnetiske holder stasjonen i en vinkel og bruke en flerkanals Pipetter for å trekke ut brukte media.
    Merk: Patu8902 og PS1 celler co seeded på 15.000 celler/godt vil vokse i 3D spheroids med en diameter på 400-600 µm innen 5-7 dager. På dette punktet spheroids er klar for metabolske karakteristikken, stoffet evaluering og andre nedstrøms programmer.

2. Metabolsk analysen av 3D bukspyttkjertelen svulst Spheroids for bioenergi veier med den ekstracellulære Flux Analyzer

Merk: I denne delen, analyse av metabolske funksjoner spheroids bruker en ekstracellulære fluks analyserer med analysen microplates spesielt utformet for 3D spheroids er beskrevet.

  1. Vask og overføring av spheroids fra vekst plater til spheroid analysen microplates.
    Merk: Spheroids kan brukes til metabolske analyser når de når en diameter på ~ 500 µm.
    1. Dagen før du utfører analysen, hydrat sonde eller sensor kassetten med analysen calibrant (200 µL/vel) i medfølgende verktøyet platen og ruge overnatting (4-18 h) i en fuktet inkubator (ikke-CO 2) satt på 37 ° C.
    2. Forberede aktuelle analysen mediet ønsket metabolske analysen ved supplere base media (se tabell for materiale) med enten 2 mM L-glutamin Glykolysen stress test (GST) analysen eller 1 mM pyruvate, 2 mM L-glutamin og 10 mM glukose for en Mitokondrielt stress test (MST) analysen.
      Merk: Den ekstracellulære flux analyzer måler både mitokondrie åndedrett (OCR) og Glykolysen (ECAR) av levende celler i 96-brønnen plate format. Disse prisene gir en oversikt over cellulære metabolske funksjoner i prøvene under etterforskning. Vennligst henvis til bruksanvisningen i analysen ideene for detaljerte instruksjoner.
    3. Etter tilføyer analysen spesifikke kosttilskudd (se trinn 2.1.1), varme supplert analysen mediet i et 37 ° C vannbad og justere pH til 7,4 ± 0,1 med 0.1N NaOH. Holde medium varme til bruk.
    4. Rekonstituer analysen kit reagenser i kalibrert analysen medium til anbefalte lager konsentrasjoner.
      Merk: Disse er laget på 10 × siste konsentrasjonen ønsket i brønnene. Lager konsentrasjoner for glukose, oligomycin og 2-deoxy-glukose (2-DG) er 100 mM, 100 µM og 500 mM, henholdsvis.
    5. Observere spheroids i vekst plate under en lys mikroskop for å sjekke for spheroid morfologi og generelle ensartethet, i forhold til form og structurav spheroids.
    6. Overføre vekst platen på en magnetisk holder stasjon og Sug opp nøye ~ 120 µL vekst medier. Forsiktig vaske spheroids med ~ 120 µL varmet og pre kalibrert analysen medier, Sug opp og gjenta vask to ganger. Kontroller spheroids under mikroskopet igjen slik at spheroids ikke er vasket bort.
    7. Forberede spheroid analysen microplate ved å legge til 180 µL varm analysen media i hver brønn.
    8. Satt P20 brønnene til 10 µL og passer et bredt lei tips til den. Hvis bred lei tips ikke er tilgjengelig, kuttet av tips av vanlige pipette-spisser med ren saks eller skalpell utvide bar.
      Merk: Dette bør redusere klipping og bevare samlede morfologi av spheroids mens overføres å analysen plater.
    9. Bruker en varm (37 ° C) overflate for å gjennomføre overføringen av spheroids. Bruk en X-ray film seer overflate varmet med hvitt lys lampe å forbedre kontrasten og hjelpe visualisering av spheroids under overføringsprosessen.
    10. Nøye leveringstanken en enkelt pre vasket spheroid fra cellen frastøtende vekst platen bruker P20 brønnene utstyrt med en bar tips og forsiktig overføring spheroid direkte i midten av hver brønn av en spheroid analysen plate for å gjennomføre den metabolske analysen. La hver spheroid å forsiktig faller inn i det sentrale mikro-kammeret i hver brønn ved ren tyngdekraften til å fylle tallerkenen analysen.
      Merk: Det tar vanligvis 5-8 s hver spheroid faller i midten av brønnen av tyngdekraften. Ikke dra ut Pipetter til spheroids har slått seg ned i mikro-kammeret. Gjør ikke innskudd spheroids i brønnene som 4 hjørnet av analysen plate (A1, A12, H1, H12) disse skal brukes som bakgrunn brønner.
    11. Overvåke morfologi og plasseringen av hver spheroid å sikre at hver spheroid er midt i hver brønn. Eventuelt flytte til midten av vel av aspirating ut formet med en bar Pipetter tips, og påfølgende deponering av tyngdekraften.
    12. Når alle spheroids er overført, plassere analysen platen i en 37 ° C fuktet luft inkubator (ikke-CO 2) for én time før analysen.
  2. Lasting sensor kassetten med forbindelser og utfører analysen
    1. forberede 10 × konsentrert analysen bestemt reagenser i analysen bestemt media beskrevet i trinn 2.1.2. For eksempel for å gjennomføre GST, Rekonstituer glukose, oligomycin og 2-DG i anbefalte mengder i analysen manualen. Både GST og MST analyser ble utført ved hjelp av Patu8902-PS1 spheroids.
    2. Riktig orientere sensor kassetten med rader merket A-H på venstre side, og Plasser en lasting guide på sensoren kassetten. Sikre riktig lasting av ønsket porten ved orientere lasting guide slik at brevet tilsvarer porten lastes på det øvre igjen hånd avkrok.
    3. Bruker en flerkanals pipette, dispensere reagenser direkte til injeksjon porter. Holde lasting guider i posisjon ved hjelp av fingertuppene hele prosedyren.
      Merk: Injiseres hver reagens en anbefalt port referert i analysen manualen. Unngå å opprette luftbobler, men ikke trykk noen del av patronene for å fjerne luftbobler.
    4. Fjerne lasting guide og posisjon i øyehøyde med patron å visuelt inspisere injeksjon portene selv lasting.
    5. Opprette eksperimentelle analysen design/instrument protokollen bruker instrument kontrolleren Wave programvare (heretter, analyseprogramvare) som beskrevet i Seksjon 2.3.
  3. Analysen design og gjennomføring bruker analyseprogramvare
    1. opprette en analysen mal for eksperimentet
      1. Åpne analyseprogramvare og klikk " maler " eller velg en eksisterende analysen mal. Dobbeltklikk på " tom mal ".
      2. Definere eksperimentelle grupper og forhold.
        1. Definere injeksjon strategier for porter A, B og C. forlate port D tomt.
          Merk: For GST analysen, bare disse portene vil bli lastet med glukose, Oligomycin og 2-DG. Ved MST analysen, oligomycin, FCCP og rotenon lastes.
        2. Definere pre behandlinger hvis spheroids ble behandlet med én eller flere test forbindelser og kontrollgruppen. Definere analysen media å inkludere kilde, kosttilskudd og annen informasjon som.
        3. Definere én eller flere celle type (f.eks Patu8902, PS1) ser den tetthet og passasje informasjonen.
      3. Klikk " generere grupper ".
      4. Klikk " Plate kart " kategorien og tilordne til analysen platen tilsvarer eksperimentell design.
      5. Velg fire hjørne brønnene som bakgrunn brønner. Sikre at det er ingen spheroids i disse brønnene.
  4. Kjør analysen på analyserer
    1. Klikk på kategorien Instrument protokollen behold standardnavnet protokollen kommandoene ved å sjekke " Kalibrer ", " likevekt " og " planlagte målesyklusen ".
    2. Klikk " injeksjoner " og definere sammensatte for hver port. Rediger målesykluser til 6 sykluser fra standard 3 sykluser for spheroids. Holde den standard 3 min blanding, 0 min vente og 3 min mål ganger.
      Merk: Standard mix-vent-mål times er 3 min, 0 minutter, 3 min, henholdsvis. Tre basale hastighet målinger er vanligvis tatt før injeksjon av første analysen sammensatte. Disse målingene kan være kalibrert og readjusted som eksperimentell design.
    3. Gjennom protokollen og gruppe Sammendrag.
    4. Lagre analysen utformingsmal.
    5. Fortsette å pre analysen kalibrering når injeksjon porter er lastet med analysen underlag. Overføre kassetten med verktøyet platen til den ekstracellulære flux analyzer.
      Merk: Dette vanligvis fullført innen 15-20 min og kalibrerer sensorer for å utføre OCR og ECAR målinger.
    6. Etter kalibrering av kassetten, erstatte verktøyet platen med forvarmes analysen platen inneholder 3D spheroids og starte analysen. Når målene er ferdig, eksportere dataene til regnearket eller grafisk og statistisk programvare for å analysere dataene.

