Stor volumen, Behaviorally relevante belysning til Optogenetics i ikke-menneskelige primater

Behavior

GE Global Research must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En protokol til at opbygge en vævet gennemtrængende illuminator for at levere lys over store mængder med minimale diameter er præsenteret.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne protokol beskriver et stort volumen illuminator, som blev udviklet for optogenetic manipulationer i primat hjerne. Af belysningen er en modificeret plast optisk fiber med ætset tip, således, at den lysemitterende overflade > 100 x, at af en konventionel fiber. Ud over at beskrive opbygningen af store mængder illuminator, detaljer denne protokol kvalitetskontrol kalibreringen bruges til at sikre endnu lysfordeling. Yderligere, denne protokol beskriver teknikker til at indsætte og fjerne den store mængde illuminator. Både overfladisk og dyb strukturer kan blive belyst. Denne store mængde illuminator behøver ikke at være fysisk koblet til en elektrode, og fordi illuminator er lavet af plastic, ikke glas, det simpelthen vil bøje under omstændigheder, når traditionelle optiske fibre vil splintre. Fordi denne illuminator leverer lys over behaviorally relevante væv diskenheder (≈ 10 mm3) uden større penetration skader end en konventionel optisk fiber, letter det adfærdsmæssige undersøgelser ved hjælp af optogenetics i ikke-menneskelige primater.

Introduction

Optogenetic værktøjer, som gør det muligt for millisekund-præcis, lys-drevet neuronal kontrol er meget udbredt at studere funktionelle fysiologi og adfærd i gnavere og hvirvelløse dyr. Tekniske udfordringer har dog begrænset brug af optogenetics i primat hjerne, som har en volumen ~ 100 x større end gnaver hjernen 1.

For at lette optogenetics undersøgelser i ikke-menneskelige primater, en illuminator var designet til at løse to konkurrerende mål: stor mængde belysning og minimal penetration skader. Tidligere forsøg på at løse en af disse bekymringer er kommet på de dyre af den anden. Bundter af fibre belyse større mængder, men med øget diameter og dermed skade2,3. Koniske glas fibre reducere penetration skader, men snævert fokus lys til lysemitterende overflade områder < 100 µm2 4,5. Eksterne hjernen belysning gennem et vindue i dura omgår udfordring af penetration skader og giver mulighed for stor mængde belysning, men det kan kun bruges til et par overfladiske hjernen områder6.

Hvis du vil oprette et stort volumen, lille diameter illuminator (figur 1a), ætset spidsen af en optisk fiber er varme tilspidset og core og beklædning plast (figur 1bc). I modsætning til andre tilspidset fibre, der fokuserer lyset til en smal punkt, giver ætsning lys til at undslippe jævnt ud af siderne af den aflæsse, således distribuere lys bredt over et stort område (figur 1 de). Fordi penetration skader er proportional med penetration diameter, denne illuminator har ingen mere penetration skade end en konventionel fiber, men det har > 100 x lysemitterende overflade område og leverer lys mere bredt med 1/100 lys magt tæthed i en hjerne phantom (1,75% Agarosen) (figur 1e). Monte Carlo model (figur 1f) illustrerer forskellen i lys spredes mellem en konventionel fiber og den store mængde illuminator, når de har lige lys effekttætheder som deres lysemitterende flader. Hver illuminator kalibreres individuelt ved hjælp af en Integrationskuglens (figur 2a, b) at sikre selv lysfordeling langs spidsen (figur 2 c).

Denne store mængde illuminator er blevet valideret med optogenetic manipulation af både adfærd og neuronal fyring i ikke-menneskelige primater. Fiber tip længde kan tilpasses ethvert område, hjernen og enkelte dyrs individuelle modtagelig feltforbindelse. Af belysningen kan være parret med en gennemtrængende elektrode til neuronal optagelser, der strækker sig over længden af belysning. Yderligere, fordi fiber kan bære alle farver af synligt lys, kan det være parret med nogen af de tilgængelige optogenetic molekyler tilgængelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: alle dyr, der var i overensstemmelse med retningslinjerne for NIH og blev godkendt af Massachusetts Institut for teknologi Udvalget om Animal Care.

1. illuminator fabrikation

  1. bruger et par skarpe Sakse til at skære en del af 250 µm diameter plast optisk fiber, der er mindst 10 cm længere end den ønskede samlede illuminator.
  2. Fjerne 15-20 cm af polyethylen jakke fra den ene ende af den plast optisk fiber ved hjælp af en 22 gauge wire stripper.
  3. Sikre den distale de fleste 3-5 cm af den solerede ende af fiber i en tabel skruestik klemme.
  4. Hold dobbeltvægget slutningen af fiber henslængt i den ene hånd med en konstant konstant pull. Fiber bør være parallelt med gulvet, vinkelret på vice. Opretholde denne konstante spændinger på fiber i hele opvarmning og afkøling (trin 1.5 og 1.6 nedenfor), således at fiber forbliver lige og stram som det tynder.
  5. Benytter den laveste indstilling af en dobbelt temperatur varmepistol (570/1.000 ° F,), varme den afisolerede del af fiber, indtil det er tyndet til en diameter på 60-100 μm eller om diameteren af et menneskehår.
  6. Vedligehold af konstant spænding på fiber knappanel fiber at køle. Manglende evne til at opretholde spændinger kan forårsage fiber til at krølle.
  7. Bekræfte diameteren af den tyndet tip under et dissekere mikroskop. Alternativt kan man bruge calipre i stedet.
    1. Hvis fiber ikke er tynd nok, Gentag trin 1.4 gennem 1,6 som nødvendige for at opnå den ønskede tip diameter.
    2. Valgfrit hvis igen trække, sætte en lille mark ved den smalleste del af fiber hvis det vil opvarmes igen, så midten af varmepistol mål den smalleste del af fiber.
    3. Hvis fibrene er for tynde, starte forfra.
  8. Når fiber er fuld afkølet og har opnået den ønskede diameter, knivspids fiber 3 cm fra den smalleste sted på begge sider. Med en hurtig, skarp pull langs aksen af fiber, separate sider for at oprette en tilspidset spids.
  9. Undersøge den koniske spids under en lav effekt (f.eks. 4 X) på dissektion mikroskop. Hvis spids er kløvet eller bøjet ( figur 1f), kassér fiber.
  10. Forbered til etch den koniske spids ved at placere et stykke lab tape nær slutningen af tip, forlader de sidste 5 mm udsat. Båndet beskytter fiber fra ætsning ovenfor den ønskede længde af lysudsendelse. Dette tip længde blev udvalgt på grundlag af tykkelsen af primat cortex i regionen mål. En længere eller kortere længde kunne udsættes afhængigt af den ønskede længde af belysning. Evt en anden etch tip længde kanten af lab båndet kan flyttes tættere på eller længere fra den koniske spids.
  11. Fold en lille (~ 1 tommer x 2 tommer) square af 5 μm siliciumcarbid lappemaskiner ark over mellem tommel- og pegefinger. Placer spidsen af fiber mellem de to sider af arket lappemaskiner og forsigtigt etch fiber ved hjælp af små cirkulære bevægelser, som hvis rullende en BB mellem tommel- og pegefinger. Ofte dreje fiber, så alle sider er ætset jævnt. Fiber-tip vises “ ru ” med det blotte øje i områder, der har været ætset, mens un-ætset områder vises typisk glat.
  12. Gentag trin 1.11 med en 3 μm aluminium oxid lappemaskiner ark.
  13. Anbringer et stik for enden af illuminator modsat den ætsede spids. Dette tillader illuminator at oprette forbindelse til et optisk kabel eller laser.
    Bemærk: Denne metode adskiller sig fra den foretrukne metode for fastsættelse af glas / silica optiske fibre i dupsko. Fordi den metal Doppsko er hårdere end de plastik optisk fiber, polering fiber og Doppsko som en enhed efter limning kan skade den plast optisk fiber som lille skår af metal fremstilles under polering processen kan integrere sig i flade-kløvet fiber.
    1. Fjerne ca. 5 mm polyethylen jakke fra den modsatte ende af illuminator ved hjælp af en 22 gauge wire stripper.
    2. Skære den modsatte ende fladt med en varm kniv til at glatte overfladen.
    3. Polsk den modsatte ende fladt med successivt finere lappemaskiner ark: 5 µm, 3 μm, 1 μm og 0,3 µm.
    4. Indsæt flat modsatte ende ind i en 260 µm indre diameter rustfrit stål Doppsko indtil det flugter med udgangen af Doppsko.
    5. Bekræfter visuelt, at den modsatte ende er glat og jævnt poleret med en fiber mikroskop.
    6. Fjerne fiber fra Doppsko og tape Doppsko lodret på kanten af et bord med fiber peger ned.
    7. Udfylde en 1 mL sprøjte med plast epoxy og lægger en stump 18 gauge kanyle på sprøjten.
    8. Bruge nålen til at anvende epoxy ned i Doppsko. Fylde Doppsko fuldstændigt med epoxy.
    9. Indsæt fiber i Doppsko.
    10. Tørre eventuelle overskydende epoxy fra poleret overflade af fiber med en våd fnugfri tør før tørringen hvis nødvendigt. Ellers, overskydende epoxy kan fjernes efter 12-24 h.
    11. Gemme fiber forsigtigt indtil kalibrering og placere en støvdæksel over Doppsko.

2. Illuminator kalibrering og kvalitetskontrol

Note: disse metoder for kalibrering vurdere for lys output ikke-linearitet på forskellige afstande fra spidsen af fiber. Ujævn lysfordeling typisk skyldes en “ ujævn ” eller “ bølgede ” taper.

  1. Opret en lys afskærmning mellemgulvet til toppen af en integrere kugle med lys absorberende folie ( figur 2).
    Bemærk: Bære handsker, når håndtering lys absorberende folie for at forhindre huden olier fra at skabe lys reflekterende snavs.
    1. Fold a 2 ” af 4 ” stykke af lys absorberende folie sig selv til at danne en 2 ” x 2 ” square. en alternativ metode er at skære en 2 ” x 2 ” square med en lys absorberende side og en lys reflekterende side (dvs. en side af standard aluminiumsfolie); men metoden fold-over er sikrere, fordi det giver en kedelig kant til håndtering af membran i det næste trin.
    2. Fold lab bånd eller elektrisk optage langs kanterne af firkanten til binde de ikke-foldede kanter. Dette både holder siderne sammen, og beskytter mod snit fra skarpe kanter.
    3. Punkteres et hul i midten af pladsen ved hjælp af en 26 gauge kanyle.
    4. Fjerne den store skrue på cap fra Integrationskuglens og dække åbningen med mellemgulvet. Placer hul over midten. Hvis mellemgulvet blev oprettet med en lys absorberende og en lys reflekterende side, placere lys absorberende side op og det lys, der reflekteres side ned, vender indersiden af Integrationskuglens.
      Bemærk: At forhindre støv og snavs ind Integrationskuglens og holde hullet centreret sikre mellemgulvet til ydersiden af Integrationskuglens med lab tape.
  2. Foranstaltning lys output langs spidsen i 500 µm-trin ved hjælp af en micromanipulator eller stereotaxisk arm og en Integrationskuglens.
    Bemærk: Beskyttelsesbriller af passende bølgelængde bør bæres, når laseren er på.
    1. Tilsluttes en laser eller lys den modsatte ende af fiber kilde, men ikke udløse lys output endnu.
    2. Sikre illuminator til et stereotaxisk indehaveren (preferably med lab tape) med tip 7-10 mm under bunden af indehaveren.
    3. Skrue stereotaxisk indehaveren i den stereotaxisk arm.
    4. Juster spidsen af illuminator med hul i midten af mellemgulvet. Nul til micromanipulator, når spidsen er på nøjagtig samme niveau som mellemgulvet.
    5. Tænder ud værelse lys og nul Integrationskuglens.
    6. Udløser laser (eller andre lyskilde) og måle den samlede lys effekt ved hjælp af Integrationskuglens.
      Bemærk: Brug den laveste lyseffekt muligt for kalibrering test.
    7. Lavere fiber 500 µm i den integrere sfære og Gentag trin 2.2.6.
    8. Fortsætte sænke fiber i Integrationskuglens og måle samlede lysudbytte på 500 µm-trin indtil samlede lys magt niveauer off
      Forsigtighed: Samlede lys effekt bør niveau når det hele tip er på området. Ikke fortsætter med at sænke fiber mere end 1-2 mm ud over den ætsede tip længde. Hvis spidsen kontakter i bunden af Integrationskuglens, det kan smelte og/eller ødelægge Integrationskuglens.
  3. Bekræfte en jævnt ætset fiber ved plotte samlede lys effekt som funktion af hvor langt den fiber er blevet sænket i Integrationskuglens at bekræfte linearitet.

3. in Vivo belysning

Bemærk: her, disse metoder er vist ved hjælp af en plastik model snarere end en primat.

  1. Implantat en 25 mm diameter optagelse salen blev implanteret over hjernen område af interesse inden eksperimenter.
  2. Udføre anatomiske magnetisk resonans imaging (MR) før eksperimenter. Placere en brugerdefineret indtaling gitter i salen og fyld den med steril kirurgiske smøremiddel til at tillade gitter visualisering og bestemmelse af niveauet for dura og target hjernen strukturerne.
  3. Udarbejde en tårn micro-drive før hver test session.
    1. Anbringer en 25 gauge guide tube med skrå spids til midterste og nederste klemmer på drevet. To klemmer bruges til at sikre, at guide tube forbliver lige. Begge af disse klemmer kan flyttes manuelt, hvis det ønskes.
      Bemærk: Guide røret kan være epoxied eller loddet til klemmerne.
    2. Secure store volumen illuminator i den øverste klemme på samme drev. Denne klemme er knyttet til drevet motor.
    3. Tråd stort volumen illuminator gennem guide tube fuldt ud og bekræfte, at spidsen af illuminator streamens spidsen af guide tube.
      Bemærk: Længden af illuminator, der strækker sig fortiden spidsen af guide tube er lig med afstanden fra dura til den nederste margin af hjernen målområde, som bestemmes via Mr.
    4. Blød guide tube og illuminator i antiseptisk opklaring (fx, chlorohexidine) til at sterilisere.
  4. Placere en brugerdefineret steriliseret gitter inde den rene afdeling og fastgøre den på en pre angivne orientering med en skrue på siden af mødesalen. Gitteret vises her har 1 mm afstand; men afstanden kan tilpasses efter behov.
    Bemærk: Dette bør være identisk med gitter og papirretning anvendes i de anatomiske Mr.
  5. Sikre stereotactic micro-drive indehaveren på optagelse kammer i en forudbestemt retning.
  6. Trække den steriliseret illuminator fra guide røret ved at trække illuminator op ved hjælp af steril, stumpe pincet. Spidsen af illuminator bør være 5-10 mm over spidsen af guide tube.
    Bemærk: Illuminator vil bøje udad mellem guide tube og klemmen. Dette vil ikke beskadige den fleksible illuminator.
  7. Anbringer mikro-drevet til indehaveren og guide røret anbringes i target gitter hul.
  8. Lavere micro-drive fase indtil guide tube er kun gennem niveauet af dura.
    Bemærk: Hvis det ønskes, kan en anden mikro-drev med en elektrode placeret på scenen og sænkes ned i en anden gitter hul. Feltet lokale potentiale på denne elektrode vil vise en afstand-afhængige lys artefakt, der kan bruges til at bekræfte illuminator placering.
  9. Forsøger den nederste del af belysningen manuelt med steril pincet.
    1. Hvis der er nogen modstand, trække illuminator 5 - 10 mm, vente 10 min for at tillade væv til at bosætte sig og prøve igen.
    2. Hvis der stadig er modstand på det andet forsøg, trække illuminator spidsen ind i guide rør, lavere guide tube 0,25 mm, og prøv igen.
    3. Gentag indtil illuminator dias gennem guide rør uden modstand.
    4. Sænke illuminator, indtil det er stramt.
      Forsigtighed: Skub ikke illuminator kraftigt mod modstand. I disse tilfælde guide tube typisk har ikke er trængt ind dura fuldt ud. Skubbe fiber kraftigt vil få det til at bøje sig selv, at forebygge fiber fra ind i hjernen og eventuelt ødelægge tip ( figur 1 g).
  10. Tilsluttes større optik oprettet eller laser Doppsko på anden enden af illuminator.
  11. Sikre at ingen lys er synlig for ikke-menneskelige primater.
    1. Bruger black-out afskærmning eller lys absorberende folie til fuldt omfatte optagelse tårne.
    2. Placerer alle optiske forbindelser i afskærmet konvolutter lavet af lys absorberende folie.
    3. Skjold alle patch kabler med enten lys absorberende folie eller sorte elektrisk tape.
    4. Som en ekstra sikkerhedsforanstaltning, placere en lokkedue light - emitting diode (LED) bank i det samme lys farve anvendes i eksperimentet bag den primat og flash lysdioder kontinuerligt på 2,5 Hz. Dette forhindrer øjne fra at justere fuldt til mørket. Hvis der var utilsigtet lys lækage, denne blinkende lys ville bidrage til at forhindre lækage fra tjener som en adfærdsmæssige udløser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Belysningen af store hjerne mængder i ikke-menneskelige primater tillader behaviorally relevante optogenetic manipulation. Acker et al. (2016) anvendes denne store mængde illuminator med rød-forskudt Halorhodopsin, Jaws 7 at studere den tidsmæssige bidrag af feltet frontal øje (FEF) til hukommelse-styrede saccades i to rhesus aber. Specifikt, blev FEF neuroner injiceret med en viral vektor indeholdende kæber og derefter belyst med rødt-lys ved hjælp af den store mængde illuminator under enten mål præsentation, forsinkelsesperioden eller motor forberedelsesperiode af en memory-styrede saccade opgave 8. figur 3 viser eksperimentet betingelser. Fejlrater (fx, fejlslagne forsøg på at udføre hukommelse-styrede saccades til ordentlig destinationsplaceringen) steget betydeligt med belysning for mål i feltet injiceres modtagelig, men ikke for mål modsat stedet for inaktivering / belysning (Figur 4a).

Ud over de adfærdsmæssige forandringer som følge af optogenetics, den store mængde illuminator tilladt for inaktivering af neuroner over fuld 2,5 mm span af cortex (fig. 4 c) og let levering over 4,5 mm (figur 4b), som det fremgår af de optisk-induceret lokale felt potentielle artefakt 8.

Figure 1
Figur 1 . Stor mængde Illuminator bredt distribuerer lys
en) optisk fiber/parring ærme/illuminator interface. b) Etched kerne og beklædning spredt lys bredt. c) lysemitterende 5 mm lange ætset tip. d) sammenligning af tip figurer for en konventionel fiber og en stor mængde illuminator. e) Illuminator og konventionelle optisk fiber med lige store samlede input lys beføjelser i 1" kubisk hjernen phantom (1,75% agar). f) Monte Carlo modeller af det midterste tværsnit af en stor mængde illuminator med 3 mm spids længde (venstre) og en konvention flade kløvet fiber af lig diameter med lige lys effekttætheder på deres lysemitterende flader. Se supplerende metoder til Acker et al., 2016 for detaljer om denne model. g) defekt stort volumen illuminator med krøllet spids. h) beskadiget stort volumen illuminator tip fra guide tube. Dette tal er blevet ændret og genoptrykt i en del fra Acker et al., 2016 8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Stor mængde Illuminator kalibrering
Dette tal er genoptrykt fra Acker et al., 2016 med mindre ændringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Hukommelse-styrede Saccade opgave med belysning eller Sham på forskellige tidspunkter.
Dette tal er genoptrykt fra Acker et al., 2016 8Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Adfærdsmæssige og elektrofysiologiske virkninger af Optogenetic hæmning med stort volumen belysning
en) fejl steget betydeligt med belysning. b) Raster jordlodder viser hæmning af neuroner der spænder over 2,5 mm tykkelse af cortex. c) lokale felt potentiale viser en lys artefakt, der spænder over 4,5 mm. For b) og c), kontakter er afstand 0,5 mm over dybden af cortex, n = 426 forsøg. Dette tal er tilpasset og Genoptrykt fra Acker et al., 20168Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens optogenetic værktøjer er meget udbredt at studere sygdom og fysiologi i gnavere, har den tekniske udfordring af lysende store hjerne diskenheder begrænset anvendelse af optogenetics i ikke-menneskelige primater. Banebrydende undersøgelser i aber bruges store lys effekttætheder (~ 100 mW/mm2 til 20 W/mm2) til at belyse små mængder, måske < 1 mm3og rapporterede beskedne adfærdsmæssige effekter med excitatoriske opsins i cortex4, 9,10,11 og en hæmmende opsin i superior colliculus12.

Derfor blev et stort volumen illuminator udviklet for at muliggøre lys levering til store væv diskenheder. Med denne illuminator og rød-forskudt halorhodopsin, kæber, robust, optogenetically-drev adfærd blev observeret i ikke-menneskelige primater8.

Protokollen beskrevet her kan ændres alt efter formålet med forsøget og geometri af væv målområde. For eksempel kan ætset spidsen af fiber forlænget eller forkortet afhængigt af størrelsen af området skal oplyses. Spidsen kan trækkes med en tykkere spids end beskrevet eller en større diameter fiber kan bruges til at oprette en mere robust illuminator. Mens denne protokol beskriver en ætset fiber tip, er det muligt at etch fiber både på spidsen og på en mere distale segment for usammenhængende belysning.

Kvalitetskontrol kontrol er en vigtig del af denne protokol. Spidsen af en stor mængde illuminator kan blive kløvet eller bøjet (fig. 1 g), især hvis det er mekanisk beskadigede, eller hvis det er trukket for tynd i første omgang. For at trække fiber med den korrekte mængde kraft konsekvent, behøver de fleste eksperimentatorer et par timer af praksis. I betragtning af de lave omkostninger at gøre fibre (anbefale plast optisk fiber koster mindre end $ 0,03/meter), mange eksperimentatorer kun anbringe fibre med perfekt tips til dupsko og, derfor, kassér mindst 30% af fibre til mindre tip mangler. Ujævn lysfordeling opdaget under kalibreringen kan korrigeres ved re polering fiber tip og re kalibrering fiber.

Yderligere, spidsen af illuminator bør kontrolleres efter hvert forsøg. Hvis eksperimentatoren tvinger illuminator gennem guide rør før guide tube har trængt dura, illuminator vil bøje tilbage på sig selv og det vil ikke trænge ind i hjernen. Typisk, illuminator tip er ødelagt i disse tilfælde (figur 1 h). Bortset fra modstand til illuminator indsættelse fungerer feltet lokale potentielle som kontrol i-eksperiment for korrekt illuminator placering. Hvis illuminator er bøjet op over dura, viser feltet lokale potentielle ikke det karakteristiske lys artefakt, der tjener som en check for korrekt illuminator placering under eksperimentet.

Mens den store mængde illuminator er designet til levering lys til flere kortikale lag samtidig, er det ikke velegnet til lysende de mest overfladiske kortikale lag mens besparende dybere lag eller lysende en enkelt lag af cortex individuelt. Hvis meget rumligt specifikke belysningsstyrke ønskes, kan traditionelle fibre, der fokuserer lyset mere snævert eller overfladiske belysning gennem vinduer i dura 6 være mere hensigtsmæssigt. Yderligere, fleksibilitet af den store mængde illuminator er både en fordel og en begrænsning. I modsætning til glas optiske fibre, denne illuminator ikke kan splintre i hjernevævet, men denne fleksibilitet også gør det vanskeligt at fremme illuminator over store kortikale afstand (f.eks., 10 mm eller mere). Derfor, for at målrette en meget dyb brain struktur (fx, pulvinar), en guide tube skulle være avanceret forbi dura og i hjernevæv til at give ekstra mekanisk styrke.

Samlet set giver denne metode en betydelig fordel i forhold til tidligere metoder fordi det giver mulighed for belysning af behaviorally relevante hjernen mængder i ikke-menneskelige primater, en nøgle til at tilpasse optogenetics til primat undersøgelser. Mens denne metode har været vist i FEF rhesus aber, ville det arbejde i mange andre områder i hjernen og endda i andre tilsvarende store hjerne arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgements

LCA anerkender støtte fra et NDSEG stipendium, NSF GRFP og venner af McGovern Institute. EP anerkender finansiering Harry og Eunice Nohara UROP fond, MIT klasse af 1995 UROP fond, og MIT UROP fond. ESB anerkender midler fra NIH 2R44NS070453-03A1, IET Harvey præmie og New York stamcelle Foundation-Robertson Award. RD anerkender midler fra NIH EY017292. Michael Williams hjalp holdet til at organisere og samle leverancer inden optagelserne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1,000 °F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211, (1), 49-57 (2012).
  3. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, (3), 387-397 (2011).
  4. Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24, (1), 63-69 (2014).
  5. Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219, (1), 142-154 (2013).
  6. Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110, (6), 1455-1467 (2013).
  7. Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17, (8), 1123-1129 (2014).
  8. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (46), 7297-7306 (2016).
  9. Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15, (10), 1368-1370 (2012).
  10. Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22, (18), 1722-1726 (2012).
  11. Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33, (42), 16684-16697 (2013).
  12. Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76, (5), 901-907 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics