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जन अलगाव और इन विट्रो में खेती के Intramolluscan चरणों की मानव रक्त अस्थाई Schistosoma Mansoni

Developmental Biology

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Summary

इस अनुच्छेद के बड़े पैमाने पर axenic अलगाव और मानव रक्त अस्थाई Schistosoma mansoni और उनके परिचय के लिए इन विट्रो संस्कृति में बाद में प्रसंस्करण के मुक्त तैराकी miracidia के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

मानव रक्त flukes, Schistosoma एसपीपी., एक जटिल जीवन चक्र है कि एक घोंघा मध्यवर्ती और स्तनधारी अंतिम मेजबान, क्रमशः के भीतर अलैंगिक और यौन विकास के चरणों शामिल है । को अलग करने और बनाए रखने के इन विट्रो संस्कृति शर्तों के तहत विभिंन जीवन चक्र चरणों के लिए क्षमता बहुत सेलुलर, जैव रासायनिक और आणविक तंत्र की जांच की सुविधा है परजीवी विकास, विकास और मेजबान विनियमन बातचीत. schistosomiasis के संचरण अलैंगिक प्रजनन और घोंघा मेजबान के भीतर कई लार्वा चरणों के विकास की आवश्यकता है; संक्रमित miracidium से, प्राथमिक और माध्यमिक sporocysts के माध्यम से, अंतिम cercarial चरण है कि मनुष्यों को संक्रमित है । इस पत्र में हम बड़े पैमाने पर सेने और संक्रमित चूहों के जिगर से प्राप्त अंडे से Schistosoma mansoni miracidia के अलगाव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और इन विट्रो संस्कृति में उनके बाद में परिचय । यह प्रत्याशित है कि विस्तृत प्रोटोकॉल नए शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने में संलग्न है और schistosome अनुसंधान के इस महत्वपूर्ण क्षेत्र को व्यापक होगा ।

Introduction

मानव रक्त flukes Schistosoma एसपीपी., schistosomiasis की प्रेरणा का एजेंट हैं, एक उपेक्षित उष्णकटिबंधीय एक अनुमानित २३०,०००,००० लोगों को दुनिया भर में पीड़ित एक बीमारी1। सबसे व्यापक प्रजातियों, Schistosoma mansoni, भौगोलिक दृष्टि से दक्षिण अमेरिका में वितरित किया जाता है, कैरेबियन द्वीपसमूह, मध्य पूर्व और उप सहारा अफ्रीका2एस mansoni, और अंय schistosomes के जीवन चक्र, जटिल है, एक स्तनधारी निश्चित मेजबान और जीनस Biomphalaria के मीठे पानी घोंघे शामिल है कि बाध्य मध्यवर्ती मेजबान के रूप में काम करते हैं ।

mansoni पुरुष और मादा वयस्क कृमि जोड़े स्तनधारी मेजबान के पीछे mesenteric नसों में रहने वाले जोड़, embryonated अंडे की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप (ओवा) कि आंतों की श्लेष्मा झिल्ली के छोटे venules में दर्ज हो जाते हैं । अंडे तो पोत दीवारों के माध्यम से टूटता है, श्लैष्मिक ऊतक के माध्यम से विस्थापित, और अंततः आंतों लुमेन जहां वे मल के साथ voided है दर्ज करें । जब ओवा मीठे पानी में प्रवेश और मुक्त तैराकी लार्वा (miracidia) हैच, वे छोटे क्रम में, अपने जीवन चक्र जारी रखने के क्रम में संक्रमित करने के लिए एक उपयुक्त Biomphalaria घोंघा खोजने चाहिए । इस संक्रमण प्रक्रिया सक्रिय प्रवेश और मेजबान में लार्वा की प्रविष्टि के बाद घोंघा के बाहरी शरीर की सतह के लिए miracidial लगाव शामिल है । प्रवेश के तुरंत बाद, miracidium अपनी बाहरी oleraceum एपिडर्मल प्लेटें शेड शुरू होता है के रूप में यह एक syncytium कि नई बाहरी सतह अगले नलिकाकार चरण के (लार्वा), प्राथमिक या मां sporocyst बन जाएगा रूपों । अलैंगिक प्रजनन के माध्यम से, प्रत्येक प्राथमिक sporocyst उत्पादन और sporocysts की दूसरी पीढ़ी विज्ञप्ति, माध्यमिक या बेटी sporocysts, जो बारी में, उत्पंन और अंतिम intramolluscan चरण के बड़ी संख्या में जारी, cercaria3 . घोंघा मेजबान से बचने पर, मुक्त तैराकी cercariae को संलग्न करने में सक्षम है और सीधे एक मानव या अंय उपयुक्त स्तनधारी मेजबान की त्वचा मर्मज्ञ । अपने नए मेजबान में प्रवेश पर, cercariae परजीवी schistosomula मंच को बदलने और संवहनी प्रणाली पर आक्रमण । वे, बारी में, फेफड़ों की ओर पलायन और फिर यकृत नस जहां वे वयस्क कीड़े, फार्म पुरुष और महिला जोड़े को परिपक्व और mesenteric नसों यात्रा करने के लिए अपने जीवन चक्र को पूरा करने के लिए ।

सफल intramolluscan या "घोंघा चरण" लार्वा schistosomes के विकास के लिए मानव की मेजबानी के चक्र के निरंतरता के लिए आवश्यक है के लिए मेजबान संचरण । महत्वपूर्ण महत्व के नि: शुल्क के प्रवेश की अवधि है घोंघा मेजबान में miracidium तैराकी और प्राथमिक sporocyst चरण के लिए अपनी प्रारंभिक परिवर्तन । शारीरिक और प्रतिरक्षा मेजबान और परजीवी के बीच अनुकूलता पर निर्भर करता है, यह लार्वा विकास के इस चरण के दौरान है कि प्रारंभिक सफलता या संक्रमण स्थापित करने के लिए विफलता निर्धारित है4,5,6 . प्राथमिक sporocysts माध्यमिक sporocysts, जो तब मानव-संक्रामक cercariae उत्पन्न उत्पादन में सक्षम asexually के बाद के विकास, आगे एक स्वतंत्र शारीरिक मेजबान पर्यावरण कि परजीवी के विकास के सभी के लिए प्रदान करता है की आवश्यकता होती है और प्रजनन की जरूरत है ।

तारीख करने के लिए, थोड़ा अंतर्निहित शारीरिक, जैव रासायनिक और आणविक प्रक्रियाओं schistosome-घोंघा बातचीत को नियंत्रित करने, विशेष रूप से अणुओं और लार्वा विकास और प्रजनन, या नियमन में शामिल रास्ते के बारे में जाना जाता है मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं । इन विट्रो संस्कृति की स्थिति है कि प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति बहुत विकास के रास्ते और कोशिका विकास के अंतर्निहित तंत्र की खोज की सुविधा होगी के तहत इन लार्वा चरणों की बड़ी संख्या के लिए तैयार उपयोग, भेदभाव और प्रजनन । महत्वपूर्ण परजीवी रास्ते या तंत्र, इन विट्रो प्रयोग के माध्यम से की पहचान की, तो लार्वा विकास को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/घोंघा मेजबान में प्रजनन, या घोंघा मेजबान प्रतिरक्षा मांयता और उंमूलन में शामिल तंत्र की पहचान miracidial या sporocyst अवस्था.

इस लेख और वीडियो प्रस्तुति में, हम में परिचय के लिए नि: शुल्क तैराकी एस mansoni miracidia की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए एक विधि का विस्तृत विवरण प्रदान इन विट्रो संस्कृति है कि तब अनुवर्ती प्रयोगात्मक अप करने के लिए अधीन हो सकता है हेरफेर (देखें चित्रा 1 प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह के एक योजनाबद्ध अवलोकन के लिए) । हालांकि इसी तरह की प्रक्रियाओं पहले7वर्णित किया गया है,8,9, हमें लगा कि एक विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो इस मॉडल को काम करने के लिए अभी भी अनुत्तरित सवालों का पता करने के लिए इच्छा के लिए उपयोगी होगा intramolluscan लार्वा विकास, सेलुलर प्रसार, और schistosome-घोंघा प्रतिरक्षा बातचीत । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण आसानी से ऐसे मूत्राशय के रूप में अंय चिकित्सकीय महत्वपूर्ण trematodes से अंडे के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एस haematobium, जिगर flukes या फेफड़ों flukes ।

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Protocol

सभी जानवरों की देखभाल और प्रायोगिक प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और विश्वविद्यालय के विस्कॉंसिन-मैडिसन के प्रोटोकॉल के तहत उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । V005717 । निंनलिखित प्रोटोकॉल मानव रोगजनकों के लिए एक सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) सुविधा में काम कर शामिल है, हालांकि इस प्रोटोकॉल में चित्रित schistosome चरणों में से कोई भी मानव या अंय स्तनधारियों को संक्रमित कर रहे हैं । जोखिम समूह 2 (RG2) मानव रोगजनकों हैंडलिंग के लिए संस्थागत नीतियों का पालन करें ।

नोट: हम महिला स्विस Webster चूहों का उपयोग करें (6 सप्ताह पुराने) उनके उच्च संवेदनशीलता के कारण10संक्रमण के लिए, जिससे बड़ा अंडा बोझ उपज । टकर एट अल. माउस और घोंघा संक्रमण इस मॉडल प्रणाली11में इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन । सामग्री की तालिका विशिष्ट उपकरण, सामग्री, रिएजेंट और पशु इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के लिए आवश्यक स्रोतों के सभी सूचीबद्ध करता है ।

1. संक्रमित जिगर की प्रोसेसिंग

  1. Euthanize चूहों, 6-7 सप्ताह के बाद संक्रमण, सह द्वारा2 asphyxiation (प्रति मिनट चैंबर की मात्रा की 10-30% की दर) । श्वसन और दिल की धड़कन की समाप्ति के लिए चूहों पर नजर.
    नोट: आमतौर पर, अप करने के लिए 20 चूहों एक निश्चित समय पर संसाधित किया जा सकता है.
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए euthanized चूहों को स्थानांतरित करने के बाद, उनके पीठ पर जगह चूहों और उनके ventral स्प्रे ७०% इथेनॉल के साथ सतहों । 1 मिनट के लिए भिगो दें ।
  3. चुटकी और निचले पेट की त्वचा को खींच और बाँझ शल्य कैंची के साथ पेट के निकटतम चुटकी भर त्वचा के आधार पर कटौती. कट त्वचा को पूर्वकाल में खींचो (यानी, सिर की ओर) जिगर प्रकट करने के लिए । ध्यान दें कि लीवर में इजाफा होना चाहिए और अंडे से प्रेरित granulomatous प्रतिक्रिया (चित्र 2a) के कारण धब्बेदार ।
  4. जिगर निकालें और यह बाँझ की २०० मिलीलीटर युक्त एक चोंच में जगह १.२% NaCl पेन युक्त समाधान strep/
  5. बचे हुए चूहों के साथ १.३ और १.४ चरणों को दोहराएँ ।
    नोट: बीस चूहों आमतौर पर एक ही फसल में संसाधित कर रहे हैं.
  6. एक बाँझ पेट्री पकवान में जिगर प्लेस और गैर जिगर वसा को हटाने/बाँझ संदंश के साथ संयोजी ऊतक.
  7. एक बाँझ करने के लिए छंटनी/साफ जिगर के हस्तांतरण २५०-एमएल केंद्रापसारक युक्त बोतल ~ २०० मल of बाँझी १.२% NaCl समाधान कलम के साथ strep/
  8. तेजी से जिगर युक्त बोतल हिला और, एक बाँझ डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग कर, अतिरिक्त सतह फोम हटाने/ धीरे से एक कंटेनर या 1% ब्लीच (संक्रमित) युक्त सिंक में शेष खारा समाधान डालना ।
  9. जोड़ ~ २०० ताजा खारा समाधान के जिगर के लिए मिलीलीटर और दोहराने चरण १.८ तीन बार ।

2. जिगर निष्कर्षण और miracidial अलगाव

  1. एक छोटे से बाँझ स्टेनलेस स्टील ब्लेंडर कप में जिगर प्लेस और १.२% NaCl समाधान की ~ 2 मिलीलीटर (चित्रा 2 बी) जोड़ें.
  2. आवरण और एक पेट्री डिश के साथ कप को कवर फैल रोकने के लिए, और कम और उच्च गति (20 एस कम स्पीड/10 एस उच्च गति बारी द्वारा 1 मिनट के लिए मिश्रण; दोहराएं) (चित्र 2c) ।
  3. समान रूप से बाँझ में मिश्रित जिगर निलंबन वितरित २५०-एमएल केंद्रापसारक बोतलों (के लिए 20 जिगर 4 बोतलों का उपयोग करें) ।
  4. के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बाँझ खारा जोड़ें ~ २०० मिलीलीटर कुल मात्रा/ /शेष बोतलें वजन से पहले केंद्रापसारक ।
  5. 4 पर 15 मिनट के लिए २९० x g में मिश्रित जिगर केंद्रापसारक हेधीरे से दूर करने से पहले ब्लीच के साथ एक कंटेनर में बंद supernatants डालना ।
  6. दोहराएं चरण 2.4-2.5 एक बार । अच्छी तरह से करने के लिए पहले से जिगर तलछट reसस्पेंड सुनिश्चित करें केंद्रापसारक ।
  7. पिछले खारा धोने (चरण २.६) को खारिज करने के बाद, strep के साथ २०० मिलीलीटर बाँझ तालाब पानी जोड़ें/गोली मारकर जिगर ऊतक के लिए, तलछट reसस्पेंड करने के लिए शेक, और निलंबन एक निष्फल 1-L volumetric कुप्पी कि पूरी तरह से एल्यूमीनियम के साथ कवर किया गया है करने के लिए स्थानांतरण गर्दन (चित्रा 2d) के शीर्ष 3 सेमी के अलावा पंनी, ।
    नोट: 1-L कुप्पी प्रति दो बोतलों (= 10 यकृत) का उपयोग करें । तालाब का पानी प्राकृतिक मीठे पानी के अंडे से सेने miracidial को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक वातावरण simulates ।
  8. बाँझ तालाब के पानी का उपयोग करना, ऊपर की कुप्पी को भरने के लगभग 3 सेमी पन्नी गर्दन पर कवर के ऊपर. फिर, देरी के बिना (के रूप में miracidia जल्द ही हैच करने के लिए शुरू), अवशिष्ट फोम और जिगर की सतह को तैरते ऊतकों को हटाने जल्दी से pipetting ऊपर ~ तालाब पानी की 12 मिलीलीटर मलबे से युक्त है और यह एक अलग छोड़ ट्यूब में खारिज । ताजे बाँझ तालाब के पानी से बदलें ।
  9. दोहराएं चरण २.८, तीन बार सफाई, त्यागना ट्यूब में miracidia की उपस्थिति के लिए जांच । सफाई कदम की पुनरावृत्ति संघर्ष अगर miracidia धोने के समाधान में दिखाई देते हैं ।
  10. के बाद पिछले धोने, धीरे से जोड़ने ~ गर्म बाँझ तालाब पानी की 12 मिलीलीटर (पूर्व 30 oC करने के लिए गर्म) शीर्ष पर स्वच्छ, बाँझ गर्म पानी के साथ एक तापमान ढाल बनाने के लिए ।
    नोट: यह सबसे अच्छा धीरे से कुप्पी गर्दन के किनारे के साथ पानी के निर्वहन से बचने के लिए मिश्रण से पूरा किया है ।
  11. कुप्पी खोलने पर एक छोटी सी पेट्री डिश कवर रखें और पानी की ऊपरी सतह को रोशन करने के लिए पन्ना कवर के ऊपर कुप्पी के ऊपर एक चमकदार प्रकाश को चमकता है ।
    नोट: आमतौर पर, 5-10 मिनट के भीतर, तैराकी miracidia, प्रकाश की ओर आकर्षित किया, बड़ी संख्या में तालाब के पानी की पहली 2-3 सेमी के भीतर ध्यान देना होगा (चित्रा 3) ।

3. Miracidial संचयन और खेती

  1. जब miracidia 10 मिनट के बाद सतह पर जमा कर दिया है, एक बाँझ हस्तांतरण प्लास्टिक का उपयोग कर, निकाल ~ 8 तालाब पानी और एक बाँझ 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण के मिलीलीटर । बर्फ पर miracidia युक्त ट्यूब प्लेस ।
  2. वापस volumetric कुप्पी के अंदर के साथ गर्म बाँझ तालाब पानी की 8 मिलीलीटर जोड़ें और एक और 10 मिनट प्रतीक्षा करें ।
  3. नए ट्यूबों हर बार का उपयोग कर, चरण ३.१ और ३.२ तीन बार दोहराएं । 4वें संग्रह के बाद, 10 मिनट के लिए बर्फ पर अंतिम ट्यूब रखने के लिए miracidia व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं । ट्यूबों के इस सेट पहली फसल शामिल हैं ।
  4. केंद्रापसारक 1 मिनट के लिए २९० x g पर miracidia युक्त ट्यूबों 4 सी में एक पूर्व ठंडा प्रशीतित केंद्रापसारक में ।
  5. तुरंत supernatant (~ 7 एमएल) के अधिकांश को दूर करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है परजीवी गोली (चित्र 3 बी) परेशान ।
  6. एक ट्यूब में इस पहली फसल से सभी miracidia पूल, तो ~ 1 मिलीलीटर बाँझ तालाब पानी के साथ मूल ट्यूबों के सभी कुल्ला और "परित" ट्यूब करने के लिए जोड़ें ।
  7. परजीवी के लिए बर्फ पर बसने के लिए अनुमति दें ~ 5 मिनट, और फिर 4 सी में 1 मिनट के लिए २९० x g पर परजीवी केंद्रापसारक ।
  8. ध्यान से निकालें supernatant और जोड़ें 6-8 मिलीलीटर बाँझ चेर्निन के संतुलित नमक समाधान (CBSS +; सामग्री की तालिका देखें) पेन युक्त strep/
  9. धीरे miracidia निलंबित और उंहें एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में aliquot (प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर), 6-8 मिलीलीटर CBSS में ट्यूब धोने के बाद + और एक अच्छी तरह से कुल्ला के 1 मिलीलीटर जोड़ने । normoxic शर्तों के तहत 26 सी में परजीवी की मशीन । पृथक miracidia की सांद्रता भिंन होगी, लेकिन आमतौर पर औसत ~ 7000/एमएल ।
  10. यदि परजीवी अभी भी प्रकाश स्रोत पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, दोहराएं कदम ३.१ ३.९ के लिए देर से सेने miracidia कटाई जारी रखने के लिए, लेकिन संग्रह के बीच समय अंतराल में वृद्धि 15-20 मिनट ।
    नोट: ट्यूबों का यह नया सेट दूसरी फसल का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि, क्योंकि miracidial संख्या आम तौर पर कम कर रहे हैं, सभी ट्यूबों से लार्वा आमतौर पर एक ही संस्कृति में जमा कर रहे है अच्छी तरह से युक्त 2 मिलीलीटर CBSS + ।
  11. पर 24 ज के बाद फसल और खेती, धीरे pipetting द्वारा अपने कुओं में sporocysts reसस्पेंड ।
  12. कुछ मिनट रुको परजीवी कुओं के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं । एक बार वे बसे हैं, ध्यान से supernatant (~ १.५ मिलीलीटर), जो oleraceum एपिडर्मल miracidia द्वारा लार्वा परिवर्तन के दौरान शेड प्लेटों के अधिकांश शामिल होगा हटा दें । इस "परिवर्तन" supernatant या तो छोड़ दिया जा सकता है या लार्वा स्रावी उत्पादों के अनुवर्ती अध्ययन में शामिल किया ।
  13. जोड़ें ताजा CBSS के १.५ मिलीलीटर + प्रत्येक अच्छी तरह से और धीरे पिपेट sporocysts reसस्पेंड करने के लिए । दोहराएँ चरण ३.१२ यदि आगे धोने या किसी भिन्न माध्यम से परिवर्तित करना वांछित है ।

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Representative Results

miracidia के विशाल बहुमत आम तौर पर पहले दो "फसल" में एकत्र किया गया होगा । CBSS में अलग miracidia की मशीन + miracidium-to-sporocyst परिवर्तन प्रक्रिया (चित्र 4a-C) ट्रिगर । CBSS युक्त संस्कृति कुओं के लिए स्थानांतरण के बाद पहले घंटे के भीतर +, miracidia के बहुमत संघर्ष तैराकी (चित्रा 4a). संस्कृति में 6 ज पर, miracidia सक्रिय रूप से अपने oleraceum एपिडर्मल प्लेट्स (चित्रा 4B) बहा की प्रक्रिया में हैं । इस बहा प्रक्रिया के साथ संयोग, लार्वा उनके बाहरी syncytial tegumental को कवर के रूप में वे प्राथमिक sporocysts को बदलने के रूप में । परजीवी के अधिकांश लार्वा परिवर्तन पूरा हो जाएगा, पूरी तरह से बनते sporocysts, CBSS + (चित्र 4c) में 24-48 ज बाद की खेती के द्वारा बनाई गई । CBSS + अकेले में संस्कृति के 4 दिनों के बाद, sporocyst अस्तित्व ~ ८०% करने के लिए कमी की उंमीद की जा सकती है । हालांकि, sporocysts CBSS में 1 दिन के लिए प्रसंस्कृत + और फिर 3 दिनों के लिए पूरी तरह से Bge (cBge) माध्यम का तबादला आम तौर पर बेहतर अस्तित्व दर और एक अधिक मजबूत उपस्थिति के साथ लार्वा में परिणाम (चित्रा 4d) । Sporocyst व्यवहार्यता आम तौर पर CBSS की तुलना में इस समय के दौरान लार्वा वृद्धि में निरंतर वृद्धि के साथ cBge में 4 और 7 दिनों के बीच स्थिर रहता है + अकेले ।

Figure 1
चित्र 1 . प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का ओवरव्यू । बड़े अलगाव और मानव रक्त अस्थाई, एस mansoniसे संक्रमित चूहों से व्युत्पंन miracidia की खेती में शामिल कदम का योजनाबद्ध सारांश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : संक्रमित जिगर की प्रोसेसिंग । () माउस जिगर भारी एस mansoni अंडे से संक्रमित । बढ़े हुए आकार, असामान्य रंग और संक्रमित यकृत में granulomas की उपस्थिति (दाएँ) की तुलना में एक सामान्य संक्रमित यकृत (बाएँ) पर ध्यान दें. () बाँझ स्टेनलेस स्टील ब्लेंडर कप के लिए स्थानांतरण के बाद माउस जिगर धोया । जिगर तो एक मिनट बाँझ पंनी और पेट्री पकवान का उपयोग कर कप को कवर के लिए मिश्रित थे, इस प्रकार फैल से बचने () । मिश्रण के बाद, जिगर homogenate, अंडे युक्त, खारा में कई बार धोया गया था और बाँझ तालाब पानी में reसस्पैंड, पहले एक 1-L volumetric एल्यूमीनियम पंनी (डी) के साथ कवर कुप्पी को हस्तांतरित किया जा रहा है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : कटाई एस. mansoni miracidia. सक्रिय रूप से volumetric कुप्पी () के शीर्ष पर प्रकाश करने के लिए आकर्षण द्वारा केंद्रित miracidia तैराकी । 10-ंयूनतम अंतराल पर, परजीवी पिपेट द्वारा काटा जाता है और लार्वा को स्थिर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है । Miracidia तो CBSS में धोया जाता है + द्वारा केंद्रापसारक और एक एकल ट्यूब में एकत्र () सिर्फ एक संस्कृति की थाली के कुओं को वितरण से पहले । CBSS +; चेर्निन के संतुलित नमक समाधान (सामग्री की तालिका) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्राथमिक sporocysts और उनके रखरखाव के लिए Miracidial परिवर्तन इन विट्रो . एस mansoni miracidia और sporocysts में रखा इन विट्रो संस्कृति के लिए अलग समय के बाद कटाई । CBSS + (A) में संस्कृति के 1 ज के भीतर नव कटाई miracidia । संस्कृति के 6 ज के बाद, miracidia अपने oleraceum एपिडर्मल प्लेटें (तीर) बहाने के रूप में वे प्राथमिक sporocysts () में बदलना शुरू कर दिया है । CBSS में 24 ज के बाद + अधिकांश miracidia ने प्राथमिक sporocysts (C) में पूरी तरह से बदल दिया है । Sporocysts CBSS में बदल + 24 एच के लिए थे, तो हस्तांतरित और cBge माध्यम में बनाए रखा 3 दिनों के लिए (D) । Sporocysts आम तौर पर और अधिक मजबूत दिखाई देते है और 4 दिनों के बाद cBge की उपस्थिति में खेती, CBSS + अकेले की तुलना में अधिक जीवित रहने की दर है । CBSS +, चेर्निन के संतुलित नमक समाधान; cBge मध्यम, पूर्ण B. glabrata भ्रूण कोशिका मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Miracidia एस mansoni, अलग और हेरफेर के रूप में यहां वर्णित है, केवल घोंघा मध्यवर्ती मेजबान को संक्रमित कर सकते हैं, और इसलिए लार्वा विकास के इस चरण के दौरान एक मानव के लिए खतरा नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, आकस्मिक जोखिम से बचने के लिए/घोंघे के संक्रमण, देखभाल क्षेत्रों जहां अतिसंवेदनशील Biomphalaria घोंघा प्रजातियों उपस्थित या बनाए रखा जा सकता है से एक अलग स्थान में miracidial अलगाव प्रदर्शन करने के लिए लिया जाना चाहिए । एक अलग कमरा, BSL2 अंतरिक्ष के रूप में पंजीकृत, अत्यधिक की सिफारिश की है । इसके अलावा, सभी धोने समाधान जिगर और लार्वा अलगाव के प्रसंस्करण में इस्तेमाल किया संक्रमित के साथ इलाज किया जाना चाहिए (उदा, 1% ब्लीच) निपटान से पहले ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संक्रमित चूहों से जिगर की शल्य चिकित्सा हटाने और उनके बाद प्रसंस्करण मिश्रण करने से पहले homogenization/रोकनेवाला शर्तों के तहत एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि, व्यावहारिक कारणों के लिए (थोक नमूनों जोड़ तोड़ में आसानी) अन्य सभी प्रक्रियाओं एक संक्रमित benchtop का उपयोग बाँझ कंटेनरों पर किया जाता है (उदा., ब्लेंडर कप, बोतल, बोतलें और ट्यूब, स्थानांतरण pipets, आदि) और बाँझ समाधान एंटीबायोटिक युक्त (खारा, तालाब का पानी, CBSS) । एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एक और एहतियात के रूप में पेश माइक्रोबियल संदूषण के खिलाफ सभी समाधान में जोड़ रहे हैं । इसके अलावा, miracidial अलगाव और संचयन कदम के दौरान (प्रोटोकॉल वर्गों 2 और 3), एक छोटे से पेट्री पकवान कवर कुप्पी खोलने पर रखा गया है फोम के प्रारंभिक हटाने के दौरान बाहर संदूषण को कम करने के लिए/जिगर मलबे और बाद के हस्तांतरण कुप्पी से केंद्रित miracidia ट्यूबों के लिए केंद्रापसारक ।

आमतौर पर, हम एक ही बैच में 20 संक्रमित माउस जिगर से miracidia फसल, जहां से हम जिगर के बारे में ५००० लार्वा के लार्वा पैदावार का अनुमान है । हालांकि, पैदावार काफी भिंन हो सकते है व्यक्तिगत चूहों के संक्रमण तीव्रता के आधार पर बैच में जिसके परिणामस्वरूप miracidial वसूली में परिवर्तन बैच । अलगाव कम शुरू जिगर का उपयोग कर बाहर किया जा सकता है, हालांकि विधि हम वर्णित है आम तौर पर 10-20 जिगर के लिए लागू है । जब 20 जिगर संसाधित कर रहे हैं, बाँझ तालाब पानी (प्रोटोकॉल खंड 2, चरण २.७) में जिगर छर्रों के अंतिम निलंबन के बाद, निलंबन २ १०००-एमएल कुप्पी (2 बोतलें/कुप्पी) में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए । यदि 10 यकृत या कम इस्तेमाल किया जाता है, मूल जिगर homogenates (प्रोटोकॉल खंड 2, २.३ कदम) 2 बोतलें और धोया निलंबन के लिए वितरित किया जा सकता है तो आगे की प्रक्रिया के लिए एक एकल volumetric कुप्पी को हस्तांतरित । एक या 2 जिगर भी संसाधित किया जा सकता है, लेकिन मात्रा (निष्कर्षण के संस्करणों), धोने और सेने समाधान आनुपातिक कम किया जाना चाहिए, तालाब पानी में अंतिम धोया तलछट के साथ एक 10 मिलीलीटर पंनी को हस्तांतरित किया जा रहा है कवर volumetric कुप्पी ध्यान केंद्रित करने के लिए miracidia ।

आदेश में जिगर का मलबा संक्रमण की एक ंयूनतम के साथ miracidial पैदावार को अधिकतम करने के लिए, यह भी करने के लिए तालाब पानी बहाकर (प्रोटोकॉल अनुभाग 2, कदम 2.7-2.9) के रूप में जल्दी और कुशलता से संभव के रूप में प्रदर्शन महत्वपूर्ण है । एक बार अंडे तालाब के पानी के लिए उजागर कर रहे हैं, miracidial सेने जल्दी ही उसके बाद होता है, हालांकि कुप्पी गर्दन में प्रकाश स्रोत पर लार्वा उपस्थिति से पहले समय 5-20 मिनट से शुरू सेने के बाद भिंन हो सकते हैं । तालाब के पानी की सफाई के दौरान परजीवी के नुकसान को सीमित कदम यह नेत्रहीन है कुप्पी गर्दन के ऊपरी पानी की परत में miracidia जल्दी पहुंचने के लिए प्रत्येक तालाब पानी धोने की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, एक बार miracidia 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों को हस्तांतरित कर रहे है और बर्फ पर रखा जाता है, वे तैराकी गतिविधि और ट्यूब नीचे बसने के लिए संघर्ष करेंगे । हालांकि, गोली लार्वा (धारा 3, कदम 3.4-3.5) के लिए के बाद, miracidia फिर से तैरना शुरू कर देंगे अगर पानी गर्म करने की अनुमति दी है । इसलिए, यह जल्दी से तालाब पानी निकालने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन गोली या pipetting अप तैराकी परजीवी परेशान किए बिना ।

के रूप में पहले उल्लेख किया है, पृथक miracidia की पैदावार व्यक्तिगत चूहों में मौजूद वयस्क कृमि जोड़े की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (संक्रमण तीव्रता) और प्रारंभिक संक्रमण प्रोटोकॉल की निरंतरता. Miracidia दृढ़ता से phototropic है और बहुमत (80-90%) पहली फसल की अवधि में प्रकाश स्रोत पर ध्यान केंद्रित करेंगे । शेष 10-20% miracidia के लिए हैच और अधिक धीरे से दूसरी फसल अवधि के दौरान जमा जारी रहेगा । सबसे (> 95%) miracidia संस्कृति में पेश किया और CBSS में 26 सी में बनाए रखा + मध्यम खेती के 24-48 ज के भीतर प्राथमिक sporocysts में तब्दील हो जाएगा । इस समय, लार्वा व्यवहार्यता आमतौर पर है > 90% । CBSS में 4 दिनों के बाद + अकेले व्यवहार्यता काफी बूंदें (70-80%) । हालांकि, CBSS से संस्कृति माध्यम स्विचन + Bge मध्यम 24 एच पूरा करने के लिए उच्च जीवित रहने की दर और अधिक मजबूत विकास में प्रारंभिक CBSS खेती के परिणाम के बाद । हम नियमित रूप से normoxic शर्तों के तहत अल्पकालिक sporocyst संस्कृतियों को बनाए रखने । हालांकि, sporocysts ऑक्सीजन के स्तर के लिए काफी संवेदनशील हैं, और विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों कि बचके oxidative नुकसान7दण्ड कर सकते हैं । ंयायाधीश बायने4 और अंय लोगों ने बताया है कि समग्र स्वास्थ्य और इन विट्रो में sporocysts की व्यवहार्यता काफी सुधार कर रहे है जब संस्कृतियों hypoxic स्थितियों के तहत बनाए रखा है । ऑक्सीजन का स्तर कम बक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (नाइट्रोजन के साथ) व्यक्ति के करीब बोतल, या नाइट्रोजन द्वारा, मशीनी4के गैस चरण के संवर्धन ।

के रूप में ऊपर उद्धृत, axenic अलग और schistosome miracidia और sporocysts के संवर्धन के लिए तरीके पहले वर्णित किया गया है । यह जल्दी है कि miracidial phototropism को आकर्षित करने और तैराकी लार्वा ध्यान केंद्रित किया जा सकता है और कि पृथक miracidia तेजी से hyperosmotic खारा समाधान (120-160 राज्यमंत्री/8के बीच में मैटीरियल हो सकता है पर मांयता प्राप्त था । यह आगे खारा समाधान में रखरखाव प्राथमिक sporocysts, पहली intramolluscan लार्वा चरण9,12के लिए miracidia के परिवर्तन के परिणामस्वरूप देखा गया था । जटिल मीडिया भी अब का समर्थन करने के लिए तैयार किया गया है अवधि इन विट्रो वृद्धि और विकास एस mansoni sporocyst चरणों9,13,14,15, साथ ही कोशिकाओं घोंघा मेजबान Biomphalaria glabrata16से व्युत्पंन । इन योगों विभिंन वाणिज्यिक मीडिया शामिल है, और अमीनो एसिड, लवण, लिपिड, एजेंटों को कम करने, और शर्करा के साथ पूरक किया गया है हो सकता है । पूरा मीडिया योगों भी विभिन्न सांद्रता पर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय या घोड़ा सीरम शामिल थे । हमने पाया है कि उचित गर्मी-निष्क्रियता (हाय) sporocyst अस्तित्व और लंबी अवधि के विकास के लिए महत्वपूर्ण था इन विट्रो। हम ६० मिनट के लिए एक ६० सी waterbath में सीरम (गल, १००-मिलीलीटर की बोतलें) की है कि मशीन, कोमल मिश्रण के साथ हर 10 मिनट के लिए समान हीटिंग के लिए सबसे प्रभावी था पाया । इसके अलावा, हम आमतौर पर लार्वा संस्कृति संगतता के लिए एक संभावित आपूर्तिकर्ता से सीरम के कई बहुत सारे परीक्षण । अंत में, पहले की स्थापना (और वर्तमान में केवल) प्रामाणिक molluscan सेल लाइन, बी glabrata भ्रूण (Bge) सेल लाइन Hansen द्वारा16 एक प्रमुख सफलता है कि काफी लार्वा में प्रगति की सुविधा थी schistosome खेती के प्रयास । पृथक एस mansoni miracidia, जब Bge माध्यमिक/बेटी sporocysts17के लिए प्राथमिक से विकसित कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति में रखा, और अंत में अंतिम cercarial चरण18,19के लिए । इस प्रकार, एस mansoni जीवन चक्र के पूरे घोंघा चरण के इन विट्रो खेती में निरंतर प्राप्त किया गया है । हमारी संस्कृति प्रणाली में प्रयुक्त Bge कोशिका माध्यम Bge सेल लाइन के sporocyst विकास/विकास और रखरखाव दोनों का समर्थन करता है ।

संक्षेप में, हम वर्णन किया है और नेत्रहीन जन axenic अलगाव और mansoniके मुक्त तैराकी miracidial चरण की खेती के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सचित्र । इन miracidia, जब उचित संस्कृति की स्थिति के अधीन, लगातार प्राथमिक और माध्यमिक sporocyst पीढ़ियों के लिए विकसित करने में सक्षम हैं, और अंततः cercariae । विकास और उपकरणों के नित्य शोधन के साथ वर्तमान में जीन और ट्रांसजेनिक के माध्यम से इन विट्रो में जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए उपलब्ध है, आरएनए हस्तक्षेप और जीनोम संपादन (जैसे, CRISPR/Cas9) दृष्टिकोण, यह अनुरूप है कि कुशल अलगाव और विविध trematode प्रजातियों में से miracidia की खेती के लिए तरीके20 के लिए इस क्षेत्र में अनुसंधान के आगे की उंनति के लिए सामग्री की खरीद के लिए आवश्यक हो जाएगा । इस विधि अच्छी तरह से अलग और संवर्धन मुक्त-तैराकी cercariae के लिए एस. mansoni की सुविधा के लिए इन विट्रो परिवर्तन में स्तनधारी schistosomula मंच21के लिए पहले से वर्णित प्रोटोकॉल पूरक, अंततः के लिए खेती के लिए ovigerous वयस्क कीड़े22

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Disclosures

लेखकों के पास कुछ भी खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

NIH अनुदान RO1AI015503 द्वारा भाग में वित्त पोषित । Schistosome-संक्रमित चूहों को NIH संसाधनों के माध्यम से वितरण के लिए NIAID-HHSN272201000005I अनुबंध कवठेकर के माध्यम से जैव चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (रॉकविल, MD) में NIAID Schistosomiasis रिसोर्स सेंटर द्वारा प्रदान किए गए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

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References

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