Representative Results

Den generelle arbeidsflyten for magnetisk bioprinting og ekstracellulære flux analyse av 3D spheroids
Figur 1 viser en oversikt over hele prosessen beskrevet i denne protokollen. Kreft i bukspyttkjertelen celler (Patu8902) og aktivert stellate celler (PS1) ble kultivert i vev kultur flasker som inneholder riktige vekst medier til en confluency på 70-80%. Cellene ble løsrevet fra 2D kultur fartøyet og vasket, cellen ble bestemt og celler endelig resuspended i vekst medier på 1 × 106 celler/mL. NS, en hydrogenion samling bestående av gull, jernoksid og poly-L-lysine ble brukt til å magnetize celler. Individuelt magnetisert Patu8902 og PS1 celler ble deretter blandet og trykt på 96-brønns celle frastøtende vekst plater montert på en magnetisk spheroid stasjon. Vi har optimalisert 15.000 å være totalt antall celler for såing en enkelt brønn (5000 Patu8902 celler blandet med 10.000 PS1 celler til å generere en enkelt spheroid). Etter inkubasjon vilkår aktuelt vev kultur for 5-7 dager, ble 3-dimensjonale spheroids innhentet, hvor veksten av disse spheroids var overvåket og spilt inn. Etter vask med analysen media, overført spheroids fysisk til en spheroid microplate å utføre metabolske analyser bruker en ekstracellulære flux analyserer for samtidig måling av Glykolysen og mitokondrie åndedrett.

Kultur og vekst av bukspyttkjertelen svulst-fibroblast spheroids
For å få funksjonell og robust spheroids, epithelial kreftcelle linje Patu8902 og aktivert stellate celler PS1 ble kultivert i RPMI-1640 supplert med fosterets bovin serum. Pat8902 og PS1 celler magnetisert med NS ble deretter blandet sammen i forholdet 1:2, så frø totalt 15 000 celler per brønn i en vekst plate. Innen 24 timer av utskrift cellene på magnetiske disker, celler focalized til midten av brønnen nøyaktig på hver magnetiske pin under hver brønn. Veksten av Patu8902-PS1 spheroids ble overvåket av tenkelig på dager 2, 4, 7 og 9 etter seeding celler. Figur 2 viser kvantifisering av gjennomsnittlig diameter på representant spheroids på ulike tidspunkt ovenfor. Diameteren på spheroids øker fra 414 µm på dag 2 til 596 µm dag 7 innlegg utskrift. Det var ingen signifikant forskjell mellom vekst på 7 og 9, og dermed all videre eksperimentering var begrenset til 7 dager spheroid vekst. Vi merket at spheroids kjøpe en skarpere morfologi spesielt rundt ytterkantene og NS er stadig mer jevnt diffust hele volumet av spheroid med dager i kultur. Vi har også anslått sphericity av 10 spheroids basert på lengden av deres overordnede og underordnede akser. Den gjennomsnittlige sphericity er 0,92 ± 0,04 for Patu8902 alene (tumor), 0,95 ± 0,04 for PS1 (stromal) alene og 0.94 ± 0,02 for co kultur spheroids.

Funksjonelle metabolske analysen av bukspyttkjertelen 3D spheroids ved hjelp av ekstracellulære flux analyzer
For å teste funksjonaliteten til spheroids, vi ansatt metabolske og bioenergi analyse å undersøke energi stier i spheroids. Vi har gjennomført en Glykolysen test på spheroids kultivert som beskrevet ovenfor. Dette ble spheroids generert fra enten Patu8902 eller PS1 celler i tillegg til de som følge av en co kultur de to celletyper utsatt for analysen. Interessant, utstilt alle tre typer spheroids, enten som stammer fra forskjellige eller blandet celler, en biologisk funksjonelle svar GST analysen. Ved å injisere en mette konsentrasjon av glukose, testet hvilke spheroids Vis øker i den glycolytic sti som gjenspeiles av en økning i ECAR (Figur 3). Når, mitokondrie ATP produksjonen var hemmet bruker oligomycin, energiproduksjon skifter til Glykolysen og presset celler til maksimal glycolytic kapasitet, som ytterligere økning i ECAR. Hemming av Glykolysen bruker 2-DG, en glukose analoge som konkurransedyktig binder glukose hexokinase, resulterte i en reduksjon i ECAR, bekrefter at tidligere økningen i ECAR skyldtes glycolytic aktivitet. Vi merket at spheroids testet i denne studien svarte på denne måten, selv om PS1 alene spheroids (gjennomsnittlig diameter 250 µm) hadde et relativt lavere signal, muligens på grunn av deres mindre størrelse og lavere glycolytic kapasitet sammenlignet Patu8902 kreft celler (gjennomsnittlig diameter 600 µm). Generelt, en høyere ECAR signal fra svulst celle avledet spheroids sammenlignet med de fra relativt mindre PS1 fibroblast avledet spheroids, muligens kunne tilskrives kreftcellene iboende metabolske helling mot Glykolysen22, 23. Alle tre typer spheroids var avledet fra såing samme antall celler, selv om vi merke spheroid størrelse variasjon mellom hver type, med PS1 alene spheroids er de minste, fulgt av co kultur spheroids, og Patu8902 alene spheroids den største.

For å teste mitokondrie funksjonen i 3D spheroids, underlagt vi co kultur spheroids en MST-analysen. MST måler nøkkelparametere mitokondrie funksjonen ved å måle direkte OCR celler (Figur 4A og 4B). En seriell injeksjon med forbindelser (oligomycin, FCCP og en blanding av rotenon og antimycin A) ble brukt til å måle mitokondrie nøkkelparameterne som ATP produksjon, maksimal åndedrett og ikke-Mitokondrielt åndedrett. Disse parameterne og basale åndedrett priser ble videre brukt til å beregne proton lekkasjen og ledig åndedretts kapasitet (figur 4C). En nedgang i OCR svar på oligomycin, en inhibitor av ATP syntase (komplekse V) samsvarer med mitokondrie åndedrett knyttet mobilnettet ATP produksjon. Spheroids ble inkubert med oligomycin for en lengere varigheten slik at maksimal gjennomtrenging og effektiv responstid. En andre injeksjon med uncoupler FCCP stimulerer maksimalt oksygenopptak og en tilsvarende økning i OCR. Det FCCP-stimulert OCR ble brukt til å beregne ledig åndedretts kapasitet, et mål på evnen til cellen for å svare på økt energietterspørsel. Tredje injeksjon; en blanding av rotenon, (en kompleks jeg hemmer), og antimycin A (en kompleks III hemmer) blokkerer mitokondrie åndedrett, sett på som en skarp nedgang i OCR (Figur 4BOng >).

Samlet bekrefte våre observasjoner funksjonaliteten til kulturperler spheroids bruker en ekstracellulære flux analyserer som et mål på sine metabolske fotavtrykk/aktivitet både i glycolytic og mitokondrie potensialet som beskrevet ovenfor.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av metodikken for kultur og analysen av kreft i bukspyttkjertelen celler/fibroblast spheroids. Patu8902 og PS1cells ble kultivert, trypsinized, vasket og telt. For frø hver spheroid, Patu8902 (5000 celler/vel) og PS1 fibroblaster (10 000 celler/vel) var magnetisert bruker NS og skrives ut på en celle frastøtende vekst plate for dag 1. Etter seeding, ble vekst platen montert på en magnetisk spheroid stasjon (med en magnet under hver brønn av 96 godt format vekst platen) og tillatt kultur i 2-7 dager for å få 3D spheroids. De resulterende spheroids ble vasket og overført til spheroid analysen microplates å gjennomføre de metabolske analyser på ekstracellulære flux instrumentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Veksten av bukspyttkjertelen svulst-fibroblast spheroids. (A) et representativt bilde av Patu8902-PS1 co kultur-formet som tilsvarer dagen i kultur vises øverst og størrelsen i diameter spheroid (µm) er kvantifisert nedenfor. Progressiv økning i spheroid størrelse og spredning av NS partikler (mørke prikker) hele volumet er tydelig mellom dager 2 og 7. Spheroids ble holdt i kultur for ytterligere 2 dager etter dette som ikke resulterte i en betydelig økning i spheroid diameter. (B) representant bilder av spheroids fra kreftceller (Patu8902), stroma cellene (PS1) og co kultivert (Patu8902 + PS1) vises. (C) Sphericity data skildres 10 personlige spheroids fra hver gruppe. Feilfelt representerer standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Glykolysen Stress Test (GST) med bukspyttkjertelen spheroids. (A) skjematisk fremstilling av en typisk glycolytic funksjonen analysen med forskjellige analysen parametere avbildet. (B) et eksempel på en GST test utført på bukspyttkjertelen spheroids kultivert bruker metodikk beskrevet. Glukose injeksjon ramper opp Glykolysen sett på som en økning i ECAR, ytterligere økning på tillegg av oligomycin å stenge mitokondrie åndedrett. ECAR faller som svar på 2-DG, en konkurransedyktig analog av glukose, ved å blokkere Glykolysen. Alle spheroids er kjent viser en funksjonell svar GST analysen. (C) en produksjon av GST analysen bruker produsentens rapportgenerator viser tre store parameterne for GST analysen. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4Mitokondrie Stress Test (MST) med Patu8902-PS1 spheroids. (A) skjematisk fremstilling av en typisk mitokondrie funksjonen analysen med ulike analysen parametere er avbildet. (B) et eksempel på en MST for bukspyttkjertelen svulst-fibroblast spheroids vises. (C) co kultur 3D spheroids utstilling funksjonelle svar på MST analysen. Som forventet, ble det bemerket mitokondrie funksjonen målt som en nedgang i OCR når spheroids ble utfordret med oligomycin, en ATP syntase inhibitor. Bruke FCCP å rampen opp elektron flyt resulterte i maksimal OCR, som umiddelbart kollapset etter hemming av mitokondrie åndedrett bruker en - cocktail av mitokondrie komplekse hemmere. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bruke bukspyttkjertelkreft, 3rd ledende årsak til kreft dødsfall i USA24, som eksempel og modell, en rask og konsekvent metode ble utviklet for å vokse og analysen 3D spheroids bruker co kulturen av kreft i bukspyttkjertelen celler og aktivert bukspyttkjertelen fibroblaster. Bruker magnetisk bioprinting, ble spheroids varierer i størrelse fra 400-600 µm i diameter innhentet. Dette ble utsatt for metabolske analyser vellykket teste funksjonaliteten til de kultiverte 3D spheroids. Denne metoden er enkel, konsekvent og kan lett tilpasses andre celletyper.

Mens denne metodikken vil akselerere og legge til translasjonsforskning verdien av analyser utført med 3D spheroids, kan den forbedres ved å utvikle teknikker som tillate multipleksing av spheroid manipulasjon og håndtering. Dette bør ytterligere redusere den totale tiden, kostnader og arbeid pålagt å utføre analysen. I tillegg kan spheroid volumer brukes til å normalisere OCR signaler som rapportert av andre6. Spheroid volum normalisert av gjennomsnittet mengder en celle kan brukes til å bestemme OCR per celle, men siden veksten av spheroids ikke vil være identisk, beregne en absolutt OCR per celle kan være utfordrende. Foreløpig er denne metodikken begrenset av mangel på et effektivt verktøy å multiplex spheroid håndtering og overføre fra vekst platene til analysen miljø.

Metoden beskrevet er endret og tilpasset fra den magnetiske bioprinting teknologien, og ytterligere validert for å vise funksjonelle relevansen ved å bruke de kultiverte spheroids en nedstrøms metabolske analysen. Metoden gir et viktig verktøy for å generere robust, levedyktig og funksjonelle spheroids som inneholder de to store celletyper i de fleste tumor vev, kreftceller og kreft tilhørende fibroblaster, som kan brukes for andre investigational analyser, som narkotika skjermer. Den relative lette og effektiviteten av NS metodikken er en stor forbedring over andre metoder25, som hengende slippe metoden2,26 spheroid generasjon.

