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대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

Developmental Biology

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Summary

이 문서에서는 대규모 axenic 분리와 인간의 혈액 요 행 Schistosoma mansoni 의 free-swimming miracidia의 컬렉션에 대 한 프로토콜 및 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 그들의 후속 처리.

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

인간의 혈액 마리가, Schistosoma 종, 달팽이 중급 및 포유류 최종 호스트, 내 성적, 성적 발달 단계를 각각 포함 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 격리 하 고 생체 외에서 문화 조건 하에서 다른 라이프 사이클 단계를 유지 하는 능력은 크게 기생충 성장, 개발 및 호스트 통제 세포, 생화학 및 분자 메커니즘의 조사를 촉진 상호 작용입니다. 전송 schistosomiasis의 성별이 없는 재생산 및 달팽이 호스트; 내에서 여러 개의 애벌레 단계 개발 필요 기본 및 보조 sporocysts 통해 infective miracidium에서 cercarial 막바지에 그것은 인 간에 게 감염입니다. 이 문서에서 우리는 대량 해칭 및 감염 된 마우스, 그리고 생체 외에서 문화에 그들의 연속적인 소개의 간은에서 얻은 달걀에서 Schistosoma mansoni miracidia의 격리에 대 한 단계별 프로토콜 제시. 자세한 프로토콜에 종사 schistosome 연구의이 중요 한 분야를 확대 하는 새로운 연구를 격려 할 것 이다 예상 됩니다.

Introduction

인간의 혈액 마리가 Schistosoma 종, schistosomiasis, 한 약된 230 백만 사람들 전세계1afflicting 소홀히 열 대 질병의 원인이 되는 에이전트입니다. 가장 광범위 한 종, Schistosoma mansoni, 지리적으로 남아메리카, 카리브 제도, 중동, 사하라 사막 이남의 아프리카2에 배포 됩니다. S. mansoni, 다른 schistosomes의 수명 주기는 복잡 하다, 포유류 확실 한 호스트 및 의무 중간 호스트 역할 속 Biomphalaria 의 민물 달팽이.

S. mansoni 남성과 여성의 성인 웜은 쌍 창 자 점 막의 작은 venules에 박 혀 되 embryonated 계란 (ova)의 출시에 따른 포유류 호스트 재현의 후부 mesenteric 정 맥에서 생활 합니다. 계란 다음 혈관 벽을 통해 휴식 점 막 조직을 통해 마이그레이션 하 고 결국 대변으로 무효 처리는 어디 장 루멘을 입력 합니다. Ova는 민물 및 free-swimming 애벌레 (miracidia) 해치를 입력, 그들은 해야 합니다, 짧은 순서로 찾아 감염의 수명 주기를 계속 하기 위해 적당 한 Biomphalaria 달팽이. 이 감염 과정 miracidial 첨부 파일을 달팽이 외부 몸 표면 활성 침투와 유 충의 항목 호스트에 다음을 포함 한다. 항목, 직후는 miracidium 다음 애벌레의 단계로, 기본 또는 어머니 sporocyst의 새로운 외부 표면 (tegument) 될 것 이다 syncytium 형성으로 그것의 외부 ciliated 상피 접시를 발산 하기 시작 합니다. 성별이 없는 재생산을 통해 각 기본 sporocyst 생성 하 고 보조 나 sporocysts 또는 딸 sporocysts, 차례 차례로, 생성 하 고 intramolluscan 결선, cercaria3 의 다 수 출시의 2 세대를 출시 . 달팽이 호스트에서 탈출, 따라 free-swimming cercariae를 연결 하 고 직접 인간 또는 다른 적합 한 포유류 호스트의 피부를 관통 할 수 있다. 그들의 새로운 주인으로 입국, 시 cercariae 기생 schistosomula 단계로 변환 하 고 혈관 시스템을 침공. 그들은, 차례 차례로, 폐 그리고 그들이 어른 벌레로 성숙, 남성과 여성의 쌍을 형성 하 고 그들의 수명 주기를 완료 하는 데 mesenteric 정 맥에 여행 간 정 맥을 마이그레이션합니다.

성공 intramolluscan 또는 "달팽이 단계" 개발 애벌레 schistosomes의 인간의 호스트-전송의 사이클의 지속에 필수적 이다. 중요 한 중요성의 달팽이 호스트와 기본 sporocyst 단계에 그것의 초기 변화에 free-swimming miracidium의 기간 다음 항목이입니다. 호스트와 기생충 간의 생리 및 면역학 호환성에 따라 그것은 애벌레의 개발의이 단계는 초기 성공 또는 실패 결정된4,5,6 감염을 설치 하 . 기본 sporocysts asexually 다음에 인간 infective cercariae 생성, 보조 sporocysts 생산 능력의 후속 개발 추가 모든 기생충의 성장을 제공 하는 관대 한 생리 호스트 환경을 요구 하 고 생식이 필요합니다.

날짜 하려면, 작은 기본 생리, 생화학에 대 한 알려져 있다 및 분자 과정 schistosome-달팽이 상호 작용 제어, 애벌레의 개발 및 재생산, 규제 또는 조절에 관여 하는 특히 분자 및 경로 호스트 면역 응답입니다. 준비에 대 한 액세스 조건 하에서 생체 외에서 문화 실험 조작을 허용 하는이 애벌레 단계의 많은 것 크게 용이 하 게 개발 통로의 발견 및 세포 성장, 감 별 법의 기본 메커니즘 그리고 재생산입니다. 중요 한 기생충 경로 또는 메커니즘, 생체 외에서 실험을 통해 확인 된 다음 사용할 수 애벌레 성장/달팽이 호스트에서 복제를 중단 하거나 달팽이 호스트 면역 메커니즘 인식과의 제거에 관련 된 식별 miracidial 또는 sporocyst 단계.

이 문서 및 비디오 프레 젠 테이 션, free-swimming S. mansoni 의 많은 수를 분리 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 후속 실험 대상이 될 수 있습니다 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 miracidia 조작 (프로토콜 워크플로의 도식 개요 그림 1 참조). 비슷한 절차 설명 되어 있지만 이전7,,89, 우리 상세한 프로토콜 관련이 아직도 대답 없는 질문을 해결 하기 위해이 모델을 채용 하고자 하는 연구자에 유용할 느꼈다 intramolluscan 애벌레 발달, 세포질 확산, 그리고 schistosome-달팽이 면역 상호 작용. 또한,이 이렇게 쉽게 방광-아리 스토 S. haematobium, 간 마리가 또는 폐 마리가 같은 다른 의학적으로 중요 한 흡 충 류에서 계란의 격리에 대 한 적응 수 있습니다.

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Protocol

모든 동물 보호 및 실험 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 위스콘신-매디슨 대학 의정서에 의해 승인 되었다 아니. V005717입니다. 다음 프로토콜 포함 인간 병원 체에 대 한 Biosafety 수준 2 (BSL2) 시설에서 근무 없음이 프로토콜에 묘사 된 schistosome 단계는 인간이 나 다른 포유류를 감염 있습니다. 위험 그룹 2 (RG2) 인간 병원 체를 처리 하는 기관의 정책을 따릅니다.

참고: 우리가 사용 하 여 감염10, 그들의 더 높은 민감도 때문 (6 주 된) 여성 스위스-웹스터 쥐 그로 인하여 더 큰 계란 부담 저조한. 터 커 외. 이 모델 시스템11에 사용 되는 마우스 및 달팽이 감염 프로토콜을 설명 합니다. 테이블의 자료 의 특정 장비, 재료, 시 약 및 동물 소스가 실험 프로토콜을 수행 하는 데 필요한 모든 나열 합니다.

1. 감염 된 간을의 처리

  1. CO2 질 (분당 챔버의 볼륨의 10-30%의 속도)에 의해 감염 된 6-7 주 후, 마우스를 안락사. 호흡 및 심장 박동의 정지에 대 한 마우스를 모니터링 합니다.
    참고: 일반적으로, 20 쥐까지 처리할 수 있습니다 주어진된 시간에.
  2. Biosafety 내각에 안락사 마우스를 옮긴 후 그들의 뒤에 마우스 놓고 그들의 복 부 표면을 70% 에탄올 스프레이 합니다. 1 분 동안 담가 보자.
  3. 꼬집어 낮은 복 부의 피부를 당겨 하 고 메 마른 외과 위 복 부에 가장 가까운 슬쩍된 피부의 기지에서 잘라. Anteriorly 잘라 피부를 당겨 (즉, 머리 쪽으로) 간 공개. Note 간 확대 하 고는 계란 유도 granulomatous 응답 (그림 2A)으로 인해 얼룩 덜 룩 합니다.
  4. 간 제거 하 고 포함 하는 살 균 1.2 %NaCl 솔루션 포함 펜/strep의 200 mL 비 커에 배치.
  5. 1.3-1.4 나머지 마우스 단계 반복 합니다.
    참고: 20 쥐 단일 수확 일반적으로 처리 됩니다.
  6. 멸 균 페 트리 접시에는 간을 놓고 소독 집게와 비 간 지방/결합 조직을 제거 합니다.
  7. 펜/strep 살 균 1.2 %NaCl 솔루션의 ~ 200 mL를 포함 하는 메 마른 250 mL 원심 분리기 병 정돈/청소 간 전송.
  8. 적극적으로 포함 하는 간 병을 동요 하 고, 거품/부동 파편 초과 표면 제거 살 균 일회용 피 펫을 사용 하 여. 천천히 용기에 남은 소금물을 부 어 또는 싱크대 포함 1% 표 백제 (소독 제).
  9. 있는 간은을 신선한 염 분 해결책의 ~ 200 mL를 추가 하 고 단계 1.8 세 번 더 반복.

2. 간 추출 및 miracidial 격리

  1. 작은 살 균 스테인리스 믹서 기 컵에는 간을 놓고 1.2 %NaCl 용액 (그림 2B)의 ~ 2 mL를 추가 합니다.
  2. 호 일와 유출 방지 하기 위해 낮은 및 높은 속도 (20 s 낮은 속도/10의 고속; 반복)를 대체 하 여 1 분 동안 혼합 배양 접시 컵 커버 (그림 2C).
  3. (20 간 4 병을 사용)에 대 한 균등 하 게 살 균 250 mL 원심 병에 혼합된 간 정지를 배포 합니다.
  4. ~ 200 mL 전체 볼륨/병에 항생제와 살 균 염 분을 추가 합니다. 체중/밸런스 원심 분리 전 병.
  5. 원심 분리기 4 oc. 부드럽게 15 분 290 x g에서 혼합된 간 부 supernatants 어 버리기 전에 표 백제와 함께 용기에.
  6. 2.4-2.5 단계를 한 번 반복 합니다. 철저 하 게 원심 분리에 앞서 간 토사를 resuspend 해야 합니다.
  7. 마지막 염 분 삭제 후 세척 (단계 2.6), 수송과 간 조직, 침전 물, resuspend 알루미늄으로 완전히 덮여 있다 멸 균된 1 L 체적 술병에 정지를 전송 하는 악수에 펜/strep 메 마른 연못 물 200 mL를 추가 호 일 톱 목 (그림 2D)의 3 cm 제외
    참고: 1 L 플라스 크 당 두 병 (= 10 간)를 사용 합니다. 연못 물 계란에서 부 화 miracidial를 자극 하는 데 필요한 자연 민물 환경을 시뮬레이션 합니다.
  8. 메 마른 연못 물을 사용 하 여, 목에 취재 호 일 위에 약 3 cm에 플라스 크를 작성. 다음, 지체 없이 (로 miracidia는 곧 부 화 하기 시작), 잔여 거품과 간 조직 파편을 포함 하는 연못 물 ~ 12 mL를 pipetting 신속 하 게 하 여 표면에 부동을 제거 하 고 튜브를 취소는 별도의 삭제. 신선한 메 마른 연못 물 바꿉니다.
  9. 청소 단계 2.8, 3 더 많은 시간, 폐기 관에 miracidia의 존재에 대 한 검사를 반복 합니다. Miracidia 세척 솔루션에 표시 하는 경우 단계를 청소의 반복을 중단.
  10. 마지막 세척 후 천천히 위에 깨끗 한, 마른 따뜻한 물으로 온도 기울기를 만들려고 따뜻한 메 마른 연못 물 (미리 30 oC 예 열) ~ 12 mL를 추가 합니다.
    참고:이 가장 천천히 혼합을 피하기 위해 플라스 크 목의 측면을 따라 물 방전에 의해 수행 됩니다.
  11. 플라스 크 오프닝에 작은 배양 접시 덮개를 배치 하 고 수 위 면을 밝히는 포 일 덮개 위에 플라스 크의 위쪽에 밝은 빛을.
    참고: 일반적으로 5-10 분 이내 수영 miracidia, 매력, 빛을 집중할 것 이다 연못 물 (그림 3A)의 첫 2-3 cm 내에서 많은 수에서.

3. Miracidial 수확 및 재배

  1. Miracidia 10 분 후 표면에 축적, 살 균 전송 피펫으로 사용 하 여 제거 ~ 8 mL 연못 물과 살 균 15 mL 원심 분리기 튜브를 전송 합니다. 얼음에 miracidia를 포함 하는 튜브를 놓습니다.
  2. 다시 8 mL 부피 플라스 크의 내부를 따라 따뜻한 메 마른 연못 물 추가 하 고 다른 10 분 기다립니다.
  3. 매번 새로운 튜브를 사용 하 여, 3.1, 3.2 단계 세 번 더 반복 합니다. 4번째 컬렉션 후 정착 miracidia 수 있도록 10 분 동안 얼음에 최종 관 유지. 튜브의이 세트 구성 첫 수확.
  4. 원심 분리기 튜브 290 x g 4 oC에서 미리 냉각된 냉장된 원심 분리기에서 1 분 동안에 miracidia를 포함 하.
  5. 바로 기생충 펠 릿 (그림 3B)를 방해 하지 않도록 주의 되 고 상쾌한 (~ 7 mL)의 대부분을 제거 합니다.
  6. 수영장 하나에이 첫 번째 추수에서 모든 miracidia 튜브, ~ 1 mL 균 연못 물으로 원래 관의 모든 씻어 그리고 "합동된" 튜브에 추가.
  7. ~ 5 분 동안 얼음에 정착 하는 기생충을 허용 하 고 다시 원심 290 x g 4 oc.에 1 분 동안에 기생충
  8. 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 6-8 mL 살 균 Chernin 소금 솔루션 (CBSS +; 참조 테이블의 재료) 포함 펜/strep 균형 추가.
  9. 부드럽게 miracidia와 약 수 24-잘 문화 접시 (우물 당 1 mL)으로 6-8 ml CBSS + 튜브를 헹 구 고 린스의 1 mL 각 잘 추가 다음 일시 중단 합니다. 26 oC normoxic 조건에서 기생충 알을 품으십시오. 격리 된 miracidia의 농도, 다르지만 ~ 7000/mL 평균 일반적으로 것입니다.
  10. 기생충은 아직도 광원에 집중, 단계 3.1 3.9 늦은 해칭 miracidia 수확 계속 반복 하지만 컬렉션 15-20 분 사이의 시간 간격을 증가.
    참고:이 새로운 집합 관의 두 번째 수확을 나타냅니다. 그러나, 일반적으로 miracidial 숫자는 낮은, 때문에 일반적으로 모든 튜브에서 애벌레 잘 CBSS + 2 mL를 포함 하는 단일 문화권에 풀링됩니다.
  11. 수확 후 24 h와 재배, 부드럽게 pipetting으로 그들의 우물에서 sporocysts resuspend.
  12. 우물의 바닥에 침전 하는 기생충 수 있도록 몇 분을 기다립니다. 그들은 정착, 신중 하 게 상쾌한 (~1.5 mL), 애벌레 변환 하는 동안 miracidia에 의해 창 고 ciliated 상피 접시의 대부분을 포함 하는 제거. 이 "변환" 표면에 뜨는 폐기 하거나 애벌레 분 비 제품의 후속 연구에 통합 될 수 있습니다.
  13. 각 잘 고 부드럽게 sporocysts resuspend에 피 펫의 신선한 CBSS + 1.5 mL를 추가 합니다. 추가 세척 또는 다른 매체를 변경 원하는 경우 단계 3.12를 반복 합니다.

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Representative Results

Miracidia의 대부분은 일반적으로 것 이다 되었습니다 수집 처음 두 "추수"에. CBSS +에서 고립 된 miracidia의 부 화 (그림 4A-C) miracidium sporocyst 변환 프로세스를 트리거합니다. 첫 번째 시간 문화에 다음 전송 우물 CBSS +, miracidia 중지 수영 (그림 4A)의 대다수를 포함 하. 문화에 6 h, miracidia 적극적으로 그들의 ciliated 표 피 판 (그림 4B)를 흘리 고 과정에 있습니다. 이 발산 과정 일치, 애벌레 형성 그들의 외부 syncytial tegumental 덮개 대로 그들은 기본 sporocysts를 변환 합니다. 기생충의 대부분 CBSS + (그림 4C)에서 24-48 h 후 재배 하 여 sporocysts 완전히 형성 되 고 애벌레 변환을 완료 됩니다. 4 일 후에 CBSS + 혼자 문화의 sporocyst 생존 ~ 80%로 감소 예상 수 있습니다. 그러나, sporocysts CBSS + 1 일 경작 하 고 3 일 일반적으로 더 나은 생존 율 및 더 강력한 모양 (그림 4D) 애벌레 결과 대 한 완전 한 Bge (cBge) 매체에 전송. Sporocyst 생존은 일반적으로 애벌레 성장 문화 CBSS + 혼자에 비해에이 기간 동안에 지속적인된 증가 함께 cBge에 4 7 일 사이의 안정적인 남아 있습니다.

Figure 1
그림 1 . 프로토콜 워크플로 개요. 주요 단계는 격리의 도식 요약 및 miracidia의 재배 인간의 혈액 요 행, S. mansoni감염 마우스에서 파생. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 감염 된 간을 처리. (A) 마우스 간 S. mansoni 계란 무 겁 게 감염. Note 확대 크기, 비정상과 (오른쪽) (왼쪽) 일반 감염 되지 않은 간에 비해 감염 간에서 육아의 존재. (B) 감 겨 주 살 균 스테인리스 믹서 기 컵을 전송 후 간 마우스. 간 다음 컵, 따라서 피하는 유출 (C)를 충당 하기 위해 살 균 호 일 및 페 트리 접시를 사용 하 여 1 분간 혼합 했다. 혼합, 후 간 homogenate, 포함 하는 계란, 식 염 수에 여러 번 씻어 고 알루미늄 호 일 (D)로 덮여 1 L 부피 플라스 크에 전송 하기 전에 메 마른 연못 물에서 resuspended. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 수확 S. mansoni miracidia. 적극적으로 부피 측정 플라스 크 (A)의 상단에 빛 매력에 의해 집중 miracidia 수영. 10 분 간격 기생충 피 펫에 의해 수확 하 고 애벌레를 무력화 하 4 ° C에. Miracidia 원심 분리에 의해 CBSS + 세척 그리고 문화 접시의 우물을 바로 배포 전에 단일 튜브 (B)에 수집 됩니다. CBSS +; Chernin의 균형 소금 솔루션 (재료의 테이블). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 기본 sporocysts 및 그들의 유지 보수 Miracidial 변환 생체 외에서 . S. mansoni miracidia와 sporocysts 서로 다른 시간에 대 한 생체 외에서 문화에 배치 후 수확. 새로 수확된 miracidia 문화 CBSS + (A)에서 1 시간 이내. 문화 6 h 후 miracidia 그들은 기본 sporocysts (B)에 변환으로 그들의 ciliated 표 피 판 (화살표)를 발산 하기 시작 했습니다. CBSS + 24 시간 후는 miracidia의 대부분은 기본 sporocysts (C)를 완전히 변형 된다. Sporocysts 변형 CBSS + 24 h에 대 한 다음 전송 되었고 3 일 (D)에 대 한 cBge 매체에 유지. Sporocysts는 일반적으로 더 강력한 나타나고 4 일 후 재배 CBSS + 혼자에 비해 cBge의 존재에 더 높은 생존 율 있다. CBSS + Chernin의 균형 소금 솔루션; cBge 매체, 완전 한 B. glabrata 배아 세포 매체 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

S. mansoni, 절연 및 여기에 설명 된 대로 조작의 Miracidia만 달팽이 중간 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 그러므로 애벌레 발달의이 단계 동안 인간의 생물 학적 변하지 않습니다. 그러나, 감염을 피하기 위해 사고 노출/달팽이의 배려는 감염 Biomphalaria 달팽이 종 수 있습니다 존재 또는 유지 하는 지역에서 다른 위치에 miracidial 격리를 수행 하기 위해가지고 한다. BSL2 공간으로, 등록 된 별도 룸이 좋습니다. 또한, 모든 세척 간 및 애벌레 절연 처리에 사용 되는 솔루션 살 균 제 (예를들면, 1% 표 백제) 전에 대우 되어야 한다.

그것은에서 간은의 외과 제거 감염 마우스 및 혼합 균질 전에 그들의 후속 처리 생물 안전 캐비닛 (BSC) 무 균 조건 하에서 수행 됩니다 주목 해야한다. 그러나, (대량 샘플 조작의 용이성) 실용적인 이유로 다른 모든 절차 수행 됩니다 소독된 벤치탑 살 균 컨테이너 (예:믹서 기 컵, 플라스 크, 병 및 튜브, 전송 pipets, 등) 및 살 균 솔루션 항생제 (염 분, 연못 물, CBSS) 포함 하는. 항생제는 도입된 미생물 오염에 대 한 추가 조치로 모든 솔루션에 추가 됩니다. 또한, miracidial 절연 및 단계 (프로토콜 섹션 2 및 3)을 수확을 하는 동안 작은 페 트리 접시 커버 거품/간 파편 및 후속 전송의 초기 제거 하는 동안 외부 오염 최소화 하 여 플라스 크 위에 배치 됩니다. 원심 관에 플라스 크에서 집중된 miracidia입니다.

일반적으로, 우리는 우리가 간 당 약 5000 애벌레의 애벌레 수익률 추정 단일 일괄 처리에서 20 감염된 마우스 간에서 miracidia 수확. 그러나, 수익률 miracidial 복구에 일괄 일괄 변화 결과로 개별 쥐의 감염 강도 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 격리 더 적은 시작 간을 사용 하 여 수행할 수 있습니다, 그리고 우리 설명 하는 메서드는 일반적으로 10-20 간 적용. 메 마른 연못 물 (프로토콜 섹션 2 단계 2.7), 간 산 탄의 최종 물의 resuspension 다음 20 간 처리 됩니다 때 정지 두 1000 mL 플라스 크 (2 병/플라스 크)에 동등 하 게 배포 해야 합니다. 10 간 이하의 사용 하는 경우 원래 간 homogenates (프로토콜 섹션 2, 단계 2.3) 2 병을 배포할 수 있습니다 하 고 정지 후 추가 처리를 위해 단일 체적 플라스 크로 세척. 하나 또는 2 간은 또한 처리 수 있습니다, 하지만 수량 (볼륨) 추출, 세척 및 부 화 솔루션의 비례, 집중 10 mL 호 일 커버 체적 술병에 전송 되는 연못 물에 앙금을 씻어 마지막으로 감소 한다 miracidia입니다.

간 파편 오염의 최소 miracidial 수율을 최대화 하기 위해 그것은 또한 신속 하 고 효율적으로 가능한 연못 물 세척 (프로토콜 섹션 2, 단계 2.7-2.9)을 수행 하는 것이 중요. 일단 달걀 연못 물에 노출은, miracidial 부 화는 비록 애벌레 모양 플라스 크 목에 광원에서 부 화 후 5 ~ 20 분에서 다를 수 있습니다 전에 시간 개시 그 후 곧, 발생 합니다. 연못 물 청소 하는 동안 기생충의 손실을 제한 하 각 연못 물을 시각적으로 확인 하는 중요 한 단계는 플라스 크의 목의 위 물 층에 이른 도착 miracidia에 대 한 세척. 또한, miracidia 15 mL 컬렉션 튜브로 전송 하 고 얼음에 배치 하는, 그들은 수영 활동 중단 되며 튜브 바닥에 정착. 작은 애벌레 (섹션 3, 단계 3.4-3.5)을 원심 분리, 후의 miracidia 다시 따뜻한 물 허용 되는 경우 수영 시작 됩니다. 따라서, 그것은 신속 하 게, 하지만 방해 하는 펠 릿 또는 기생충을 수영을 pipetting 없이 연못 물을 제거 하는 것이 중요입니다.

앞서 언급 했 듯이, 고립 된 miracidia의 수확량 개별 마우스 (감염 강도)에 성인 벌레 쌍의 수와 초기 감염 프로토콜의 일관성에 따라 다를 수 있습니다. Miracidia는 강하게 phototropic 하 고 대부분 (80-90%)는 첫 번째 수확 기간 동안 광원에 집중할 것 이다. Miracidia의 나머지 10-20%는 부 화를 계속 되 고 더 천천히 두 번째 수확 기간 동안 축적. 대부분 (> 95%) miracidia 문화에 도입 하 고 26 oC CBSS + 매체에 유지 기본 sporocysts 경작의 24-48 시간 내에 변화 것입니다. 이 시점에서 애벌레 생존 능력은 일반적으로 이다 > 90%. CBSS + 4 일 후 혼자 생존 상당히 떨어진다 (70-80%). 그러나,에서 CBSS + Bge 중간 24 h 다음을 완료 하는 데 문화 매체 전환 초기 CBSS 재배 결과 더 높은 생존 율 보다 강력한 성장. 우리는 정기적으로 단기 sporocyst 문화 normoxic 조건 하에서 유지합니다. 그러나, sporocysts는 산소 수준, 그리고 특히 해로운 산화 손상7을 입힐 수 있습니다 반응성 산소 종에 매우 민감합니다. C.J. Bayne4 와 다른 보고는 전반적인 건강 및 생체 외에서 sporocysts의 생존 능력은 크게 향상 문화 hypoxic 조건 하에서 유지 됩니다. 가스 (질소)로 개별 closeable 플라스 크, 또는 질소 농축 인큐베이터4의 가스 단계 낮춘된 산소 레벨을 얻을 수 있습니다.

Axenic 분리 하 고 schistosome의 배양, 위의 인용된 방법으로 miracidia와 sporocysts는 설명 이전. 그것은 miracidial 광성 유치 하 고 수영 애벌레를 집중 사용 될 수 및 그 격리 된 miracidia hyperosmotic (120-160 모스/Kg) 사이 염 분 솔루션8빠르게 동원 수 초기에 인정 받았다. 그것은 더 그 염 분 솔루션 유지 보수 기본 sporocysts, 첫 번째 intramolluscan 애벌레 단계9,12miracidia의 변환에서 결과 관찰 되었다. 복잡 한 미디어도 장기 생체 외에 성장 및 미 mansoni sporocyst 단계9,13,,1415, 뿐만 아니라 세포의 개발을 지원 하기 위해 공식화 되었습니다. 달팽이 호스트 Biomphalaria glabrata16에서 파생. 이러한 공식 다양 한 상업 미디어를 통합 하 고 아미노산, 지질, 감소 시키는 대리인, 소금과 설탕와 보충 수 있습니다. 완전 한 미디어 공식 또한 태아 소 열 비활성화 또는 다양 한 농도에 말 혈 청에 포함. 우리는 그 적절 한 열 비활성화 (HI)은 sporocyst 생존 및 장기 개발에 생체 외에서중요 한 발견 했다. 우리는 60 분 60 oC waterbath에 있는 혈 청 (해 동, 100 mL 병)의 그 부 화, 유니폼 난방에 대 한 모든 10 분을 혼합 하는 부드러운 가장 효과적 이었다. 또한, 우리는 일반적으로 애벌레 문화 호환성에 대 한 잠재 공급 업체에서 혈 청의 여러 많은 테스트합니다. 마지막으로, 첫번째 (와 현재) 정통 molluscan 셀 라인, 한 센16 B. glabrata 배아 (Bge) 셀 라인의 설립은 크게 애벌레 schistosome에서 발전을 촉진 주요 돌파구 재배 노력입니다. Bge 셀 기본에서 개발 하는 보조/딸 sporocysts17, 하 고 결국 최종 cercarial 단계18,19공동 문화에 배치 하는 때 미 mansoni miracidia를 고립. 따라서, S. mansoni 라이프 사이클의 전체 달팽이 위상의 지속적인 체 외에서 경작을 달성 하고있다. 우리의 문화 시스템에 사용 되는 Bge 셀 매체 sporocyst 성장/개발 및 Bge 셀 라인의 유지 관리를 지원 합니다.

요약 하자면, 우리가 설명 하 고 시각적으로 대량 axenic 고립과 S. mansonifree-swimming miracidial 단계의 재배에 대 한 상세한 프로토콜을 설명. 이러한 miracidia, 적절 한 문화 조건을 복종 될 때 연속 된 기본 및 보조 sporocyst 세대, 그리고 결국 cercariae를 개발 할 수 있다. 개발 및 현재 유전자 및 유전자 표현에 생체 외에서 유전자 변형, RNA 간섭 및 게놈을 통해 조작에 사용할 수 있는 도구의 지속적인 상세 편집 (예: CRISPR/Cas9) 접근, 그 효율적인 상상은 절연 및 다양 한 trematode 종20 에서 miracidia의 재배 방법 추가이 분야 연구의 발전에 대 한 자료를 조달 하는 데 필요한 수 계속 됩니다. 이 방법은 잘 분리 하 고 대 한 포유류 schistosomula 단계21, 생체 외에서 변화를 촉진 하기 위하여 S. mansoni free-swimming cercariae 경작에 대 한 이전 설명된 프로토콜 보완 최종 ovigerous 성인 재배22벌레.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

NIH 그랜트 RO1AI015503에 의해 일부를 투자. Schistosome에 감염 된 쥐 바이 리소스를 통해 배포에 대 한 NIH NIAID 계약 HHSN272201000005I 통해 NIAID Schistosomiasis 리소스 센터 생물 의학 연구소 (락 빌, 메릴랜드)에 의해 제공 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

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References

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