Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза белок часто бывает загрязнена бактериальной нуклеиназы во время очистки. Этот метод определяет нуклеиназы загрязнения и удаляет его из окончательной подготовки фермента.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Интегразы (IN) белок ретровируса прототип пенистый вируса (PFV) является фермент модель для изучения механизма ретровирусной интеграции. По сравнению с в других ретровирусов, PFV в более растворимые и более пригодным для экспериментальных манипуляций. Дополнительно он чувствителен к ингибиторам в клинически значимых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1), предполагая, что каталитического механизма в PFV похож на что из ВИЧ-1 дюйма в катализирует ковалентных присоединения вирусных комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) целевой ДНК в процесс называется стренги передачи. Эта реакция передачи стренги вводит Никс ДНАО цели. Анализ интеграции продуктов реакции может быть confounded с присутствием nucleases, которые аналогичным образом Ник ДНК. Было показано, что бактериальные нуклеиназы совместно очищают с рекомбинантным PFV IN, выраженная в Escherichia coli (E. coli). Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать в PFV от загрязняющих нуклеиназы хромотографией сродства гепарина. Фракций легко проверяются для нуклеиназы загрязнения с supercoiled плазмиды и электрофорез геля агарозы. PFV IN и загрязняющих нуклеиназы отображения альтернативных сходство для гепарина sepharose, позволяя нуклеиназы бесплатная подготовка рекомбинантных PFV в подходит для массового анализа биохимических или одной молекулы интеграции.

Introduction

Биохимические и одной молекулы исследования взаимодействий протеина с ДНК требуют исключительно чистым рекомбинантных белков. Заражение nucleases от бактерий может скрывать результаты этих анализов. Загрязняющие нуклеиназы были найдены в подготовке рекомбинантных белков кислород мусорщик protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) и прототип пенистый вирус (PFV) интегразы (IN) изолированы от Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.

Антиретровирусного лечения интеграции анализов полагаются на преобразование supercoiled ДНК одноцепочечным или линейные продукты как мера в деятельности4. Во время сотовой инфекции в присоединяется к два концы вирусный cDNA принимающей хроматина5. Каждый конец присоединения реакции называется стренги передачи. Анализы из рекомбинантных в деятельности могут вступать два ДНК олигомеров подражая вирусный cDNA заканчивается к целевому ДНК в согласованной интеграции реакции4,5,6,,7,8. В качестве альтернативы рекомбинантных в могут вступать только один конец ДНК в9,реакция-физиологически соответствующих половину сайта интеграции10. Когда supercoiled плазмида ДНК является целью интеграции, согласованной интеграции, которую продукты линеаризованных ДНК и половину сайта интеграции продукты расслабленной кругах. Эти продукты реакции идентифицируются по их относительной мобильностью во время электрофореза геля агарозы1. Если рекомбинантных в загрязняющих Нуклеаза, будет ложное расслабленной круги или возможно линеаризованного плазмида смешения экспериментальные результаты. Вирусной ДНК олигомеров может называться дневно окончательно определить интеграции продуктов, в отличие от нуклеиназы продуктов. Однако в значительной степени способствует supercoiled ДНК целей; любые потери supercoiled плазмиды расслабленной круги или линейной ДНК, загрязняющих нуклеиназы может исказить результаты и интерпретации данных11. Таким образом важно, чтобы удалить бактериальный nucleases из антиретровирусные препараты.

В PFV имеет различные сродство sepharose гепарина, по сравнению с бактериальным нуклеиназы1. PFV IN и нуклеиназы могут быть разделены линейного градиента элюирование с гепарином sepharose. Нуклеаза не обнаруживается легко ультрафиолетового (УФ) поглощения пика 280 Нм или аналитических натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE). Вместо этого нуклеиназы обнаруживается нуклеиназы деятельности пробирного, используя преобразование supercoiled плазмид в расслабленной круги или линейные продукты. Каждая фракция после гепарина sepharose хроматографии проверяется на нуклеиназы деятельности. В PFV и загрязнителем нуклеиназы имеют никакой разницы в сродство для моно-Q анионообменных смол. Существует небольшая разница в сродство для моно-S катиона смолы. Однако моно-S резолюции бактериальных нуклеиназы и PFV в не позволит эффективное разделение белков. В конечном итоге очищение сродства sepharose гепарина предлагает лучшее разделение бактериальной нуклеиназы PFV в и имеет то преимущество, неограниченные загрузки тома.

Тестирование для загрязнения нуклеиназы активности могут быть адаптированы для других белков. Протеин интереса, вероятно, будет иметь альтернативные соответствия характеристик чем PFV IN; разница в обязательную силу характеристики протеина интереса и загрязняющими нуклеиназы должна определяться эмпирически. Эта методология для определения нуклеиназы загрязнения могут быть адаптированы к другим смолам, включая моно-S катион или моно-Q анионообменных смол. Аффинити и ионообменных смол может предложить надежный метод для изоляции рекомбинантных белков интересов от загрязнения nucleases без ограничений на объем белка во время хроматографии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. побудить PFV в выражении E. coli

  1. Добавить 1 мкл PFV в выражение плазмида (10 нг/мкл) 20 мкл pLysS E. coli BL21(DE3) (20 мкл Алиготе коммерчески доступных клеток имеет > 2 х 106 кое/мкг плазмида) в 1,5 мл. Смешайте нежно палец нажатие или стряхивая трубки. Инкубируйте на льду 5 мин.
    1. Тепловой шок для ровно 30 s в 42 градусов вода ванна и затем немедленно вернуться к лед на 2 мин.
    2. Добавьте 80 мкл комнатной температуре супер оптимального бульон с catabolite репрессий (SOC) средства массовой информации. Инкубируйте 1 ч при 37 ° c с 225 оборотов в минуту (об/мин) встряхивания.
    3. Тарелка 25 мкл смесь на 100 мм x 15 мм Петри, содержащих 25 мл Лурия бульон (LB) агар (агар LB 1 Л: bacto Триптон 10 g, 10 g NaCl, 5 g дрожжевой экстракт, 15 g агар) и ампициллин 100 мкг/мл (раствор 100мг/мл).
    4. Пластина оставшиеся 75 мкл трансформированных клеток на второй идентичные пластины. Инкубировать пластины с крышками вниз ночь на 37 ° C.
  2. Извлечение пластин превращается E. coli. Использовать единую колонию для инокуляции 3 мл фунтов (1 Л LB: 10 г bacto Триптон, 10 г NaCl, 5 г дрожжей экстракт) дополняется 100 мкг/мл ампициллин в трубы полипропиленовые культуры круглым дном 14-мл. Инкубируйте ~ 8 ч при 37 ° c встряхивании 225 об/мин.
    1. Добавьте 3 мл культуры до 50 мл LB, дополненная 100 мкг/мл Ампициллин и хлорамфеникол 34 мкг/мл (раствор 34 мг/мл) в 250 мл колбу Эрленмейера. Инкубируйте культуры на ночь при 37 ° C встряхивании 225 об/мин.
    2. Передача по 53 мл культуры LB 1 Л, 100 мкг/мл Ампициллин и 34 хлорамфеникол мкг/мл в колбу Эрленмейера 4 Л. Инкубируйте при 37 ° C встряхивании 225 об/мин.
    3. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600OD) культуры периодически. Первоначально проверьте культуры ОД600 каждый час. Как культуры достигает желаемого ОД600, проверьте каждые 15 мин не зарастают. Расти культура ОД600 от 0,9 до 1,0. Передать ледяной ванне колбу и вихрем для снижения температуры культуры.
  3. Передача 1 мл культуры 1,5 мл трубки для последующего анализа, денатурации анализ SDS-PAGE.
    1. Пелле клетки в 1,5 мл центрифугированием за 1 мин в отцентрифугировать в 14.000 x g при комнатной температуре. Выбросите супернатант. Ресуспензируйте гранулы в 150 мкл фосфатный буфер (PBS), закупорить. PBS может быть с или без CaCl2 и MgCl2.
    2. Добавить 150 мкл 2 x буфер образца SDS-PAGE (150 мм трис-HCl, pH 6.8, 1,2% SDS, глицерина 30%, 15% β-меркаптоэтанол (βME), 0.0018% бромфеноловый синий) и тщательно перемешать, накапайте или вихря. Кипятить 3 мин магазина при-20 ° C.
  4. Добавить к бактериальной культуры: конечная концентрация 0,25 мм изопропил бета D-тиогалактопиранозид (ИПТГ, Стоковый раствор 0,25 М) и 50 мкм ZnCl2 (50 мм раствор). IPTG индуцирует экспрессию гена PFV в от промоутера T7 и ZnCl2 добавляется в качестве дополнения для правильного складывания домен палец амино терминала цинка в PFV дюйма инкубировать культуры при 25 ° C сразу же встряхивании в 225 rpm для 4 ч. передать колбу ледяной бане. Сохраните 1 мл культуры для анализа SDS-PAGE после тот же протокол, как указано выше в разделе 1.3.
  5. Передать бактериальной культуры соответствующего размера центрифуги бутылки. Например 1 Л культуры могут быть переданы четыре коническое дно Стерильные одноразовые 250 мл полипропиленовые бутылки. Спиновые бутылки в охлажденных настольная центрифуга на 3000 x g 20 мин на 4 градусов. Выбросите supernatants, налив.
    1. Ресуспензируйте все гранул от 1 Л бактериальной культуры в общем объеме 25 мл (6,25 мл за бутылку) холодной PBS (с или без CaCl2 и MgCl2), закупорить. Объединить и передать один тюбик 50 мл конические бактериальных суспензий. Спина в охлажденных центрифуги на 3000 x g 20 мин при 4 ° C. Отказаться от супернатанта, заливки или закупорить.
  6. Ресуспензируйте бактериальных Пелле в буфере ресуспендирования 10 мл (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 500 мм NaCl и 500 мкм phenylmethylsulfanoxide (PMSF) ингибитор протеазы), закупорить. Оснастки заморозить гранулы, поставив трубку в Дьюара с жидким азотом, достаточно потопить Тюбик 50 мл. Осторожно извлеките трубку из жидкого азота и хранить при температуре-80 ° C.
    Примечание: Бактериальные гранулы могут храниться несколько месяцев при температуре-80 ° C. Мы видели без потери активного белка после хранения-80 ° C для двух лет.
  7. Анализировать образцы предварительно индукции и после индукции, 8,3 см шириной, 7,3 см высотой, 0,75 мм, толщиной SDS-PAGE гели с 1,5 мл 6% полиакриламида укладки слой (125 мм трис-HCl, pH 6.8, 6% акриламида, 0.1% SDS, персульфат аммония 0,1%, 0,001% TEMED) и 3,5 мл 10% Полиакриламид урегулирования слой (375 мм трис-HCl, рН 8,8, 10% акриламида, 0.1% SDS, персульфат аммония 0,1%, 0,001% TEMED)12.
    1. После заливки штабелируя гель, вставьте 10 хорошо гребень. Когда Гель полимеризуется, собрать аппарат страницы и добавить достаточно SDS-PAGE идущий буфер (25 мм трис, глицин 192 мм, 0,1% SDS).
    2. Загрузите 10 мкл каждого образца и 4 мкл prestained белка стандартов. Запуск на 16,5 V/см до тех пор, пока краска фронта достигает нижней части геля, примерно 60 мин.
    3. Разбирать гель пластины и передачи гель пластиковое корыто. Добавьте Кумасси синим окрашивание раствора (0,1% Кумасси блестящий синий R-250, 40% метанола, 10% уксусной кислоты) щедро покрытия гель и пятно на 20 мин при комнатной температуре.
    4. Удаление окрашивание раствора путем заливки и заменить Отмойте решение (40% метанола, 10% уксусной кислоты) до тех пор, пока легко видны полосы. Удаление destaining решения, поливая и заменить деионизированной водой. В PFV должно быть легко идентифицированы в образце после индукции. В PFV с тегом hexahistidine имеет молекулярный вес 47374 да.
    5. Если в PFV не отображается, повторите индукции, начиная с другой колонии от одной из пластин преобразования.