Robust spheroids generert som gir en i vitro svulst modell som inkluderer stromal celler, som ofte mangler mange 3D kulturstudier. Mulighetene for bruk av 3D-formet modeller generert som er stort. Slike modeller kan for eksempel brukes til å undersøke celle-celle interaksjoner, bioenergi Skift og teste genetisk mottakelighet og avhengighet av ulike terapeutiske regimer. 3D spheroids som recapitulate i vivo svulst microenvironment tjene som svært relevant og nyttig verktøy for narkotikarelaterte screening studier og de undersøkt virkningsmekanismer av gjeldende og romanen therapeutics. Metabolsk analyser sondering energi trasé bruker spheroids kulturer mutant cellene kan hjelpe kaste nytt lys inn i rollen de gener og relaterte stier i pathobiology i en relevant 3D modell av kreft, som spheroids som er beskrevet i denne studien.

Bruk av denne metoden bruker fremst helse celler kreves for magnetisk utskrift, derfor celle vokser i logaritmisk fase skal høstes og magnetized. Det er viktig bruke magnetiske spheroid stasjonen magnetisert celler og ikke holde kjøre, som skal benyttes bare under spheroid vask og media fylle trinnene av metoden beskrevet. Den andre viktigste aspektet for vellykket avlesning av metabolske analyser er å opprettholde morfologi av spheroids under overføringsprosessen fra vekst platen til analysen plate.

Samlet er denne protokollen etablert for generering av 3D spheroids som inneholder både kreft og stromal celler, etter påfølgende metabolske analysen av spheroids med den ekstracellulære flux analysatoren. De viktigste funksjonene i denne metoden er at det er rask, lett tilpasses og konsekvent, gjelder og etterligner i vivo svulst microenvironment, er relativt billig og kan tjene som et nytt verktøy for å studere svulst biologi og utvikle anticancer agenter.

Disclosures

Forfatterne George W. Rogers og Andrew Neilson er ansatte/aksjonærer Agilent teknologier som produserer reagenser og instrumenter brukes i denne artikkelen. Alle andre forfattere erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Samuel Zirbel for hjelp til å optimere oppdrettsforholdene og overvåking spheroid vekst. Vi er takknemlige til Agilent teknologier for SeaHorse XFe96 analyzer, analysen reagenser og teknisk innsikt. Vi også takke Dr. Hemant Kocher Barts Cancer Institute i Storbritannia for å gi PS1 cellene. Dette arbeidet var støttes delvis av Seena Magowitz Foundation for Pancreatic Cancer Research og stå opptil kreft-kreft forskning UK-Lustgarten Foundation Pancreatic kreft Dream Team forskningsstipend (Grant nummer: SU2C-AACR-DT-20-16). Stå opptil kreft er et program med underholdning industrien Foundation. Forskning tilskudd administreres av American Association for Cancer Research, det vitenskapelige partneren av SU2C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Sigma 25300-054
96 well cell repellant plate USA Scientific/ Griener Bio-One 655970 spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002
D-Glucose Sigma D9434
DPBS Gibco 14190-144
Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103020-100
L-Glutamine Sigma 59202C
Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL  Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4 °C
Patu8902 cells Laboratory Stock pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells Laboratory Stock activated pancreatic stellate cells
RPMI1640 Gibco 11875-093 growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer Agilent Technologies extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate Sigma S8636
XF Base media Agilent Technologies 102365-100 base media for metabolic assays on XFe96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5, (3), 239-248 (2011).
  2. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  3. Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22, (2), 151-152 (2004).
  4. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
  5. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33, (4), 1837-1843 (2015).
  6. Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532, (7598), 255-258 (2016).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130, (4), 601-610 (2007).
  8. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  9. Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5, (4), 291-296 (2010).
  10. Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8, (10), 1940-1949 (2013).
  11. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
  12. Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
  13. Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19, (9), 665-675 (2013).
  14. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19, (5), 336-344 (2013).
  15. Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
  16. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
  17. Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20, (3), 422-429 (2015).
  18. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
  19. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
  20. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
  21. Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175, (2), 636-648 (2009).
  22. Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66, (18), 8927-8930 (2006).
  23. Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13, (3), 170-188 (2013).
  24. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67, (1), 7-30 (2017).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats