Anvendelse af kapsler til negativ farvning af virale prøver inden for biokonduktion

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Denne protokol giver vejledning til negative farvningsvirusprøver, der let kan bruges i BSL-2, -3 eller -4-laboratorier. Det omfatter brugen af ​​en innovativ behandlingskapsel, som beskytter transmissionselektronmikroskopi nettet og giver brugeren nemmere håndtering i de mere turbulente miljøer inden for biokonduktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bruges til at observere ultrastrukturen af ​​vira og andre mikrobielle patogener med nanometeropløsning. De fleste biologiske materialer indeholder ikke tætte elementer, der er i stand til at sprede elektroner for at skabe et billede; Derfor kræves en negativ plet, som placerer tætte tungmetalsalte rundt om prøven. For at visualisere virus i suspension under TEM skal de påføres små rister, der er belagt med en gennemsigtig overflade, kun nanometer tyk. På grund af deres lille størrelse og skrøbelighed er disse grids vanskelige at håndtere og let flyttes af luftstrømme. Den tynde overflade er let beskadiget, hvilket giver prøven svært eller umuligt billede. Infektiøse vira skal håndteres i et biosikkerhedsskabe (BSC), og nogle kræver et biokonduktiv laboratoriemiljø. Farvevirus i biosikkerhedsniveauer (BSL) -3 og -4 er særligt udfordrende, fordi disse miljøer er mere turbulente og teknikere er påkrævet tO Brug personlige værnemidler (PPE), hvilket reducerer fingerfrekvensen.

I denne undersøgelse vurderede vi en ny enhed til at hjælpe med negative farvningsvirus i biokontainering. Enheden er en kapsel, der fungerer som en special pipettespids. Når rister er fyldt ind i kapslen, aspirerer brugeren simpelthen reagenser ind i kapslen for at aflevere virussen og pletterne til det indkapslede gitter, hvilket eliminerer brugerhåndtering af gitter. Selvom denne teknik er designet specielt til brug i BSL-3 eller -4-biokonduktion, kan det lette prøveforberedelsen i ethvert laboratoriemiljø ved at muliggøre let negativ farvning af virus. Denne samme metode kan også anvendes til fremstilling af negative farvede TEM-prøver af nanopartikler, makromolekyler og lignende prøver.

Introduction

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er et effektivt redskab til at se morfologi og ultrastruktur af biologiske prøver, der er for små, til at ses med et traditionelt lysmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 . TEM'er skyder elektroner gennem en meget tynd prøve, der producerer et højere opløsningsbillede, da elektroner har en meget kortere bølgelængde end lys. Regioner af prøven, der bøjer eller blokkerer elektroner, ser mørke ud, mens områder, der er elektronlucent, fremstår som hvide.

Mangel på elektron tæt stof gør viruser vanskelige at se under en TEM, fordi de ikke kan scatter elektroner. Negativ farvning er den mest almindelige metode til at oprette kontrast og se virus med en TEM. Den første negative farvningsprocedure blev foreslået af Brenner og Horne i 1959, baseret på et eksperiment hvor Hall (1955) og Huxley (1957) observeredeVed udseendet af biologiske strukturer i omvendt kontrast, når de nedsænkes i et elektron-tæt stof 5 . Processen med negativ farvning har været stort set uændret i løbet af det sidste halve århundrede. Negativ farvning indebærer kort anvendelse af en tungmetalsaltopløsning på en prøve på et TEM-net i et forsøg på at omslutte virussen med tæt materiale uden at infiltrere viruset 6 . Dette skaber en mørk kant og afslører partikelens form 5 . Denne undersøgelse bruger to reagenser til negativ farvning, uranylacetat (UA) og kaliumphosphotungstic acid (PTA). Begge disse pletter anvendes almindeligt til at plette små biologiske prøver negativt, såsom vira, proteinkomplekser og nanopartikler 7 , 8 , 9 .

Den konventionelle negative farvningsteknik er den manuelle dråbe negative farvningsteknologiNique 7 . Denne metode kræver præcis håndtering af små, skrøbelige TEM grids med tang for at anvende små mængder af virusprøve, plet og skylninger. Den typiske fremstillingsprotokol involverer påføring af en dråbe prøveekspension på overfladen af ​​et filmcoatet TEM-gitter ( figur 1A ). Efter tilslutning af prøven til filmoverfladen skylles gitteret for at fjerne ikke-vedhængende vira og farves med enten UA eller PTA i nogle sekunder til et minut afhængigt af typen af ​​prøve. Overskydende væske er ond væk fra gitteret ved at røre et stykke filterpapir til kanten af ​​gitteret.

Den manuelle dråbe metode kræver, at hvert gitter skal fremstilles individuelt. Hvis de ikke håndteres omhyggeligt, kan de coatede TEM-net nemt punkteres, bøjes eller forurenes. Behandling af flere prøver kan medføre problemer med at spore nettet og sikre ensartet farvning for hver prøve. Denne manuelle farvningsprocedure er meget mere dEffektive, når det udføres på biosikkerhedsniveau (BSL) -3 og -4 biokonduktionslaboratorier, på grund af det krævede personlige værnemiddel (PPE), der kræves for disse miljøer. PPE er besværligt, og biokonduktionsmiljøet er meget mere turbulent sammenlignet med et almindeligt laboratorium. Personale i BSL-3 biokonduktionslaboratorier skal have 2 par handsker og arbejde i et biosikkerhedsskabe (BSC). Dette dobbeltlag af handsker reducerer taktil følsomhed og begrænser finmotor bevægelse. Luftstrømmen af ​​BSC, der beskytter brugeren og hjælper med at forhindre prøveforurening kan medføre, at prøverne og pletterne tørrer for hurtigt og dermed påvirker pletkvaliteten. Den stærke turbulente luftstrøm i BSC kan også hurtigt blæse væk et gitter, der ikke er godt sikret. I BSL-4 biokonduktionslaboratorier er der yderligere sikkerhedskrav. Personale skal have en positiv trykdragt, som yderligere begrænser fysisk bevægelse og evnen til at se og manipulere klartUlate grids. Teknikeren, der arbejder i BSL-4, bærer også mindst 2 par handsker, hvor det ydre par er en tyk handske, der i høj grad reducerer fingerfærdighed og taktil følelse. Endelig er de tang, der bruges til at håndtere TEM-gitter, skarpe og derved udgør en risiko for teknikeren på grund af deres evne til at punktere handsker. Med kapsler, der indeholder gitter, er tænger ikke nødvendige, hvilket giver et sikkert, tangfrit alternativ til manipulation af gitter i biokontainering. Endelig tilvejebringer kapslerne også en effektiv måde at lagre gitter under behandling, osmiumdampdekontaminering og under opbevaring; Hvorved netene organiseres og sikres mod skader.

I denne rapport introducerer vi en ny metode til negativ farvning af TEM-net i biokonduktionslaboratorier, der anvender mPrep / g kapsler, en kapselbaseret enhed til nethåndtering og farvning 10 , 11 , 12 . Kapslen accomModificerer to TEM-net, minimerer direkte håndtering og reducerer potentialet for netskader. Kapslen føjes direkte til en enkelt- eller flerkanalspipette på samme måde som en pipettespids, hvilket tillader anvendelse af forskellige væsker til gitter indeholdt i. Dette muliggør samtidig forberedelse af flere prøver med dubletter ( figur 1B ). Til negativ plet med kapsler aspireres virusprøven ind i kapslen og holdes i 10 minutter for at lade virusserne adsorbere på gitterfladerne. Gitterene med adsorberet virus vaskes efterfølgende med deioniseret (dI) vand og farves med enten UA eller PTA i nogle få sekunder til 1 min. Denne proces bruger de samme protokolstrin og reagenser som den manuelle dråbe metode; Forskellen er, at alt arbejde sker inden i kapslen uden fysisk håndtering af gitterene. ( Fig. 1C , 1D ).

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere kapsler somEn ny metode til negativ farvning af virusprøver i biokonduktionsmiljøer. Denne undersøgelse undersøgte også kvaliteten af ​​TEM-billeder fremstillet ved to forskellige virusinaktiveringsprocedurer: 1) hurtig inaktivering med 1% osmiumtetroxiddamp og 2) 24 timers inaktivering med 2% glutaraldehyd. Begge disse blev udført under anvendelse af kapslerne. Endelig vurderede vi to almindeligt anvendte negative pletter, UA og PTA, til brug i kapslen. 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentforberedelse i et BSL-2 miljø før arbejde med virusprøverne

  1. Forbered eller køb Formvar og carbonbelagt TEM kobbergitter, normalt 200-400 mesh.
  2. Indsæt de coatede TEM-gitter i kapsler.
    1. Brug en forstørret linse til at gøre denne proces nem at udføre. Et eller to gitter kan indsættes i hver kapsel. Forlæste kapsler kan købes for at eliminere dette trin, hvis det ønskes.
  3. Overfør kapslerne med indsatte TEM coatede net sammen med andre forsyninger og reagenser til biokonduktion, hvor viraene bliver negativt farvede.

2. Kapselmetoden til negativ farvning i biokontainering under anvendelse af vandigt glutaraldehyd og 1% osmium tetroxid damp inaktivering

  1. Inden for biokonstruktion BSC aspirerer 40 μl virus suspension i kapslen fastgjort til en pipette.
    BEMÆRK: Pipetten forbliver fastgjort til thE kapsel, indtil processen er afsluttet. Virusforberedelse er ifølge vores tidligere offentliggørelse 14 .
  2. Placer pipetten på sin side i 10 minutter med grids orienteret vandret. Dette er at fremme en jævn fordeling af viruspartikler på de belagte gitter.
  3. Inaktiver virus inden i kapslen inde i biokonstruktions BSC.
    1. Pick up pipetten og tryk stemplet for at aflevere virusopløsningen i en affaldsbeholder.
    2. Aspirer 40 μL 2% glutaraldehydfixeringsmiddel i kapslerne.
      Forsigtig: Glutaraldehyd er et farligt kemikalie og kræver passende beskyttelse. Glutaraldehyd kan anvendes i korte perioder i et normalt BSC, men udvidet åbent reagens kræver arbejde i en kanaliseret BSC eller kemisk dampkåle.
    3. Placer pipetten på siden i 20 minutter. Dette er for at sikre, at prøverne er godt fastgjort.
    4. Udstød fiksativet og aspirér 40 μl dI vand ind i kapslerne til wAske væk fixativet. Gentag dette vaske trin for i alt 3 skyllemetoder.
  4. Aspirer 40 μL af enten 1% uranylacetat (UA) eller 1% kaliumphosphotungsticsyre (PTA) i kapslerne og lad dem sidde i 30 s.
    BEMÆRK: Farvningstiden kan variere fra 10 s til 1 min baseret på virusprøve.
    Forsigtig: UA er en alfa-emitter og et kumulativt toksin. Håndter det med passende beskyttelse.
  5. Fjern kapslen fra pipetten og blottet tørre netene ved at røre et stykke filterpapir i kanten af ​​gitterene, mens gitterene forbliver inden i kapslen.
  6. Osmium tetroxid damp inaktivering procedure.
    1. Læg kapslen, med låget åbent, i et 50 ml centrifugerør indeholdende filterpapir gennemblødt i en 1% osmiumtetroxidopløsning.
      Forsigtig: Osmiumtetroxid er ekstremt giftigt med lavt damptryk. Det skal bruges i en BSC eller kemisk dampkåle. Håndter det med passende beskyttelse. Indsend advarselOplysninger på arbejdsområdet.
    2. Sæt 50 ml centrifugerøret i 1 time for at tillade fuldstændig permeation af osmiumtetroxiddampen. Derefter dekontaminere og overføre røret fra biokonstruktionen til BSL-2 EM-anlægget.
  7. Fjern EM gitter fra kapslen.
    1. I BSL-2 EM-anlægget skal du fjerne kapslen fra centrifugerøret og placere den på en pipette.
    2. Aspirer 40 μl dl vand ind i kapslen og dispens vandet i en affaldsbeholder tre gange.
    3. Fjern kapslen fra pipetten og blæk tørrer gitterene med filterpapir for at røre kantens kant.
    4. Efter lufttørring opbevar gitterene til efterfølgende TEM-billeddannelse.

3. Kapselmetoden til inaktivering i biokontainering med 2% glutaraldehyd efterfulgt af negativ farvning i et BSL-2 laboratorium

  1. Virus inaktivering procedure.
      Forsigtig: Glutaraldehyd er et farligt kemikalie og kræver passende beskyttelse. Glutaraldehyd kan anvendes i korte perioder i et normalt BSC, men udvidet åbent reagens kræver arbejde i en kanaliseret BSC eller kemisk dampkåle.
    1. Inaktiver virus med fixativ i mindst 24 timer inden emballering, dekontaminering og overfør den til BSL-2 EM faciliteten.
  2. I BSL-2 EM-anlægget aspirerer virus- og fikseringsblandingen i kapslen, der indeholder to TEM-gitter, der er fastgjort til en pipette.
  3. Placer pipetten vandret i 10 minutter med gitteret orienteret vandret.
    BEMÆRK: Dette er at fremme en jævn fordeling af viruspartikler på TEM-netværket.
  4. Pick up pipetten og tryk stemplet for at udvise virusen i en affaldsbeholder. Aspirer 40 μl dlVand ind i kapslerne og uddriv det i affaldsbeholderen i 3 skyllecykler.
  5. Aspirer 40 μL af enten 1% UA eller 1% PTA i kapslerne i 30 s.
    BEMÆRK: Farvningstiden varierer fra 10 s til 1 min baseret på virusprøve.
    Forsigtig: UA er en alfa-emitter og et kumulativt toksin. Håndter det med passende beskyttelse.
  6. Fjern kapslen fra pipetten og blød tørret gitter ved at røre kanten af ​​gitterene på et stykke filterpapir. Lufttør netene og opbevar dem til efterfølgende TEM-billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kapselmetoden producerer god kvalitet negativ farvning til TEM-billeddannelse:

For det første vurderede vi kvaliteten af ​​billeder genereret ved at bruge både manuel dråbe metode og kapsel metoder til negativ farvning Zaire ebolavirus. Ebolaviruser er medlemmer af Filoviridae- familien sammen med Marburg-virus. Ebolavirus er typisk 80 til 100 nm i diameter og kan være over 1000 nm i længden. Ebolavirus skal håndteres i et biokonstruktionsmiljø BSL-4. Figur 2 viser billeder genereret ved hjælp af manuel dråbe metode og kapselmetoden til negativ farvning. Figur 2A (manuel dråbe metode) og Figur 2B (kapselmetode) viser ebolavirusprøver, der har klart definerede detaljer med nukleokapsidstrukturer i centrum af virionen og synligt ebolavirusglycoproteinS på overfladen. Således har både kapsel- og dråbe-metoderne mulighed for at producere lignende kvalitets-TEM-billeder.

Sammenlign og vurder EM-billedkvalitet efter hurtig inaktivering med vandigt glutaraldehyd og 1% osmiumtetroxiddamp versus 24 timers inaktivering med 2% vandigt glutaraldehyd ved anvendelse af kapselmetoden:

Vi vurderede kvaliteten af ​​TEM-billeder genereret af to forskellige metoder til prøveinaktivering ved hjælp af Chikungunya-virus. Chikungunya-virus er medlem af Alfavirus- slægten i familien Togaviridae . Det er sfærisk med en diameter på 60-70 nm. Virionen indeholder en konvolut rig på glycoproteiner, som danner trimeriske pigge på viraloverfladen. Chikungunya-virus skal håndteres i BSL-3. Hurtig inaktivering opnås ved anvendelse af 2% glutaraldehyd i 20 minutter efterfulgt af en 1 time eksponering for 1% osmiumtetroxid damp, med hele negAtiv farvningsproces, der forekommer i en kapsel inden for et BSC i biokonduktionslaboratoriet ( figur 1C ). Når der imidlertid anvendes 2% glutaraldehyd i 24 timer for at inaktivere virussen, forekommer inaktiveringen i et biokonduktionsmiljø, men 1% UA-negativ farvemetoden udføres ved anvendelse af kapselmetoden i et BSL-2 laboratorium ( Figur 1D ). Disse inaktiveringsprocedurer producerer ikke de samme kvalitetsbilleder ( figur 3 ). Det fremgår klart af figur 3, at fiksering i glutaraldehyd uden tilstedeværelse af osmiumtetroxid ( figur 3A , 3B ) viser mere ultrastrukturelt detaljer end prøver fremstillet med glutaraldehyd og osmiumtetroxid ( figur 3C , 3D ).

Kapselmetoden virker godt ved anvendelse af uranylacetat (UA) og phosphOtungstic acid (PTA) som negative pletter for aldehydfaste prøver.

Eksempler på UA- og PTA-negativ farvning under anvendelse af kapselmetoden er vist i figur 4 på aldehyd-fikserede viruslignende partikler (VLP'er). VLP'erne er proteiner samlet i viruslignende strukturer, men indeholder ikke noget viralt genetisk materiale. De anvendes typisk i vaccineudvikling og til grundvirusforskning. Negativ farvning er et værdifuldt værktøj til at evaluere VLP-samling og morfologi. Vi brugte både UA og PTA til negativ farvning af VLP'er med kapselmetoden. Begge pletter viser resultater af høj kvalitet med glykoproteiner synlige og klart definerede grænser af Ebola nano-VLP'erne 15 ( Figur 4A , 4B ) og Murine Leukemia VLP'er 16 ( Figur 4C , 4D ).


Figur 1: Negative farvningsmetoder Oversigt. ( A ) Manuelle dråbemetode udføres ved sekventielt bevægende TEM-gitter fra dråben til dråbe af prøve, skylninger og pletter. ( B ) Opstilling af kapselmetoden med gitter og påføring af prøveophæng. ( C ) Typisk procedure ved anvendelse af kapselmetoden i biokontainering med kortvarig inaktivering med 1% osmiumtetroxiddamp. ( D ) Anbefalet procedure ved anvendelse af kapselmetoden i biokontainering med langvarig inaktivering med 2% glutaraldehyd. Figur blev tidligere offentliggjort og genbrugt med tilladelser fra reference 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 2: Sammenligning af 1% PTA Negative Stained Ebolavirus Partikler. ( A ) Negativ farvet med den manuelle dråbe metode. ( B ) Negativ farvet ved anvendelse af kapselmetoden. Figur blev tidligere offentliggjort og genbrugt med tilladelser fra reference 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: 1% UA negativ farvning med kapselmetoden for Chikungunya-virus ved anvendelse af forskellige inaktiveringsprocedurer. ( A , B ) inaktivering i mindst 24 timer med kun 2% glutaraldehyd. ( C ,D) Hurtig inaktivering med 2% glutaraldehyd og 1% osmiumtetroxiddamp. Figur blev tidligere offentliggjort og genbrugt med tilladelser fra reference 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Eksempler på phosphotungstic acid (PTA) og urranylacetat (UA) negativt farvede viruslignende partikler (VLP'er) ved anvendelse af kapselmetoden. ( A ) Lav forstørrelse overblik over 1% PTA-farvede ebola nano-VLP'er. ( B ) TEM-billede med høj forstørrelse, der viser strukturelle detaljer af PTA-farvede ebola nano-VLP'er. ( C ) Lav forstørrelse overblik over 1% UA-farvede Murine Leukemia VLP'er. ( D ) Høj forstørrelse TEM billede viser strukturelle detAils af UA farvede Murine Leukemia VLPs med ebolavirus glycoprotein på deres overflade. Figur blev tidligere offentliggjort og genbrugt med tilladelser fra reference 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Negativ farvning er en værdifuld TEM-teknik til evaluering og størrelsen af ​​virus, proteinkomplekser og nanopartikler. Droplet forberedelse af disse prøver ved manuel flytning af gitter fra reagens til negative pletter har været den klassiske protokol i mere end et halvt århundrede. Det er en simpel proces, men kræver ekspertise opnået gennem træning for vellykket gennemførelse. Fremragende negativ farvning betragtes stadig som et avanceret færdighedssæt og meget ønskeligt i mange TEM-laboratorier. Kapselmetoden har flere forskellige fordele i forhold til den manuelle dråbe metode, især i biokonduktionslaboratorier. Først kræver den manuelle dråbe metode en betydelig træning og erfaring, før den kan udføres med succes, mens den nemme at bruge kapselmetoden kan udføres af indgangsniveau teknikere ved simpel pipettering. Den største udfordring med den manuelle dråbe metode er den vellykkede håndtering af TEM-netene med tang i BSL-3 og BSL-4 PPE på grund af tO den stærkt reducerede taktile sensation og fingerfærdighed Fragile coated TEM grids er let beskadiget eller punkteret med tang. Skader på det belagte TEM-gitter er ofte ikke afsløret, før det ses med en TEM. En anden fordel ved kapsler er, at TEM-netene kun håndteres direkte, når de indsættes i kapsler, og når de fjernes for indsættelse i elektronmikroskopet. Uanset om man arbejder i biokonduktionslaboratoriet eller i BSL-2 EM-anlægget, er der ingen direkte nethåndtering. En tredje fordel ved kapselmetoden er, at begge sider af gitteret er dækket af vira og pletter. Dette kan være nyttigt, når prøvekoncentrationen er lav; Dog kan dette forårsage for meget prøve, hvis koncentrationen er høj eller resultere i fortynding af prøven før brug.

Negative farvning flere gitter ved hjælp af manuel dråbe teknik er tidskrævende, fordi hver prøve skal individuelt fremstilles og farves. Dette fører til vanskeligheder obtaiNing konsistent, reproducerbar farvning. Endvidere er det altid en udfordring at holde styr på mange individuelle net. Hver kapsel indeholder to gitter, og flere kapsler kan fastgøres til en flerkanalspipette, der strømliner processen. Kapsler sikrer derfor, at gitter er farvet ved hjælp af en meget lignende proces under konsekvente prøvebetingelser og på samme tid. Kapslerne kan mærkes til hjælp i organisationen, hvilket reducerer potentialet for sammenblanding eller fejlidentifikation af gitter. Et andet almindeligt problem, der står over for, når man bruger den manuelle dråbe metode, er gitterforurening. Dette kan ske, når gitterene er forladt i fri luft i for lang tid eller tabt. Kapslen beskytter TEM-netværkerne fra fri luft og holder dem sikkert, så de aldrig tabes. Kapsler giver større eksperimentel kontrol og repeterbarhed ved tilberedning og negativ farvning, fordi kapslen er et mere kontrolleret miljø.

Kapslerne kan købes forudindlæst, hvis defar til. Manuel indlæsning af gitter i kapslerne tager en vis praksis for at sikre, at gitter ikke er beskadiget. Kapselmetoden kræver også lidt mere prøve og plet end den manuelle dråbe metode. Kapselmetoden kræver mindst 40 μL prøve sammenlignet med den manuelle dråbe metode, som kan gøres med så lidt som 8 μL.

Virus inaktivering er en vigtig del af negativ farvning i BSL-3 og BSL-4, da det tillader, at den inaktiverede virus tages ud af biokonduktionslaboratorierne til billeddannelse i EM-anlægget. Inaktivering ved hjælp af fikseringsmidler har den ekstra fordel ved at fastsætte virussen og forhindre nedbrydning. Der er to forskellige måder at inaktivere virusprøven, som begge blev undersøgt i denne undersøgelse. Den første adhærer virussen til overtrukne TEM-net, fastgør virusserne i 20 minutter i en 2% glutaraldehydopløsning efterfulgt af 1 timers eksponering af gitteret til osmiumtetroxiddamp ( figur 1C ). Dette inaktivererIon-metoden er fordelagtig, fordi den sparer tid ved at muliggøre, at prøven tages ud af biokonduktionslaboratoriet efter 1 time og 20 minutter. Det forhindrer også fortynding af virus før påføring på det coatede TEM-gitter, så det kan være nødvendigt for prøver, der formodes at være nær TEM-detektionsgrænsen. Imidlertid reducerer 1% osmiumtetroxiddamp kvaliteten af ​​TEM-billeder, da osmiumet yderligere kan pletter prøven ( figur 3 ). Tidligere rapporter viser en 5 min eksponering for osmium tetroxid damp giver gode resultater, når negativ farvning; Imidlertid krævede længere eksponering for absolut viral deaktivering en blanding af positiv og negativ farvning 17 . Den anden inaktiveringsmetode involverer mindst 24 timer i en 2% glutaraldehydopløsning og kræver ikke osmiumtetroxiddampbehandling ( Figur 1D ). Denne anden metode tager længere tid at fuldføre, da prøven ikke fjernes fra biokonduktionslaboratorietRatory i 24 timer, men kan være fordelagtigt, fordi det tillader negativ farvning at udføres uden for biokonstruktion i et BSL-2 miljø og eliminerer behovet for farligt osmiumtetroxid. Vores resultater viser, at 24 h glutaraldehyd-inaktivering producerer TEM-billeder af højere kvalitet, end når prøver behandles med osmiumtetroxiddamp ( figur 3 ).

To negative pletter blev brugt i dette forsøg: UA og PTA. Begge pletter anvendes som 1% opløsning. UA, acetatsaltet af uran fungerer godt som en negativ plet, fordi tætte uranatomer scatter elektroner 5 . PTA, en heteropolysyre, fungerer ligeledes godt som en negativ plet på grund af tætte wolframatomer 5 . PTA er undertiden foretrukket over UA, fordi det er meget mindre giftigt og kun mildt irriterende ved indånding eller kontakt. Ved negativ farvning ufiksede prøver skal den lavere pH af UA overvejes, da det kan forårsage skade tO prøven De vira, der anvendes i dette forsøg, kræver fiksering til inaktivering, så både UA og PTA opnår lignende resultater, og der kunne ikke påvises nogen klar fordel for hver plet. Begge pletter er lette at arbejde med, og de producerer begge samme TEM-kvalitetskvalitet ( figur 4 ).

Samlet set er kapselmetoden nemmere at anvende i et biokonduktiv miljø og kan bruges som et alternativ til den manuelle dråbe metode. Brug af kapsler letter ekspansionsmanipuleringsfejl og giver TEM-billeder af god kvalitet. Billederne produceret ved hjælp af kapselmetoden er sammenlignelige med billeder produceret ved hjælp af manuel dråbe metode. Kort virusinaktivering med osmiumtetroxid forbedrer hastigheden, men bør kun bruges, hvis reduceret billedkvalitet er acceptabel, eller det er mistænkt, at fortynding af virus vil lægge den under TEM-detektionsgrænsen for proceduren. Både UA og PTA giver lignende resultater med de faste virusprøver anvendt i denne undersøgelse; hoWever, resultater kan være forskellige, når farvning ufiksede vira.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Meninger, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger, der er angivet i artiklen, er forfatterne og er ikke nødvendigvis godkendt af den amerikanske hær eller forsvarsministeriet.

Acknowledgements

Vi vil gerne anerkende og takke Dr. John Carra og Rowena Schokman for at tilvejebringe rensede Ebola nano-VLP'er, Dr. Rajini Mudhasani for at levere Chikungunya-virus, og Dr. Charles (Jason) Shoemaker til at tilvejebringe murine leukæmi VLP'er, der udtrykker Ebolavirus-glycoproteiner. Vi vil også gerne takke MAJ Carl Soffler for at lette Summer Internship Programmet (SIP) og Science and Engineering Apprenticeship Programmet (SEAP) og Dr. Catherine Wilhelmsen til laboratorie sikkerhedstræning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics