Fare Pnömonektomi ve Protez İmplantasyonu ile İç Akciğer Yüzey Alanının Ölçümü için Standart Bir Yöntem

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Akciğer hastalıklarında ve yaralanmaya bağlı alveol rejenerasyonunda akciğer morfolojisi ve fizyolojisini değerlendirmek için iç akciğer yüzey alanı (ISA) kritik bir kriterdir. Burada hem akciğer pnömonektomisinde hem de protez implantasyon fare modellerinde ISA için önyargı önlemeyi en aza indirecek standart bir yöntem açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Akciğerin temel işlevi, kan damarları ile atmosfer arasındaki oksijen ve karbon dioksit değişimidir. Bronkopulmoner displazi (BPD), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD) ve akut solunum yolu enfeksiyonları gibi akciğer hastalıkları, ISA 2 azalmasına neden olur. Akciğer hastalığını araştıran araştırmacılar, MLI, ILV, gaz değişim birimi sayısı, ISA ve akciğer dokusu uyumluluğu 2 , 3 dahil olmak üzere akciğerlerdeki morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için çeşitli niceliksel yöntemler geliştirmiştir. Weibel ve ark.nın öncü çalışmaları 4 ve Duguid ve ark. 5 , ISA'nın insan akciğerlerindeki akciğer gaz değişim kapasitesinin doğrudan bir ölçümü olarak kullanılabileceğini ve amfizemin ciddiyetini belirlemek için bir kriter olarak kullanılabileceğini birlikte ortaya koymuştur. Son beş yılda yayınlanan bir dizi çalışma, akciğer morfolojik parametrelerini ( örn. 6 gelişme sırasında ve yaralanma PNX 1 , 7 kurtarma sırasında farelerin akciğerlerinde morfolojik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için. ISA, Denklem 8 , 9 kullanılarak hesaplanır:

Denklem

, Burada ILV, iç akciğer hacmi ve MLI, pulmoner periferik hava sahası büyüklüğünü 10 gösteren aracı bir parametredir.

PNX, bir veya daha fazla akciğer lobunun cerrahi olarak çıkarılması, insanlar 11 , fareler 1 , köpekler 12 , sıçanlar 13 ve tavşanlar 14 , 15 dahil olmak üzere birçok türe ait alveol rejenerasyonunu uyardığı yaygın olarak bildirilmiştir. SaplamaOn dört gün sonra fareler, akciğer y sonrası PNX önceden var olan alveoller genişlemesi ve alveollere de novo oluşumu hem ISA, ilv restorasyonu ve kalan akciğer dokularında 1 alveol sayısını katkı göstermiştir. Biz ve diğerleri, PNX'yi takiben boş göğüs boşluğuna sünger, balmumu veya özel şekil verilmiş bir protez gibi materyallerin sokulduğunu ( örn. , Protez implantasyonu) alveol rejenerasyonunu engellediğini gösterdik. Artık mekanik kuvvetin alveol rejenerasyonunu başlatmak için en önemli faktörlerden biri olarak işlev gördüğü tam olarak bilinmektedir 1 , 16 , 17 . Bu tür çalışmalar, alveol rejenerasyonunu kantitatif olarak değerlendirmek için bir kriter olarak PNX ile tedavi edilen ve Protez implante edilen akciğerlerden alınan ISA değerlerinin etkinliğini vurgulamıştır.

Gözlemci önyargılarının ölçülen vayı önemli derecede etkilediği bilinmektedirAkciğer morfolojik parametreleri ( örn. , MIL ve ILV). ISA hesaplamasında kullanılan iki parametre olan hem ILV hem de MLI'yi belirlemede bu önyargıdan kurtulmak için standart protokoller kullanılabilir. Burada, bu akciğer parametrelerini ölçmek için oldukça ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller sunuyoruz. Daha da önemlisi, ISA'yı doğru bir şekilde ölçebilme özelliği, yaralanmaya bağlı alveolar rejenerasyon modellerinde akciğer fonksiyonlarının güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmayı ve çoklu pulmoner hastalıklarda mekanik keşifleri kolaylaştırmayı taahhüt eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde kullanılan tüm prosedürler, Pekin Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsünün Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Yönergelerdeki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. 8 haftalık CD-1 erkek fareler, deneyler gerçekleştirilene kadar spesifik bir patojen içermeyen (SPF) tesiste barındırıldı. Ameliyatlar tamamen anestezi uygulanmış fareler kullanılarak gerçekleştirildi (diğer bir deyişle çimdikleme tepkileri olmadan). Ameliyattan sonra fareler yeterli miktarda yiyecek ve tatlı su ile sıcak, nemli bir odada tutuldu. Fareler, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen bir anestetik doz aşımı kullanılarak öldürüldü.

1. Fare PNX Cerrahisi

  1. İntraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla farelere sodyum fenobarbital (120 mg / kg vücut ağırlığı) ve buprenorfin (0.1 mg / kg vücut ağırlığı) ile tamamen uyartın. Fareler artık parmak ucu ile tepki göstermediğinde ameliyat yapın.
  2. Farelerin sol toraksındaki saçları kimyasal madde ile çıkarınilatory tedavisi (~ 3 x 3 cm 2 alan).
  3. Her fareyi, ventral tarafı operatöre bakacak şekilde entübasyon platformuna sabitleyin ( Şekil 1A ).
  4. Farenin dilini çekin ve ses tellerini, kateterleri 18 ( Şekil 1A ) yönlendirmek için bir çentik içeren küçük bir hayvan laringoskopu ile aydınlatın.
  5. Solunum sırasında ses tellerinin hareketlerini gözleyerek ses tellerini ayırt edin. Anterior açı 19 ile trakea 20 G intravenöz entübasyon kanülünü yavaşça yerleştirin.
  6. Fareleri sağ yanal yatık konuma getirin ve kanülü mekanik bir ventilatöre bağlayın ( örn., Basınç kontrollü , Malzeme Tablosuna bakın). Fare göğsünün solunum hareketlerini gözleyerek kanülün trakeaya sokulduğunu kontrol edin ( Şekil 1B ).
  7. İnspirasyon basıncını ayarlayınVentilatörü 12 cm H 2 O'ye ayarlayın ve solunum hızını dakikada 120 nefes alma değerine ayarlayın ( Şekil 1B ).
  8. Cerrahi bölgedeki cildi betadin ve% 70 etanol ile arındırın.
  9. 5. interkostal boşluktaki boşluğa Noyes Bahar Makas (kesici kenar: 14 mm, uç çapı: 0.275 mm) ile cilt ve kasları keserek 2-3 cm posterolateral torakotomi insizyonu yapın ( Şekil 2B , C ). Torakotomi prosedürü için kullanılan cerrahi aletler kullanımdan önce sterilize edilir.
  10. Sol akciğerin ortaya çıkması için 5. interkostal boşluğa 1.5 cm'lik bir kesi yapın ( Şekil 2D , E ). Ameliyat sırasında kanamayı durdurmak için yüksek sıcaklıkta bir koterizer kullanın.
  11. Sol akciğer lobunun üçte birini künt uçlu forseps ile göğüsten kaldırın ( Şekil 2F ) ve daha sonra solun tamamını dışarı çekmek için bir pamuk çubuğu kullanınAkciğer ( Şekil 2G ).
  12. Sol akciğer lobunun pulmoner arter ve bronşunu belirleyin ( Şekil 2G ).
  13. Bronşu ve damarları ipek cerrahi dikişle hilumda sıkıca bağlayın ve ligasyondan 3-4 mm uzakta sol akciğer lobunu kesin ( Şekil 2H , I ).
    NOT: (toraks boşluğunda yani hava veya gaz) pnömotoraks neden olabilir sol hilusta, üzerinde dikiş knot kesmeye özen gösterin.
  14. 1 dikiş ile göğüs duvarını kapatın ve kas tabakasını ve cilt tabakasını sırayla 5-6 kesilmiş sütürleri kullanarak dikin. Her dikiş arasında 3-4 mm boşluk bırakın ( Şekil 2M , 2N ).
    NOT: Cerrahi dikiş iğnesini kalpten uzak tutun; İstenmeyen kardiyak ponksiyon ölümle sonuçlanır.
  15. Cerrahi alanı povidon iyotla dezenfekte edin.
  16. AfteCerrahi işlem, fareyi 38 ° C'lik bir termal yastığa yerleştirin ve spontan solunum hareketleri başlayana kadar fareyi vantilatörün içine bağlayın ( Şekil 2O ).

2. Protez İmplantasyonu

  1. PNX prosedürünün adımları 1.1 - 1.13'ü gerçekleştirin (farenin sol akciğer lobu çıkarıldığı noktaya kadar).
  2. Künt forseps kullanarak silikon protezin (müşterinin yaptığı, 12 mm uzunluğunda, 3 mm kalınlığında, 7 mm genişliğinde, 0.2 g, elipsoid şeklinde) kelepçeleyin ( Şekil 2J ). Silikon protezi yerleştirmeden önce sterilize edin.
  3. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgayı bir elinizle forsepsle tutun ve daha sonra başka bir elle boş protezi sol boş torak boşluğuna yerleştirin.
    NOT: Ekleme açısı protezin ön yüzü ile göğüs arası yüzeyi arasında yaklaşık 45 derecedir ( Şekil 2K ,L). Protezi yerleştirirken çok nazik olun. Aşırı kuvvet plevral rüptüre neden olur.
  4. Protezin sol boş torak boşluğunu kapladığından emin olmak için künt forsepsle protezin yönünü ayarlayın.
  5. Fare PNX prosedürünün 1.14 - 1.16 adımlarını uygulayın.

3. ILV ölçümü

  1. Tek kullanımlık bir serolojik pipetten (10 mL), bir iğne adaptörü olan 40 cm uzunluğunda bir esnek borudan, bir akış hızı kontrol valfinden ve 18 G'lik bir iğneden çıkarılmış bir pistondan oluşan özel bir cihaz hazırlayın ("şişme tüpü"). Montajdan sonra, pipeti bantla bir tahtaya sabitleyin ( Şekil 3A ). Pipet üstü ile deney tezgahı arasındaki mesafe en az 30 cm olmalıdır.
  2. Elle çalkalanarak, 55 ° C'lik bir su banyosunda 500 gr önceden ısıtılan 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 20 g PFA'nın eritilmesi ile taze% 4 paraformaldehit (PFA) fiksasyon çözeltisi hazırlayınSolüsyon berrak olana kadar her 10 dakikada bir temizleyin. Oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, solüsyonu 0.45 um'lik bir filtreyle süzün.
    DİKKAT: PFA kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipmanı (PPE) giyin.
  3. Anestezik doz aşımı dozunda (% 0.8 fenobarbital sodyum, 1000 U / mL heparin) fareleri kurban edin.
  4. Her fare bir polistiren diseksiyon plakası üzerinde sabitleyin ve% 70 alkol ile püskürtün.
  5. Farenin göğsünü dikkatli bir şekilde açın ve akciğer loblarını iyice ortaya çıkarmak için göğüs uçlarını makas kullanarak kesin.
  6. Trakea maruz bırakmak için aşırı makroyu makas kullanarak çıkarın. Trakeayı özofagustan ayırdığınızdan emin olun.
  7. Karın aortunu kesin ve sağ kalp sağ ventrikülüne 25-gauge iğne yerleştirin; Bu yerleştirmeden önce iğneyi 20 mL şırınga ile birleştirin. Akciğerler beyaza dönüşene kadar kan hücrelerini çıkarmak için yavaşça kalbe 1x PBS itin. Tipik olarak, pulmoner kan damarlarını temizlemek için 5 - 10 mL PBS gereklidir.
  8. Doldurun thE% 4'lük yeni PFA ile özel olarak yapılmış enflasyon tüpünü ve enflasyon tüpündeki tüm kabarcıkları çıkartın.
  9. Enflasyon borusunun 18-mertebeli iğnesini trakea sokun ve sıvı sızıntısını önlemek için trakeaya gemi klipsleri ile bağlayın.
  10. 25 sm bir sabit, transpülmoner basınç / H2O 2, 20% 4 PFA ile akciğerlerini şişirmek. Akciğerleri oda sıcaklığında 2 saat inkübe ederek tamamen akciğer genişletmesini sağlayın. Bu "ön-düzeltme" adımı, akciğer morfolojisini korumak için kritik önem taşır.
    1. Enflasyon borusunu izleyerek ilk% 4 PFA hacminin değerini kaydedin ve nihai hacmi kaydedin. İç akciğer hacmi, ilk% 4 PFA hacminden eksi son 4% PFA hacmine eşittir.
  11. Trakea bağlayın ve makas kullanarak, çevredeki bağ dokularından akciğerleri hafifçe parçalayın (akciğerleri sağlam tutun). Akciğerlere zarar vermemek için çok nazik olun.
  12. incuAkciğerleri, 4 ° C'de 12 saat boyunca çalkalayıcıda hafifçe çalkalayarak (50 dev / dak)% 4'lük PFA ile dolu 50 ml'lik bir konik tüpe koyun. Doku işleme ve boyama işlemlerine devam edin (bkz. Bölüm 4).

4. Doku Gömme, Kesitleme ve Hematoksilen ve Eozin (H & E) Boyama

  1. Düzeltmeden sonra, akciğerlerden kalbi ve aşırı bağ dokularını düzeltmek için Noyes Bahar Makas kullanın. Akciğer loblarını trakeaya bağlayan bronşu keserek bireysel akciğer loblarını nazikçe ayırın.
  2. Bir yörünge çubuğu çalkalayıcıda (50 dev / dak) akciğer loblarını 50 mL 1x PBS'de (30 dakika / yıkama) 3-4 kez yoğun yıkayın.
  3. Son yıkamayı takiben, doku 50 mL'lik konik tüplerin dibine (yaklaşık 12 saat) batıncaya kadar akciğer loblarını 4 ° C'de% 30 sükroz çözeltisine (1x PBS) daldırmak suretiyle kriyoproteksiyona uğratın.
  4. Gömülmeden ve cryosectioning dokularından önce, forseps ile tüplerden akciğer lob örnekleri çıkarın, acces korumakHistolojik analiz için sory lobları, aksesuar lop numunelerinin yüzeyinden kalan sukroz çözeltisini ilave edin ve sonra yaklaşık 30 dakika boyunca optimum kesme ısısı (OCT) bileşiğini içeren bir Petri kabına iyice daldırın.
  5. Cryomolds kullanarak sıvı azot içerisindeki OCT gömülü aksesuar lob örneklerini dondurun. Lobun en geniş yüzey alanını kalıbın tabanına paralel konuma getirin.
  6. Histolojik analiz için cryosectioning sırasında her numune için toplam üç 10-μm kalınlığında bölümleri hazırlayın. İlk 1 mm'lik dokuyu atın, 10 mm kalınlığında bir bölüm toplamayın, 0.5 mm doku atın, başka bir bölüm toplamayın, 0.5 mm doku atın ve üçüncü (son) bölümü toplayın.
  7. H & E boyamayı yapmadan önce bölümleri 1 saat boyunca havayla kurutun.
  8. H & E boyama yapın
    1. Musluk suyundaki 3-4 değişikliklerdeki bölümleri yıkayın ve daha sonra bölümleri taze hematoksilen içinde 2 dakika boyayın; Musluk suyunun altında yıkayın; Fazla hematoksileni çıkarmak için bölümü% 1 HC1-% 70 etanol solüsyonuna iki kez batırın.
    2. Parçayı taze eozin içinde 3 dakika boyunca boyayın; % 95 etanol içinde iki ardışık 30 s yıkama ve% 100 etanol ile iki 30 s yıkama ile bölümleri kurutun; Ksilen bölümlerini 30 s temizleyin, temizleme adımını bir kez taze ksilen içinde tekrarlayın; Slaytları, cam lamelleri kullanarak montaj ortalığına monte edin.

5. MLI ölçümü

  1. Parlak alan mikroskopu kullanarak H & E lekeli aksesuar lob bölümlerinin dijital görüntülerini (20X büyütme) elde edin.
  2. MLI'yi ölçmek için, 3 bölümden oluşan uygun alanlardan (arterler, damarlar, ana hava yolları ve alveolar kanallar olmaksızın) rastgele toplam 15 bindirmeyen görüntü (1000 μm x 1000 μm) seçin.
  3. 10 adet eşit dağıtılmış dikey çizgi ve 10 adet eşit olarak dağıtılan yatay çizgi ile bir ızgarayı yerleştirin.Cetvel aracını kullanarak seçilen alanlarda gth (1000 μm); Her hat 100 μm aralıklarla ayrılır ( Şekil 4B ).
  4. Bir kesişmenin değerini iki bitişik alveolar epitelyum arasındaki doğrusal uzunluk olarak tanımlayın. Her bir 1000 μm uzunluk çizgisi boyunca tüm kesişme değerlerini ölçün.
  5. Her bir ızgara için, 10 yatay 1000 μm uzunluk çizgisi ve 10 dikey 1.000 um uzunluk çizgisi arasındaki tüm kesme noktalarının değerlerini ölçün.
    NOT: MLI, her aksesuar lob için hazırlanan 3 bölümden analiz edilen toplam 15 ızgaradan kesme uzunluklarının ortalama değeridür.

6. ISA'nın hesaplanması

  1. Denklem 1'i kullanarak ISA'yı hesaplayın ( Giriş'e bakın). ILV'nin ölçümü için bölüm 3'e bakınız ve MLI'nin nicelendirilmesi için bölüm 5'e bakınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, PNX ile işleme tabi tutulan bir grup ve bir protez implantasyonu (Protez yerleştirilmiş) grubu ile bir deney gerçekleştirdik. Bu gruplamalar, araştırma grubumuzdan daha önce yayınlanmış bir çalışmada kullanılan gruplamalarla aynıdır 14 .

Fare PNX ve protez yerleştirme prosedürleri Şekil 2'de gösterilmektedir. Ameliyatlar ve kantifikasyon için 8 haftalık CD-1 erkek fareler kullanılmıştır. PNX ile tedavi edilen grupta ve Protez implanted grubunda sol akciğer lobları rezeke edildi ( Şekil 2A - 2I ). Protez implanted grubunda, sol akciğer lobu çıkarıldıktan sonra sol akciğer lobunun boyut ve şeklini taklit eden bir protez göğüs içine sokuldu ( Şekil 2J - 2L ).

Ameliyattan on dört gün sonra geriye kalan sağ akciğerlerin ILV'sini belirlemek için ısmarlama bir şişirme tüpü kullanıldı ( Şekil 3A ). Kalan sağın ortalama ILV'si 5 PNX ile muamele edilen farelerin akciğerleri yaklaşık 1.4 mL idi ve bu da Protez yerleştirilen 5 farenin sağ akciğerlerinin 1.05 mL ILV değerlerinden anlamlı derecede yüksekti ( Şekil 3B , Tablo 1 ).

MLI ölçümü için, her fareden hazırlanan 3 bölümden toplam 15 görüş analiz edilmiştir. Şekil 4A , aksesuar lob kesitinden birleştirilmiş bir görüntüyü ve MLI'nın nicelendirilmesi için kullanılan seçili bir alan ( örn., Görünüm 1 - 3) veya seçilmemiş bir alan ( örn., Görünüm 4 - 5) için morfolojik standardı göstermektedir. Burada, PNX ile tedavi edilen grubun aksesuar akciğer lob bölümünden görüntü 3,MLI ölçümü ( Şekil 4B ). Resim 3 için büyütülmüş bir resim de görüntülenir ( Şekil 5A ). Hat 3 örneği olarak sunulmuştur: kesilen alveol hava boşluğunun iki başlı ok çizgileri tarafından gösterilen uzunluğu. Analizlerimiz, PNX ile muamele edilen farelerin kalan sağ akciğerlerindeki MLI değerlerinin, protez yerleştirilen farelerin kalan sağ akciğerlerinden anlamlı ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi ( Şekil 5B , Tablo 1 ). Tüm veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur ( Şekil 5B ).

ISA Denklem 1 kullanılarak hesaplandı. Tablo 1 , tüm akciğerlerin ILV değerlerini, MLI değerlerini ve ISA'sını göstermektedir. Protez ile implante edilen farelerin ISA'sı, PNX ile muamele edilmiş farelerinkinden çok daha küçüktü ve bu, insertioBir protezin PNX ile indüklenen rejenerasyonu zayıflattı.

Şekil 1
Şekil 1: Fare Endotrakeal Entübasyon ve Mekanik Ventilasyon. ( A ) Laringoskop ile 20G intravenöz entübasyon kanülü ile endotrakeal entübasyon. ( B ) Ameliyat öncesinde tamamen anestezi altındaki fareyi basınç kontrollü bir mekanik ventilatöre bağlayın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Fare Pnömonektomi (PNX) ve Protez İmplantasyonu. ( A - C ) Cildi ve kas tabakasını kesin; B durdurCerrahi işlem sırasında yüksek sıcaklıklı bir koterizör ile leeding. ( D - E ) 5. interkostal boşluğa 1.5 cm'lik bir kesi yapın. ( F - H ) Sol akciğer lobunu künt forseps ile dışarı çekin ve hilumda bağlayan pulmoner arter ve bronşları tanımlayın. Ok başları, sol akciğer lobunun pulmoner arter ve bronşunu temsil eder. ( I ) Sol akciğer lobu ligasyondan 3-4 mm'de rezeke edildi. ( J - L ) Sol göğüs boşluğuna protez takın. ( M, N ) Göğüs, kas tabakası ve cilt katmanı dikin. ( O ) Spontan solunum hareketleri başlayıncaya kadar fareleri izleyin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.


Şekil 3: Kalan Sağ Akciğerlerin İç Akciğer Hacimlerinin (ILV) Ölçümü. ( A ) İç akciğer hacimlerini ölçmek için özel bir cihaz ("enflasyon tüpü"). ( B ) PNX ile tedavi edilen grubun ve kalan Protez uygulanan grubun geri kalan sağ akciğerlerinin ILV'leri (ortalama ± SEM) PNX sonrası 14 gün içinde ölçüldü. **, p <0.01, Öğrencinin t testi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Kalan Sol Akciğerlerde Aksesuar Lobların Ortalama Doğrusal Kesişiminin (MLI) tayini. ( A ) Birleştirilmiş bir imAksesuar lob bölümünün yaşı gösterilir. MLI kantifikasyonu için seçilen alanlara örnekler ( örn., Görünüm 1 - 3) ve seçilmemiş alanlar ( örn., Görünüm 4 - 5). ( B ) Seçilen uzunlukta (1000 μm) eşit aralıklarla yerleştirilmiş 10 adet dikey çizgi ve eşit aralıklarla yerleştirilmiş 10 adet yatay çizgi seçilen alana yerleştirildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: PNX ile işlemden geçirilmiş akciğerler ve protezle implante edilen akciğerlerde MLI'nin miktarı. ( A ) Şekil 4B'deki büyütülmüş bir görüntü 3 gösterilmektedir. Çift ok uçlu kırmızı renkli çizgiler, bir doğrusal kesmenin uzunluğunu temsil eder. ( B ) MLI değerleri (ortalama ± SEM.), PNX ile muamele edilmiş farelerin ve Protestij ile implante edilen farelerin aksesuar loblarının PNX sonrası 14 günde ölçülmüştür. *, P <0.05, Öğrencinin t testi. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Ameliyattan 14 gün sonra Iç akciğer hacmi (ml) Ortalama doğrusal kesişim (mm) İç akciğer yüzey alanı = 4ILV / PAM (cm2)
PNX ile muamele 1.5 57.8 1.038,06
1.35 49.6 1.088,71
1.42 48.5 1.171,13
1.4 51.5 1.087,38
1.4 54.6 1.025,64
Protez implante 1.1 49.6 887,10
1 50.5 792,08
1.1 47.3 930,23
1.15 44.8 1.026,79
0.86 46.3 742,98

Tablo 1: PNX ile muamele edilmiş ve Protez İmplante Edilen Farelerin ISA Değerlerinin Hesaplanması. PNX sonrası 14 günlük aksesuar lobların ILV, MLI ve ISA değerleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde, fare sol akciğer PNX ve protez yerleştirildikten sonra pulmoner parametrelerin ölçümü hakkında ayrıntılı açıklamalar sağlarız. ISA, şimdi birçok pulmoner hastalıkta solunum fonksiyonlarının değerlendirilmesi ve yaralanmanın yol açtığı alveol rejenerasyonunda önemli bir metrik olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, pulmoner araştırma topluluğu ISA'nın yararlı bir metriği olarak yararlı olduğu konusunda anlaşmaya rağmen, günümüze kadar ISA hesaplamak için kullanılan iki parametre olan ILV ve MLI'nin ölçümünün standardizasyonu hakkında pek düşünülmemiştir. Açıkçası, herhangi bir ölçümde olduğu gibi, tarafsız veriler elde etmeye çalışmak önemlidir. Mevcut araştırmanın temel amacı, fare atmosferi araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere standartlaştırılmış bir protokol oluşturmaktır.

Bu protokolü geliştirdikçe ölçüm önyargı kaynaklarını çeşitli şekillerde azaltmaya çalıştık. ILV ölçümlerinde varyasyonun kırmızı olduğunu tespit ettikTrakea içine yerleştirilen iğnenin boyutunun boyutsal olarak eşleştirildiğinden emin olunarak sıvı sızıntısını önleyerek bulaştırdı (18-gauge iğnelerinin farelerin trakealarına çok yakın olduğunu gördük). Fare göğüs duvarının, PFA enflasyonundan önce iyice çıkartılması gerektiğini de bulduk, çünkü bu, göğüs duvarının ILV ölçümleri üzerindeki potansiyel etkisini en aza indiriyor. MLI değerleri, alveol morfolojisine büyük ölçüde bağlıdır. Buna göre, yaş uyumlu ve cinsiyet uyumlu farelerin kullanılmasının önemine ilaveten, akciğer fiksasyon işlemleri sırasında alveol morfolojisinin düzgün bir şekilde bakımı kritik öneme sahiptir. Burada geniş kabul görmüş bir fiksasyon yöntemi kullandık: Akciğer dokusunu tamamen genişletmek için akciğerleri taze hazırlanmış% 4 PFA ile 25 cm H 2 O'luk bir transpulmoner basınç altında şiştık. Deneyimlerimize göre, daha düşük distansiyon basınçları doku daralmasına, anormal alveolar morfolojiye ve sonuçta düşük MLI değerlerine neden olabilir.

GözlemleriÖnceki çalışmalarımız, kalan akciğerin aksesuar lobunun, PNX yenilenmesinden sonra sağ akciğerin diğer üç lobu ile karşılaştırıldığında maksimal hacimsel genişleme sergilediğini; Kalan akciğerin aksesuar lobu da morfolojik parametrelerin ( örn., MLI) 21 , 22 , 23 , 24 değerlerinde maksimum artışlar sergilemektedir. Bu nedenle, sadece farklı akciğer loblarındaki değişimleri önlemek için aksesuar loblardan alınan bölümleri analiz ettik. MLI miktarının belirlenmesinde kullanılan çeşitli bölümler arasındaki varyasyonu azaltmak için gömme sırasında lob yönünü kontrol ettik: lobun en geniş yüzeyini kriyometrenin tabanına paralel olarak yerleştirdik. Ayrıca numune dilimlerinin kalınlığını, kesit örneklemesinin sırasını ve kesit alma sırasındaki kesme konumunu dikkatlice kontrol ettik. Numune işleme ek olarak, başka bir importanStandartlaştırmanın bir yönü, tüm damar ve damarlar, plevra, ana hava yolları ve alveolar kanalların MLI kantifikasyonu sırasında değerlendirilen doku bölgelerinden çıkarılması gerektiğidir. Arterler, damarlar ve alveolar kanalların hepsi alveollerden (4 - 10 kat daha büyük) daha büyüktür, bu nedenle bu büyük yapıların hariç tutulması güvenilir kesişim ölçümleri elde etmek için önemlidir. Her bir grup için, 5 fare, niceleme için yeterlidir. Her bir fare için, aksesuar lobun 3 bölümünün uygun alanlarından (arterler, damarlar, ana hava yolları ve alveolar kanallar olmaksızın) rasgele seçilen toplam 15 bindirmeyen görüntü (1000 μm x 1000 μm) gösterildi. Örnek gömme yöntemi ve MLI ölçümü aynı zamanda parafin ile tedavi edilen akciğer dokularına da uygulanabilir.

Diğerleri, toplam hat uzunluğu çapraz alveolar duvarlar 25 ile kesilenlerin sayısına bölünmüş olarak MLI'yi tanımlarken, burada doğrusal bir kesişim olarak doğrusal bir kesişim kullandıkMLI verilerinden mezenşimin kalınlığını göz ardı ederek, MLI hesaplamaları sırasında iki bitişik alveolar epitelyal duvar arasında. Buna göre, ISA'yi ILV kullanarak hesapladık, ancak toplam akciğer hacmini hesapladık.

PNX ve protez implantasyon prosedürleri için, PNX uygulanan farelerin hayatta kalma oranı% 85 ila% 90 arasında değişmektedir. Protez implantasyonu geçiren farelerin hayatta kalma oranı% ~ 80 civarındaydı. Tüm ameliyatlarda farelerin hayatta kalmasını iyileştirmek için birkaç adım atılmalıdır. 1) Kateteri trakeaya doğru şekilde yerleştirmek başarılı PNX işlemi için bir ön şarttır. Bir larengoskobun yönlendirmesiyle, fare trakeası, güvenli ve etkili endotrakeal entübasyonu kolaylaştırmak için kolaylıkla gözlemlenebilir. 2) İşlem sırasında akciğerleri veya kalpleri delmeyin. Beşinci sol interkostal boşluğun toraksının geniş açılıp açılmadığından ve sol lob hilumunun lobektomiden önce açık bir şekilde tanımlandığından emin olun. Sol akciğer lobunu tekrar uygularkenBölümünde, pulmoner kanamayı ve / veya lob rüptürünü önlemek için künt forseps vasıtasıyla sol lobun sağlam olduğundan emin olun. Yara kapanırken, cerrahi iğnenin ucunu kalpten ve ciğerlerden uzak tutun. 3) Protezi boş göğüs boşluğuna sokarken nazik olun, zira aşırı kuvvet plevra rüptürüne neden olabilir. 4) Fareler, 38 ° C'lik bir termal ped üzerine konmalı ve postoperatif hipoterminin fare hastalıklarını artırdığı bilinirse, duyuları iyileşinceye kadar izlenmelidir.

Sol akciğer lobunun çıkarılmasından sonra hem pulmoner respiratuar üniteler hem de internal akciğer gazı değişim bölgesi önemli derecede azaldı. Ameliyattan 14 gün sonra geriye kalan akciğer dokusunda ILV, MLI ve ISA, PNX ile tedavi edilen farelerin Protez yerleştirilmiş grubundan daha belirgin bir şekilde daha büyüktü ve bir protezin sokulmasının, PNX ile uyarılan alveoları bloke ettiğini şiddetle önermişti rejenerasyon. Böylece hem PNX hem de protez yerleştirme fare moduMekanik güçle uyarılan yeniden alveolarizasyon sırasında oluşan hücresel ve moleküler olayların araştırılması için güçlü araçlar olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, Yap AT2 null akciğerlerinin ISA değerleri, PNX sonrası gün 14 1'de kontrol akciğere kıyasla belirgin şekilde küçüktür ve bu da protokolün genetik mutant farelerin bozulmuş rejenerasyonunu tespit etmek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada sunulan sıkı ve standartlaştırılmış nicel yöntemler, gelişimsel çalışmalarda ve kronik obstrüktif akciğer hastalıklarında amfizem, akciğer yaralanmalarını takiben alveol rejenerasyonu ve akciğer gelişimini içeren genetik olarak modifiye edilmiş birçok hastalığın hayvan modellerinde akciğer parametrelerini ve ISA'yı ölçmek için uygulanabilir kusurlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, yardım için Pekin Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü'nü kabul etmek istiyorlar. Bu çalışma Pekin Belediye Tabiat Bilimleri Vakfı (No. Z17110200040000) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16, (7), 1810-1819 (2016).
  2. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22, (6), 483-496 (1967).
  3. Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108, (2), 412-421 (2010).
  4. Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
  5. Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
  6. Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351, (6274), 707-710 (2016).
  7. Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, (3), 539-553 (2011).
  8. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, (4), 320-328 (1962).
  9. Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137, (3530), 577-585 (1962).
  10. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95, (5), 765-773 (1967).
  11. Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, (16), 244-247 (2012).
  12. Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94, (1), 405-412 (1994).
  13. Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120, (5), 1125-1136 (1979).
  14. Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5, (2), 92-95 (1988).
  15. Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115, (1), 7-13 (1977).
  16. Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75, (2), 195-205 (1939).
  17. Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281, (5), L1279-L1287 (2001).
  18. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  19. Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
  20. Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158, (4), 1230-1234 (1998).
  21. Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107, (5), 1569-1578 (2009).
  22. Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24, (4), 524-532 (2004).
  23. Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
  24. Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2, (1), (2012).
  25. Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics