Isobaric लेबलिंग, व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और सॉफ्टवेयर असिस्टेड ठहराव द्वारा डीप Proteome profile

Biochemistry

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Summary

हम सही isobaric लेबलिंग, व्यापक भिन्नीकरण, bioinformatics उपकरण, और एक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इंटरफेस के साथ संयोजन में गुणवत्ता नियंत्रण कदम के साथ प्रोटीन quantitate करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

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High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

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Abstract

कई असाधारण अग्रिमों में किया गया है मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ms)-आधारित प्रोटियोमिक्, में विशेष तकनीकी प्रगति के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी (lc) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री करने के लिए युग्मित (नियंत्रण रेखा एमएस/ms) और isobaric लेबलिंग division क्षमता. यहां, हम एक गहन प्रोटियोमिक् रूपरेखा प्रोटोकॉल है कि 10-plex मिलकर जन टैग (टीएमटी) एक व्यापक नियंत्रण रेखा के साथ लेबलिंग/एमएस/एमएस मंच, और पोस्ट-एमएस अभिकलनी हस्तक्षेप सुधार को सही quantitate पूरी proteomes को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल निंनलिखित मुख्य चरणों में शामिल हैं: प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी लेबलिंग, 2 आयामी (2d) नियंत्रण रेखा, उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री, और गणना डेटा प्रोसेसिंग । गुणवत्ता नियंत्रण चरण समस्या निवारण और प्रयोगात्मक भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किए गए हैं । स्तनधारी नमूनों में १०,००० से अधिक प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के साथ आत्मविश्वास से quantitated हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल को मामूली बदलाव के साथ पोस्ट शोधों के संशोधनों के quantitation पर भी लागू किया जा सकता है । इस मल्टीप्लेक्स, मजबूत विधि जटिल नमूनों की एक किस्म में proteomic विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, सेल संस्कृति, पशु ऊतकों, और मानव नैदानिक नमूनों सहित.

Introduction

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम जैविक प्रणालियों और मानव रोग के अध्ययन के लिए एक नया परिदृश्य के लिए नेतृत्व किया है । इस जीनोम की माप की एक बड़ी संख्या की अनुमति दी है, transcriptome, proteome, metabolome, और अंय आणविक प्रणालियों मूर्त बनने के लिए । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है, और प्रोटियोमिक् में अपने आवेदन तेजी से मानव जीनोम के अनुक्रमण के बाद विस्तार किया गया है । प्रोटियोमिक् क्षेत्र में, पिछले कुछ वर्षों के एमएस-आधारित मात्रात्मक विश्लेषणों में प्रमुख तकनीकी अग्रिमों की पैदावार हुई है, जिसमें इंस्ट्रूमेंटेशन के अतिरिक्त isobaric लेबलिंग और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ संयोजित की गई है अग्रिम, कम नमूना आवश्यक सामग्री के साथ तेजी से, अधिक सटीक माप के लिए अनुमति दी । मात्रात्मक प्रोटियोमिक् उच्च जटिल जैविक नमूनों में प्रोटीन और posttranslational संशोधनों के हजारों के दसियों की रूपरेखा के लिए एक मुख्यधारा दृष्टिकोण बन गए हैं1,2,3,4 , 5 , 6.

division isobaric लेबलिंग विधियाँ जैसे सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए isobaric टैग (जैसे, iTRAQ) और मिलकर मास टैग (टीएमटी) एमएस ने नमूना प्रवाह में काफी सुधार किया है और नमूनों की संख्या में वृद्धि की है जो एक एकल में विश्लेषण किया जा सकता है प्रयोग1,6,7,8. अंय एमएस-आधारित quantitation विधियों, जैसे लेबल मुक्त quantitation और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबलिंग सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के साथ (यानी, SILAC), प्रोटियोमिक् क्षेत्र में इन तकनीकों की क्षमता काफी है9 ,10,11. उदाहरण के लिए, टीएमटी विधि 10-plex रिएजेंट का उपयोग करके 1 प्रयोग में एक साथ विश्लेषण करने के लिए १० प्रोटीन नमूनों को अनुमति देता है । इन संरचनात्मक समान टीएमटी टैग एक ही समग्र द्रव्यमान है, लेकिन भारी आइसोटोप अंतर कार्बन या नाइट्रोजन परमाणुओं पर वितरित कर रहे हैं, प्रत्येक टैग के एमएस/ms विखंडन के दौरान एक अद्वितीय रिपोर्टर आयन में जिसके परिणामस्वरूप, जिससे रिश्तेदार quantitation सक्षम 10 नमूनों के बीच । टीएमटी रणनीति जैविक रास्ते, रोग प्रगति, और सेलुलर प्रक्रियाओं12,13,14का अध्ययन करने के लिए नियमित रूप से लागू किया जाता है ।

पर्याप्त तकनीकी सुधार है तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा)-एमएस/एमएस सिस्टम, दोनों नियंत्रण रेखा जुदाई और एमएस मापदंडों के संदर्भ में, quantitation सटीकता त्याग के बिना प्रोटीन की पहचान को अधिकतम करने के लिए । दूसरे आयाम के लिए उच्च orthogonality के साथ एक जुदाई तकनीक द्वारा पेप्टाइड्स के पहले आयाम जुदाई शॉटगन प्रोटियोमिक् विधि के इस प्रकार के लिए अधिकतम परिणाम20प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है । उच्च पीएच उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC) बेहतर प्रदर्शन प्रदान करता है से पारंपरिक मजबूत कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी20। जब उच्च पीएच RPLC कम पीएच RPLC के एक दूसरे आयाम के साथ संयुक्त है, दोनों विश्लेषणात्मक गतिशील रेंज और प्रोटीन कवरेज में सुधार कर रहे हैं, व्यक्त प्रोटीन के थोक की पहचान करने के लिए जब पूरे प्रदर्शन-proteome विश्लेषण की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप15 ,16,17,18. अंय तकनीकी अग्रिमों छोटे C18 कणों (१.९ µm) और विस्तारित लंबे स्तंभ (~ 1 m)19शामिल हैं । इसके अलावा, अंय उल्लेखनीय सुधार तेजी से स्कैन दर, बेहतर संवेदनशीलता और संकल्प20, और एमएस डाटा खनन21के लिए परिष्कृत bioinformatics पाइपलाइन के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के नए संस्करणों में शामिल हैं ।

यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि संशोधनों के साथ सबसे हाल के तरीके शामिल दोनों संवेदनशीलता और प्रवाह में सुधार का वर्णन है, जबकि प्रयोग में गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर ध्यान केंद्रित । प्रोटोकॉल में प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी 10-plex लेबलिंग, बेसिक पीएच और एसिड पीएच RPLC अंश, उच्च संकल्प एमएस डिटेक्शन, और एमएस डाटा प्रोसेसिंग (चित्रा 1) शामिल हैं । इसके अलावा, हम समस्या निवारण के लिए कई गुणवत्ता नियंत्रण चरणों को लागू करने और प्रयोगात्मक भिंनता का मूल्यांकन । इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए शोधकर्ताओं ने क्षेत्र के लिए नए नियमित रूप से पहचान और सही एक lysate या ऊतक से प्रोटीन के हजारों quantitate मदद करना है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सावधानी: कृपया उपयोग से पहले सभी प्रासंगिक सुरक्षा डाटा शीट ( यानी , MSDS) से परामर्श करें । इस प्रोटोकॉल को करते समय कृपया सभी उपयुक्त सुरक्षा अभ्यासों का उपयोग करें ।

< p class = "jove_content" > नोट: एक टीएमटी 10-plex isobaric लेबल रिएजेंट सेट में 10 नमूनों की proteome quantitation के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है ।

< p class = "jove_title" > 1. कोशिकाओं/ऊतकों को तैयार करना

< p class = "jove_content" > नोट: यह अपने मूल जैविक राज्य में प्रोटीन रखने के लिए कम तापमान पर न्यूनतम समय में नमूनों को इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. वॉश अनुयाई कोशिकाओं ( जैसे , HEK २९३ कोशिकाओं) पर एक 10 सेमी प्लेट में दो बार 10 मिलीलीटर आइस कोल्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ । पंजाब के 1 मिलीलीटर में स्क्रैप और सेल (~ 2 x 10 6 कोशिकाओं) इकट्ठा । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए ६०० x g पर 4 & #176 पर केंद्रापसारक के बाद पंजाबियों को हटाने; c. स्टोर सेल छर्रों पर-८० & #176; ग तक lysis.
    नोट: एक प्रायोगिक प्रयोग अक्सर प्रोटीन उपज की जांच करने के लिए किया जाता है । लगभग 1 मिलीग्राम प्रोटीन से 10 x 10 6 स्तनधारी कोशिकाओं या ८०% संगम के साथ एक 15 सेमी प्लेट से निकाला जा सकता है ।
  2. वैकल्पिक रूप से, लाइसे अनुयाई कोशिकाओं को धोने के बाद प्लेट में सीधे lysis बफर जोड़कर उनकी थाली पर । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में lysates लीजिए और २.५ कदम में प्रोटोकॉल विवरण का उपयोग करें ।
  3. 15 मिलीलीटर ट्यूबों में निलंबन कोशिकाओं को इकट्ठा, बर्फ ठंडा पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने, १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरण, और ६०० एक्स जी पर केंद्रापसारक को हटाने के लिए पंजाब । lysis बफर अवयवों की वांछित एकाग्रता बनाए रखने के लिए पूरी तरह से धो चरणों से पंजाबियों को हटा दें । स्टोर सेल छर्रों पर-८० & #176; ग तक lysis.
  4. इकट्ठा और ऊतकों को जल्दी से तौलना । विच्छेदन के तुरंत बाद तरल नाइट्रोजन में ऊतक रखें और स्टोर पर-८० & #176; C.
    नोट: ऊतकों की प्रोटीन उपज लगभग 5% से 10% ऊतक वजन
  5. समरूप ऊतक आकार और शारीरिक क्षेत्रों का उपयोग करने के लिए 10 नमूनों के लिए नमूना विविधता को कम करने के लिए है । प्रोटीन quantitation और बहाव डेटा विश्लेषण को प्रभावित करने के लिए अत्यधिक प्रचुर मात्रा में रक्त प्रोटीन से बचने के लिए दो बार बर्फ ठंडा पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ नमूने धोने के द्वारा रक्त संदूषण निकालें ।
< p class = "jove_title" > 2. प्रोटीन निष्कर्षण, गुणवत्ता नियंत्रण पश्चिमी सोख्ता, समाधान पाचन में, और पेप्टाइड को नमकीन करना

< p class = "jove_content" > नोट: किसी भी चरण के दौरान 10 नमूनों में से प्रत्येक को हैंडलिंग उसी तरह टीएमटी-लेबल वाले नमूनों के पूलिंग को कम करने के लिए आवश्यक है भिंनता.

  1. बनाने lysis बफर (५० मिमी HEPES [पीएच ८.५], 8 मीटर यूरिया, और ०.५% सोडियम deoxycholate) प्रयोग के दिन.
    नोट: नमूना lysis के दौरान आंशिक प्रोटीन विकार प्रोटीन पाचन क्षमता को प्रभावित करता है ।
  2. lysis बफर जोड़ने के लिए इतना है कि बफर का अनुपात नमूना मात्रा के लिए है 10:1 और ~ ग्लास मोती (०.५ mm व्यास) के अंतिम खंड के सेल छर्रों या ऊतकों को 20% ( उदा , बफर और नमूनों के बीच 10:1 मात्रा अनुपात) 5 के एक अंतिम प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल के लिए । सभी 10 नमूनों का इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या या प्रत्येक नमूने के ऊतक वजन पर विचार करके एक ही एकाग्रता रखें.
  3. नमूने के लिए ठोस यूरिया जोड़कर 8 मीटर पर यूरिया एकाग्रता बनाए रखें । सेल गोली या ऊतक की मात्रा जब ठोस यूरिया की मात्रा की गणना करने के लिए नमूने को जोड़ने के लिए 8 मीटर एकाग्रता को प्राप्त करने पर विचार याद रखें ।
    नोट: संयुक्त राष्ट्र के ताजा यूरिया बफर कृत्रिम रासायनिक संशोधन ( यानी , प्रोटीन carbamylation) को लागू करने और नकारात्मक पहचान पेप्टाइड्स की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं । यूरिया काफी मात्रा में है (१०० मिलीग्राम यूरिया के लिए रह रहे हैं ~ ७३ & #181; L in solution).
  4. में अघुलनशील मलबे को रखने के लिए lysate में अघुलनशील प्रोटीन के पाचन की अनुमति देना < सुप class = "xref" > 23 .
  5. लाइसे एक ब्लेंडर में नमूनों को 4 & #176; C 30 एस के लिए स्पीड 8 पर, 5 एस के लिए आराम, और दोहराने 5 बार या जब तक नमूने homogenized हैं । नमूने भी कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए भंवर से लीजड जा सकता है (RT) बर्फ पर एक 30 एस के साथ ~ 10 चक्र के लिए ठंडा अवधि । नमूना प्रकार के आधार पर, आवश्यक के रूप में lysis शर्तों को समायोजित करें ।
  6. मिश्रण के बिना lysate अच्छी तरह से और बनाने के 2 छोटे aliquots (~ 15 & #181; L प्रत्येक) । का प्रयोग करें 1 aliquot प्रोटीन एकाग्रता और 1 aliquot को मापने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन करके सकारात्मक नियंत्रण मांयता प्रदर्शन । शेष बड़ी aliquot को प्रोटियोमिक् विश्लेषण के लिए रखें.
  7. एक मानक प्रोटीन quantitation परख द्वारा या एक Coomassie-सना हुआ लघु सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय (10%) < सुप क्लास = "xref" > 22 विथ गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) विथ ए स्टैंडर्ड. ज्ञात एकाग्रता सटीकता की एक उच्च डिग्री के साथ एक BSA मानक का प्रयोग करें । सटीकता के उच्चतम स्तर को प्राप्त करने के लिए, BSA मानक के एमिनो एसिड विश्लेषण प्रदर्शन ।
    नोट: अन्य सटीक मानक उपलब्ध हो सकते हैं । प्रोटीन सांद्रता भी कोशिका संख्या या ऊतक वजन से अनुमान लगाया जा सकता है । हालांकि 1 मिलीग्राम प्रोटीन (१०० & #181; g/नमूना) की सिफारिश की है, विश्लेषण के साथ किया जा सकता है के रूप में कम के रूप में १०० & #181; प्रोटीन का g (10 & #181; g/नमूना).
  8. जोड़ें १००% acetonitrile (ACN) के लिए 10% ACN और LysC के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक एंजाइम-सब्सट्रेट अनुपात 1:100 (डब्ल्यू/डब्ल्यू) में उच्च denaturing शर्तों के तहत प्रोटीन को पचाने के लिए आरटी पर 2 ज < सुप वर्ग के लिए = "xref" > 1 . 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ें प्रोटीन में डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने और 1 ज. ७.२ एम यूरिया की अंतिम एकाग्रता में LysC पाचन प्रदर्शन के लिए मशीन ।
  9. ५० mM HEPES (पीएच ८.५) के साथ 2 मीटर यूरिया के नमूनों को पतला और आगे 3 ज या 1:50 के प्रोटीन अनुपात (डब्ल्यू/डब्ल्यू) के लिए एक trypsin पर रात भर के लिए आरटी में trypsin के साथ नमूनों को पचाने । लगभग 2 & #181 का उपयोग करें; g for trypsin of १०० & #181; छ प्रोटीन और एक trypsin एकाग्रता के लगभग 10 एनजी/& #181; L.
    नोट: कारक है कि अकुशल trypsin पाचन के लिए नेतृत्व कर सकते है पीएच मुद्दों, निष्क्रिय trypsin, या सब्सट्रेट करने के लिए एंजाइम का एक अनुचित अनुपात का उपयोग कर रहे हैं ।
  10. 1 मिमी उपज के लिए डीटीटी जोड़ें और आगे RT.
  11. पर 2 ज के लिए पेप्टाइड्स को कम
  12. iodoacetamide (आईएए) प्राप्त करने के लिए 10 मिमी । Cys-युक्त पेप्टाइड्स alkylate करने के लिए अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी पर मशीन ।
  13. डीटीटी जोड़ने के लिए 30 मिमी और आरटी
  14. में 30 मिनट के लिए मशीन को प्राप्त करने से बुझाने की प्रतिक्रिया आईएए
  15. प्रत्येक नमूने के एक छोटे से aliquot का परीक्षण करके trypsin पाचन की दक्षता की जाँच करें । एक 10 & #181 का उपयोग करके नमक; एल पिपेट टिप क्रोमैटोग्राफी मीडिया मृत अंतरिक्ष में एंबेडेड के साथ, निर्माता के अनुसार & #39; एस प्रोटोकॉल । नियंत्रण रेखा से प्रत्येक नमूने का विश्लेषण-ms/ms. lc-ms/ms पैरामीटर चरण 5 में, के रूप में एक ही है अपवाद के साथ कि ग्रैडिएंट 10 min < सुप वर्ग = "xref" > 23 .
  16. एमएस रॉ डेटा के लिए एक डेटाबेस खोज करते हैं (6 चरण में और अधिक विस्तार से देखें) एक खोज पैरामीटर के रूप में 4 याद क्लीवेज का उपयोग करके.
    नोट: यदि छूटी हुई दरारों की संख्या & #62; 10% है, तो यह अपूर्ण trypsin पाचन का संकेत हो सकता है । यह नकारात्मक बहाव परिणामों को प्रभावित करेगा । यह एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण (QC) चरण है ।
  17. डाइजेस्ट नमूनों को फिर से यदि छूटी हुई दरार & #62 है; 10% जोड़कर एक अतिरिक्त 10 & #181; L नमूनों को trypsin के.
  18. Acidify trifluoroacetic एसिड (TFA) को जोड़कर नमूनों को 1% एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । पीएच पट्टी का उपयोग करके पीएच को मापने । सत्यापित करें कि पीएच शर्त हैवीएन २ र ३ । जब तक सही पीएच हासिल नहीं हो जाता तब तक आवश्यकतानुसार अधिक TFA ड्रॉप वार (1 & #181; L) डालें.
  19. 10 मिनट के लिए आर टी पर २०,००० x जी पर केंद्रापसारक और supernatant.
  20. इकट्ठा
  21. वाश ०.५ to ६० & #181; g क्षमता स्पिन कॉलम युक्त C18 रिवर्स चरण राल मेथनॉल के ०.२५ मिलीलीटर के साथ यदि १०० & #181; g नमूनों का उपयोग कर । वाश ०.०३ को 30 & #181; g क्षमता स्पिन कॉलम with ६०% ACN/0.1% TFA का उपयोग अगर 10 & #181; g नमूनों का प्रयोग । 30 एस
  22. के लिए ५०० x g पर स्पिन कॉलम केंद्रापसारक
  23. Equilibrate कॉलम ०.१% TFA की ०.५ मिलीलीटर के साथ और 30 s.
  24. के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा निकालें
  25. स्तंभों पर नमूने लोड करें और १०० x g पर 3 मिनट के लिए या सभी नमूना स्तंभ के माध्यम से पास किया गया है जब तक कि द्वारा स्तंभों के लिए नमूने बाइंड करें ।
  26. स्तंभ के लिए ०.१% TFA की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और 30 एस
  27. के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक
  28. Add १२५ & #181; L की ६०% ACN/0.1% TFA प्रत्येक कॉलम और elute के लिए 3 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा । सुनिश्चित करें कि सभी समाधान स्तंभ के माध्यम से बीत चुका है ।
  29. eluents को वैक्यूम ध्यान से सुखाएं । सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से शुष्क है और कोई तरल ट्यूबों में रहता है । स्टोर पर-८० & #176; ग तक आगे विश्लेषण.
< p class = "jove_title" > 3. पेप्टाइड की टीएमटी लेबलिंग

< p class = "jove_content" > नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी नमूने पूरी तरह से टीएमटी रिएजेंट द्वारा लेबल किए गए हैं । कई कारकों ( जैसे , टीएमटी रिएजेंट इस्तेमाल की राशि, पीएच मूल्य, और प्रोटीन quantitation की सटीकता) टीएमटी लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं, जो सभी अनुप्रवाह परिणामों को नकारात्मक रूप से बदल देगा ।

  1. ५० & #181; ५० mM HEPES बफर (पीएच ८.५) के एल में प्रत्येक नमकीन पेप्टाइड नमूना का पुनर्गठन । पीएच की जांच करें और सुनिश्चित करें कि यह 7 और 8 के बीच है ।
    नोट: नमूना अंलीय हो सकता है अगर पूरी तरह से नमक के बाद नहीं सूख कदम है, जो लेबलिंग दक्षता को प्रभावित करेगा ।
  2. ~ 1 & #181; g प्रत्येक अनलेबल्ड नमूना के लिए एक अनुवर्ती टीएमटी लेबलिंग दक्षता परीक्षण के लिए, चरण ३.३ में वर्णित के रूप में ।
  3. निर्माता & #39; s निर्देश का पालन करते हुए निर्जल ACN और लेबल पेप्टाइड नमूनों में टीएमटी रिएजेंटों को भंग करना । 1 एच
  4. के लिए आरटी पर मशीन
  5. के द्वारा एक QC टीएमटी लेबलिंग दक्षता परीक्षण निष्पादित करना ~ 1 & #181; प्रत्येक टीएमटी-लेबल वाले और-अनलेबल्ड नमूने का उपयोग कर 10 & #181; L पिपेट सुझाव के अनुसार एंबेडेड क्रोमैटोग्राफी मीडिया के साथ निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल । नियंत्रण रेखा द्वारा टीएमटी-लेबल और लेबल वाले नमूनों का विश्लेषण-ms/ms.
    नोट: LC-ms/ms पैरामीटर है के रूप में एक ही खंड में 5, कि ग्रेडिएंट है 10 min.
  6. अपवाद के साथ
  7. यह सुनिश्चित करने के लिए अपुष्ट डेटा का परीक्षण करें कि लेबल किए गए नमूनों में अनलेबल्स वाले पेप्टाइड्स का पता नहीं लगाया गया है, पूर्ण लेबलिंग दक्षता सुनिश्चित करना (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 2 ). लेबलिंग दक्षता को सत्यापित करने के लिए 6 से 10 अलग पेप्टाइड्स के लिए ऐसा करें ।
  8. 4 & #181 को जोड़कर रिएक्शन को बुझाएं; L 5% hydroxylamine के लिए और 15 min.
  9. के लिए मशीन
  10. मिश्रण एक छोटे और बराबर मात्रा (2 & #181; L) प्रत्येक टीएमटी-लेबल वाले नमूने के aliquot । नमक का उपयोग कर 10 & #181; L पिपेट एंबेडेड क्रोमैटोग्राफी मीडिया के साथ युक्तियां । ३.४ चरण में वर्णित के रूप में LC-ms/ms द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें । कूदो सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का प्रयोग करें (एक खुला स्रोत डेटाबेस खोज एल्गोरिथ्म है कि मिलकर एमएस रॉ फ़ाइलें धर्मांतरित पेप्टाइड्स और प्रोटीन की एक सूची के लिए) सभी 10 नमूनों के सापेक्ष एकाग्रता अनुपात टीएमटी टैग द्वारा सभी की पहचान पेप्टाइड्स की तीव्रता निर्धारित करने के लिए ।
    नोट: इस QC premix अनुपात परीक्षण अंतिम पूलिंग से पहले समान मिश्रण के लिए सही अनुपात का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है, pipetting त्रुटियों के रूप में हो सकता है कि सांद्रता और प्रोटीन quantitation कदम हमेशा सही नहीं हो सकता है बदल जाएगा । यह भी सबसे अच्छा तरीका यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम मिश्रण के लिए इस्तेमाल किया 10 नमूनों में से प्रत्येक की राशि एक समान अनुपात में सभी कर रहे हैं, चरण ३.५ में वर्णित के रूप में.
  11. के रूप में कई बार दोहराने के रूप में आवश्यक सभी 10 नमूनों में 1:1 अनुपात को प्राप्त करने के लिए ।
  12. समान रूप से premix अनुपात परीक्षण के परिणामों के अनुसार 10 नमूनों को मिलाएं । अंय 9 नमूनों की मात्रा समायोजित करने के लिए आधार रेखा के रूप में ंयूनतम एकाग्रता के साथ नमूना का उपयोग करें ।
  13. पूलिंग की शमन करने वाली रिएक्शन के शोधकार्य को दूर करते हुए टीएमटी-लेबल वाले नमूने को नमकीन करके.
  14. धो 1 मिलीलीटर ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस युक्त ५० मिलीग्राम sorbent प्रति कॉलम 1 मिलीलीटर/0.25 एमएल के साथ मेथनॉल अगर १०० & #181; g नमूनों का उपयोग कर । धो ०.५-to ६०-& #181; g क्षमता C18 स्पिन कॉलम 1 एमएल/0.25 एमएल के साथ ६०% ACN/0.1% TFA का उपयोग कर यदि 10 & #181; छ नमूने । 30 एस
  15. के लिए ५०० x g पर कॉलम केंद्रापसारक
  16. Equilibrate कॉलम ०.१% TFA की ०.५ मिलीलीटर के साथ और 30 s.
  17. के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा निकालें
  18. स्तंभों पर लोड नमूने और १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा बाइंड 3 मिनट के लिए या नमूना के सभी जब तक स्तंभ के माध्यम से पारित कर दिया है ।
  19. स्तंभ के लिए ०.१% TFA की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और 30 एस
  20. के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक
  21. Add १२५ & #181; L की ६०% ACN/0.1% TFA प्रत्येक कॉलम और elute के लिए 3 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा । सुनिश्चित करें कि सभी समाधान स्तंभ के माध्यम से बीत चुका है ।
  22. eluents को वैक्यूम ध्यान से सुखाएं । सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से शुष्क है और कोई तरल ट्यूबों में रहता है । स्टोर पर-८० & #176; ग तक आगे विश्लेषण.
< p class = "jove_title" > 4. व्यापक उच्च संकल्प, बुनियादी पीएच LC अतिक्रमण

  1. सेट अप 2 जुड़े C18 स्तंभों युक्त पाटने ईथीलीन संकर कणों (४.६ मिमी x 25 सेमी, totaling ५० cm; ३.५ & #181; एम कण आकार) और एक microliter प्रवाह उच्च प्रदर्शन के लिए नियंत्रण रेखा पंप का उपयोग अंश.
    नोट: 2 कॉलम का उपयोग पेप्टाइड लोड बढ़ जाती है और जरूरी क्रोमैटोग्राफी में सुधार नहीं है । & #8804 युक्त नमूनों के लिए; २०० & #181; जी पेप्टाइड्स के, 1 कॉलम पर्याप्त है ।
  2. धो द १००-& #181; l पाश के बाद के जोड़ के साथ ३०० & #181; l प्रत्येक मेथनॉल, पानी, और एक बफर (10 मिमी अमोनियम formation, पीएच ८.०).
  3. धो के साथ कॉलम १०० & #181; समान रूप से मिश्रित isopropanol, मेथनॉल, ACN, और पानी और equilibrate के कॉलम में ९५% बफर A के लिए 2 ज.
  4. Solubilize ने नमकीन परित की टीएमटी-लेबलित पेप्टाइड सैंपल में ६५ & #181; L के बफर A. सत्यापित करें कि नमूना पीएच ~ ८.० है । यदि अभी भी अंलीय, उपयोग अमोनियम हीड्राकसीड के लिए पीएच समायोजित करने के लिए ८.०.
  5. Fractionate बफ़र के साथ निंन ग्रेडिएंट का उपयोग कर नमूना B (बफ़र A प्लस ९०% ACN): 15 मिनट के लिए 20%, १०० मिनट के लिए ३५% के लिए 20% है, और ३५% से ५०% के लिए 30 मिनट । अंश कलेक्टर सेट लोडिंग समय सहित हर 2 मिनट भागों इकट्ठा करने के लिए । प्रवाह दर सेट करने के लिए ०.४ मिलीलीटर/ देखें संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > नोभेम्बर र < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ एक प्रतिनिधि वर्णलेख.
  6. ८० भागों और शुष्क ४० भागों की कुल इकट्ठा (हर दूसरे अंश) सूखापन पूरा करने के लिए एक वैक्यूम ध्यानी के साथ ।
  7. का प्रयोग करें ४० नियंत्रण रेखा के लिए सूखे नमूनों-ms/
  8. नियंत्रण रेखा से सभी ८० अंश-ms/एमएस अल्ट्रा गहरी proteome कवरेज प्राप्त करने के लिए विश्लेषण ।
< p class = "jove_title" > 5. LC-ms/एमएस तैयारी और पैरामीटर्स

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: टीएमटी-आधारित quantitation में, पेप्टाइड आयनों isobaric हैं और एक MS1 स्कैन में 1 मास के रूप में दिखाई देते हैं । हालांकि, वे रिपोर्ट आयनों की तीव्रता के अनुसार quantitated रहे हैं (10 अद्वितीय रिपोर्टर आयनों) में एमएस/एमएस स्कैन के बाद पेप्टाइड आयन उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण के साथ खंडित किया गया है (HCD). टीएमटी रिपोर्टर आयन अनुपात से दबा जा सकता है सह-रेफरेंस की टीएमटी-लेबल आयनों < सुप वर्ग = "xref" > २४ . आयन आइसोलेशन विंडो को सीमित करना < सुप वर्ग = "xref" > २५ , गैस-चरण शुद्धि < सुप वर्ग = "xref" > 26 , द MultiNotch MS3 method < सुप क्लास = "xref" > 27 , या बहुआयामी नियंत्रण रेखा और लंबे ढाल के साथ व्यापक भिन्नीकरण (4-8 ज) < सुप वर्ग = "xref" > 28 वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं ।

  1. Pack ७५ & #181; मीटर इनर व्यास (ID) १.९ & #181 के साथ खाली कॉलमों; C18 राल का m 30 से ४० सेमी लंबाई (~ १.३ & #181; L बिस्तर मात्रा).
  2. ६५ पर कॉलम हीट & #176; सी एक तितली पोर्टफोलियो हीटर के साथ backpressure कम करने के लिए और अल्ट्रा उच्च दबाव लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (UPLC) सिस्टम । स्तंभ 2 से 3 बार तितली हीटर के भीतर कुंडल सुनिश्चित करें कि पूरे कॉलम बिस्तर लंबाई गर्म है । टेप हीटर के अंदर के लिए कॉलम के लिए हीटर के अंदर तापमान संवेदक पर टेप नहीं सावधान किया जा रहा है ।
    नोट: तितली पोर्टफोलियो हीटर घुड़सवार और एक कस्टम पर टेप है उपकरण के XYZ मंच से जुड़ी सामिल का टुकड़ा बनाया ।
  3. तैयार बफर एक (3% dimethyl sulfoxide और ०.२% फार्म का एसिड) और बफर बी (एक से अधिक ६७% ACN बफर) और स्तंभों को अच्छी तरह से धो ९५% बफर बी के साथ । उसके बाद, पूरी तरह से equilibrate स्तंभ में ९५% बफ़र A (कम 3 स्तंभ वॉल्यूम) । का प्रवाह दर का उपयोग करें ~ ०.२५ & #181; L/min और backpressure के २८० ३२० बार.
  4. १०० चूहे मस्तिष्क पेप्टाइड्स के एनजी (या हमारी पसंद के मानक) दो बार टीएमटी-लेबल नमूने का विश्लेषण करने से पहले चलाने के द्वारा LC-ms/एमएस सिस्टम की गुणवत्ता की जांच । उच्च गुणवत्ता वाले डेटा संग्रह सुनिश्चित करने के लिए निंन पैरामीटर्स की जांच करें: सर्वेक्षण एमएस सिग्नल तीव्रता (बेस पीक तीव्रता के लिए e8 और e9 के बीच), एमएस/ms स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता (y और b आयनों का एक अच्छा प्रतिनिधित्व), पीक चौड़ाई (12-22 s), समग्र अवधारण समय, LC system दाब (दाब वृद्धि & #62; ५० बार एक गंदा स्तंभ या भरा हुआ उत्सर्जक टिप इंगित करता है), और रन-टू-रन परिवर्तनशीलता (समान चोटियों & #60 होना चाहिए; 30 एस रन के बीच).
    नोट: 10-plex टीएमटी रिएजेंट (६.३२ एमडीए अंतर) के निकट-isobaric रिपोर्टर आयनों को हल करने के लिए, ms/ms समाधान के लिए कम से ३०,००० ४०० m/z पर सेट किया जाना चाहिए । HCD आम तौर पर TMT10-plex रिपोर्टर आयन विखंडन के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में यह आयन जाल उपकरणों में टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के लिए लागू होता है कि एक तिहाई नियम के अधीन नहीं है.
  5. साफ और एमएस साधन नियमित रूप से जांचना और ताजा नियंत्रण रेखा बफ़र्स का उपयोग करने के लिए प्रणाली के प्रदर्शन में सुधार होगा ।
  6. 5% TFA.
  7. में बुनियादी पीएच जुदाई से सूख पेप्टाइड्स का पुनर्गठन
  8. भार ~ ०.२ & #181; छ कॉलम पर जबकि बह 5% बफर A.
  9. १५० मिनट में बफर बी के ४५% से 15% के साथ Elute । एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, निम्न ग्रेडिएंट का उपयोग करें: समय 0, बफ़र B 5%; समय 2, बफर बी 15%; समय १३५, बफर बी ४५%, समय १४५, बफर बी ७०%; और समय १५०, बफर बी ९५% । मूल पीक chromatograms.
  10. की समीक्षा करने के बाद जल्दी और देर से बुनियादी पीएच RPLC भागों के लिए ढाल थोड़ा समायोजित करें
  11. एक सर्वेक्षण आयन ट्रैप जन विश्लेषक में स्कैन के साथ डेटा-निर्भर मोड में जन स्पेक्ट्रोमीटर संचालित (400-1600 m/z ; ६०,००० संकल्प; 1 x 10 6 स्वत: प्राप्त नियंत्रण (AGC) लक्ष्य; ५० ms अधिकतम आयन समय; और केन्द्रक मोड). प्रदर्शन 20 एमएस/ms उच्च संकल्प स्कैन (६०,००० संकल्प, 1 x 10 5 AGC लक्ष्य, ~ १०० MS अधिकतम आयन समय, ३५ HCD सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, ०.४ m/जेड आइसोलेशन विंडो, और 20 एस गतिशील अपवर्जन).
    नोट: इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण पृथक्करण (ETD) TMT10 के लिए अनुशंसित नहीं है-plex एजेंट क्योंकि ETD दरार साइटों HCD से अलग हैं, रिपोर्टर आयन ओवरलैप में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, ETD HCD है क्योंकि tryptic पेप्टाइड्स आम तौर पर उत्पन्न + 2 आरोप लगाया राज्यों, और ETD उच्च प्रभार राज्यों में अधिक कुशल है के रूप में प्रभावी नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 6. MS डेटा विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: हम जंप सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ डेटा विश्लेषण का वर्णन करते हैं । हालांकि, डेटा विश्लेषण अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या मुक्त प्रोग्राम के साथ किया जा सकता है ।

  1. प्रक्रिया raw फ़ाइलें मास स्पेक्ट्रोमीटर टैग-आधारित हाइब्रिड खोज इंजन जंप के साथ < सुप वर्ग = "xref" > 21 , जो एक पैटर्न-आधारित डेटाबेस खोज और एक टैग-आधारित de नोवो अनुक्रमण को जोड़ती है संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधार करने के लिए.
  2. mzXML प्रारूप और खोज MS2 स्पेक्ट्रा लक्ष्य-डेको UniProt मानव डेटाबेस (या अन्य उपयुक्त प्रजातियों-विशिष्ट डेटाबेस) के खिलाफ गलत डिस्कवरी दर (एफडीआर) की गणना करने के लिए अपुष्ट डेटा कनवर्ट करें ।
  3. दोनों अग्रदूत और टुकड़ा आयनों के लिए एक 10 पीपीएम जन सहिष्णुता का उपयोग करके खोजों प्रदर्शन । 2 अधिकतम याद दरारें, 3 पेप्टाइड प्रति अधिकतम संशोधन साइटों के साथ पूरी तरह से tryptic प्रतिबंध के लिए अंय खोज मापदंडों सेट, और के काम एक , बी , और y आयनों के लिए पेप्टाइड्स स्कोर । Lys अवशेषों और एन टर्मिनी पर टीएमटी टैग के लिए स्थिर संशोधनों सेट (+ २२९.१६२ डीए) और Cys अवशेषों के carbamidomethylation (+ ५७.०२१ डीए) । सेट गतिशील संशोधनों से मुलाकात की ऑक्सीकरण (+ १५.९९४ डीए) है, जो एक आम पेप्टाइड नमूना हैंडलिंग से जिसके परिणामस्वरूप विरूपण साक्ष्य है शामिल हैं ।
  4. निंनलिखित मानदंडों के आधार पर फ़िल्टर डेटा: 7 एमिनो एसिड ंयूनतम पेप्टाइड लंबाई, m/z सटीकता ( जैसे , 5 पीपीएम), और मिलान स्कोर (जंमू स्कोर और deltaCn) । पेप्टाइड लंबाई, trypticity, और प्रभारी राज्य के अनुसार समूह पेप्टाइड्स.
  5. 1% से नीचे प्रोटीन एफडीआर को कम करने के स्कोर मिलान द्वारा फ़िल्टरिंग के एक अतिरिक्त स्तर का उपयोग करें । एक एकल वर्णक्रमीय गिनती द्वारा की पहचान की प्रोटीन एक उच्च मिलान स्कोर की आवश्यकता होती है.
  6. एक प्रोटीन परिवार के कई सदस्यों द्वारा साझा पेप्टाइड्स के लिए, 1 समूह में मिलान प्रोटीन सदस्यों क्लस्टर.
    नोट: बचत सिद्धांत के अनुसार, समूह प्रोटीन द्वारा आवंटित पेप्टाइड्स और अन्य प्रोटीन अद्वितीय पेप्टाइड्स द्वारा मिलान की सबसे अधिक संख्या के साथ प्रतिनिधित्व किया है < सुप वर्ग = "xref" > १ .
  7. Quantitate प्रोटीन सभी मिलान पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मैचों (PSMs) में एक कूद सॉफ्टवेयर सुइट में निर्मित कार्यक्रम का उपयोग करके रिपोर्टर आयन की गिनती संक्षेप द्वारा ।
  8. प्रत्येक स्वीकृत PSM के लिए
  9. , निकालें और लेबलिंग रिएजेंट और लोडिंग पूर्वाग्रह के isotopic वितरण के अनुसार टीएमटी रिपोर्टर आयन की तीव्रता को सही करें, जिसकी गणना ग्लोबल PSM quantitation डेटा से की जाती है । quantitation.
  10. के दौरान यूज़र-डिफ़ाइंड थ्रेशोल्ड के साथ निंन तीव्रता और उच्च नॉइज़ स्तर के साथ फ़िल्टर PSMs
  11. प्रत्येक रिपोर्टर आयन और सभी 10 रिपोर्टर आयनों के औसत के बीच एक रिश्तेदार संकेत की गणना । पहचाने गए प्रोटीन के लिए PSMs के सापेक्ष संकेतों का योग । इसी प्रोटीन में शीर्ष 3 PSMs की औसत रिपोर्टर आयन तीव्रता गुणा करके निरपेक्ष संकेतों के लिए इन रिश्तेदार संकेतों को परिवर्तित.
  12. सही हस्तक्षेप के लिए एक के बाद एमएस गणनात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करें । यह मानते हुए कि वाई 1 आयन तीव्रता रिपोर्टर आयन तीव्रता के लिए आनुपातिक है, स्वच्छ स्कैन से रैखिक संबंध की गणना और शोर स्कैन में दूषित y1ion तीव्रता से हस्तक्षेप के स्तर प्राप्त < सुप वर्ग = "xref" > २३ .
    नोट: टीएमटी-लेबल tryptic पेप्टाइड्स के लिए, K-टीएमटी और आर अवशेषों y 1 आयनों के 2 प्रकार (३७६.२७५७४ दा और १७५.११८९५ दा, क्रमशः) MS2 स्कैन में कर रहे हैं । यदि केवल 1 y 1 आयन का पता लगाया है और पहचाने गए पेप्टाइड के अनुरूप है, तो MS2 क्लीन स्कैन समझा जाता है (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए ). अगर दोनों y1ions का पता चल जाता है तो MS2 का शोर स्कैन समझा जाता है ।
  13. आगे विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के लिए प्रोटीन quantitation मूल्यों का निर्यात । pairwise तुलना या विचरण के विश्लेषण का उपयोग करने के लिए प्रोटीन है कि अंतर व्यक्त कर रहे है की पहचान ।
< p class = "jove_title" > 7. ms डेटा मांयता

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: एमएस डेटा की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, कम 1 सत्यापन की विधि समय लेने वाले जैविक प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले किया जाना चाहिए ।

  1. मैंयुअल रूप से ब्याज की एमएस/ms स्पेक्ट्रा की जांच करने के लिए पेप्टाइड अनुक्रम और टीएमटी रिपोर्टर आयन quantitation.
  2. मांय
  3. एमएस परिणाम की पुष्टि करने के लिए ज्ञात प्रोटीन quantitation डेटा का उपयोग करें ।
  4. एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण के साथ प्रोटीन परिवर्तन की जाँच करें ( जैसे , पश्चिमआरएन ब्लाटर और immunohistochemistry एनालिसिस).
  5. रासायनिक रूप से ब्याज की पेप्टाइड्स को संश्लेषित करते हैं और देशी पेप्टाइड्स की पहचान की पुष्टि करने के लिए आंतरिक मानकों के रूप में उनका उपयोग करते हैं ।
    नोट: उनके एमएस/एमएस पैटर्न और अवधारण समय के दौरान नियंत्रण रेखा-ms/एमएस समान होना चाहिए ।
  6. एक लक्षित एमएस दृष्टिकोण के साथ प्रोटीन परिवर्तन सत्यापित करें ।

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Representative Results

हम पहले से वर्णित पार प्रजातियों पेप्टाइड मिश्रण का इस्तेमाल किया पूर्व एमएस आंशिक सहित 3 प्रमुख प्रोटोकॉल चरणों में अनुपात संपीड़न के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, एमएस सेटिंग्स, और बाद एमएस सुधार23. पूर्व एमएस अंश मूल्यांकन और बुनियादी पीएच RPLC और अंलीय पीएच RPLC का एक संयोजन का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था । पोस्ट-एमएस विश्लेषण के लिए केवल प्रजाति-विशिष्ट पेप्टाइड्स पर विचार किया गया । हम इस हस्तक्षेप मॉडल का इस्तेमाल किया MS2 आइसोलेशन विंडो, ऑनलाइन एलसी संकल्प, ऑनलाइन अंलीय पीएच RPLC की मात्रा लोड हो रहा है, और ऑफलाइन उच्च पीएच RPLC के संकल्प सहित नियंत्रण रेखा में पैरामीटर की एक संख्या की जांच करने के लिए (संदर्भ में चित्रा 3 देखें 29).

ऑफ़लाइन नियंत्रण रेखा के दौरान समाधान को बदलने के लिए, हम isobaric लेबल पेप्टाइड्स में ३२० भिन्न, और फिर अलग-अलग पावर को समायोजित करने के लिए एक साथ संयुक्त चयनित भिन्न करता है । ऑफ़लाइन नियंत्रण रेखा रिज़ॉल्यूशन एकत्रित भिन्न सबसेट (1, 5, 10, 20, ४०, ८०, और ३२०) की एक संख्या का उपयोग करते हुए, हस्तक्षेप के स्तर की निगरानी के द्वारा परीक्षण किया गया था । हमने पाया है कि हस्तक्षेप के स्तर को १६.४% से २.८% से धीरे से कम हुई है, यह दर्शाता है कि ऑफ़लाइन नियंत्रण रेखा के दौरान व्यापक विभाजन कुछ हद तक सह eluting पेप्टाइड्स की समस्या को दूर लेकिन पूरी तरह से हटाने के काबिल नहीं था हस्तक्षेप.

अगले, हम हस्तक्षेप पर MS2 अलगाव खिड़की के प्रभाव का मूल्यांकन किया । हम प्रयोग किया है कि हस्तक्षेप लगभग अलगाव खिड़की के आकार के लिए आनुपातिक था, पिछले अध्ययन के साथ समझौते में निर्धारित29,30। उदाहरण के लिए, एक 4-गुना अंतर विंडो आकार (१.६ करने के लिए ०.४ दा) के परिणामस्वरूप एक ~ 4-निष्कर्ष स्तर के अंतर गुना (१४.४% से ३.७%) । हम भी एमएस विश्लेषण के लिए कॉलम पर इष्टतम लदान राशि निर्धारित किया है और इस जानकारी का उपयोग करने के लिए आगे हस्तक्षेप नकारना । हमने ९.४% से ३.३% तक के व्यवधान का नमूना उचित मात्रा में लोड करके घटाया । बहुत अधिक नमूना लोड हो रहा है31 विस्तार शिखर और इसलिए हस्तक्षेप स्तर बढ़ाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कम प्रोटीन quantitation सटीकता में जिसके परिणामस्वरूप. अंत में, हम ढाल लंबाई (1, 2, और 4 एच) बदलकर और एक लंबे कॉलम (~ ४५ सेमी) का उपयोग करके ऑनलाइन RPLC संकल्प अनुकूलित । हमने पाया है कि एक 4-h ढाल लगभग हस्तक्षेप समाप्त (०.४%), लेकिन यह भी साधन समय जोड़ा । अनुकूलित मापदंडों एक संकीर्ण अलगाव विंडो (०.४ डीए), ~ १०० नमूने के एनजी कॉलम पर लोड पता चला, और midlevel अंश (~ ४० x 2 एच, ३.३ दिन) । हम यह भी पता चला है कि एक कंप्यूटर के बाद आधारित एमएस सुधार रणनीति हम मात्रात्मक परिशुद्धता जब प्रोटीन अनुपात का निर्धारण (चित्र बी) का उपयोग करके ।

हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि अनुकूलित नियंत्रण रेखा के उपयोग-एमएस पैरामीटर और पोस्ट एमएस सुधार एक पूरी तरह से proteomic प्रोफ़ाइल प्रदान कर सकते है और वस्तुतः हस्तक्षेप है कि अक्सर प्रोटीन quantitation के लिए isobaric लेबलिंग तकनीक द्वारा उत्पादित है को समाप्त ।

Figure 1
चित्र 1: टीएमटी-नियंत्रण रेखा/lc-ms/ms द्वारा पूरे-proteome की रूपरेखा विश्लेषण की योजना । दस जैविक नमूनों लीजड, पचा रहे थे, और 10 अलग टीएमटी टैग के साथ लेबल, समान रूप से परित, और ८० भागों में ऑफ़लाइन बुनियादी पीएच रिवर्स चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) द्वारा fractionated । हर दूसरे अंश आगे अंलीय RPLC द्वारा अलग और एक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के साथ ऑनलाइन विश्लेषण किया गया था । एमएस/एमएस रॉ फ़ाइलें संसाधित किया गया और पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान के लिए एक Uniprot डेटाबेस के खिलाफ खोज की । प्रोटीन टीएमटी टैग के सापेक्ष तीव्रता के अनुसार quantitated थे । अंत में, एकीकृत डेटा विश्लेषण के लिए पहचाने गए और quantitated प्रोटीन प्रस्तुत किए गए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: टीएमटी लेबलिंग दक्षता परीक्षा । दोनों टीएमटी-लेबल और उनके इसी unलेबलित नमूनों को नियंत्रण रेखा द्वारा विश्लेषण किया गया था-ms/ फुल टीएमटी लेबलिंग के लिए (A) लेबल्ड पेप्टाइड पीक में पूरी तरह से अनुपस्थित था, (B) जबकि टीएमटी-लेबल्ड पेप्टाइड केवल लेबल के नमूने में मौजूद था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एमएस डेटा संग्रह के बाद हस्तक्षेप हटाने के लिए गणनात्मक दृष्टिकोण. (एक) सभी MS2 स्कैन साफ (बाएं पैनल) और शोर स्कैन (सही पैनल) में विभाजित किया गया था । शोर स्कैन कश्मीर और आर के दोनों y1 आयनों (एक लक्ष्य पेप्टाइड से 1 और दूसरों को प्रदूषित पेप्टाइड्स से) का प्रदर्शन. (B) ई कोलाई पेप्टाइड्स व्यक्तिगत रूप से 3 अलग टीएमटी रिएजेंट के साथ लेबल और 1:3:10 अनुपात में परित थे । लगभग 20 गुना अधिक चूहे पेप्टाइड्स पृष्ठभूमि के रूप में जोड़ा गया । 3 समूहों में ई. कोलाई पेप्टाइड्स के संक्षेप रिश्तेदार तीव्रता से पता चला कि y1 आयन आधारित सुधार टीएमटी के लिए और अधिक सटीक आधारित quantitation है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम 10-plex isobaric लेबलिंग रणनीति के साथ प्रोटीन के quantitation के लिए एक उच्च-प्रवाह प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो कई प्रकाशनों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है12,13,14,३२ . इस प्रोटोकॉल में, हम 1 प्रयोग में 10 अलग जैविक प्रोटीन के नमूनों का विश्लेषण कर सकते हैं । हम नियमित रूप से पहचान और उच्च विश्वास के साथ १०,००० प्रोटीन पर अच्छी तरह से quantitate कर सकते हैं । हालांकि isobaric लेबलिंग प्रोटीन quantitate करने के लिए एक प्रभावी तकनीक है, यह अनुपात संपीड़न है कि मात्रात्मक अशुद्धि के लिए नेतृत्व कर सकते है द्वारा सीमित है । हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग विभिंन रणनीतियों, जैसे नियंत्रण रेखा/नियंत्रण और एमएस/ms सेटिंग्स का अनुकूलन के साथ संयोजन में y1 आयन-आधारित के बाद एमएस सुधार, प्रभावी रूप से सबसे हस्तक्षेप प्रभाव को हटाता है और इसलिए काफी की परिशुद्धता को बढ़ाता है प्रोटीन quantitation.

प्रोटीन quantitation के लिए, कार्यक्रमों की छलांग सुइट तरीकों की एक संख्या में कार्य करता है । हम खरीदे गए एजेंट, जो विक्रेता-प्रदान किए गए प्रमाण पत्र में रिपोर्ट की गई मान से थोड़ा अलग के हर बैच के लिए isotopic नापाक मापा । मापा isotopic नापाक सॉफ्टवेयर कूद में रिपोर्टर आयनों की तीव्रता को सही करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक प्रोटीन आमतौर पर विभिंन निरपेक्ष तीव्रता है कि ionization दक्षता के रूप में कई कारकों से प्रभावित कर रहे है के साथ बहुत से PSMs द्वारा quantitated है । क्योंकि कारकों के प्रभाव अज्ञात है, मास स्पेक्ट्रा एक टीएमटी परख में रिपोर्टर आयनों के केवल रिश्तेदार बहुतायत से पता चलता है । रिपोर्टर आयनों के सापेक्ष बहुतायत सभी 10 पत्रकारों की औसत तीव्रता से प्रत्येक रिपोर्टर आयन की तीव्रता विभाजित करके गणना कर रहे हैं । सबसे अच्छा प्रतिनिधि "प्रोटीन के पूर्ण संकेत" प्रदान करने के लिए, हम 3 PSMs के सापेक्ष तीव्रता प्रोटीन से उच्चतम पूर्ण तीव्रता के साथ एक औसत की गणना और सबसे मजबूत निरपेक्ष गहनता का अनुमान करने के लिए निरपेक्ष का औसत प्रोटीन के संकेत । हमने इन चरणों को फिर से स्केलिंग के रूप में परिभाषित किया । y1 सुधार किसी भी टीएमटी परख के लिए सार्वभौमिक रूप से लागू होता है; हालांकि, कुछ मामलों में हम एमएस/ms स्पेक्ट्रा y1 आयन युक्त के साथ पेप्टाइड्स के लिए सही नहीं कर सका । हालांकि, हमने पाया है कि ~ स्पेक्ट्रा के ९०% दोनों lysine और arginine से y1 आयनों है । सीओ eluting पेप्टाइड्स कि एक ही सी-टर्मिनल अवशेषों की पहचान की पेप्टाइड के रूप में है के कारण हस्तक्षेप के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, अनुमानित हस्तक्षेप स्तर अनिवार्य रूप से दोगुनी और सुधार के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस धारणा अनुभवजंय सबूत है कि हम कई टीएमटी प्रयोगों पर एकत्र किया है पर आधारित था, जिसमें हम y के लिए एक ही तीव्रता स्तर में मनाया1 K-और आर युक्त पेप्टाइड्स ।

हस्तक्षेप क्या हम इस प्रोटोकॉल, ऐसे MS3 multinotch दृष्टिकोण के रूप में वर्णित है के अलावा अंय कई तरीकों से कम किया जा सकता है । इन पद्धतियों के सभी वैध है और उनके व्यक्तिगत गुण हैं । अंततः, इस्तेमाल किया पद्धति सहित कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है, लेकिन नमूना राशि तक ही सीमित नहीं है, साधन उपलब्धता (यानी, साधन प्रकार और समय नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक), वांछित परिणाम (यानी, की संख्या पहचाने गए प्रोटीन), और quantitation सटीकता की जरूरत है ।

सबसे सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह प्रोटोकॉल भर में गुणवत्ता नियंत्रण कदम ध्यान महत्वपूर्ण है । ये नमूना quantitation के लिए सही मानकों का उपयोग शामिल है (उदा., BSA है कि एमिनो एसिड विश्लेषण आया है), टीएमटी रिएजेंट की लेबलिंग दक्षता परीक्षण, trypsin पाचन की दक्षता का निर्धारण, एक premix अनुपात परीक्षण प्रदर्शन सभी 10 नमूनों के बराबर मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, और किसी भी लोडिंग पूर्वाग्रह को सही करने के लिए एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना । मामलों में, जिसमें एक ज्ञात प्रोटीन या एकाधिक प्रोटीन व्यक्तिगत नमूनों के बीच अभिव्यक्ति परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं, यह प्रारंभिक सेल lysis कि इन परिवर्तनों मौजूद हैं और पता लगाया जा सकता है की पुष्टि करने के बाद पश्चिमी दाग विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह सुनिश्चित करता है कि नमूने जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व करने का परीक्षण किया जा करने के लिए और समय, पैसा बचाता है, और पूरे टीएमटी प्रोटोकॉल बाहर ले जाने से पहले प्रयास । यदि एक विशेष नमूना कुछ प्रोटीन (ओं) व्यक्त नहीं की उंमीद है, यह भी पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने से पहले lysis के बाद उनकी अनुपस्थिति की पुष्टि महत्वपूर्ण है । अधिकांश प्रोटीन 10 जैविक नमूनों में परिवर्तन नहीं करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं जब premix अनुपात परीक्षण किया जाता है. हम भी keratins जैसे दूषित प्रोटीन ज्ञात हटा दिया है, तो वे नकारात्मक हमारे सुधार को प्रभावित नहीं करेगा । हमारे quantitation विधि pipetting त्रुटियों, आदि से हुई हो सकता है कि किसी भी त्रुटि के लिए सही. जब संभव हो, हम विशेष रूप से पिपेट खंड 5 µ l से अधिक त्रुटियों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया । हम यह सुनिश्चित करने के लिए कि हम एक सटीक 1:1 मिश्रण प्राप्त इस premix परीक्षण के कई दौर प्रदर्शन किया । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि हम premix अनुपात परीक्षण के इस प्रकार के प्रदर्शन नहीं किया जब प्रोटोकॉल के लिए immunoprecipitation नमूनों का उपयोग कर, जैसा कि हम प्रोटीन का एक बड़ा प्रतिशत को बदलने की उंमीद थी । ऐसे मामलों में premix टेस्ट से नतीजे टेढ़े होंगे । यह भी किसी भी प्रयोग के सच है जिसमें 10 नमूनों में से कम से 1 के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति (खाली सदिश, proteasome अवरोध, आदि) में बहुत भिंन होने की उंमीद है ऐसे मामलों में, यह अत्यधिक quantitation की सुविधा के लिए दोहराने का उपयोग की सिफारिश की है सांख्यिकी. हम सामांयतया करने की अनुशंसा करते है 3 के नमूने के इन प्रकारों के लिए प्रतिकृति । अंततः, प्रतिकृति की संख्या प्रत्येक नमूने की अपेक्षित परिवर्तनशीलता पर आधारित है ।

कुछ ठीक ट्यूनिंग के साथ, इस मजबूत प्रोटोकॉल एक सामान्य proteomic पाइपलाइन के रूप में प्रोटीन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, प्रोटीन रास्ते, रोग प्रगति, और अन्य जैविक कार्यों. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है के लिए गहरी प्रोटीन कवरेज प्राप्त करने और ठहराव के दौरान अनुपात दमन को कम । मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को आसानी से quantitate प्रोटीन posttranslational संशोधनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे फास्फारिलीकरण, ubiquitination, और acetylation३३,३४। व्यापक प्रोटियोमिक् परियोजनाओं के इन प्रकार के जीनोमिक्स, transcriptomics के साथ एकीकृत किया जा सकता है, और संभवतः एक प्रणालियों जीव विज्ञान दृष्टिकोण के लिए जैविक प्रणालियों को समझने और आणविक तंत्र के उपंयास खोजों को सुविधाजनक बनाने के लिए metabolomics, रोग में, और चिकित्सीय लक्ष्य13,28,३५,३६,३७,३८

हम सही quantitating पूरे सेल या ऊतक lysates से १०,००० से अधिक प्रोटीन के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है । हम इस विधि को व्यापक रूप से कई जैविक प्रणालियों के लिए लागू होने की उंमीद है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उपयोगी चर्चा के लिए अंय सभी लैब और सुविधा के सदस्यों को धंयवाद । इस काम को नी H पलाश R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, और ALSAC ने आंशिक रूप से समर्थन दिया था । एमएस विश्लेषण NIH कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30CA021765 द्वारा आंशिक रूप से समर्थित सेंट झड बच्चों के शोध अस्पताल प्रोटियोमिक् सुविधा में किया गया था । लेखकों ने पांडुलिपि के संपादन में मदद के लिए निशा Badders का धन्यवाद किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

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