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質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養

Developmental Biology

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Summary

この記事では、大型無菌免人間住血吸虫マンソン住血吸虫の自由遊泳性の miracidia のコレクションのためのプロトコルおよび生体外の文化への導入、後続の処理について説明します。

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

人間住血吸虫、住血吸虫属、それぞれカタツムリ中間および哺乳類最終的なホスト、内で無性生殖と性的発達段階を含む複雑なライフ サイクルがあります。分離し、体外で培養条件下で別のライフ サイクル段階を維持する能力は寄生虫の成長、開発およびホストを制御する細胞, 生化学的および分子機構の研究を促進しています。相互作用。住血吸虫症の伝送は、無性生殖とカタツムリ ホスト内で複数の幼虫の段階の開発を必要とプライマリおよびセカンダリの sporocysts を介して感染のミラシジウムから cercarial 終盤それが人間に感染です。本稿では大量孵化とマンソン住血吸虫感染マウスと生体外で文化にその後導入の肝臓から得られた卵から miracidia の分離手順プロトコルを提案します。詳細なプロトコルに従事し、住血吸虫研究のこの重要な分野を広げる新しい研究者を奨励することも予想されます。

Introduction

人間血蛭住血吸虫属、住血吸虫症、12 億 3000 万人推定世界を苦しめる顧みられない熱帯病の病原です。最も普及している種、マンソン住血吸虫、地理的に、南アメリカ、カリブ海諸島、中東、サハラ以南のアフリカ2で配布されています。マンソン住血吸虫など、およびその他の住のライフ サイクルは、哺乳類の決定的なホストと偏の中間宿主となるBiomphalaria属の淡水の貝を含む複雑です。

マンソン住血吸虫など男性と女性の大人のワーム ペア哺乳類宿主再現の後部上腸間膜静脈に住んでいる腸内の粘膜の小さな静脈にひっかかる鶏卵 (ova) の解放に終っています。卵の血管壁壊れる粘膜組織を移行し、最終的に糞便を無効になった彼ら、腸内腔を入力がします。Ova は、淡水性で自由遊泳の幼虫 (miracidia) ハッチを入力、短いのため、そのライフ サイクルを続行するために感染に適したBiomphalariaカタツムリを見つける必要があります、彼ら。この感染プロセスには、ホストに進行中の侵入と幼虫のエントリが続いてカタツムリの外側のボディ表面に miracidial の添付ファイルが含まれます。エントリー後すぐに、ミラシジウム小屋を開始するその外側の毛表皮板次の幼虫、プライマリまたは母の sporocyst の新しい外面 (テグメントタンパク) となるシンシチウム形成。無性生殖は、各プライマリ sporocyst 生成し、二次と呼ばれる sporocysts または intramolluscan 終盤、ケルカリア3の大規模な番号を解放と生成し、順番の娘 sporocysts の第二世代をリリース.カタツムリのホストからの脱出、時に自由遊泳セルカリアは接続して人間や他の適した哺乳類宿主の皮膚を直接貫通が可能です。新しいホストへの参入、セルカリア寄生 schistosomula ステージに変換、血管のシステムに侵入します。、彼らは順番に、肺と肝静脈成虫に成熟、男性と女性のペアを形成、そのライフ サイクルを完了する上腸間膜静脈への旅行、どこを移行します。

Intramolluscan 成功または幼虫住の「カタツムリ フェーズ"開発人間ホストに転送サイクルの継続に不可欠です。重要性のカタツムリ ホストとプライマリ sporocyst 段階、初期変換に自由遊泳のミラシジウムの期間の次のエントリです。寄生虫とホスト間の生理学的および免疫学的互換性、によってそれは幼虫の開発のこの段階で、その初期の成功または感染症が決定した4,56,を確立する失敗.無性人間感染セルカリアを生成し、二次 sporocysts を作り出すことができる主な sporocysts の後続の開発はさらに寄生虫の成長のすべてを提供する寛大な生理的ホスト環境を必要と生殖が必要です。

までに、少しは知られているについて生理学的、生化学的な基礎となると住血吸虫カタツムリの相互作用を制御する分子過程、特に分子や経路に関与する幼虫の発育と生殖を規制、または変調ホストの免疫反応。体外で培養実験的操作を可能にする条件の下でこれらの幼虫の段階の多数へのアクセスが大いに促進され発達経路の発見と細胞増殖、分化のメカニズム再現。重要な寄生虫の経路やメカニズム、体外実験によって識別される可能性があります、カタツムリ ホストで幼虫の成長・再生を妨害するまたはカタツムリ ホストの認識と排除に関与する免疫メカニズムを識別するためにmiracidial または sporocyst の段階。

この記事とビデオ プレゼンテーションは、我々 提供自由遊泳マンソン住血吸虫などの大規模な番号を分離する方法の詳細については、実験のフォロー アップを受ける生体外の文化への導入 miracidia操作 (プロトコル ワークフローの概要は図 1を参照)。ただし、同様の手順を記載されている以前7,8,9, 詳細なプロトコルが関連するまだ未回答の質問に対処するこのモデルを採用する研究者に役立つだろうと感じましたintramolluscan 幼虫の発育、細胞増殖と住血吸虫カタツムリ免疫の相互作用。さらに、このアプローチは、肺吸虫や肝蛭膀胱住居S. ビルハルツなど他の医学的に重要な吸虫類からの卵の分離に適合しやすい可能性があります。

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Protocol

制度的ケアおよび使用委員会議定書の下でウィスコンシン州マディソンの大学がすべての動物の世話と実験プロシージャを承認しません。V005717。次のプロトコルは、このプロトコルで描かれた住血吸虫段階のどれもが人間や他の哺乳類に感染が人間の病原体のためのバイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) 施設での作業を伴います。リスク グループ 2 (RG2) 人間の病原体を処理するための機関のポリシーに従ってください。

注: 我々 は降伏より大きい卵負担感染10より高い感受性のため (週齢 6) 女性のスイス ウェブスター マウスを使用します。タッカーは、このモデル システム11で使用されるマウスとカタツムリ感染プロトコルを説明します。テーブルの材料には、特定の機器、材料、試薬、この実験的プロトコルを実行するために必要な動物の源のすべてが表示されます。

1. 感染した肝臓の処理

  1. CO2窒息 (毎分室の容積の 10-30% の率) によって 6-7 週間後感染マウスを安楽死させます。呼吸・心拍停止のためマウスを監視します。
    注: 通常、20 マウスまで処理できます特定の時点で。
  2. バイオ セーフティ キャビネットに安楽死させたマウスを転送した後、背中にマウスを置き、70% エタノール腹側表面をスプレーします。1 分間浸してみましょう。
  3. ピンチし下腹部の皮膚を引き上げ、滅菌手術用ハサミで腹部に最も近いピンチ肌のベースでカットします。前方カット皮膚を引っ張って (すなわち、頭に向かって) 肝臓を明らかにします。肝臓の拡大し、(図 2 a) 卵誘発肉芽腫性反応のため斑点する必要があることに注意してください。
  4. 肝臓を取り出し、含む滅菌 1.2 %nacl ソリューション含むペン/連鎖球菌の 200 mL ビーカーに置きます。
  5. 1.3 と 1.4 残りのマウスとの手順を繰り返します。
    注: 20 マウスは通常単一収穫で処理されます。
  6. 滅菌シャーレに肝臓を配置し、滅菌ピンセットで非肝脂肪・結合組織を削除します。
  7. ペン/連鎖球菌を滅菌 1.2 %nacl 水溶液の ~ 200 mL を含む滅菌 250 mL 遠心ボトル/きれいにトリミングされた肝臓に転送します。
  8. 積極的に肝臓の入ったボトルを振るし、泡/フローティング破片過剰な表面滅菌使い捨てピペットを使用して、削除します。ゆっくりと残りの食塩を容器に注ぐまたは漂白剤 1% 含む (消毒) をシンクします。
  9. 肝臓に新鮮な食塩水の ~ 200 mL を追加し、手順 1.8 を 3 回繰り返します。

2. 肝抽出および miracidial の分離

  1. 小さな滅菌ステンレス製ブレンダー カップに肝臓を配置し、1.2 %nacl 水溶液 (図 2 b) 〜 2 mL を追加します。
  2. 箔とこぼれを防ぐためし、低・高速度 (20 s の低速/10 秒高速; 繰り返し) を交互に 1 分のブレンドにペトリ皿カップをカバー (図 2)。
  3. (20 の肝臓は、4 ボトルを使用) の遠心分離機 250 mL 滅菌瓶にブレンド肝サスペンションが均等します。
  4. 〜 200 mL 合計ボリューム/ボトルに抗生物質と滅菌生理食塩水を追加します。遠心分離前にボトルの重さ/バランス。
  5. 遠心分離機 290 x g 4 oC. 静かに 15 分間でブレンドされた肝臓は培養上清を破棄する前に漂白剤と容器に注ぐ。
  6. 2.4 2.5 の手順をもう一度繰り返します。必ず遠心分離前に肝臓の土砂を徹底的に再懸濁します。
  7. 最後の生理食塩水を破棄した後 (ステップ 2.6) を洗って、小球形にされた肝組織、土砂、再懸濁し、懸濁液を滅菌 1 L のメスフラスコは、完全にアルミニウムで覆われているに転送する手ふれにペン/連鎖球菌と 200 mL 滅菌池の水を追加箔、首 (図 2 D) の 3 cm 上を除いて。
    注: は、1 L フラスコあたり 2 本 (= 10 肝臓) を使用します。池の水は、卵から孵化を miracidial を刺激するために必要な自然の淡水環境をシミュレートします。
  8. 滅菌池の水を使用すると、首をカバーする箔の上約 3 cm に、フラスコを埋めます。その後、遅滞なく (、miracidia はすぐに孵化を開始)、残留泡とすぐに池の水の残骸を含む ~ 12 mL をピペットで表面に浮かぶ肝組織を取り外し、管別に破棄破棄します。新鮮な滅菌池の水を交換してください。
  9. クリーニングのステップ 2.8 回廃棄管 miracidia の有無の確認 3 つを繰り返します。洗浄液に miracidia が表示されて場合手順を洗浄の繰り返しを停止します。
  10. 最後の洗浄後徐々 に上のきれいな、滅菌の暖かい水と温度勾配を作成する (加温 30 oC) 暖かい滅菌池水 〜 12 mL を追加します。
    注: 最善の混合を避けるためにフラスコの首の側面に沿って水をゆっくりと放電による方法です。
  11. フラスコの開口部に小さなシャーレ カバーを置き、水の上部の表面を照らす箔カバー上フラスコの上部に明るい光を照らします。
    注: 通常、5-10 分以内 miracidia、光に惹かの水泳に集中する多数の池の水 (図 3 a) の最初の 2-3 cm 以内。

3. Miracidial の収穫と栽培

  1. Miracidia を 10 分後表面に蓄積しているときは、滅菌ピペットを使用して 〜 8 mL の池の水と滅菌 15 mL 遠心チューブへの転送を削除します。氷の上の miracidia を含む管を配置します。
  2. バック 8 mL の容積測定フラスコの内側に沿って暖かい滅菌池水を追加し、別の 10 分を待ちます。
  3. たびに新しいチューブを使用して、さらに 3 回の 3.1 と 3.2 の手順を繰り返します。4thコレクション後解決するため miracidia を許可する 10 分間氷の上最終管を維持します。チューブのこのセットには、最初の収穫が装備されています。
  4. 遠心チューブ 290 x g 4 oC 予冷冷却遠心機で 1 分で miracidia を含みます。
  5. 寄生虫ペレット (図 3 b) の邪魔にならないように注意しながら上澄み (〜 7 mL) のほとんどをすぐに削除します。
  6. プールの 1 つにこの最初の収穫からすべての miracidia チューブ、すべて 〜 1 mL 滅菌池の水を使ったオリジナル チューブを洗浄、「プール」チューブ追加。
  7. 〜 5 分間氷の上解決する寄生虫を許可し、再度 4 oc 以上で 1 分間 290 x g で寄生虫を遠心
  8. 慎重に上澄みを除去し、6-8 mL 滅菌チャーニンの平衡塩溶液 (バルト海沿岸 +; 参照テーブルの材料) 含むペン/連鎖球菌性を追加します。
  9. 優しく miracidia および 24 ウェル培養プレート (ウェルあたり 1 mL) にそれらは続いてバルト海沿岸 + 6-8 mL のチューブを洗浄とリンスの 1 mL を各ウェルに追加する因数を中断します。26 oC 培養条件下で寄生虫が孵化させなさい。分離 miracidia の濃度は異なりますが、通常 〜 7000/mL、平均は。
  10. 寄生虫はまだ光を集中している、孵化後半 miracidia を収穫を続けます 3.9 ステップ 3.1 を繰り返しますが、コレクションを 15 〜 20 分間の時間間隔を増加します。
    注: チューブのこの新しいセットは、2 番目の収穫を表します。ただし、通常、miracidial の数値は低いため通常すべてのチューブから幼虫にもバルト海沿岸 + 2 mL を含む単一のカルチャにプールされます。
  11. 24 h 後収穫と栽培、軽くピペッティングによる者で sporocysts を再懸濁します。
  12. 井戸の底に沈殿する寄生虫を許可するように、いくつかの分を待ちます。一度彼らが定住している幼虫の変形の間に miracidia によって流す毛表皮板のほとんどが含まれます上清 (~1.5 mL) を慎重に取り外します。この「変換」上澄みは破棄または、幼虫の分泌製品の追跡調査に組み込む可能性があります。
  13. 各井戸と優しく sporocysts を再懸濁しますピペットに新鮮なバルト海沿岸 + 1.5 mL を追加します。さらに洗浄または別の媒体への変更が必要な場合は、3.12 のステップを繰り返します。

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Representative Results

Miracidia の大半は収集最初の 2 つの「収穫」で通常されます。バルト海沿岸 + で孤立した miracidia の孵化は、ミラシジウム-sporocyst 変換プロセス (図 4 a-c) をトリガーします。最初の 1 時間内で文化に次の転送は、バルト海沿岸 +、miracidia 停止水泳 (図 4 a) の大半を含む井戸します。文化の 6 h で、miracidia は積極的に流して、繊毛上皮プレート (図 4 b) を進めています。この取除くプロセスと一致する、幼虫を形成、外側の合胞体 tegumental カバー主な sporocysts に変身をします。寄生虫のほとんどは、バルト海沿岸 + (図 4) では 24-48 時間後栽培によって完全に形成された sporocysts になって幼生の変換が完了しました。バルト海沿岸 + だけで文化の 4 日後 〜 80% に低下 sporocyst 生存が期待できます。しかし、sporocysts はバルト海沿岸 + で 1 日間培養、3 日間は通常よりよい生存率とより堅牢な外観 (図 4) と幼虫で結果の完全 Bge (cBge) 培地に転送されます。Sporocyst 生存率は一般にバルト海沿岸 + 単独と比較して文化のこの時期に幼虫の成長の継続的な増加と cBge で 4 と 7 日間安定したままです。

Figure 1
図 1.プロトコルのワークフローの概要。Miracidia の培養と分離に関与する主な手順の概要は、人間の住血吸虫、マンソン住血吸虫などの感染マウスから派生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 感染した肝臓の処理します。(A) マウス肝大きくマンソン住血吸虫など卵に感染します。大きく、異常な色 (右)、(左) 通常感染していない肝臓に比べて感染肝肉芽腫の存在を注意してください。(B) 洗浄は、滅菌のステンレス製ブレンダー カップに転送後肝臓をマウスします。肝臓は、(C) の流出を避けるため、カップをカバーする滅菌箔とペトリ皿を使用して 1 分のブレンドだった。ブレンド後、肝臓ホモジネート、卵を含む生理食塩水で数回洗浄されアルミ箔 (D) で覆われている 1 L メスフラスコに転送される前に滅菌池の水で再停止されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 収穫マンソン住血吸虫など miracidia.メスフラスコ (A) の上部に光に魅力によって集中される miracidia は活発に泳ぐ。10 分間隔で寄生虫はピペットで収穫され、幼虫を固定する 4 ° C に配置されます。Miracidia は遠心分離によってバルト海沿岸 + で洗浄し、培養プレートの井戸を配布の直前に単管 (B) で収集します。バルト海沿岸 +;チャーニンの平衡塩類溶液 (材料表) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 主 sporocysts とその維持に Miracidial 変換体外. 別の回の体外培養にマンソン住血吸虫などmiracidia と sporocysts 後に収穫します。バルト海沿岸 + (A) で文化の 1 時間以内の新米 miracidia です。文化の 6 時間後 miracidia は、プライマリ sporocysts (B) に変身を繊毛上皮プレート (矢印) を流すし始めています。バルト海沿岸 + 24 h 後、miracidia のほとんどが主要な sporocysts (C) へ完全変形します。Sporocysts が、24 時間でバルト海沿岸 + 変換し、転送、3 日 (D) cBge 中維持されます。Sporocysts は、一般的に表示より堅牢なより高い生存率に比べてバルト海沿岸 + 単独で cBge の存在下で 4 日後の栽培。バルト海沿岸 + チャーニンの平衡塩溶液;cBge 中、完全なB. glabrata胚細胞培地 (材料の表を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

マンソン住血吸虫など、分離、本明細書で説明されているように操作の Miracidia だけカタツムリ中間ホストに感染し、幼虫の開発のこの段階で人間バイオハザードは表現していません。ただし、 Biomphalariaカタツムリ種の影響を受けやすい可能性があります存在または維持領域から別の場所に miracidial の分離を実行する、カタツムリの偶発的な暴露/感染症を避けるためには、注意をすべき。独立したルーム、BSL2 スペースとして登録することを強くお勧めします。また、肝臓と幼虫の分離の処理で使用されるソリューションは、処分前に消毒剤 (例えば1% の漂白剤) で扱われるべきすべての洗浄。

肝臓からの外科的除去感染マウス、無菌条件下で生物学的安全キャビネット (BSC) のブレンド/均質化する前に、後続の処理を実行するに注意してください。ただし、実用的な理由 (一括サンプルを操作するための使いやすさ) 他のすべてのプロシージャは、滅菌容器 (例えば、ブレンダー カップ、フラスコ、ボトル、チューブ、転送 pipets 等) と滅菌ソリューションを利用した消毒ベンチトップで行われます抗生物質 (生理食塩水、池の水、バルト海沿岸) を含みます。抗生物質は、すべてのソリューションに導入された微生物汚染に対する予防策として追加されます。さらに、miracidial 分離と手順 (プロトコルのセクション 2 と 3) を収穫の間に小さいペトリ皿カバーは泡/肝臓の残骸とのそれに続く転送の初期の削除時に外部汚染を最小限に抑えるために開くフラスコ上に配置します。チューブを遠心分離機にフラスコから集中して miracidia。

通常、肝臓あたり約 5000 幼虫の幼虫の収穫を推定するから 1 つのバッチで 20 の感染マウスの肝臓から miracidia を収穫します。ただし、利回りは miracidial 回復のバッチごとに変化の生じる個々 のマウスの感染強度に応じてかなり異なります。分離は少ない開始肝臓を使用して行うことが、メソッドについては 10-20 肝臓に一般的に適用されます。20 肝臓が処理されると、次の滅菌池の水 (プロトコル セクション 2、ステップ 2.7) で肝臓のペレットの最終的な再懸濁懸濁液は 2 つの 1000 mL フラスコ (2 ボトル/フラスコ) に均等に分散する必要があります。10 肝臓または少ないを使用する場合元の肝ホモジネート (プロトコル セクション 2、ステップ 2.3) 2 本に分散することができ、懸濁液をさらに処理するための単一のメスフラスコに転送を洗浄します。1 つまたは 2 肝臓も処理することができます、しかし、量 (ボリューム) の抽出、洗浄およびソリューションを孵化すべき按分、最終的に集中する 10 mL ホイルで覆われた容積測定フラスコに転送されている池の水の堆積物を洗浄miracidia。

肝残骸汚染を最小限に抑えて miracidial 利回りを最大化するためにも、迅速かつ効率的に可能な限り池水洗浄 (プロトコル セクション 2、手順 2.7 2.9) を行うことが重要としてます。卵は、池の水にさらされている、一度、miracidial 孵化は孵化後 5 〜 20 分からフラスコの首の光源で幼虫の外観があります前に時間を開始が、その後すぐに発生します。池水洗浄中に寄生虫の損失を制限するには、手順は、各池の水を視覚的に確認することが重要です洗浄フラスコの首の上部水層の早期到着 miracidia。さらに、miracidia 15 mL 採血管に転送され、氷の上に配置、水泳活動をやめ、管底に沈殿が。しかし、遠心分離の幼虫 (セクション 3、ステップ 3.4 3.5) をペレットにした後 miracidia 再び泳ぐ暖かい水が許可された場合に開始されます。したがって、ペレットを妨害または寄生虫を水泳をピペッティングします、ことがなく、すぐに池の水を除去することが重要です。

前述したとおり、分離 miracidia の利回り成虫ペア個々 のマウス (感染強度) の現在の数と最初の感染プロトコルの一貫性によって異なります。Miracidia は強く phototropic、大部分 (80-90%) は最初の収穫期間にわたって光源に濃縮します。はゆっくりと 2 番目の収穫期間中に蓄積、miracidia の残りの 10-20% が孵化していきます。最も (> 95%) miracidia 文化に導入され、26 oC バルト海沿岸 + 中でプライマリ sporocysts 栽培の 24-48 時間以内に変換されます。この時、幼生の生存率は通常は > 90%。バルト海沿岸 + で 4 日後だけで生存率が著しく低下 (70-80%)。しかし、バルト海沿岸 + Bge 中 24 h 以下を完了するから培養液の切り替え初期のバルト海沿岸栽培は高い生存率とより堅牢な成長の結果します。我々 は日常的に培養条件下での短期の sporocyst 文化を維持します。ただし、sporocysts は非常に敏感な酸素のレベルに、特に有害な酸化損傷7を与えることができる活性酸素種。C. j. オンラインベイン4等の全面的な健康および sporocysts生体外での生存率が大幅向上する文化は低酸素の条件の下で維持されるときことを報告しています。個々 の閉めフラスコ (窒素) ガス抜き、インキュベーター4気体の窒素濃縮は、低酸素レベルを得られるかもしれない。

無菌隔離、住血吸虫の培養するため、上記に引用した方法としては、miracidia と sporocysts が以前記載されています。Miracidial 光屈性を誘致し、遊泳が集中される可能性があります、その孤立した miracidia は高浸透圧の食塩水 (120-160 mOs/Kg) 間の8に急速に動員できるが早期に認められました。さらに、食塩水でのメンテナンスが主な sporocysts、最初の intramolluscan の幼虫9,12に miracidia の変換の結果が観察されました。また、細胞と同様、マンソン住血吸虫などsporocyst ステージ9,13,14,15の長期生体外で成長と発展をサポートするため策定されている複雑なメディアカタツムリ ホストBiomphalaria glabrata16から派生します。これらの製剤は、様々 な商業メディアを組み込まれており、アミノ酸、塩、脂質、還元剤は、糖と補足されています可能性があります。完全なメディア製剤は、胎仔ウシの熱不活化または様々 な濃度で馬血清にも含まれています。我々 は、適切な熱不活化 (HI) は sporocyst 生存と体外で長期的な開発に重大だった発見しました。我々 は血清 (解凍、100 mL ボトル) の潜伏 60 oC の洗浄器は、60 分、穏やかな混合均一加熱のため 10 分毎に最も効果的だった。さらに、我々 は通常、幼虫の文化との互換性のため将来のサプライヤーからの血清のいくつかの多くをテストします。最後に、最初の (そして現在唯一) の本格的な貝セルの行、ハンセン16 B. glabrata胚 (Bge) セル行の設立は大幅幼虫住血吸虫の進歩を促進する画期的耕作の努力。プライマリ セカンダリ/娘 sporocysts17と最終的に最終 cercarial 段階18,19から開発された Bge 細胞と共培養をまとめてマンソン住血吸虫などmiracidia を分離しました。したがって、マンソン住血吸虫などライフ サイクルの全体のカタツムリの段階の連続培養栽培を実現しています。私たち文化システムで使用される Bge 細胞培地では、sporocyst 成長/発達と Bge 細胞ラインのメンテナンスをサポートしています。

要約すると、我々 は説明し、質量無菌免とマンソン住血吸虫などの自由遊泳 miracidial 段階の栽培に詳しいプロトコルを視覚的に示します。適切な培養条件に服従するとき、これらの miracidia は、プライマリとセカンダリの連続 sporocyst 世代、最終的にセルカリアに開発が可能です。現在遺伝子と遺伝子表現の in vitro遺伝子、RNA 干渉とゲノムを操作するために使用できるツールの継続的な改良、開発と編集 (例えば、CRISPR/Cas9) アプローチ、効率的と想定されますこの分野の研究の更なる向上のための材料を調達するために必要とされる多様な吸虫種20から miracidia の分離と培養法がいきます。このメソッドうまく分離及び培養の体外哺乳類 schistosomula ステージ21への変換を容易にするマンソン住血吸虫などの自由遊泳のセルカリア上記プロトコルを補完する最終的な抱卵大人に栽培はワーム22をです。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

NIH グラント RO1AI015503 によって部分的に資金を供給しました。住血吸虫感染マウスは備リソースを介して配布する NIH NIAID 契約 HHSN272201000005I を通じて NIAID 住血吸虫症リソース センター生物医学研究所 (メリーランド州ロックビル) によって提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

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References

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