2. Хромотография сродства никеля

  1. Размораживание одного бактериальных гранул на льду.
    Примечание: Это займет значительное время (примерно 2-3 ч). Когда гранулы размороженным для суспензии клеток, добавьте дополнительные 500 мкм PMSF (Стоковый раствор 100 мм).
  2. Держите тюбик 50 мл бактерий навозной жижи на льду. Sonicate бактерий на 30% амплитуды для 30 s (1 s, 1 s выкл) на Пелле, производный от 1 Л культуры с помощью sonicator с рогом био диаметром 0,5 дюйма с диаметром 0,125 дюйма коническая microtip, частота 20 кГц и максимальная мощность 400 Вт.
  3. Передать образец клеток холодной ультрацентрифуга трубки. Использование поликарбоната бутылка сборок (диаметр 25 мм, 89 мм высота) совместимы с фиксированным углом ротором типа 60 Ti. Роторы и альтернативные труб может использоваться если достичь той же силой гравитации. Спиновые 120000 g x 60 мин при 4 ° C. Должно быть очевидным Пелле. Супернатант может иметь желтый цвет.
  4. Передача супернатант лить или закупорить холодной 50 мл Конические трубки. Обратите внимание, объем; Этот объем должен быть примерно объем буфера ресуспендирования до замораживания оснастки. Если супернатант вязкой, он может загрязнены бактериальной ДНК, которые могут засорить столбце хроматографии. В этом случае повторите ultracentrifugation в гранулах бактериальной ДНК.
  5. Подготовка 500 мл буфера (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 500 мм NaCl, 500 мкм PMSF) и 500 мл буфера B (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 500 мм NaCl, 500 мкм PMSF, имидазола 200 мм).
    Примечание: В настоящем Протоколе, держите быстро белок жидкостной хроматографии (ПСОК) системы, все буферы и образца при температуре 4 ° C в холодной комнате.
    1. Буферы стерильного фильтра A и B с 0,2 мкм одноразовые фильтр единицы. В зависимости от системы ПСОК Промойте насос A и B насос с буфера A и B буфера, соответственно. B буфера потока 90% буфера A и 10% через систему до тех пор, пока проводимости и чтений УФ стабилизации. Максимальный расход будет зависеть от этого инструмента; Используйте скорость потока 5 мл/мин с лимитом максимальное давление 1,0 МПа.
  6. Подготовить 110 мм длиной, диаметр 5 мм ПСОК столбец с 1,5 мл заряженных никель смолы (максимальная связывающая способность 50 мг/мл, максимальное давление 1 МПа). Столбец может быть готовить в день до очистки и хранить при 4 ° c.
  7. Подключите столбец к ПСОК инструмента. Сбалансировать столбец с 20 мл 90% буфера A и 10% буфера B (имидазол 20 мм) при скорости потока 0,5 мл/мин с лимитом максимальное давление 0.5 МПа. Инструмент следует сбор данных в реальном времени проводимости и УФ поглощения в 280 Нм (280). Проводимость и УФ чтений должна стабилизироваться. Если эти показания не стабилизировалась, продолжают буферы потока через колонку до тех пор, пока они являются стабильными.
  8. Загрузите образец протеина (~ 10 мл на гранулах) в столбце со скоростью потока 0,15 мл/мин с лимитом максимальное давление 0.5 МПа. Потока и столбец давление остается неизменным на протяжении очистки. Сбор через поток в 50 мл трубки.
    1. Промойте колонку с 20 мл 10% и 90% A буфера Buffer б. собирать мыть в 50 мл трубки. Элюировать белки с 20 мл линейным градиентом от 10% до 100% буфера B (20 мм до 200 мм имидазола).
    2. Наконец промойте колонку с 100% 5 мл буфера B (200 мм имидазола). Собирать градиента и окончательной стирки в фракций 0,27 мл.
  9. Объединить 15 мкл пример буфера 2 x SDS-PAGE с 15 мкл потока через, мыть и пик A280 фракции. Сварите образцы для 3 мин.
    1. Подготовьте два 10%, что Гели SDS-PAGE, как описано выше в шаге 1.6 за исключением с 15 хорошо Расчески. Загрузите 10 мкл каждого образца для гелей и 4 мкл prestained белка стандартов. Запуск, пятно и анализировать гели, как описано в шаге 1.6.
    2. Комбинат фракций, которые содержат почти чисто PFV в основе визуального осмотра. Измерьте объем закупорить, обычно 8-10 мл.
    3. Используя спектрофотометр, А280 комбинированных фракций измерить и рассчитать общее количество белка в PFV; Наш типичный урожайность-~ 10 мг на Л индуцированных культуры. Коэффициент вымирания в PFV с тегом hexahistidine — 59360 см-1 М-1.
  10. Чтобы удалить тег hexahistidine, дополнение в PFV 10 мм Дитиотреитол (DTT, Стоковый раствор 1 М) и 0,1 мм ЭДТА, рН 8,0 (0,5 М раствор). Добавьте 15 мкг человека риновирусов (ВСР) 3C протеазы на мг PFV дюйма инкубировать на 4 ° c на ночь. Расщепление уменьшает PFV в молекулярной массой от 47374 да 44394 да и может быть проверена путем анализа SDS-PAGE 10%.

3. гепарин аффинной хроматографии

  1. Подготовка 250 мл буфера C (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм DTT, 0,1 мм ЭДТА, 500 мкм PMSF) и 250 мл буфера D (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм DTT, 0,1 ЭДТА, 500 мкм PMSF, 1 M NaCl).
    Примечание: В настоящем Протоколе, системы ПСОК, буферов и образцы хранятся в холодной комнате на 4 градусов.
    1. Стерильные фильтр буферов C и D с 0,2 мкм одноразовые фильтр единицы. В зависимости от системы ПСОК Промойте насос A и B насос с буфера C и D буфера, соответственно. D буфера потока 20% и 80% буфера C через систему до тех пор, пока проводимости и чтений УФ стабилизации. Максимальный расход будет зависеть от этого инструмента; Мы регулярно использовать скорость потока 5 мл/мин с лимитом максимальное давление 1,0 МПа.
  2. Подготовка 80 мм длиной, 5 мм диаметр ПСОК столбец с 1 мл раствора гепарина sepharose смолы (максимум, связывающая способность 2,0 мг говядину антитромбин III мл смолы; максимальное давление 1,4 МПа). Столбец может быть готовить в день до очистки и хранить при 4 ° C. Подключите столбец к ПСОК инструмента.
    1. Сбалансировать столбец с 20 мл с лимитом максимальное давление 1 МПа 80% буфера C и 20% буфера D (200 мм NaCl) со скоростью потока 0,5 мл/мин. Инструмент следует сбор данных в реальном времени проводимости и УФ поглощения в 280 Нм (280). Проводимость и УФ чтений должна стабилизироваться. Если эти показания не стабилизировалась, продолжают буферы потока через колонку до тех пор, пока они являются стабильными.
  3. Снижения концентрации NaCl образце PFV в до 200 мм, добавив 1.5 томов буфера C. Например добавьте 15 мл буфера C дюйма PFV 10 мл Наш общий объем составляет обычно ~ 25 мл.
  4. Нагрузки разреженных PFV в образец столбце sepharose гепарина на 0,5 мл/мин скорость потока с максимального давления ограничение 1,0 МПа. Потока и столбец давление остается неизменным на протяжении очистки. Сбор через поток в 50 мл Конические трубки.
    1. Мыть столбец с 20 мл 80% буфера C и 20% буфера D (200 мм NaCl), собирая мыть в 50 мл Конические трубки. Элюировать столбце 30 мл линейным градиентом от 20% до 100% D буфера (200 мм на 1 М NaCl).
    2. Промойте колонку с 5 мл 100% буфера D. сбор градиента и окончательной стирки в 0.37 мл фракций.
  5. Анализ нагрузки, поток через, мыть и фракции 8% SDS-PAGE, как описано в 2.9. В PFV после расщепления hexahistidine тега имеет молекулярный вес 44394 да и коэффициент вымирания остается 59360 см-1 М-1 без hexahistidine тег. Храните все фракции на 4 ° c до завершения анализа нуклеиназы.

4. нуклеиназы пробирного

  1. Выявления гепарина sepharose фракций, которые содержат почти чисто PFV дюйма объединить 3 мкл гепарина фракции и 50 нг 3 КБ supercoiled плазмида ДНК в реакции буфера (10 мм HEPES, рН 7,5, 110 мм NaCl, 5 мм MgSO4, 4 мкм ZnCl2 10 мм DTT) с окончательной объемом 15 мкл. Инкубируйте на 37 градусов за 90 минут включают отрицательный контроль с не PFV дюйма
    1. Остановить реакции с 1 мг/мл протеиназы K (Стоковый раствор 20 мг/мл) и 0,5% SDS (10% раствор). Инкубируйте при 37 ° C, за 1 ч. образцы можно хранить при температуре от-20 ° C для последующего анализа.
  2. Подготовьте 125 мл гель 1% веса в тома (w/v) агарозы 1 x TAE буфера (40 мм трис ацетат, ЭДТА 1 мм) с 0,1 мкг/мл ethidium бромид (раствор 10 мг/мл)13. Растопить агарозы решения и налить в трей литья гель 15 x 10 см. Вставка 15 хорошо гребень с 5 мм шириной, 0,75 мм толщиной скважин. Тонкие скважин дают лучшее разрешение группы, по сравнению с 1,5 мм толщиной скважин. Разрешить гель затвердевают при комнатной температуре.
    1. Погружать гель в 1 x TAE бромидом ethidium 0,1 мкг/мл. Добавьте 3,5 мкл 6 x загрузки краситель (50% глицерина, 0,15% G оранжевый краситель) в реакции пробирного нуклеиназы. Загрузите весь объем для геля. Побегите гель при постоянном напряжении, 10 Вольт на см (100 V) при температуре окружающего воздуха за 1 ч или до тех пор, пока краска передний оранжевый G достигает конца геля.
  3. Сразу же изображение агарозном геле с флуоресцентные сканера, набор для обнаружения бромид ethidium. Линейная ДНК истинный размер 3 КБ, supercoiled ДНК следует запустить быстрее (~ 2 kb), и расслабленной круг ДНК должны выполняться медленнее (~3.5 kb).
    1. С помощью программного обеспечения для анализа изображений, рассчитайте объем пикселей плазмида supercoiled, линейной и расслабленной круг в каждом ряду. Вызовите сумму пиксела томов для этих трех форм ДНК «Всего ДНК» значение и использовать его для вычисления процент линейных и расслабленной кругов. Например, объем пикселей расслабленной кругов делится на общее значение точки ДНК в этом переулке, умножить это число на 100, чтобы определить процент. Фракции, которые содержат загрязняющих нуклеиназы отображения более высокий процент линейных и расслабленной кругов, по сравнению с отрицательного контроля.
  4. Объединить гепарина sepharose фракции, которые не отображают загрязняющих нуклеиназы активности. Dialyze в 10 мм 6-8 кДа молекулярный вес отсечки (MWCO) диализа труб на 4 ° C на ночь против 1 Л 50 мм трис-HCl, pH 7.5, 200 мм NaCl, 50 мкм ZnCl2, 10 мм DTT, 20% глицерина.
  5. Восстановление образце PFV в свободной от нуклеиназы диализа труб. Измерить A280 и рассчитать концентрацию окончательный белка. Алиготе и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить аликвоты-80 ° c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рекомбинатные PFV в часто бывает загрязнена бактериальной нуклеиназы1. Интеграции биохимических анализов зависят от quantitation преобразование supercoiled плазмидной ДНК расслабленной круги и линейные продукты. Присутствие загрязняющих нуклеиназы может привести к ложным количественный этих анализов. Выражение в PFV с тегом hexahistidine наведено в E. coli (рис. 1) и сначала очистить хромотографией сродства никеля (рис. 2). Дроби с почти чисто PFV в объединяются и тег hexahistidine расщепляется, протеазы. Мы определили, что PFV IN и загрязняющих нуклеиназы имеют различные сродства для гепарина sepharose хроматографии (рис. 3)1. В PFV фракции после гепарина sepharose хроматографии инкубируют с supercoiled плазмиду для анализа для расслабленной кругов и линеаризованное плазмида, продуктов нуклеиназы активности (рис. 4). Этот assay позволяет выявление белковых фракций без нуклеиназы (рис. 5). Эти фракции следует объединить, dialyzed и замороженных для дальнейших экспериментов.

Figure 1
Рисунок 1: Индукции PFV в в E. coli . Клетки из культур до (пер. 2) и после (Лейн 3) индукции анализируются на присутствие PFV IN, 47374 ПДР образцы были разделены на 10% SDS-PAGE и витражи с блестящим Кумасси синим. Переулок 1, молекулярный вес маркеры (кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Никель фракций хромотографии сродства. Растворимые бактериальных лизатов были отделены хромотографией сродства никеля. В PFV с тегом hexahistidine был этого eluted с линейным градиентом от 20 мм до 200 мм имидазола. Фракций были оценены на 10% SDS-PAGE и витражи с блестящим Кумасси синим. PFV IN, 47374 Да, очевидна в образце загружены в столбце (нагрузки), но менее очевидна в поток через или мыть. Фракции, которые элюировать в начале градиента имидазола обычно отображения медленнее мобильности загрязнения вблизи 75 кДа, а также некоторые загрязняющие вещества быстрее мобильность на уровне или ниже 25 кДа. При более высоких концентрациях имидазола существует без очевидной загрязнителей и PFV в, как представляется, относительно чистый. В этом примере фракций #33 через #84 были объединены и далее очищенный. Молекулярный вес маркеры (кДа) находятся в левой части каждого геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Гепарин sepharose хроматографии PFV в 1 . После никеля аффинити и протеазы удаление тега hexahistidine был фракционированный PFV в (44394 Da), гепарин sepharose. Белки были этого eluted с линейным градиентом от 200 мм до 1 M NaCl. 8% SDS-PAGE витражи с Кумасси синий были оценены даже фракций #12 до #44. Молекулярный вес маркеры (кДа) находятся в левой части каждого геля. Эти фракции были протестированы для деятельности нуклеиназы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Нуклеаза пробирного гепарина sepharose фракций 1 . Каждая фракция sepharose гепарин был добавлен в supercoiled плазмиды. Часть номеров коррелируют тем показано на рисунке 3. После инкубации нуклеиназы реакции были deproteinated и разделенных агарозы 1% бромидом ethidium. Негативный контроль включают плазмида ДНК с предыдущей очистки дикого типа PFV в известный быть свободным от нуклеиназы (PFV в WT) и не белок (целевой только). Положительный контроль для загрязнения нуклеиназы деятельность является предыдущий очищение каталитически неактивным в PFV, которая как известно загрязняющих нуклеиназы (PFV в D128N). Размер маркеров ДНК приведены в КБ. Указаны supercoiled плазмиды (SC), линейных плазмид (L) и расслабленной круги (RC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Количественный нуклеиназы анализов 1. были отсканированы Гели агарозы и значения пикселей были количественно для supercoiled (SC), линейная (L) и расслабленной круг (RC) полос в каждом ряду. Часть номеров коррелируют тем показано в рисунки 3 и 4. Процентные показатели линейной и расслабленной кругов были рассчитаны с использованием значения пикселов и уравнения показано. Например, пиксел значения полос фракции #12: 817636 supercoiled плазмиды, 50467 линейных плазмид и 112052 расслабленной кругах. Общее значение пиксела ДНК для фракция #12 представляет собой совокупность этих ценностей, 980155. Процент линейной ДНК является 50467 умноженный на 100 для процент и делится на общее значение ДНК, составило 5,1%. Процент расслабленной кругов является 112052 умножить на 100 и делится на общее значение ДНК сложений 11,4%. Линейные и расслабленной круг проценты сумма 16,5%. Отрицательный контроль плазмида ДНК с не белка (не в, нижняя графа) указывает, что эта подготовка плазмида включен 4,4% всего ДНК как линейный или расслабленной круги. Второй отрицательный контроль был предыдущий очищение дикого типа PFV IN (WT), отображаемый 8,6% всего ДНК как линейный или расслабленной круги. Эти два элемента управления полосы указывают уровень фона одноцепочечным или линеаризованного плазмида с подложкой самостоятельно и с PFV дюйма Положительный контроль является предыдущий очищение каталитически неактивных PFV в (D128N), который был 23% всего ДНК как линейные и расслабленной круги. ДНК, подвергается гепарина sepharose фракций #12 через #22 привели в > 10% ДНК как линейные и расслабленной круги. В этом примере, фракций #24 до #42 отображается < 10% преобразование линейной и расслабленной кругах. Эти фракции были объединены и dialyzed. Аликвоты были заморожены и температуре-80 ° C для использования в будущем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рекомбинатные протеины, которые взаимодействуют с ДНК, такие как ДНК ремонт белков, мусорщиков кислорода для одной молекулы микроскопии приложений, или антиретровирусного лечения integrases, должна быть свободна от заражения бактериальной nucleases2,3. Эти загрязняющие вещества могут запутать интерпретацию результатов во время массовых анализов биохимического или одной молекулы.

Мы нашли, что бактериальные нуклеиназы часто совместно очищает с PFV дюйма Однако в PFV отображает сродство для sepharose гепарина, который легко отличить от нуклеиназы бактериальных загрязнений1. Ключ к подготовке в свободной от нуклеиназы PFV является тщательный количественный нуклеиназы активности в каждой фракции, после градиента элюции от sepharose гепарина. Градиент должен быть достаточно неглубоко, чтобы отделение в PFV от нуклеиназы загрязнений; крутой градиент не будет совместим с эффективной сепарации. Кроме того плазмида ДНК субстрат должен иметь низкий процент расслабленной кругов для уменьшения фона assay нуклеиназы. Если субстрат ДНК плазмиды имеет высокий фон расслабленной кругов, должно выполняться новый очищения плазмиды. Нуклеаза деятельности пробирного показывает наличие загрязняющих нуклеиназы и фракций, которые должны быть отброшены.

В некоторых случаях размер гель-проникающей хроматографии (SEC) может быть эффективным методом для удаления загрязняющих нуклеиназы2. Предыдущие группы использовали SEC во время очистки PFV в4. SEC имеет объем ограниченной нагрузки и стремится уменьшить концентрацию окончательный белка. Основным преимуществом сродства и ионообменной хроматографии является возможность загрузки значительно больший объем, чем SEC.

Тестирование для нуклеиназы активности может быть адаптирована для различных белков, которые совместно очищают с бактериальной нуклеиназы. Здесь мы определяем что PFV IN и загрязняющих нуклеиназы могут быть разделены гепарина sepharose хроматографии. Ранее мы показали, что в PFV имеет аналогичный профиль для нуклеиназы с моно-S катион и анион моно-Q обмен хроматографии, делая эти смолы неподходящих для этого белка. В зависимости от характеристик сходства требуемой белка по отношению к нуклеиназы этот протокол может использоваться с сходства или ионообменных смол и градиента элюции. Ключ к эффективной удаление нуклеиназы загрязнения от протеин интереса является разница в сродство для смолы. Каждая фракция должна быть assayed нуклеиназы деятельности. Хроматография смолы этот протокол не может применяться непосредственно для всех белков, которые совместно очищают с бактериальной nucleases. Однако общая концепция использования сходства или ионообменную смолу отделить нуклеиназы от протеина интереса и свидетельствующим фракций нуклеиназы деятельности широко могут применяться.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics