Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Cancer Research
 

Summary

Här beskrivs en metod för beredning av 3-dimensionell (3D) sfäroid samtidig kultur av pankreascancer celler och fibroblaster, följt av mätning av metaboliska funktioner med hjälp av en extracellulär flux analysator.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Många typer av cancer, inklusive cancer i bukspottkörteln, har en tät fibrotiska stroma som spelar en viktig roll i tumör progression och invasion. Aktiverade cancer associerade fibroblaster är en nyckelkomponent i tumör stroma som interagerar med cancerceller och stödja deras tillväxt och överlevnad. Modeller som aktiverade fibroblaster och varupartiernas växelverkan av cancerceller är viktiga verktyg för att studera stromal biologi och för utveckling av antitumöreffekt agenter. Här beskrivs en metod för snabb generering av robust 3-dimensionell (3D) sfäroid samtidig kultur av pankreascancer celler och aktiverade bukspottskörteln fibroblaster som kan användas för efterföljande biologiska studier. Dessutom beskrivs användningen av 3D spheroids utför funktionella metabola analyser sond cellulära bioenergetik vägar med en extracellulär flux analysator paras ihop med en sfäroid mikroplattan. Pankreascancer (Patu8902) och aktiverade bukspottskörteln fibroblast celler (PS1) odlades tillsammans och magnetiseras använder en biokompatibel nanopartiklar församling. Magnetiserade celler var snabbt bioprinted med magnetiska hårddiskar i en 96 väl format, i tillväxt medier att generera spheroids med en diameter som sträcker sig mellan 400-600 µm inom 5-7 dagar av kultur. Funktionella metabola analyser med hjälp av Patu8902-PS1 spheroids genomfördes sedan med den extracellulära flux tekniken sond cellulära energisk vägar. Metoden är enkel häri, tillåter konsekvent generation av cancer cell-fibroblast sfäroid samtidig kulturer och potentiellt kan anpassas till andra typer av cancer cell vid optimering av den nuvarande metoden som beskrivs.

Introduction

Under det senaste decenniet, har flera in vitro- 3D modeller utvecklats för att sammanfatta och pröva i vivo tumör biologi, närmiljön och tillväxt förutsättningarna för cancer celler1,2. Tvådimensionell (2D) enskiktslager cellodling system med enhetlig exponering för biokemiska faktorer och prövningsläkemedel föreningar misslyckas att replikera de infödda 3D tumör-stromal interaktioner utsatt till en gradient av föreningar sprida genom den extracellulära Matrix proteiner (ECM)3,4. Således, i jämförelse med 2D vävnadsodling modeller, 3D cancer modeller har vuxit fram för att bättre Visa potentiella på simulera den tumör närmiljön och tjänstgjorde som viktiga verktyg för att bättre förstå i vivo tumör egenskaper, såsom hypoxi, desmoplasia, dvala, drog penetrans, toxicitet och terapeutiska motstånd5,6. I detta syfte har 3D modeller potential att överbrygga klyftan mellan 2D cellkultur och hela djurmodeller genom att härma i vivo tumör funktioner, samtidigt som den är relativt billig och optimerad för snabba generationen och enhetlighet. Dessa fördelar utnyttjas för att påskynda translationell forskning inom många områden bland annat cancerbiologi, morfogenes och Vävnadsrekonstruktion7,8.

I en våg av 3D vävnadsodling metoder, magnetisk levitation tekniker har nyligen utvecklats och beskrivits för tillväxt, testmetoder och avbildning av spheroids härrör från olika cell typer9,10, 11 , 12. magnetiska 3D bioprinting utnyttjar användningen av magnetiska krafter att ingenjör vävnader genom magnetisering celler med biokompatibel nanopartiklar och skriva ut dem i flera format. Detta tillåter snabb produktion av konsekvent, nära identiska 3D spheroids, som kan utnyttjas och anställd i en uppsjö av nedströms tillämpningar för biokemiska och biofysiska undersökning10. Här har vi anpassat magnetiska bioprinting tekniken använder ett biokompatibelt material som kallas Nanoshuttle (NS) består av järnoxid, poly L-lysin och guld nanopartiklar att märka pankreascancer celler och fibroblaster. NS fäster elektrostatiskt till plasmamembranet, är inte känt att binda till eventuella specifika receptorer och utgåvor av cellen ytbehandlar inom en vecka. Det kräver mycket låga magnetiska krafter (30pN), tillräckligt för att aggregat men inte skada celler och påverkar inte cellernas viabilitet, metabolism eller spridning att göra det extremt biokompatibel för 3D kulturer10,13,14 ,15.

I denna studie beskriver med pankreascancer som ett exempel och en modell, vi generation och metabola test av 3D cancer cell-fibroblast spheroids. Start från celler odlade i 2D fartyg, illustrera vi kultur och tillväxt villkoren i bukspottskörteln tumör-fibroblast samtidig kultur spheroids använder magnetiska bioprinting. Odlade spheroids användes sedan i funktionella metabola analyser med hjälp av en extracellulär flux analysator, en teknik visat att samtidigt mäta två stora energi producerar vägar, glykolys och mitokondrie respiration, i en mängd olika live celler och vävnader16,17,18,19,20. Glykolys mättes som en förändring i den extracellulära försurning (ECAR), medan mitokondriell andning eller oxidativ fosforylering mättes som syre materialåtgången (OCR). Vi föreslår att denna metod som utvecklats för bukspottskörteln tumör spheroids kan tjäna som en ryggrad för optimering och översätta 3D tumör sfäroid generation och analys till andra cell/vävnadstyper.

Protocol

1. kultur av pankreascancer 3D Spheroids använder magnetiska Bioprinting

  1. använda standard aseptisk vävnadsodling teknik, kultur celler av intresse i en T75 kolv till en konfluens på 70-80% i lämpliga odlingsmedier.
    Obs: Vanligen 5-7 × 10 6 celler från en 70-80% konfluenta T75 kolv skördades. Två olika celltyper användes i denna studie - Patu8902 (bukspottskörteln tumörceller) och PS1 celler (aktiverade bukspottskörteln stjärnformade celler 21). Både cellinjer odlades i Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) kompletteras med 10% (v/v) fostrets bovin serum(FBS), 1 × penicillin-streptomycin (p/s).
  2. Tvätta cellerna en gång med 5 mL Dulbecco ' s fosfatbuffrad saline(DPBS).
  3. Koppla celler från plast yta av trypsinizing med 2 mL 0,05% Trypsin-EDTA för 5-10 min vid 37 ° C. Kontrollera för cell lossnar under ett mikroskop.
  4. Inaktivera trypsin genom tillsats av 8 mL tillväxtmassmedia till fristående celler. Undvika över trypsinization, eftersom detta kan negativt påverka hälsa/livskraft celler.
  5. Pipettera celler upp och ner för att generera en enda cellsuspension och räkna cell densiteten med hjälp av en automatiserad cell räknare eller en hemocytometer.
  6. Under tiden jämvikta en injektionsflaska med NS omgivningstemperatur.
  7. Beräkna mängden celler krävs för sådd önskat antal spheroids (brunnar) och alikvot till en ny 15 mL koniska tub. Till exempel, att frö en hela 96 väl platta med 5 000 celler per brunn, alikvot minst 5,5 × 10 5 celler.
  8. Samla celler genom centrifugering vid 500 x g i 3 min. noggrant aspirera eller Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna vid en koncentration på 1,0 x 10 6 celler/mL i tillväxt medier. Pipettera försiktigt med en bred uttråkad Pipettera tips för att undvika klippning. Till exempel Omsuspendera 5,5 x 10 5 celler i 550 µl av tillväxtmassmedia.
  9. Magnetisera önskad mängd celler med skakad NS (steg 1,6).
    1. Direkt lägga till NS cellsuspensionen i tillväxt medier och gnugga försiktigt. För effektiv magnetiska uppmΣrkning av celler, Använd 10 µL NS per 100 µL celler (resuspended på 1 x 10 6 celler/mL).
      Obs: För en typisk experiment, etikett 5,5 × 10 5 Patu8902 celler i 550 µL med 55 µL NS och 1,1 × 10 6 PS1 celler i 1100 µL, (säljs separat) med 110 µL NS.
    2. Försiktigt Invertera tube ett par gånger för att säkerställa cellsuspension. Tillfälligt, överföra cell-NS mixen i en enda bra 24-bra platta. Göra detta separat för varje celltyp att magnetiseras. Täckplatta och inkubera cellerna i rumstemperatur i 2 h med mild skakar för att tillåta NS binda till cellytan.
      Obs: Kultur och haltbestämning av spheroids börjar antingen från Patu8902 eller PS1 ensam celler, förutom samtidig kultur spheroids börjar med båda cell typer förblandade innan utskrift på magnetiska hårddiskar framgångsrikt uppnås med hjälp av denna metod i oberoende experiment. En metod för att generera samtidig kultur spheroids från Patu8902 och PS2 celler beskrivs nedan i de efterföljande stegen.
  10. Pipettera upp och ner magnetiserade cellerna försiktigt att blanda jämnt och förbereda en master mix som innehåller önskad cell numret. För sådd spheroids, använda sammanlagt 15 000 celler (5,000 Patu8902 + 10.000 PS1) och justera till en total volym på 150 µL per brunn av en plattan med 96 brunnar.
    Obs: Den slutliga volymen dispenseras i varje brunn måste vara densamma oavsett antalet celler används.
  11. Placera en cell myggmedel plattan med 96 brunnar ovanpå enheten med 96 brunnar magnetiska sfäroid och dispensera 150 µL av cell mix i varje brunn. Iaktta cellerna sakta samla till mitten av brunnen över magneten. Täcka och inkubera plattan över natten i en 5% CO 2 inkubator inställd vid 37 ° C med magnetiska sfäroid enheten fortfarande sitter. Ta bort magnetiska enheten och inkubera i ytterligare tillväxt i upp till 7 dagar.
    Obs: Det är viktigt att använda cell myggmedel tillväxtplattor för sfäroid utskrift använder magnetiska sfäroid enheter. Se till att sfäroid disken med tunnare mindre magneter används, inte hålla enheten.
  12. Övervaka tillväxten av spheroids varje dag. Fylla på med färska tillväxt medier varje tre dagar genom att placera tillväxtplattan monteras på magnetiska hålla enheten i vinkel och med ett flerkanaligt Pipettera för att dra ut använt media.
    Obs: Patu8902 och PS1 celler Co seedade på 15 000 celler per brunn kommer att växa till 3D spheroids med en diameter på 400-600 µm inom 5-7 dagar. På denna punkt spheroids är redo för metabola karakterisering, drug utvärdering och andra nedströms tillämpningar.

2. Metaboliska test av 3D bukspottskörteln tumör Spheroids för bioenergetik vägar med hjälp av extracellulära Flux Analyzer

Observera: I detta avsnitt, analysen av de metaboliska funktionerna i de spheroids med hjälp av en extracellulär flux Analyzer med assay mikroplattor utformats speciellt för 3D spheroids beskrivs.

  1. Tvätt och överföring av spheroids från tillväxtplattor sfäroid assay mikroplattor.
    Obs: Spheroids kan användas för metabola analyser när de når en diameter på ~ 500 µm.
    1. Dagen innan utför analysen, återfukta sond eller sensor patronen med assay standard (200 µL per brunn) i den medföljande verktyg plattan och inkubera över natten (4-18 h) i en fuktad inkubator (icke-CO 2) vid 37 ° C.
    2. Förbereda lämpliga analyssubstratet för önskad metabola analysen genom att komplettera base media (se tabell av material) med antingen 2 mM L-glutamin för glykolys stresstest (GST) analys eller med 1 mM pyruvat, 2 mM L-glutamin och 10 mM glukos för en mitokondriell stresstest (MST) assay.
      Obs: Den extracellulära flux analyzer mäter både mitokondrie respiration (OCR) och glykolys (ECAR) av levande celler i ett format som plattan med 96 brunnar. Dessa priser ger en översikt av cellulära metaboliska funktion i prover under utredning. Hänvisas till manualen i assay kit för detaljerade instruktioner.
    3. Efter att lägga till assay särskilda tillägg (se steg 2.1.1), värm kompletterade analyssubstratet i 37 ° C vattenbad och justera pH till 7,4 ± 0,1 med 0.1N NaOH. Hålla medium varm fram till användning.
    4. Rekonstituera assay satsreagenser i kalibrerad analyssubstratet rekommenderade lager koncentrationer.
      Obs: Dessa är gjorda på 10 × slutliga koncentration önskas i brunnarna. Beståndet koncentrationer för glukos, oligomycin och 2-deoxy-glukos (2-DG) är 100 mM, 100 µM och 500 mM, respektive.
    5. Observera spheroids i tillväxtplattan under en ljus Mikroskop för att kontrollera för sfäroid morfologi och övergripande enhetlighet; i fråga om form och structure i spheroids.
    6. Överför tillväxtplattan på en magnetisk holding-enhet och sug noga ut ~ 120 µL tillväxt medier. Försiktigt tvätta spheroids med ~ 120 µL av värmde och pre kalibrerad assay media, aspirera och upprepa tvätta två gånger. Inspektera spheroids under lupp igen för att säkerställa att spheroids inte tvättas bort.
    7. Förbereda sfäroid assay mikroplattan genom att lägga till 180 µL varma assay media till varje brunn.
    8. Ange en P20 mikropipett till 10 µL och passa en bred uttråkad spets till den. Om breda uttråkad tips inte är tillgängliga, skära av tips av regelbundna pipettspetsar med en ren sax eller skalpell att vidga hålet.
      Obs: Detta bör minska klippning och bevara den övergripande morfologin av spheroids medan de överförs för att assay plattor.
    9. Använda en varm (37 ° C) yta för att genomföra överföringen av spheroids. Använda en X-ray film viewer yta värms med en vitt ljus lampa att förbättra kontrast och stöd visualisering av spheroids under överföringsprocessen.
    10. Noggrant bore aspirera en enda förtvättat sfäroid från cell myggmedel tillväxtplattan med hjälp av en mikropipett P20 försedd med en bred spets och försiktigt överföring sfäroid direkt in i centrera av varje brunn sfäroid assay platta för att utföra den metabola assay. Låt varje sfäroid försiktigt falla i den centrala mikro-kammaren i varje brunn av ren gravitationen att fylla assay plattan.
      Obs: Det tar vanligtvis 5-8 s för varje sfäroid falla i mitten av brunnen av gravitationen. Dra inte ut pipetten tills spheroids har lugnat ner sig i mikro-kammaren. Gör inte insättning spheroids i 4 hörn brunnarna av assay plattan (A1, A12, H1, H12) eftersom dessa kommer att användas som bakgrund brunnar.
    11. Övervaka morfologi och position varje sfäroid att säkerställa att varje sfäroid är i mitten av varje brunn. Vid behov, flytta till mitten av brunnen av aspirera ut sfäroid använder ett brett bore Pipettera spets, och efterföljande nedfall självtryck.
    12. När alla spheroids har överförts, placera assay plattan i en 37 ° C befuktade luftens inkubator (icke-CO 2) en timme före till assay.
  2. Lastning sensor patronen med föreningar och utför analysen
    1. Förbered 10 × koncentrerad specifika analysreagenser i assay specifika media beskrivs i steg 2.1.2. Till exempel att utföra GST, rekonstruera glukos, oligomycin och 2-GD i rekommenderade mängder som avses i assay manualen. Både GST och MST analyser utfördes med hjälp av Patu8902-PS1 spheroids.
    2. Ordentligt orientera sensor patronen med rader märkta A-H på vänster sida och placera en lastning guide ovanpå sensorn patronen. Säkerställa korrekt laddning av önskad port genom att orientera guiden lastning så att den bokstav som motsvarar porten som skall lastas på det övre vänstra hörnet.
    3. Med hjälp av en flerkanalspipett, fördela reagenser direkt i injektion hamnar. Håller lastning guider på plats med hjälp av fingertopparna under hela förfarandet.
      Obs: Varje reagens kommer att injiceras i en rekommenderad hamn som anges i handboken för analys. Undvika att skapa luftbubblor men tryck inte någon del av patronen för att avlägsna luftbubblor.
    4. Ta bort lastning guide och position i ögonhöjd med patron för att visuellt inspektera injektion portar för även lastning.
    5. Skapa experimentell test design/instrument protokollet använda instrumentet controller Wave programvara (hädanefter analys programvara) som beskrivs i avsnitt 2.3.
  3. Assay design och utförande med programvaran analys
    1. skapa en mall för analys för experimentet
      1. Öppna programvaran analys och klicka " mallar " eller Välj en befintlig analys Mall. Dubbel klick på " tom mall ".
      2. Definiera experimentella grupper och villkor.
        1. Definiera injektion strategier för portar A, B och C. lämna port D tom.
          Obs: För GST assay, endast dessa portar kommer att laddas med glukos, Oligomycin och 2-DG. Vid MST assay, oligomycin, FCCP och Rotenon laddas.
        2. Definiera före behandlingar om spheroids behandlades med ett eller flera test föreningar och kontrollgruppen. Definiera assay media att omfatta källa, kosttillskott och annan information.
        3. Definiera en eller flera celltyp (t.ex. Patu8902, PS1) ser densitet och passage informationen.
      3. Klicka " skapa grupper ".
      4. Klicka på " tallrik karta " fliken och tilldela grupper till assay plattan motsvarar experimentell design.
      5. Välj fyra hörn brunnarna som bakgrund brunnar. Se till att det finns ingen spheroids i dessa brunnar.
  4. Köra test på analysatorn
    1. Klicka på fliken Instrument protokollet behåller standard protokoll kommandon genom att kontrollera " kalibrera ", " jämvikt " och " baslinjen mätcykeln ".
    2. Klicka " injektioner " och definiera sammansatta för varje port. Redigera mätning cykler till 6 cykler från standard 3 cykler för spheroids. Hålla den standard 3 min mix, 0 min vänta och 3 min åtgärd gånger.
      Obs: Mix-vänta-åtgärd standardtiderna är 3 min, 0 min, 3 min, respektive. Tre mätningarna basala ränta vanligtvis före injektion av första analysen förening. Dessa mätningar kan kalibreras och justeras enligt experimentell design.
    3. Granska protokollet och gruppen Sammanfattning.
    4. Spara assay formgivningsmall.
    5. Vidare till före assay kalibrering när injektionen hamnar har laddats med assay substrat. Överföra patronen med verktyget plattan till den extracellulära flux analyzer.
      Obs: Detta vanligtvis är klar inom 15-20 min och kalibrerar sensorer för att dimensionera OCR och ECAR.
    6. Efter kalibrering av patronen, Ersätt verktyget plattan med pre värmde assay plattan som innehåller 3D spheroids och inleda analysen. Efter mätningarna är slutförda, exportera data till kalkylblad eller grafritande och statistisk programvara för att analysera data.

Representative Results

Det allmänna arbetsflödet för magnetiska bioprinting och extracellulära flux analys av 3D spheroids
Figur 1 visar en överblick över hela processen som beskrivs i detta protokoll. Pankreascancer celler (Patu8902) och aktiverade stjärnformade celler (PS1) odlades i vävnadsodling kolvar som innehåller lämpliga odlingsmedier till en konfluens på 70-80%. Cellerna var fristående från 2D kultur fartyget och tvättas, cell densiteten bestämdes och celler slutligen resuspended i odlingsmedier på 1 × 106 celler/mL. NS, en nanopartikel församling bestående av guld, järnoxid och poly-L-lysin användes att magnetisera celler. Individuellt magnetiserade Patu8902 och PS1 cellerna var sedan blandas och tryckta på 96 brunnar cell myggmedel tillväxtplattor monterad på en magnetisk sfäroid enhet. Vi har optimerat de 15.000 för att vara det totala antalet celler för sådd en enda brunn (5.000 Patu8902 celler blandat med 10 000 PS1 celler att generera en enda sfäroid). Efter inkubation under lämpliga vävnadsodling förhållanden för 5-7 dagar erhölls 3-dimensionell spheroids, under vilken tid var tillväxten av dessa spheroids övervakas och registreras. Efter tvätt med assay media, överfördes spheroids fysiskt på en sfäroid mikroplattan att utföra metabola analyser med en extracellulär flux analysator för samtidig mätning av glykolys och mitokondrie respiration.

Kultur och tillväxt av bukspottskörteln tumör-fibroblast spheroids
För att få funktionella och robusta spheroids, den epiteliala cancercellen linje Patu8902 och aktiverade stjärnformade celler PS1 odlades i RPMI-1640 kompletteras med fetalt bovint serum. Pat8902 och PS1 celler magnetiseras med NS blandades sedan tillsammans i ett förhållande av 1:2, så att utsäde sammanlagt 15 000 celler per brunn i en tillväxtplattan. Inom 24 h för att skriva ut cellerna på de magnetiska hårddiskar, focalized celler till mitten av brunnen exakt på toppen av varje magnetiska stift under varje brunn. Tillväxten av Patu8902-PS1 spheroids övervakades av imaging dag 2, 4, 7 och 9 efter sådd celler. Figur 2 visar kvantifiering av representativa spheroids genomsnittliga diameter vid olika tidpunkter ovan. Diametern på spheroids ökar från 414 µm dag 2 596 µm på dag 7 inlägg utskrift. Det var ingen signifikant skillnad mellan tillväxt på dag 7 och 9 och således alla ytterligare experiment var begränsad till 7 dagar sfäroid tillväxt. Vi märkte att spheroids förvärva en skarpare morfologi speciellt runt ytterkanterna och NS sprids gradvis mer jämnt i hela volymen av sfäroid med fler dagar i kultur. Vi uppskattade också sfärisk av 10 spheroids baserat på längden av deras större och mindre axlar. Genomsnittliga sfärisk är 0,92 ± 0,04 för Patu8902 ensam (tumör), 0.95 ± 0,04 för PS1 (stromaceller) ensam och 0,94 ± 0,02 för samtidig kultur spheroids.

Funktionella metabola haltbestämning av bukspottskörteln 3D spheroids använder den extracellulära flux analyzer
För att testa funktionaliteten hos spheroids, vi anställt metabola och bioenergetik analys sond de energi vägarna i spheroids. Vi genomförde en glykolys stresstest på spheroids odlade enligt ovan. I detta syfte utsattes spheroids genereras från antingen Patu8902 eller PS1 celler förutom de som härrör från en samtidig kultur av de två celltyper för analysen. Intressant, uppvisade alla tre typer av spheroids, huruvida med ursprung från distinkta eller blandade celler, ett biologiskt funktionella svar på GST analysen. Vid injicering av en mättar koncentration av glukos, testade de spheroids typerna Visa ökar i glycolytic väg vilket framgår av en ökning av ECAR (figur 3). När, mitokondriell ATP produktionen hämmades använder oligomycin, energiproduktion skiftar till glykolys och sköt celler till maximal glycolytic kapacitet, ses som ytterligare ökning ECAR. Hämning av glykolys använder 2-DG, en glukos analog som konkurrenskraftigt binder glukos hexokinas, resulterade i en minskning ECAR, bekräftar att ökningen tidigare ECAR berodde glycolytic aktivitet. Vi märkte att de spheroids testas i denna studie svarade på detta sätt, även om de PS1 ensamma spheroids (genomsnittliga diameter 250 µm) hade en relativt lägre signal, möjligen på grund av sin mindre storlek och lägre glycolytic kapacitet jämfört med Patu8902 cancer celler (genomsnittliga diameter 600 µm). I allmänhet en högre ECAR signal från tumör cell härrör spheroids jämfört med de från relativt mindre PS1 fibroblast härrör spheroids, skulle möjligen kunna tillskrivas cancercellernas inneboende metabola lutning mot glykolys22, 23. Alla tre typer av spheroids härleddes från sådd samma antal celler, även om vi märkt sfäroid storlek variation mellan varje typ, med PS1 ensam spheroids är den minsta, följt av samtidig kultur spheroids, och Patu8902 ensam spheroids vara den största.

För att testa mitokondriefunktion i 3D spheroids, utsätts vi en MST-analysen samtidig kultur spheroids. MST mäter viktiga parametrar av mitokondriell funktion genom att direkt mäta OCR av celler (figur 4A och 4B). En seriell injektion med föreningar (oligomycin, FCCP och en blandning av Rotenon och antimycin A) användes för att mäta mitokondriell nyckelparametrar såsom, ATP produktionen, maximal andning och icke-mitokondriell respiration. Dessa parametrar och basala respiration användes ytterligare att beräkna proton läcka och respiratoriska reservkapacitet (figur 4 c). En nedgång i OCR i svar på oligomycin, en hämmare av ATP synthase (komplex V) korrelerar till mitokondriell respirationen är associerade med cellulär ATP produktionen. Spheroids inkuberades med oligomycin under en längre tid att tillåta maximal penetration och effektiv svarstid. En andra injektion med uncoupler FCCP stimulerar maximal syreförbrukning och en motsvarande ökning av OCR. FCCP-stimulerad OCR användes för att beräkna respiratoriska reservkapacitet, ett mått på cellens förmåga att svara på ökad efterfrågan på energi. Den tredje injektionen; en blandning av rotenon, (ett komplex jag hämmare), och antimycin A (en komplex III-hämmare) blockerar mitokondriell respiration, ses som en kraftig minskning av OCR (figur 4BOng >).

Sammantaget bekräftar våra observationer funktionaliteten hos odlade spheroids med en extracellulär flux analysator som ett mått på deras metaboliska fotavtryck/aktivitet både när det gäller glycolytic och mitokondrie potential enligt beskrivningen ovan.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk representation av metoden för kultur och haltbestämning av pankreascancer celler/fibroblast spheroids. Patu8902 och PS1cells var odlade, trypsinized, tvättas och räknade. För sådd varje sfäroid, Patu8902 (5 000 celler per brunn) och PS1 fibroblaster (10 000 celler per brunn) var magnetiseras använder NS och tryckt på en cell myggmedel tillväxtplattan på dag 1. Efter sådd, var tillväxtplattan monterad på en magnetisk sfäroid enhet (med en magnet under varje brunn av 96 väl format tillväxtplattan) och kultur för 2-7 dagar att få 3D spheroids. De resulterande spheroids var tvättas och överförs till den sfäroid assay Mikroplattor för att utföra de metabola analyserna på extracellulära flux instrumentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Tillväxten av bukspottskörteln tumör-fibroblast spheroids. (A) en representativ bild av Patu8902-PS1 samtidig kultur sfäroid motsvarar dagen i kultur visas på toppen och storlek i diameter sfäroid (µm) kvantifieras nedan. Progressiv ökning sfäroid storlek och diffusion av NS partiklar (mörka prickar) i hela sin volym är uppenbart mellan dag 2 och 7. Spheroids förvarades kultur ytterligare 2 dagar efter detta, vilket inte ledde till en betydande ökning sfäroid diameter. B representativa bilder av spheroids härrör från tumörceller (Patu8902), stroma (PS1) och samtidig odlade celler (Patu8902 + PS1) visas. (C) sfärisk data avbildas från 10 individuella spheroids från varje grupp. Felstaplar representera standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Glykolys stresstest (GST) med bukspottskörteln spheroids. (A) Schematisk bild av en typisk glycolytic funktionen analys med olika assay parametrar skildras. (B) ett exempel på en GST test utförs på de bukspottskörteln spheroids odlade enligt den metod som beskrivs. Glukos injektion ramper upp glykolys ses som en ökning i ECAR, ytterligare ökning om tillsättning av oligomycin att stänga av mitokondriell respiration. ECAR faller svar på 2-DG, en konkurrenskraftiga analog till glukos, genom att blockera glykolys. Alla spheroids noteras att ställa ut ett funktionellt svar på GST analysen. (C) en utgång av GST analysen med hjälp av tillverkarens rapportgenerator som skildrar de tre viktigaste parametrarna GST analysens. Felstaplar representera standardfel för medelvärde (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4Mitokondriella stresstest (MST) med Patu8902-PS1 spheroids. (A) Schematisk bild av en typisk mitokondriefunktion test med olika parametrar för analys är avbildad. (B) ett exempel på en MST på de bukspottskörteln tumör-fibroblast spheroids visas. (C) samarbete kultur 3D spheroids uppvisar ett funktionellt svar på MST analysen. Som förväntat, märktes mitokondriell funktion mätt som en minskning av OCR när spheroids utmanades med oligomycin, ATP-syntas hämmare. Använda FCCP till ramp upp elektronflödet resulterade i maximal OCR, som omedelbart kollapsade vid hämning av mitokondriell respiration använder en - cocktail av mitokondriell komplexa-hämmare. Felstaplar representera standardfel för medelvärde (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Pankreascancer, 3rd ledande orsaken till cancer i samband med dödsfall i USA24, som ett exempel och en modell, en snabb och konsekvent metod utvecklades för att växa och assay 3D spheroids med hjälp av samtidig kultur av pankreascancer celler och aktiverad bukspottskörteln fibroblaster. Med hjälp av magnetiska bioprinting, erhölls spheroids varierar i storlek från 400-600 µm i diameter. Dessa utsattes för metabola analyser att framgångsrikt testa funktionaliteten hos de odlade 3D spheroids. Denna metod är enkel, konsekvent och kan enkelt anpassas till andra celltyper.

Denna metod kommer att påskynda och lägger till translationell värdet av de analyser som utförs med 3D spheroids, kan den förbättras genom att utveckla tekniker som gör att multiplexering av sfäroid manipulation och hantering. Detta bör ytterligare minska den totala tid, kostnad och arbete krävs för att utföra analysen. Sfäroid volymer kan dessutom användas för att normalisera OCR signaler som rapporterats av andra6. Sfäroid volym normaliserad av genomsnittliga volymen av en cell kan användas för att bestämma OCR per cell, men eftersom tillväxten av spheroids inte kommer vara identiskt, beräkning av en absolut OCR per cell kan utmanande. Denna metod är för närvarande begränsad av avsaknaden av ett effektivt verktyg att multiplex sfäroid hantering och överföring från tillväxtplattor till assay miljö.

Metoden beskrivs modifieras och anpassas från den magnetiska bioprinting tekniken, och ytterligare validerade för att visa den funktionella betydelsen genom att tillämpa de odlade spheroids en nedströms metabola test. Metoden ger ett viktigt verktyg för att generera robust, hållbar och fungerande spheroids som innehåller de två stora celltyper som finns i de flesta tumörvävnad, cancerceller och cancer associerad fibroblaster, som kan användas för andra prövningsläkemedel analyser, till exempel drog skärmar. Den relativa lätthet och effektivitet av metoden som NS är en stor förbättring över andra metoder25, såsom hängande droppe metod2,26 i sfäroid generation.

Robust spheroids genereras som sådan ger en in vitro- tumör modell som innehåller stromaceller, som ofta saknas många 3D kulturstudier. Möjligheterna för tillämpning av 3D sfäroid modeller genereras som sådan är stora. Sådana modeller kan exempelvis användas för att undersöka cell-cell interaktioner, bioenergetik förskjutningar och testa genetisk känslighet och beroende av olika behandlingsregimer. 3D spheroids att sammanfatta den i vivo tumör närmiljön fungerar som mycket relevanta och användbara verktyg för drug screening studier och de undersöker verkningsmekanismer av nuvarande och nya therapeutics. Metaboliska analyser sondera energi vägar använder spheroids kulturer med mutanta celler kan bidra till att kasta nytt ljus in i rollen av dessa gener och relaterade vägar i patobiologi i relevanta 3D modell av cancer, som de spheroids som beskrivs i denna studie.

En framgångsrik tillämpning av denna metod är främst beroende av hälsan hos celler krävs för magnetiska utskrift, vilket är anledningen till cell växer i logaritmiska fas bör skördas och magnetiseras. Det är viktigt att använda magnetiska sfäroid enheten för att skriva ut magnetiserade celler och inte hålla enheten, vilket bör utnyttjas endast under den sfäroid tvätt och media replenishing stegen i den beskrivna metoden. Den andra mest kritiska aspekten för framgångsrik avläsning av metabola analyser är att upprätthålla av spheroids morfologi under överföringen från tillväxtplattan till assay plattan.

Sammantaget har detta protokoll fastställts för generering av 3D spheroids som innehåller både cancer och stromaceller, efter den påföljande metabola haltbestämningen av de spheroids med hjälp av extracellulära flux analyzer. Nyckel dragen av den här metoden är att det är snabbt, lätt att anpassa och konsekventa, relevanta för och efterliknar den i vivo tumör mikromiljö, är relativt billiga och kan tjäna som ett nytt verktyg för att studera tumörbiologi och utveckla cancer ombud.

Disclosures

Författarna George W. Rogers och Andrew Neilson är anställda/aktieägare Agilent Technologies som producerar reagens och instrument som används i denna artikel. Alla andra författare förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgements

Vi vill tacka Samuel Zirbel för hjälp med att optimera odlingsbetingelserna och övervakning sfäroid tillväxt. Vi är tacksamma till Agilent technologies för att tillhandahålla SeaHorse XFe96 analyzer, analysreagenser och tekniska insikter. Vi tackar också Dr Hemant Kocher vid Barts Cancer Institute i Storbritannien för att tillhandahålla PS1 cellerna. Detta arbete var stöds delvis av stiftelsen Kim Magowitz för bukspottskörteln Cancer Research och stå upp till Cancer-Cancer Research UK-Lustgarten Foundation bukspottskörteln Cancer dröm Team forskningsbidrag (Grant nummer: SU2C-AACR-DT-20-16). Stå upp att Cancer är ett program för stiftelsen underhållning industri. Forskningsanslag administreras av American Association for Cancer Research, SU2C vetenskapliga partner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Sigma 25300-054
96 well cell repellant plate USA Scientific/ Griener Bio-One 655970 spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002
D-Glucose Sigma D9434
DPBS Gibco 14190-144
Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103020-100
L-Glutamine Sigma 59202C
Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL  Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4 °C
Patu8902 cells Laboratory Stock pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells Laboratory Stock activated pancreatic stellate cells
RPMI1640 Gibco 11875-093 growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer Agilent Technologies extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate Sigma S8636
XF Base media Agilent Technologies 102365-100 base media for metabolic assays on XFe96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5, (3), 239-248 (2011).
  2. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  3. Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22, (2), 151-152 (2004).
  4. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
  5. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33, (4), 1837-1843 (2015).
  6. Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532, (7598), 255-258 (2016).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130, (4), 601-610 (2007).
  8. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  9. Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5, (4), 291-296 (2010).
  10. Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8, (10), 1940-1949 (2013).
  11. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
  12. Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
  13. Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19, (9), 665-675 (2013).
  14. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19, (5), 336-344 (2013).
  15. Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
  16. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
  17. Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20, (3), 422-429 (2015).
  18. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
  19. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
  20. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
  21. Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175, (2), 636-648 (2009).
  22. Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66, (18), 8927-8930 (2006).
  23. Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13, (3), 170-188 (2013).
  24. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67, (1), 7-30 (2017).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics