Induksjon av lammelse og visuelle systemet skade i mus ved T-celler spesifikke for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å indusere lammelse og opticospinal betennelse av overføring av aquaporin-4 (AQP4)-spesifikke T-celler fra AQP4- / - mus i WT mus. I tillegg viser vi hvordan du bruker serielle optical coherence tomografi overvåke visuelle systemet dysfunksjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mens det er anerkjent at aquaporin-4 (AQP4)-spesifikke T celler og antistoffer delta i patogenesen av neuromyelitis optica (NMO), en menneskelig sentralnervesystemet (CNS) autoimmune demyeliniserende sykdom, etableringen av en AQP4 målrettede modell med både klinisk og histologic manifestasjoner av CNS autoimmunitet har vist seg utfordrende. Immunisering av vill-type (WT) mus med AQP4 peptider vakte T celle spredning, selv om de T-cellene ikke kan overføre sykdom til naiv mottaker mus. Nylig ble to romanen AQP4 T celle epitopes, peptid (p) 135-153 og p201-220, identifisert når studere immunreaksjoner til AQP4 i AQP4-mangelfull (AQP4- / -) mus, tyder T celle reaktivitet til disse epitopes er vanligvis styrt av thymic negativ utvalg. AQP4- / - Th17 polarisert T celler primet å p135 153 eller p201-220 indusert lammelse i mottakerens WT mus, som var assosiert med overveiende leptomeningeal betennelse i ryggmargen og optiske nervene. Betennelse rundt optiske nervene og involvering av indre retinal lagene (IRL) ble manifestert ved endringer i seriell optical coherence tomografi (OCT). Her illustrere vi tilnærminger brukt til å lage denne nye i vivo modellen av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet (ATCA), som kan nå brukes til å studere mekanismer som tillater utvikling av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T-celler og hvordan de kan samarbeide med B cellene i NMO patogenesen.

Introduction

Neuromyelitis optica (NMO) er en sentralnervesystemet (CNS) autoimmune inflammatoriske demyeliniserende sykdom som forårsaker tilbakevendende episoder av lammelse og synstap fører til nevrologiske invaliditet1. NMO regnes tiden primært en humoral autoimmun sykdom2 som det er forbundet med antistoffer (Igs) rettet mot aquaporin-4 (AQP4), en vann kanal uttrykt rikelig på astrocyttene3,4. CNS betennelse er imidlertid en forutsetning for CNS oppføringen AQP4 Ig5,6. Dermed har det ikke vært mulig å etablere en modell av NMO ved overføring av anti-AQP4 Igs alene. Funnene at (1) sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke Igs i NMO pasienter er IgG11,2, en T celle-avhengige Ig underklasse7 (2) T-celler identifiseres i NMO lesjoner8,9 (3) NMO er tilknyttet med visse MHC-II gener (f.eks HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10og (4) proinflammatory AQP4-reaktive DR-begrenset Th17 celler er utvidet i NMO pasienter11,12 alle indikerer at AQP4-spesifikke T celler har en nøkkelrolle i NMO patogenesen. Derfor er det viktig å utvikle dyr modeller for å bestemme hvordan AQP4-spesifikke T celler kan bidra til NMO patogenesen.

Flere år siden, ble flere AQP4 T celle epitopes identifisert i vill-type (WT) mus13,14 og rotter15. Mens det ble observert at AQP4-reaktive T celler kan indusere opticospinal betennelse i naiv mottaker rotter15,16, var betydelig klinisk underskriver av CNS sykdom ikke observert. Tilsvarende direkte immunisering av WT mus med peptider som inneholder AQP4 T celle epitopes14,17, eller overføre proinflammatory T-celler som er rettet mot de determinanter17, ikke forårsake kliniske tegn eller histologic bevis på CNS autoimmunitet.

Nylig det ble observert at immunisering for C57BL/6 AQP4 dårlig (AQP4- / -) mus AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, to determinanter spådd for å binde MHC-II (enb) med høy affinitet18, vakte sterke CD4 + T celle svar17. Disse to peptider vakte derimot bare beskjeden proliferativ svar i WT mus. Videre var T-celle reseptor (TCR) repertoaret brukes for anerkjennelse av disse determinanter av T-celler fra AQP4- / - mus unik. Samlet viser disse funnene at T celle anerkjennelse av AQP4 er regulert av thymic negative utvalg. AQP4 p135-153 - eller p201-220-spesifikk Th17 celler fra AQP4- / - giver mus indusert lammelse i nesten 100% av naiv mottaker WT mus; Dette var tilknyttet opticospinal infiltrerer T celler og B-celler monocytter. Føljetong opticospinal coherence tomografi (OCT) vist dynamiske visuelle filsystemet. Mus med T celle-mediert AQP4 målrettede CNS autoimmunitet (ATCA) utvinnes fra lammelse og visuelle systemet skade. I motsetning til EAE indusert av myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) p35-55-spesifikke T celler, som førte til vedvarende klinisk sykdom, var ATCA av T-celler alene ikke tilknyttet axonal tap eller reduksjon i netthinnen ganglieceller (RGCs). Resultatene har vist at det er flere sykdomsfremkallende AQP4 T celle determinanter. Denne modellen av ATCA er nyttig for å studere mekanismer som styrer utviklingen av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T-celler, lære hvordan cellene indusere CNS betennelse og hvordan de kan samarbeide med AQP4-spesifikke B celler og antistoffer å fremme NMO patogenesen .

Nåværende rapporten beskriver vi protokollene som brukes til å indusere og evaluere T celle-indusert ATCA. Vi begynner med teknikkene som brukes for immunisering, T cellekultur og Th17 polarisering generere sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T celler, flyt cytometri analyse å bekrefte polarisering og adopsjon overføring av disse T-celler. Vi beskriver metoder for å vurdere kliniske og histologic og bruk av føljetong OCT overvåke visuelle systemet skade i mottakerens mus.

Protocol

alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med eksperimentelle retningslinjer godkjent av University of California, San Francisco institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. C57BL/6 (H-2 b) kvinnelige mus, 8 ukens av alderen, ble kjøpt og C57BL/6 AQP4 - / - mus ble levert av A. Verkman.

1. immunisering av mus med AQP4 peptider

  1. forberede komplett Freund ' s adjuvant (CFA) arbeider lager.
    1. Fint slipe en desiccated forberedelse av M. tuberkulose (H37Ra) bruker en morter.
    2. Legg til bakken H37Ra til ufullstendig Freund ' s oppnå en siste konsentrasjon av 4 mg/mL. CFA kan lagres på 4 ° C i opptil 6 måneder.
  2. Oppløsning lyofiliserte antigen (Ag) AQP4 peptid i fosfat bufret saltvann (PBS) til en siste konsentrasjon av 1 mg/mL. Opprettholde 4 ° C eller ice.
  3. Forberede montering av 2 engangssprøyter med luer-lock, sammen med en stopcock, som inneholder den CFA/peptid emulsjonen.
    1. Fest glass luer-lock sprøyter uten stempelet en 3-veis nylon stopcock med 2 mannlige luer-lock-tilkoblinger. Lukk stopcock ved å bytte spaken mot sprøyten. Plasser den åpne enden av opp, slik at sprøyten som et reagensrør. Sette dette i en tube rack for stabilitet.
    2. Vortex CFA arbeider lager og Ag løsningen. Legge til en 1:1 mengde peptid / CFA til åpne sprøyten. 200 µL av CFA/Ag (4 x 50 µL) kreves per musen.
      Merk: Vanligvis ca 1 mL av forberedelse går tapt i stopcock, noe som vil redusere mengden tilgjengelig for immunisering. Derfor er det viktig å innlemme dette i beregningen av totalt volum kreves.
      Eksempel: For immunisering 5 mus: (200 µL/dyr x 5 dyr) + 1 mL ekstra volum = 2 mL totale CFA/Ag kreves.
    3. Sett glass stempelet til sprøyten og mens du holder den på plass, inverter sprøyten slik at stopcock orienteres oppover. Bytt stopcock spaken til den ubrukte kvinnelige tilkoblingen. Forsiktig bruk trykk glass utskyteren for å fjerne overflødig luft fra sprøyten. Væsken fyller den andre mannlige luer-lock-tilkoblingen på stopcock.
    4. Koble andre glass sprøyter (stempelet helt inn) til andre mannlige luer-lock tilkobling av til stopcock. Dette bør være et lukket system av 2 glass sprøyter med en stopcock som inneholder som litt overflødig luft som mulig.
    5. Opprette en emulsjon, blande av presser stempler sende væsken vekselvis mellom de 2 sprøyter for ca 2 min. Chill sprøyter på is ca 10 min. gjenta den skremmende og blande inntil det er en klar endring i viskositeten av forberedelse , resulterer i en svært stiv, hvit emulsjon. Kjøle sprøyter som inneholder emulsjonen på 4 ° C eller beholde ice.
  4. Overføre alle emulsjonen til ett glass luer-lock-sprøyter, fjerne tomme glass sprøyten og erstatte den med luer-lock 1 mL sprøyte for injeksjon. Fylle nye sprøyten med emulsjon, fjerne den fra stopcock og fest en nål (25G x 5/8).
  5. " vann-test " emulsjonen for konsistens. Utvise en dråpe emulsjonen i en liten skål med vann. Emulsjonen bør ikke spre, indikerer at det er egnet for injeksjon.
    1. Hvis emulsjonen fordeler, det er ikke klar for injeksjon, overføre væske tilbake i glasset sprøyter og fortsette å blande og deretter chill igjen til emulsjonen er stiv.
    2. Teste emulsjonen igjen til riktig konsistens er oppnådd.
  6. Injisere donor AQP4 - / - mus subcutaneously (SC) med emulsjon som inneholder AQP4 peptid. Hver musen får 4 x 50 µL SC injeksjoner (200 µL totalt (100 µg peptid)). De 4 områdene inkluderer begge sider av den nedre buk som tømme i lysken lymfeknuter (LN), og begge sider av brystveggen mediale til hver armhulen som tømme i axillaris LN. Adopsjon overføringen krever 1-2 vaksineres donor mus per mottaker musen.

2. T cellekultur og Proinflammatory T celle polarisering

  1. 10-12 dager etter immunisering, samle LN fra musene.
    1. i en isen brett, forberede 60 mm Petri retter utstyrt med en celle sil (mesh størrelsen 70 µm) og inneholder kjølt RPMI media med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og 100 U/mL penicillin-100 µg/mL streptomycin (penn-strep) (Anbudsforespørsler).
    2. Euthanize mus ved eksponering for CO 2, etterfulgt av cervical forvridning. Fordype mus i 70% etanol, og deretter feste hver footpad en disseksjon styret.
    3. Kuttet en midtlinjen huden snitt fra lysken i nakken og ned hver etappe. Huden fra peritoneum og feste det tautly til styret. Dissekere lysken og axillaris LN og plasser i Petriskål inneholder Anbudsforespørsler, på is. 19
    4. adoptivforeldre overføring eksperimenter, kombinere LN fra alle dyr innen samme immunisering gruppe. For flyt cytometric analyser av Vβ, skille LN fra enkeltindivider.
  2. Sett celle silen som inneholder LN på en 50-mL sentrifuge rør som inneholder Anbudsforespørsler. Bruk flat slutten av et sterilt 5 mL sprøytestempelet for å trykke LN cellene gjennom silen, vaske med 20-30 mL av Anbudsforespørsler til rette for utvinning av cellene. Opprettholde LN celler på isen gjennom behandlingen til tid for kultur.
  3. Vask to ganger, sentrifugering 393 x g i 5 min. Etter andre vask, resuspend LN cellene i T celle media (TCM). TCM inneholder RPMI med 10% inaktivert FBS, 292 µg/mL L-glutamin, 110 µg/mL natrium pyruvate, og 55 µM 2-mercaptoethanol og penn-strep. Vanligvis et volum på 5 mL TCM per donor mus brukes.
  4. Telle LN celler. Forventet avkastning er ca 3-6 x 10 7 LN celler per vaksineres musen donor. Sette til side 3-4 x 10 6 for en spredning analysen (se avsnitt 3 nedenfor).
  5. Satt opp polariserende kulturer for adopsjon overføring (del 6).
    1. Forberede en Th17 polariserende kultur på 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL rekombinant musen interleukin (IL)-23 og 10 ng/mL rekombinant mus IL-6 i TCM.
    2. Eventuelt for Th1 polarisasjon, forberede en kultur for 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag og 10 ng/mL rekombinant musen IL-12 i TCM.
    3. Legge 2 mL (1 x 10 7 celler) per brønn av polariserende kultur blandingen i en 12-vel plate. LN cellene fra 2-4 donor mus fyller en 12-vel plate. Opprettholde kulturer i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO 2 for 72 h.
    4. Sjekk visuelt LN cellene i kultur for aktivering på 48 timer og 72 h. aktivert celler vil danne omfattende klynger og T-celler vil øke i størrelse, bli mer pleomorphic. Økningen i stoffskiftet vil føre en senking av pH i media, endre fra fersken til oransje. Hvis pH er lav nok å gulne media, legge 1 mL av fersk TCM å hindre toksisitet for cellene i den gjenværende 24 h.
    5. Gå til Seksjon 6 for adopsjon overføring. Polarisering effektivitet kan være bekreftet av intracellulær cytokin flekker (ICS), som described i paragraf 5.
  6. Satt opp kulturer bruker LN fra personlige mus for flyt cytometric analyse av overflaten Vβ uttrykk (del 4).
    1. Forberede 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag i TCM.
    2. Legge 2 mL (1 x 10 7 celler) kultur per brønn i en 12-vel plate. Kulturer bør opprettholdes i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO 2 i 10 dager. Gå til seksjon 4.

3. Spredning analysen

Merk: Dette fortsetter fra delen 2.4.

  1. Forberede 3-4 mL LN celler i et rør, 2 x 10 6 celler per mL i TCM.
  2. Bland forsiktig cellene ved å snu røret flere ganger, og deretter overføre til et sterilt trau.
  3. Bruk analyser til platen 100 µL av celler per brønn i en 96-brønns runde vev kultur bunnplaten. Vanligvis plate 15 brønner for tre eksemplarer testing av 4 Ag konsentrasjoner og en ingen Ag referanse.
  4. Fortynne Ag i TCM i ulike konsentrasjoner, vanligvis 80, 20, 5, 1 og 0 µg/mL (for 2 x aksjer). Legge til 100 µL hver konsentrasjon i tre eksemplarer for en siste konsentrasjon av 40, 10, 2.5. 0,5 og 0 µg/mL. Inkuber omtrent 72 h på 37 ° C.
    Merk: trinn 3.5 gjennom 3.7 involverer radioaktivt materiale. Riktig bruk, overvåking og deponering av radioaktivt materiale skal utføres, i henhold til institusjonelle og statlige bestemmelser.
  5. Forberede en fungerende lager løsning 3 H-thymidine (40 µCi/mL) for å legge til 1 mCi 3 H-thymidine 25 mL RPMI, og lagre denne på 4 ° C. Pipetter 0,5 mL av arbeider løsningen i et sterilt trau.
  6. Legge til 25 µL av 3 H-thymidine (1 µCi) per godt med en flerkanals pipetter. Inkuber en ytterligere 18 h på 37 ° C.
  7. Høste celler på glass filter mat med en 96-brønns celle korn, og skyll med 70% etanol. Etter tørking, sel filter mat i en plast sample pose med 5 mL scintillation væske. Mål radioaktivitet i hver brønn ved å en scintillation teller.

4. Flow cytometri analyse for celle overflaten TCR Vβ uttrykket

Merk: Dette fortsetter fra delen 2.6. Antistoffer for musen TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 og 5.2, 6, 7, 8.1 og 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 og 17a er tilgjengelig kommersielt for testing TCR Vβ uttrykket.

  1. For påvisning av TCR Vβ, dislodge T celler fra kultur plate av pipettering flere ganger og overføre cellene til en tube.
  2. Vask med FACS buffer (FB) som inneholder 2% FBS, 0,1% Natriumazid og 2 mM EDTA i PBS.
  3. Overføring cellene til en V-bunn 96-brønns plate på en tetthet av 1 x 10 5 til 3 x 10 6 celler per brønn. Hvis hele Vβ panelet blir testet, cellene skal distribueres til flere brønner (én vel per Vβ blir testet).
  4. Utelukke døde celler fra flyt cytometric analyse av flekker med en LIVE/DEAD levedyktighet fargestoff, som reagerer med gratis aminer ved nekrotisk celler. Følger produsentens ' s instruksjoner for sentrifugering og rørets i levedyktighet fargestoff. Ruge på is 10-20 min. hele cellen flekker prosedyrer, beskytte celler fra lys og holde på ice.
  5. Inkubasjon vaskes platen én gang i FB. For å oppdage TCR Vβ, suspendere cellene i 100 µL av FB inneholder en 1: 100 fortynning av antistoffer for CD4 (klone RM4-5) og TCR Vβ. Inkuber for 15-60 min på ice.
  6. Vaske platen én gang i FB og fastsette cellene ved å legge til 200 µL av 4% paraformaldehyde fortynnet i PBS. Inkuber etter 20 min på is. Vaske platen i FB og analysere av flowcytometri.

5. Flow Cytometric analyse for intracellulær cytokin produksjon

  1. For intracellulær cytokin flekker (ICS), behandle T cellekulturer med en 1:1,000 fortynning av protein transport hemmer reagens (f.eks GolgiPlug) i TCM, 4 h før ICS å hindre cytokin sekret. På den tiden, aktivere T-celler med 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) og 500 ng/mL ionomycin for å indusere protein produksjon.
  2. Etter 4 h kultur på 37 ° C, fjerne celler fra kultur plate av pipettering opp og ned og overføre til en sentrifuge tube (15 eller 50 mL).
  3. Vask med FB. Resuspend celler i FB og overføre til en V-bunn 96-brønns plate på en tetthet 5 x 10 5 til 3 x 10 6 celler per brønn.
  4. Flekk celler med levedyktighet fargestoff som beskrevet ovenfor (inndelingen 4.2). Inkubasjon vaskes platen én gang i FB.
  5. Legge antistoffer til å søke etter overflate markører som følger:
    1. For påvisning av overflate markører, suspendere cellene i 100 µL av FB inneholder en 1: 100 fortynning av antistoff for CD4 (klone RM4-5).
    2. Inkluderer eventuelt antistoffer for B220 (klone 30 F11) og CD11b (klone M1/70) på en 1: 100 fortynning å forbedre gating av B-celler og monocytter/makrofager, henholdsvis. Vanligvis fungerer PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 og PerCP-Cy5.5 anti-CD11b bra. Valg av antistoff/fluorochrome conjugates bør styres av konfigurasjonen av flyt cytometer som skal brukes for analyse og optimal konsentrasjoner av antistoffer bør fastsettes empirisk.
    3. Inkuber for 15-60 min på ice.
  6. Vaske platen med FB og resuspend cellene i 200 µL av fiksering/Permeabilization løsning for 20 min på is. Dette vil fikse cellene og permeabilize membraner.
  7. For å opprettholde permeabilization cellemembraner under intracellulær farging, bruke Perm/vaskebuffer (PW) (fortynnes 1:10 fra 10 X lager) i stedet for FB. Vask brønnene i 200 µL av PW.
  8. For ICS, forberede en 1: 100 fortynning av antistoffer interferon (IFN)-γ og IL-17A med 1 x PW. Ett alternativ er APC anti-IFN-γ (klone XMG1.2) og PE anti-IL-17A (klone eBio17B7) som fungerer bra. Resuspend celler i 100 µL av intracellulær antistoffer cocktail og deretter ruge i minst 15 min. Det er også mulig å fortsette den flekker over natten på 4 ° C.
  9. Vask brønnene i 200 µL av PW og rørets i FB for flowcytometri.
  10. Parallelt, forberede en unstained kvinne prøve (celler i FB uten antistoffer) å optimalisere detektor spenninger og single-farget prøver for hver individuelle fluorochrome (dvs. celler eller kompensasjon perler med bare én antistoff/fluorochrome) til fastslå kompensasjon smitteeffekter verdier.
  11. Bruker en flyt cytometer, erverve ≥ 10 000 celler (hendelser), gating på levedyktig (LIVE/DEAD-negativ) CD4 + celler. For å sikre nøyaktig gating av T-celler, kan du ekskludere B220 + og CD11b + celler (B celler og monocytter/makrofager, henholdsvis). Innenfor CD4 + T celle subpopulasjon, finne ut prosentandelen av celler uttrykke IFN-γ (Th1 avstamning) eller IL-17A (Th17 avstamning).

6. Adopsjon overføring av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T celler

Merk: dette trinnet følger delen 2,5: T celle kultur og proinflammatory T celle polarisering.

  1. Gjenopprette polarisert celler fra 12-vel plater av pipettering opp og ned for å løsne, og overføre dem til en 50 mL tube. MAintain på is inntil injeksjoner.
  2. Telle celler, vaske to ganger i kalde PBS og forberede en suspensjon av 1 x 10 8 celler/mL i PBS. Generelt, injisere cellene i timen.
  3. Forsiktig bland cellene av virvlende og overføre til en 1 mL sprøyte ved injeksjon. Administrere 200 µL av cellene (2 x 10 7) intravenøst (IV) til hver mus, gjennom halen vene.
  4. Injisere hver mottaker musen IP med 200 ng av B. kikhoste toxin fortynnet i 200 µL av PBS den dagen og 2 dager senere. Overvåke mus daglig for underskriver av kliniske sykdommen.

7. Klinisk vurdering av ATCA

  1. undersøke mottaker mus daglig for klinisk underskriver av CNS autoimmunitet. Generelt, viser mus tegn på CNS autoimmunitet 5-8 dager etter adoptivforeldre overføring av AQP4-spesifikke T celler. Mus viser kliniske symptomene av Nevrologisk dysfunction. Det er nyttig å utføre evalueringene på en naiv mus å definere vanlige evne til mus.
  2. Evaluer mus for tap av halen tone. Hold mus forsiktig ved foten av halen og løft oppreist. En hale droops kontinuerlig som beskrives som tap av halen tone (score på 1). Tap av halen tone er ofte det første kvittere av kliniske sykdommen.
  3. Test for rettende refleks ved å plassere musen på ryggen på en flat overflate. Langsom rettende er et tegn på manglende koordinasjon truncal (score på 2). Naive musen vil helt motstå forsøk å plassere den på ryggen, slik noen treghet i evnen til høyre er scoret som en dysfunksjon. Det er vanlig å teste musen 3 - 4 ganger for denne refleks.
  4. Evaluer holdning og ambulation. Mus begynner å vise en endring i holdningen resulterer i en senking eller dra på hoftene under ambulation (score på 2,5). Videre sykdom resultater i monoplegia, fullstendig lammelse av en hind lemmer (score på 3.0) og paraplegia, fullstendig lammelse av både hind lemmer (score på 3,5). Moderat quadraparesis, svakhet i alle fire ekstremiteter, resulterer i meget langsom bevegelse fremover (score på 4). Alvorlig quadraparesis gir nesten ingen bevegelse fremover (score på 4.5). Til slutt, med alvorlig sykdom kan de bli døende eller dø (score på 5).
  5. Administrere til musene som miste å kjøpe væske eller solid mat 1 mL av 5% glukose i saltvann IP eventuelt bruk tilskudd med væske gel kopper, høy kalori gel og bacon smågutter å motvirke dehydrering og mat deprivasjon. Euthanize døende mus.

8. Vev forberedelse og Histology

  1. bedøve mus med 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine, og deretter feste hver footpad en disseksjon styret.
  2. Åpne opp brystet, utsette hjertet. Incise leveren for å gi blod utløp. Fest en sommerfugl nål slangen av en miniflow variabel hastighet pumpen bruker en separat reservoaret for PBS og 10% formalin. Sett inn nålen i venstre ventrikkel hjertet og perfuse med 5 mL PBS, etterfulgt av 25 mL av 10% formalin.
  3. Fjerne hodet og øynene. Behandle øyne og Netthinne som beskrevet tidligere 20. På tvers av øyehulene, sett saks på nesen og kutte skallen anterior bakre på hver side.
    1. Fjerne skallen, utsette optikk nerver, kuttet optikk chiasm og plasser i en kassett mellom 2 skum pads.
    2. Immerse i 10% formalin (24 timer), og deretter 50% etanol (24 timer) og deretter overføre til 70% etanol.
  4. Fjern hjernen og ryggraden og plasser i 10% formalin. Serielt delen hjerner i koronale flyet; delen spinal ledninger i sagittal (omtrent halvparten) og føljetong Koronal fly (ca 20 tverrsnitt per musen).
  5. Prosessen CNS prøver rutinemessig for parafin innebygging. Stain 8 µm tykk deler med hematoxylin og eosin (optiske nervene) eller Luxol rask blå-hematoxylin og eosin (hjernen og ryggmarg).
  6. Vurdere optiske nervene for tilstedeværelsen av betennelse i nerve og omkringliggende meninges (optisk nevritt) eller hovedsakelig i omkringliggende meninges (fiberoptisk perineuritis).
  7. Teller meningeal og parenchymal inflammatorisk foci (> 10 gruppert mononukleære celler) i hjernen og ryggmarg utvalgene hver musen.

9. I Vivo Retinal Imaging av Optical Coherence tomografi (OCT)

Merk: Spectral domene OCT retinal imaging mus utføres med kommersielle utstyr (f.eks Spectralis med TruTrack øye tracker) å oppnå konsistent okulær retning og redusere bevegelse.

  1. Fem minutter før bildebehandling, dilate elevene med 1% tropicamide (en dråpe per øyet) og Plasser musen til å avbildes i anestesi induksjon kammeret, gir en jevn strøm av 2 liter per min (1,5% isoflurane). Slå på heten mat og forberede etter anestesi utvinning buret.
  2. Plasserer musen på tenkelig sylinderen og omdirigere bedøvelse strømmen tilsvarende. Beskytte øynene med 0,3% hydroksypropylcellulose methylcellulose å holde øyet fuktig og sikre brytning kontinuitet. Plassere en egendefinert kontakten linsen på øyet undersøkes.
  3. Guided by infrarød fundus bildet, direkte laser for øyet, sikre strålen er sentrert på synsnerven hodet. Vertikale og horisontale OCT skanner bør bekrefte at netthinnen legger vinkelrett til laser.
  4. Utføre 25 B-skanner i modus for høyoppløselig og Rasteriser 30 gjennomsnitt A-skanner.
  5. Etter bildebehandling begge øynene, fjerne linse og gjelder ophthalmica gel. La musen i varm utvinning buret.

10. Behandling og analyse av OCT

  1. bruke modulære bildebehandlingsprogramvare for automatisk segmentering.
    1. Manuelt riktig segmenter tilsvarer den indre begrense membran (ILM) og indre plexiform lag (IPL), som representerer grensene for den indre retinal lag (IRL) 21.
    2. Kontroller at netthinnen nerve fiber laget (RNFL) og ganglion celle laget (GCL) bor innenfor grensene for IRL ikke overlapper.
  2. Beregne IRL tykkelser tidlig behandling diabetisk retinopati studie (ETDRS) 2 rutenettet med diameter på 1, 2 og 3 mm sentrert på blinde flekk og eksport til en regnearkfil. Programvaren beregner tykkelsen på hver retinal lag av gjennomsnittlig hver rutenettet sektor. Derfor sentrale segmentet, tilsvarer synsnerven hodet, utelates.
  3. Analyserer statistiske forskjeller mellom gruppene på hvert tidspunkt. Analysere begge øynene for hver musen, bruk av generalisert beregne ligninger med en utskiftbare korrelasjonsmatrise og justeringene for intra underlagt mellom øyet sammenhenger 21.

Representative Results

I denne protokollen brukte vi giver T celler fra C57BL/6 AQP4- / - mus. Subkutan immunisering av disse musene AQP4 p135-153 eller p201-220, som inneholder sykdomsfremkallende T celle epitopes, vakte sterke proliferativ T celle svar i drenering lymfeknuter (figur 1), mens disse to peptider indusert mye svakere T-celle spredning i WT mus. Sammenligning immunisering med AQP4 p91-110, som inneholder en ikke-patogene AQP4 T celle determinant13eller MOG p35-55, en myelin peptid som aktiverer T-celler som forårsaker eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE)22,23 ,24, indusert lignende omfanget av T celle spredning i AQP4- /- og WT mus. Analyse av TCR utnyttelse av flyt cytometri flekker for individuelle Vβ eller Vβ familier, vist at p135 til 153 - og p201-220-spesifikke T celler fra AQP4- / - mus utnyttet unike TCR repertoar. Selektiv hyper-spredning av AQP4 p135-153 og p201-220 AQP4- / - mus, så vel som unike TCR utnyttelse (figur 2), indikerte at sykdomsfremkallende T celle Svar å disse faktorer er normalt regulert av thymic negative utvalg, understreker viktigheten av å bruke AQP4- / - giver T celler i denne protokollen.

Før adopsjon overføring for induksjon av ATCA, ble lymfeknute celler fra AQP4 peptid-primet mus kultivert i vitro Th17 - eller Th1-polarisert forhold i tre dager. Omfanget av polarisering av donor CD4+ T celler ble bekreftet av intracellulær cytokin flekker (ICS) og målt ved flowcytometri (Figur 3). Naive mottaker musene ble injisert intravenøst med 2 x 107 donor AQP4 peptid-spesifikke T-celler. Etter ca seks dager utviklet nesten 100% av mottakeren mus klinisk underskriver av CNS autoimmune sykdommer, inkludert halte hale og hind lem lammelse (Figur 4). Th17-polarisert AQP4-spesifikke T celler forårsaket mer alvorlig kliniske sykdommen enn Th1 polarisert AQP4-spesifikke T celler. En representant mus som fikk Th17 AQP4-peptid-spesifikk og utviklet komplett hind lem lammelse (paraplegia) vises i Video 1. Kontrast mus som utviklet EAE etter administrasjon av MOG-spesifikke Th17 celler, mottaker mus utvinnes fra klinisk sykdommen forårsaket av AQP4-spesifikke Th17 celler. Som for EAE indusert av MOG p35-55-spesifikk Th17 celler, klinisk sykdommen forårsaket av AQP4 p135-153-spesifikke eller p201-220-spesifikk Th17 celler var assosiert med infiltrasjon av mononukleære celler i CNS parenchyma og meninges (figur 5). Leksjonen var mer rikelig i meninges enn i parenchyma for CNS autoimmunitet indusert av AQP4-spesifikke Th17 celler.

Synsnerven engasjement ble demonstrert av histologiske evaluering og av føljetong OCT. AQP4-spesifikke og MOG-spesifikke Th17 celler både indusert synsnerven betennelser, som ble preget av tilstedeværelsen av mononukleære celler. Mens AQP4-spesifikke Th17 celler forårsaket fiberoptisk perineuritis, forårsaket MOG-spesifikke Th17 celler alvorlig optisk nevritt (figur 5). Bruke serielle OCT, synsnerven betennelse var tydelig av hevelse og økt indre retinal laget (IRL) tykkelse for klinisk sykdommen forårsaket av AQP4-spesifikke eller MOG-spesifikke Th17 celler (figur 6). For AQP4 Th17-indusert CNS autoimmunitet, IRL tykkelse tilbake til opprinnelig som mus utvinnes fra kliniske sykdommen. Derimot utholdenhet av EAE indusert av MOG-spesifikke Th17 korresponderte med IRL tynning og, som vi viste tidligere17, var forbundet med tap av netthinnen ganglieceller.

Figure 1
Figur 1 : AQP4 p135-153 og p201-220 framprovosere robust T celle spredning i AQP4- / - mus, men ikke WT mus. Mus ble vaksinert SC med de angitte peptidene i CFA. Elleve dager senere, ble lymfeknuter fjernet, og så kultivert med enten ingen antigen eller peptid brukes for immunisering. Spredning ble målt ved 3H-thymidine inkorporering (gjennomsnittlig ± SEM, representant 5 eksperimenter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : AQP4-spesifikke T celler fra AQP4- / - mus utnytte unike TCR repertoar. AQP4- /- og WT mus ble vaksinert med de angitte peptidene. Elleve dager senere, ble lymfeknuter fjernet og kultivert med peptid brukes for immunisering. Cellene ble høstet. TCR Vβ utnyttelse ble analysert av flowcytometri (mener ± SEM, n = 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Proinflammatory polarisering av donor AQP4-spesifikke T celler. Elleve dager etter immunisering med AQP4 p135-153 eller p201-220, ble lymfeknute celler høstet og kultivert med peptid brukes for immunisering i ikke-polarisert forhold, Th1 - eller Th17-polarisert forhold. Th17 eller Th1 polarisering ble undersøkt av ICS og flyt cytometri IL-17 eller IFN-γ, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Th17-polarisert AQP4-spesifikke T celler indusere lammelse i WT mottaker mus. WT mottaker mus mottatt 2 x 107 donor Th17-polarisert AQP4 p135-153 eller p201-220-spesifikke T celler fra AQP4- / - mus. Th17-polarisert MOG-spesifikke T-cellene var en positiv kontroll. Resultatene er representant for 8 eksperimenter (n = 5/gruppe). * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : AQP4-spesifikke Th17 celler indusere opticospinal betennelse i WT mus. Mottaker mus fikk 2 x 107 donor Th17 AQP4 p135-153 - eller p201-220-fylt Th17 celler fra AQP4- / - mus eller Th17 MOG p35-55-spesifikk celler og ble ofret 10 dager senere. Ryggmargen og synsnerven vev var forberedt og farget med H & E/LFB å vurdere for bevis for betennelse og demyelinisering, henholdsvis. Resultatene er representant for 5 mus/gruppe. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Synsnerven betennelse forårsaket av AQP4-spesifikke Th17 celler kan overvåkes av langsgående retinal oktober WT mottaker mus mottatt 2 x 107 donor Th17-polarisert AQP4 p201-220-spesifikke eller MOG p35-55-spesifikke T-celler på dag 0. De ble undersøkt av OCT dagen 0 (før administrasjon av T-celler) og deretter på dager 4, 7, 8, 9 10, 11 14 og 21. IRL tykkelse ble målt (gjennomsnittlig ± SEM). Statistikken indikerer en sammenligning med naiv kontroll. Resultatene er representant for 3 eksperimenter (5 mus/gruppe). * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

AQP4 ble identifisert som den primære målet i NMO IgG i 20053. Da ble det kjent at det ville være viktig å etablere en AQP4 målrettede dyr modell av CNS autoimmunitet. Slik modell kan være nyttig å undersøke hvordan AQP4-spesifikke T- og B-cellene delta i utviklingen av CNS autoimmunitet og teste kandidat therapeutics for NMO. Selv om identifikasjonen av AQP4-spesifikke T celle epitopes i vill-type mus ble først rapportert i 201013, T-celler som svarer til de epitopes ikke forårsake klinisk eller histologic14,17. Manglende evne til å generere en modell av CNS autoimmunitet basert på immun reaktivitet til AQP4 forble et mysterium inntil 2015 når Jones, et al. 25 oppdaget at giver AQP4 p135-153-primet T celler fra AQP4- / - mus var kan forårsake klinisk og histologic tegn på CNS autoimmunitet i WT mus. Av interesse spådd AQP4 p135-153 for å binde MHC-II (enb) med høy affinitet17. Bare en annen AQP4 aminosyresekvens, 201-220, er spådd for å binde enb med lignende høy affinitet. Faktisk observerte vi at AQP4 p135-153 og p201-220 både framprovosere robust spredning i AQP4- / -, men ikke WT, mus. Her har vi vist hvordan man kan isolere og utvide encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - og p201-220-reaktive T celler fra AQP4- / - mus. Når overført til WT mottaker mus, induserte donor AQP4-reaktive Th17 cellene lammelse, som ble ledsaget av mononukleære celle infiltrerer i ryggmargen og synsnerven. Afferente visuelle systemet skade er kjent hos pasienter med AQP4-avrusningsenhetene NMOSD26. Her observerte vi at synsnerven betennelse forårsaket av AQP4-reaktive og MOG-reaktive Th17 cellene var tydelig. Mens AQP4-spesifikke Th17 celler indusert fiberoptisk perineuritis, forårsaket MOG-spesifikke Th17 celler alvorlig optisk nevritt. Vi har også beskrevet teknikker brukes til å overvåke synsnerven betennelse forårsaket av AQP4-spesifikke og MOG-spesifikke T celler av føljetong OCT. Andre etterforskere skal nå kunne bruke protokollene beskrevet her for å fremme sine egne studier fokuserte på patogene mekanismer for ATCA.

Man kan lett unngå tre potensielle fallgruver i våre protokollen. Første, adopsjon overføring av ATCA krever AQP4-spesifikke T celler fra AQP4- / - giver mus. Spesielt forårsake giver WT AQP4 p135-153-spesifikke T celler ikke ATCA i mottakerens WT mus. Dernest er det viktig å utføre en "vann-test" med en dråpe peptid/CFA emulsjonen før immunisering av AQP4- / - mus (protokollen trinn 1.5). Emulsjonen bør ikke spre i vann når det passer for SC injeksjon. Hvis emulsjonen fordeler, bør en blande emulsjonen igjen, chill igjen og gjenta vann-testen. Til slutt indusere aktivert donor CNS antigen-spesifikke T celler CNS autoimmunitet mer effektivt enn hvile T celler. En bør visuelt undersøke disse kulturer under lys mikroskopet før høsting donor T celler for adopsjon overføring. Hurtig deler celler kan danne sektorgrupper, som er lett identifiseres. Også når kulturer inneholder mange aktivert T-celler, kan media overgangen fra rosa til oransje eller til gul, på grunn av reduksjon i pH. Man kan også vurdere aktivering av donor AQP4-primet lymfeknute T celler for spredning av 3H-thymidine innlemmelse, som beskrevet i protokollen trinn 3.

Våre funn at to sykdomsfremkallende AQP4 T celle epitopes er (1) spådd å binde MHC-II med høy affinitet og (2) framprovosere potente proliferativ reaksjoner i AQP4- / -, men ikke WT, mus tyder på at T-celler som er rettet mot disse determinants er normalt kontrollert av thymic negative utvalg17. TCR repertoar benyttes for anerkjennelse av AQP4 p135-153 og p201-220 i AQP4- / - mus er unik (figur 2), som er også i overensstemmelse med klonal sletting formidlet av thymic medullær epitelceller. Andre tolerogenic mekanismer kan vanligvis hindre immunreaksjoner til AQP4. Etter vårt første rapport17viste en annen gruppe også at AQP4 p201-220 inneholder en encephalitogenic T celle determinant27. Når α/β (TCRα- / -) T celle-mangelfull mus ble rekonstituert med AQP4- / - CD4+ T celler, det var mulig å lokke fram en encephalitogenic AQP4-spesifikke T celle respons, men ikke en AQP4-spesifikke humoral respons, noe som i WT mus AQP4-spesifikke B celle svar, analog med AQP4-spesifikke T celle svar, kan negative utvalg. Faktisk, tap av ryggmargen axons og RGCs, ble ikke registrert i WT mus med ATCA av AQP4-spesifikke T celler alene, kan kreve deltakelse av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke antistoffer. Det er klart at musen modeller av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet vil fortsette å utvikle seg som vi lærer mer om de tolerogenic mekanismene som vanligvis styrer AQP4-spesifikke T-celler og B-celle immunitet.

Andre modeller av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet blir også utviklet6,16,28,29,30. Hver og en kan gi fordeler for å undersøke bestemte aspekter som er relevante for NMO patogenesen. AQP4-spesifikke T celler har blitt identifisert i WT rotter6,16,29. AQP4-spesifikke T celler forårsaket histologic endringer i CNS autoimmunitet, men ligner observasjoner i mus, WT rotte AQP4-spesifikke T celler forårsaker ikke betydelig underskriver av kliniske sykdommen. Mekanismer for toleranse begrenser T-celler og B-celle AQP4-spesifikke immunreaksjoner i WT mus er derfor også i rotter. Uansett, bør en ikke undervurdere kraften i å bruke musen modeller for å studere mekanismer involvert i patogenesen av sykdom. Vell av knock-out, transgene og reporter mus kan være fordelaktig. Det bør også anerkjent at flere grunnleggende funn i autoimmunitet ble gjort ved hjelp av musen EAE modeller. For eksempel demonstrasjon T cellen kloner bestemt en selv-antigen kan megle autoimmun sykdom31,32, identifikasjon av rollen T celle costimulation autoimmunitet33 og oppdagelsen av den utviklingsmessige veien for Th17 differensiering34 ble først beskrevet ved hjelp av musen EAE modeller. Bruker musemodell av ATCA som vi har utviklet, har en nå har midler til å studere utviklingen og regulering av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke immunreaksjoner i vivo, som skal gi viktig innsikt knyttet til NMO patogenesen.

Disclosures

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, AJ Green og ra Sobel rapporterer ingen avsløringer. SS. Zamvil assisterende redaktør av nevrologi, Neuroimmunology og Neuroinflammation og er medlem av advisory board for det internasjonale samfunnet av Neuroimmunology. Han har vært i Journal of Clinical Investigation, The Journal for immunologi og The Journal av nevrologiske fag, og er et medlem av grant gjennomgangen komiteen for den nasjonale institutter Health (NIH) klinisk Neuroimmunology og hjernen svulster (CNBT) studie delen og nasjonal multippel sklerose samfunnet (NMSS). Han har som konsulent og fikk honoraria fra Biogen-Idec, EMD-Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech og Teva Pharmaceuticals, Inc., og har tjent eller serverer Data sikkerhet overvåking styrene til Lilly, BioMS, Teva og Opexa Therapeutics. For tiden mottar Dr. Zamvil forskning gi støtte fra NIH, NMSS, Maisin stiftelsen, Biogen og Celgene.

Acknowledgements

Støtte ble gitt til S.S.Z. av National Institute of Health (RO1 AI073737 og RO1 NS092835-01), nasjonal multippel sklerose samfunnet (RG 4768, RG 5179 og RG 5180), Maisin Foundation og Guthy Jackson veldedige Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15, (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364, (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202, (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66, (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66, (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7, (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24, (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72, (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5, (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6, (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122, (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130, (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86, (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25, (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210, (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4, (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13, (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317, (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162, (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80, (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, (7090), 235-238 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics