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人血 Intramolluscan 期的体分离与培养的研究血吸虫氏

Developmental Biology

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Summary

本文介绍了一个协议的 large-scale 无隔离和收集自由毛蚴的人类血液侥幸血吸虫氏及其后续的处理, 介绍到体外文化。

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

人的血液吸虫,血吸虫, 有一个复杂的生命周期, 涉及无性和性发育阶段内的蜗牛中间和哺乳动物的最终宿主, 分别。在体外培养条件下, 分离和维持不同生命周期阶段的能力大大促进了对寄生生物生长、发育和寄主的细胞、生物化学和分子机制的研究。相互.血吸虫病的传播需要在钉螺寄主内无性繁殖和发育多个幼体期;从感染毛蚴, 通过初级和次级 sporocysts, 到最后的尾蚴阶段, 是感染人类。本文提出了一个 step-by 的程序, 用于大规模孵化和隔离的血吸虫氏毛蚴从被感染小鼠的肝脏获得的卵子, 并随后介绍到体外培养。预计详细的协议将鼓励新的研究人员参与并拓宽这一重要的血吸虫研究领域。

Introduction

人的血液吸虫血吸虫, 是血吸虫病的致病因子, 一种被忽视的热带疾病, 在全世界估计有2.3亿人在1。最广泛的物种,日本血吸虫氏, 分布在南美洲, 加勒比群岛, 中东和撒哈拉以南非洲地区2S. 氏和其他血吸虫的生命周期是复杂的, 涉及哺乳动物的确定性宿主和Biomphalaria的淡水蜗牛, 它们充当强制的中间宿主。

S. 氏雄性和雌性成年蠕虫对生活在哺乳动物宿主的后肠系膜静脉中, 导致胚卵 (卵) 在小肠黏膜的小静脉中释放。卵然后冲破血管壁, 通过粘膜组织迁移, 最终进入肠道, 在那里它们被粪便所破坏。当卵进入淡水和自由幼虫 (毛蚴) 孵化, 他们必须, 在短的顺序, 找到一个合适的Biomphalaria蜗牛感染, 以继续其生命周期。这一感染过程涉及 miracidial 附着在蜗牛的外体表, 其次是主动渗透和进入寄主的幼虫。进入后不久, 毛蚴开始脱落其外纤毛表皮板, 因为它形成了一个合, 将成为新的外表面 (皮) 的下一个幼虫阶段, 主要或母亲孢子囊。通过无性繁殖, 每个主要孢子囊生产和释放第二代 sporocysts, 称为次要或女儿 sporocysts, 反过来, 生成和释放大量的最终 intramolluscan 阶段, 尾蚴3.从蜗牛主机逃生后, 自由尾蚴能够附着并直接穿透人类或其他合适的哺乳动物宿主的皮肤。进入新寄主后, 尾蚴转化为寄生童阶段, 侵入血管系统。反过来, 他们迁移到肺, 然后到肝静脉, 他们成熟的成年蠕虫, 形成男性和女性对和旅行到肠系膜静脉, 以完成他们的生命周期。

成功的 intramolluscan 或 "蜗牛相" 发育的幼虫血吸虫是必不可少的继续循环的人类主机传播。最重要的是自由毛蚴进入蜗牛寄主的时期, 并将其早期转化为初级孢子囊阶段。根据寄主和寄生虫之间的生理和免疫相容性, 这是在幼体发育的这一阶段, 最初的成功或失败建立感染是确定的4,5,6.随后开发的初级 sporocysts 能够无性生产的次生 sporocysts, 然后产生人感染尾蚴, 进一步需要一个宽容的生理宿主环境, 提供所有的寄生虫的增长和生殖需求。

到目前为止, 关于控制血吸虫-蜗牛相互作用的基本生理、生物化学和分子过程, 特别是有关调节幼虫发育和繁殖的分子和途径, 或调节宿主免疫应答。在体外条件下, 可随时访问大量这些幼体阶段, 允许进行实验操作的培养基将极大地促进发现发育途径和细胞生长的基本机制, 分化和繁殖。关键的寄生虫通路或机制, 通过体外试验确定, 然后可以用来扰乱幼虫生长/繁殖在蜗牛寄主, 或识别蜗牛宿主免疫机制参与识别和消除miracidial 或孢子囊阶段。

在本文和视频演示中, 我们提供了一种方法的详细描述, 用于隔离大量的自由S. 氏毛蚴, 以便导入到体外区域性, 然后再进行后续实验操作 (有关协议工作流的示意图概述, 请参见图 1 )。虽然先前已描述过类似的过程789, 但我们认为, 详细的协议对于希望使用此模型来解决与intramolluscan 幼虫发育, 细胞增殖, 血吸虫-蜗牛免疫相互作用。此外, 这种方法可以很容易地适应分离的卵子从其他医学重要的吸, 如膀胱居住的S. 埃及, 肝吸虫或肺吸虫。

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Protocol

所有动物保育和实验程序均由威斯康星大学-麦迪逊分校动物保育和使用委员会批准。V005717以下协议涉及在人类病原体的生物安全2级 (BSL2) 设施中工作, 尽管本议定书中所描述的血吸虫阶段都没有感染人类或其他哺乳动物。遵循处理风险 2 (RG2) 人类病原体的机构政策。

注: 我们使用女性瑞士-韦伯斯特小鼠 (6 周), 由于他们更高的易感性感染10, 从而产生更大的鸡蛋负担。塔克et al.描述了此模型系统11中使用的鼠标和蜗牛感染协议。材料表列出了执行此实验协议所需的所有特定设备、材料、试剂和动物源。

1. 感染肝脏的处理

  1. 安乐小鼠, 6-7 周感染, 由 CO2窒息 (室容积每分钟10-30% 的速率)。监测小鼠停止呼吸和心跳。
    注: 一般情况下, 可在给定时间处理多达20只老鼠。
  2. 将被安乐死的小鼠转移到生物安全柜后, 将小鼠放在背上, 用70% 乙醇喷洒它们的腹面。让浸泡1分钟。
  3. 捏和拉下腹部的皮肤, 并削减在最接近腹部的捏皮肤底部与无菌手术剪刀。将切口皮肤前 (即,朝向头部) 以显示肝脏。请注意, 肝脏应扩大和斑点, 由于鸡蛋引起的肉芽肿反应 (图 2A)。
  4. 取出肝脏并将其放在含有200毫升无菌1.2% 氯化钠溶液中的烧杯中, 其中含有笔/链球菌。
  5. 重复步骤1.3 和1.4 与剩余的小鼠。
    注: 二十只老鼠通常在一次收获中加工。
  6. 将肝脏放在不育的培养皿中, 用无菌钳除去肝脂肪/结缔组织。
  7. 将已修剪/清洁的肝脏转移到一个不育的250毫升离心机瓶中, 含有200毫升无菌 1.2% NaCl 溶液与笔/链球菌。
  8. 用力摇动含有肝脏的瓶子, 使用无菌一次性吸管, 去除多余的表面泡沫/漂浮杂物。慢慢地将剩余的盐水溶液倒入含有1% 漂白剂 (消毒剂) 的容器或水槽中。
  9. 在肝脏中加入〜200毫升的新鲜盐水溶液, 重复步骤1.8 三次。

2. 肝提取和 miracidial 分离

  1. 将肝脏放入一个不育的不锈钢搅拌机杯中, 加入〜2毫升的 1.2% NaCl 溶液 (图 2B)。
  2. 用箔和培养皿盖住杯子以防止溢出, 并通过交替的低速和高速混合1分钟 (二十年代低 speed/10 s 高速; 重复) (图 2C)。
  3. 均匀地分布混合的肝脏悬浮入无菌250毫升离心机瓶 (为20肝脏使用4瓶)。
  4. 将无菌生理盐水加抗生素到 ~ 200 毫升总容积/瓶。在离心前称量/平衡瓶子。
  5. 离心混合的肝脏在 290 x g 为15分钟在 4 oc. 在丢弃之前, 用漂白剂轻轻地将清倒入容器中。
  6. 重复步骤 2.4-2.5 次。在离心前一定要彻底重肝沉积物。
  7. 在丢弃最后一次盐水洗涤 (步骤 2.6) 后, 在颗粒肝组织中加入200毫升无菌池塘水和笔/链球菌, 摇动至重沉积物, 并将悬浮液转移到已完全覆盖铝的灭菌1升容积烧瓶中箔, 除了前3厘米的颈部 (图 2D)。
    注: 每1升瓶使用两瓶 (= 10 肝)。池塘水模拟的自然淡水环境需要刺激 miracidial 孵化从鸡蛋。
  8. 使用无菌池塘水, 填补了烧瓶约3厘米以上的铝箔覆盖在颈部。然后, 没有延迟 (如毛蚴很快开始孵化), 清除残留的泡沫和肝脏组织漂浮到表面, 迅速移高达〜12毫升池塘水含有碎片, 并丢弃到一个单独的丢弃管。用新鲜的无菌池塘水代替。
  9. 重复清洁步骤 2.8, 三次, 检查是否存在毛蚴的丢弃管。如果毛蚴出现在洗涤液中, 请停止重复清洗步骤。
  10. 最后一次洗涤后, 慢慢地加入〜12毫升的温水无菌池塘水 (5ml 到 30 oC) 创建一个温度梯度与清洁, 无菌温水在上面。
    注意: 这是最好的完成, 慢慢排出水沿一侧的烧瓶颈部, 以避免混合。
  11. 在烧瓶的开口处放置一个小的培养皿盖, 并在箔盖上方的烧瓶顶部亮出一盏明亮的光, 照亮水的上表面。
    注: 通常, 在5-10 分钟内, 游泳毛蚴, 吸引到光, 将集中在大数在前 2-3 cm 池塘水 (图 3A)。

3. Miracidial 收获和耕种

  1. 当毛蚴在10分钟后在表面积聚, 使用无菌转移吸管, 除去8毫升的池塘水, 并转移到无菌15毫升离心管。把装有毛蚴的管子放在冰上。
  2. 在容积烧瓶的内侧加回8毫升温热无菌池塘水, 再等10分钟。
  3. 每次使用新的管, 重复步骤3.1 和3.2 三次。在 4th集合之后, 将最后一根管放在冰上10分钟, 以使毛蚴能够解决。这套管子包括第一个收获。
  4. 离心管包含毛蚴在 290 x g 为1分钟在 4 oC 在预冷藏离心机。
  5. 立即删除大部分上清 (〜7毫升) 注意不要扰乱寄生虫颗粒 (图 3B)。
  6. 所有的毛蚴从这第一次收获到一个管, 然后冲洗所有的原始管与〜1毫升无菌池塘水, 并添加到 "池" 管。
  7. 允许寄生虫在冰上定居5分钟, 并再次离心的寄生虫在 290 x g 1 分钟, 在 4 oC。
  8. 小心地去除上清, 并加入6-8 毫升无菌彻的平衡盐溶液 (波罗的海 +; 见材料表), 含有笔/链球菌。
  9. 轻轻地暂停毛蚴和分他们进入一个24良好的文化板块 (1 毫升每井), 其次是冲洗管6-8 毫升波罗的海 + 和增加1毫升冲洗每井。在常条件下孵育 26 oC 的寄生虫。分离的毛蚴的浓度会有所不同, 但通常会平均〜 7000/毫升。
  10. 如果寄生虫仍然集中在光源, 重复步骤3.1 至3.9 继续收割后期孵化毛蚴, 但增加的时间间隔之间的集合到15-20 分钟。
    注: 这套新的管子代表第二个收获。然而, 由于 miracidial 数字通常是低的, 从所有管的幼虫通常被汇集到一个单一的文化井包含2毫升波罗的海 +。
  11. 在24小时收获和耕种, 温和地重 sporocysts 在他们的井由移。
  12. 等几分钟, 让寄生虫沉淀到井底。一旦他们已经解决, 小心地删除上清 (〜1.5 毫升), 这将包含大部分的纤毛表皮板棚毛蚴在幼虫转化。这种 "转化" 的上清液要么被丢弃, 要么被纳入到幼虫分泌产品的后续研究中。
  13. 加入1.5 毫升的新鲜波罗的海 + 每一个井和轻轻吸管到重 sporocysts。如果需要进一步清洗或更改到不同的介质, 请重复步骤3.12。

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Representative Results

绝大多数的毛蚴通常都是在前两个 "收获" 中收集的。波罗的海中孤立毛蚴的培养触发 miracidium-to-sporocyst 转换过程 (图 4A-C)。在迁移到含有波罗的海的培养井后的第一个小时内, 大多数毛蚴停止游动 (图 4A)。在6小时的文化, 毛蚴正在积极脱落他们的纤毛表皮板 (图 4B)。与此脱落过程, 幼虫形成它们的外合体表覆盖, 因为它们转化为初级 sporocysts。大多数寄生虫将完成幼体转化, 成为完全形成的 sporocysts, 由 24-48 h post-cultivation 在波罗的海 + (图 4C)。经过4天的文化波罗的海 + 单独, 孢子囊生存可能会减少到〜80%。然而, sporocysts 培养1天的波罗的海 +, 然后转移到完整的 (cBge) 培养基3天通常会导致更好的生存率和幼虫具有更健壮的外观 (图 4D)。孢子囊的生存能力一般保持稳定在4和7天之间在 cBge 与持续增加的幼虫生长在这时间在文化与波罗的海 + 单独。

Figure 1
图 1.协议工作流的概述.从感染人类血液侥幸的小鼠毛蚴的分离和培养中所涉及的主要步骤的概要, S. 氏请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 处理受感染的肝脏.(A) 老鼠肝严重感染了卵。注意被感染的肝脏 (右) 与正常未感染的肝 (左) 相比, 肿大的大小、异常的颜色和肉芽肿的存在。(B) 清洗后的小鼠肝脏转移到无菌不锈钢搅拌机杯。然后用无菌箔和培养皿将肝脏混合一分钟, 以覆盖杯子, 从而避免溢出 (C)。在混合后, 肝匀浆, 含卵, 在盐水和悬浮在无菌池塘水中被洗涤多次, 在被转移到一个1升的容量烧瓶覆盖铝箔 (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 收获S. 氏毛蚴活跃地游泳毛蚴集中由吸引力对光在容量烧瓶 (A) 的顶端。在10分钟的间隔, 寄生虫收获的吸管和放置在4° c 的固定幼虫。毛蚴然后被洗涤在波罗的海 + 通过离心和收集在一根管子 (B) 在分配到文化板材的井之前。波罗的海 +;彻的平衡盐溶液 (材料表)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: Miracidial 转换为主 sporocysts 及其维护体外. S. 氏毛蚴和 sporocysts 置于体外区域性中, 用于不同时间后。新收获的毛蚴在波罗的海 + (A) 中的 1 h 文化中。经过 6 h 的文化, 毛蚴已经开始脱落他们的纤毛表皮板 (箭头), 因为他们转化为主要 sporocysts (B)。在波罗的海 24 h 之后, 大多数毛蚴已完全转换为主 sporocysts (C)。Sporocysts 被变换了波罗的海 + 为 24 h, 然后转移并且维护在 cBge 媒介为3天 (D)。Sporocysts 一般表现得更健壮, 在 cBge post-cultivation 的4天内存活率更高, 而波罗的海 + 单独。波罗的海 +, 彻平衡盐溶液;cBge 培养基, 完整的B. 光滑胚胎细胞培养基 (参见材料表)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

毛蚴的S. 氏的分离和操作, 如本文所述, 只能感染蜗牛中间宿主, 因此在幼体发育的这一阶段不代表人类的生物危害。然而, 为了避免意外暴露/感染蜗牛, 应注意执行 miracidial 隔离在不同的地方, 在敏感的Biomphalaria蜗牛物种可能存在或维持。一个独立的房间, 注册为 BSL2 空间, 是强烈建议。此外, 在处理肝脏和幼体隔离过程中使用的所有洗涤液都应使用消毒剂 (, 1% 漂白剂) 处理。

应当指出, 在无菌条件下, 在生物安全柜 (BSC) 中, 手术切除受感染小鼠的肝脏, 并在混合/均质之前进行处理。然而, 出于实际原因 (易于操作散装样品), 所有其他程序都是在消毒台式上使用无菌容器 (例如、搅拌机杯、烧瓶、瓶子和管子、转移吸管等) 和无菌溶液进行的。含抗生素 (盐水, 池塘水, 波罗的海)。抗生素被添加到所有的解决方案作为一个进一步的预防措施, 防止引入微生物污染。此外, 在 miracidial 隔离和收割步骤 (协议2和3节), 一个小的培养皿盖放在烧瓶开放, 以尽量减少外部污染在最初清除泡沫/肝脏碎片和随后转移浓缩毛蚴从烧瓶到离心管。

通常, 我们从20受感染的小鼠肝脏中采集毛蚴, 我们估计每肝幼虫的幼体产量约为5000。然而, 产量可能会有很大的不同, 取决于感染强度的个别小鼠导致批次变化的 miracidial 恢复。隔离可以使用较少的启动肝脏进行, 虽然我们所描述的方法通常适用于10-20 肝脏。当20肝脏被处理, 在无菌池塘水的肝脏药丸的最后悬浮以后 (协议部分 2, 步骤 2.7), 悬浮应该均匀地被分配入二个1000毫升烧瓶 (2 瓶/烧瓶)。如果使用10肝脏或更少, 原肝匀 (协议部分 2, 步骤 2.3) 可以分配到2瓶和洗涤的悬浮然后转移到一个单独容量烧瓶为进一步处理。一个或2的肝脏也可以处理, 但数量 (体积) 的提取, 洗涤和孵化解决方案应按比例减少, 最后洗涤沉积在池塘水被转移到10毫升箔覆盖的体积烧瓶集中毛蚴.

为了最大限度地提高 miracidial 的产量和最低限度的肝脏碎片污染, 这也是重要的是执行池塘水冲洗 (协议节 2, 步骤 2.7-2.9) 尽可能快和有效。一旦卵暴露在池塘水, miracidial 孵化发生不久, 虽然在幼鱼出现在瓶颈的光源前的时间可以从孵化开始后的5-20 分钟不等。为了限制在池塘水清洗步骤中寄生生物的损失, 必须在烧瓶的颈部上部水层中目视检查每个池塘的水冲洗, 以便尽早到达毛蚴。此外, 一旦毛蚴被转移到15毫升收集管和被放置在冰上, 他们将停止游泳活动和定居到管底部。然而, 离心后的颗粒幼虫 (3 节, 步骤 3.4-3.5), 毛蚴将再次开始游泳, 如果水是允许温暖。因此, 重要的是要迅速清除池塘水, 但不干扰的颗粒或移的游泳寄生虫。

如前所述, 分离的毛蚴的产量可能会因个别小鼠 (感染强度) 和初始感染协议的一致性而不同。毛蚴是强烈 phototropic 和多数人 (80-90%) 将集中在光源在第一个收获期间。余下的10-20% 的毛蚴将继续孵化, 并在第二个收获期间更缓慢地积累。大多数 (> 95%) 毛蚴引入到文化中, 并保持在波罗的海 + 培养基中的 26 oC 将在24-48 小时内转化为初级 sporocysts。在这个时候, 幼虫的生存能力通常是 > 90%。在4天以后在波罗的海 + 单独生存能力可观地下落 (70-80%)。然而, 在初始波罗的海培养后, 将培养基从波罗的海中转换为完整培养基24小时, 存活率更高, 生长更强劲。我们经常在常条件下维持短期孢子囊文化。然而, sporocysts 是相当敏感的氧水平, 特别是对活性氧的物种, 可以造成有害的氧化损伤7。苦丁茶特里·沃贝恩4和其他人报告说, 当培养物在缺氧条件下保持时, sporocysts体外的整体健康和生存能力得到显著改善。降低的氧气水平可以通过毒气 (与氮气) 单独 closeable 烧瓶, 或通过氮气增殖的孵化器的气相4

如上所述, 对血吸虫毛蚴和 sporocysts 的无分离和培养方法进行了描述。早期认识到, miracidial 光可用于吸引和浓缩游泳幼虫, 而隔离的毛蚴可以迅速固定在渗盐水溶液中 (在 120-160 mOs/千克之间)8。进一步观察到, 在盐水溶液中的维护导致了毛蚴的转化为原 sporocysts, 第一 intramolluscan 幼虫阶段9,12。复杂的介质也被公式化支持 longer-term在体外生长和发展S. 氏孢子囊阶段9,13,14,15, 以及单元格从蜗牛主机Biomphalaria 光滑16派生。这些配方结合了各种商业媒体, 并可能已补充了氨基酸, 盐, 血脂, 还原剂和糖。完整的培养基配方还包括不同浓度的热灭活胎牛或马血清。我们发现, 适当的热失活 (HI) 是孢子囊生存和长期发展的关键,在体外。我们发现, 血清 (解冻, 100 毫升瓶) 在 60 oC 水60分钟, 与温和混合每10分钟的均匀加热是最有效的。另外, 我们通常会从一个潜在的供应商那里测试几种不同的血清来培养幼体的相容性。最后, 建立的第一个 (目前唯一) 正宗软体动物细胞系, B. 光滑胚胎 (人) 细胞系由汉森16是一个重大突破, 大大促进了血吸虫幼虫的进展耕种努力。孤立的S. 氏毛蚴, 当其与从主到次/子 sporocysts17的从小学到二级/第二个或最后一个尾蚴阶段的人共培养.因此, 连续的体外培养的整个蜗牛阶段的S. 氏生命周期已经实现。在我们的培养系统中使用的孢子囊细胞培养基支持的生长/发展和维护的, 在我们的细胞线。

总之, 我们描述并直观地说明了S 氏的自由 miracidial 阶段的大规模无隔离和培养的详细协议。这些毛蚴, 当受到适当的文化条件, 能够发展到连续的小学和中学孢子囊代, 并最终尾蚴。通过转基因、RNA 干扰和基因组编辑 (如 CRISPR/Cas9) 的方法, 开发和不断细化目前可用于操纵基因和基因表达的工具体外, 它的设想是高效不同吸种毛蚴分离培养方法的研究20将继续需要, 以便采购材料, 以便进一步推进这一领域的科学研究。此方法很好地补充了先前描述的用于隔离和培养S. 氏的自由尾蚴的协议, 以方便体外转化为哺乳动物童阶段21, 最终栽培对 ovigerous 成年蠕虫22

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

部分由 NIH 资助 RO1AI015503。血吸虫感染小鼠由 NIAID 血吸虫病资源中心在生物医学研究所 (马里兰州罗克韦尔, MD) 通过 NIH-NIAID 合同 HHSN272201000005I 提供通过北资源分配。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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