세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Immunology and Infection

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Summary

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

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Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

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Abstract

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

Introduction

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈1내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성2. 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.

그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질5그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직---발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질9에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.

우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질13,14, 지 단백질9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다 . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.

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Protocol

1. 세포 성장 및 세포

  1. 후반 지 수 단계 (OD600 1.0-1.5의) 15 mL tryptic 간장 국물 (TSB) 또는 유사한 리치 미디어에 박테리아를 성장. 원심 분리에 의해 세포를 수확, Tris 버퍼 식 염 수/EDTA (: TBSE)로 한 번 씻어 프로토콜을 계속 하거나 사용까지 동결.
    참고:: TBSE: 20 mM Tris-염 산 (HCl), pH 8.0, 130 m m 염화 나트륨 (NaCl), 그리고 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)). 단백 식 수정 성장 조건 (예: 산도, 염 분, 성장 매체) 및 성장 단계15에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 원하는대로, 하지만 15 mL 세포 성장 조절 수 셀은 권장 단백질의 단일 준비에 대 한 초과 바이오 매스 단백 생산량을 줄일 수 있습니다. 한 15 mL 준비는 일반적으로 2 ~ 4의 최적의 로드에 대 한 충분 한 샘플 생성 표준 SDS 페이지 미니 젤에 차선.
  2. 1mm phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF)와 0.5 mg/mL lysozyme 800 μ: TBSE 셀 resuspend 솔루션 2.0 mL 스레드 microcentrifuge 튜브 스크류 캡 및 o-링을 전송 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
    참고: 특정 종 lysozyme에 의해 세포에 감염 되지 않습니다. 적절 한 용균성 효소 세포에 도움을 대체 한다.
  3. 튜브 ~ 800 μ 0.1 m m 지 르 코니 아/실리 카 구슬을 추가 하 고 30의 5 사이클는 균질 화기에 최대 속도 (7000 rpm)에서 떨고 하 여 셀을 방해 s 각 사이클 사이 얼음에 각각, 2 분 휴식.
  4. (작은 구슬 및 손상 되지 않은 세포)에 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 샘플. 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송 및 얼음에 계속.
  5. 200 μ: TBSE 나머지 펠 릿을 추가 하 고 추가 주기에 균질 화기 돌아갑니다. (위와) 원심을 상쾌한 이전 상쾌한 (800-1000 μ 총 볼륨 되어야 함)와 결합 합니다.

2. 텍사스-114 단계 분할 하 여 단백질의 농축

  1. TX-114 2% (vol/vol)의 최종 농도에 계면 활성 제와 함께 상쾌한은 동일한 양의 4% (vol/vol) 얼음 처럼 차가운: TBSE에 계면 활성 제를 추가 하 여 보충 하 고 1 시간 반전에 의해 모든 ~ 15 분을 혼합에 대 한 얼음에 품 어.
    참고: 냉장, 계면 활성 제와 상쾌한 됩니다 혼합할 수 있는.
  2. 37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 및 상 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어. 샘플 bi phasic 분리를 유지 하기 위해 실내 온도 에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심
  3. 부드럽게 위 수성 단계에서 플라스틱 그리고 삭제. 그것의 원래 볼륨을 튜브 리필 낮은 계면 활성 단계로 얼음: TBSE를 추가 하 고 혼합에 반전. 10 분 동안 얼음에 품 어.
  4. 37 ° C 물 목욕 튜브 전송 단계 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어 다음 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
  5. 3 별거의 총 단계 2.3-2.4를 한 번 더 반복 합니다. 위 수성 단계를 제거 하 고 삭제.
  6. 계면 활성 제 단계에 차가운: TBSE의 1 볼륨을 추가 하 여 기사 (튜브의 하단에 표시)의 과정에서 형성 된 침전 된 단백질의 펠 릿을 제거 합니다. 불용 성 단백질을 작은 2 분 16000 x g에서 4 ° C에서 원심.
    참고: 샘플은 단일 단계를 유지 한다. 단계 분리 발생 하면, 다시 샘플을 진정 하 고 다시 원심. 펠 릿 일반적으로 단백이 아닌 오염 물질의 구성 이지만 추가 분석을 위해 유지 될 수 있습니다.
  7. 즉시 신선한 2.0 mL microcentrifuge 튜브 100% 아세톤의 1250 μ를 포함 하는 상쾌한 전송. 점도 있을 것 이다 팁에서 샘플을 씻어 철저 하 게 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 반전 하 여 혼합 하 고 단백질을 침전에-20 ° C에서 밤새 품 어.
  8. 샘플 튜브의 방향에 주의와 단백질 pellet을 실 온에서 20 분 16000 x g에서 원심 지 단백질 튜브의 외부 벽을 따라 얇고, 백색 필름을 형성 합니다.
  9. 100% 아세톤과 두 번 펠 릿을 세척. 아세톤을 가만히 따르다 고 공기 샘플을 건조 수 있습니다.
  10. 10 mM Tris HCl, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼16 의 20-40 μ를 추가 하 고 철저 하 게 아래로 침전 된 지 단백질으로 벽에 pipetting으로 resuspend. 지 단백질을 꺼내 려 피 펫 팁 튜브의 측면을 다쳤어요.
    참고: 단백질 Tris 버퍼에서 분해 되지 않습니다 하지만 오히려 한 현 탁 액을 형성.
    1. -20 ° C에서 단백질 사용까지 저장 합니다.

3. SDS 페이지, Electroblotting, Ponceau s 얼룩

  1. SDS 페이지 표준 방법16를 사용 하 여 별도 단백질.
    참고: 적절 한 젤 아크릴 비율의 용도 단백질의 크기에 따라 달라 집니다. 여기, E. faecalis 단백질 분리 되었다 10% 이상, 트리 스-글리신 젤 16.5% 트리 스 tricine 젤 작은 대장균 단백 Lpp17사용 되었다.
  2. 표준 electroblotting 프로시저를 사용 하 여 니트로 전송 막에는 단백질을 전송 합니다.
    참고: 세미 드라이 전송 Bjerrum 란-닐슨 버퍼 플러스 0.1 %SDS 사용 하 여 25 V, 1.3에서 수행한 15 분18mA. 그러나 또는 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 사용할 수, 그것은 니트로 보다 더 소수, 그것은 나중 단계에서 막에서 소수 lipopeptides의 효율적인 차입을 줄일 수 있습니다.
  3. 컨테이너와 커버 Ponceau S 솔루션 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 초 산에서)와 니트로 막 전송. 바위 부드럽게 5 분 또는 때까지 빨강 분홍색 밴드를 볼 수 있습니다.
  4. Ponceau S 솔루션을 부 어와 신중 하 게 씻어2O를 초과 제거 얼룩 지명 타자로 니트로 막.
    참고: Ponceau 스테인드 밴드는 급속 하 게 destain 것입니다. 밴드는 사라지고, 착 색 과정을 반복 합니다.
  5. 깨끗 한 면도날으로 원하는 밴드와 microcentrifuge 튜브에 소비 세. DH2O를 완전히 밴드 destain의 1 mL로 세 번 세척.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 저장소 삭제 섹션 사용까지-20 ° C에서 물으로 덮여 있습니다.
  6. 깨끗 한 표면에와 깨끗 한 면도날으로 섹션을 전송, 0.5 mL 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브로 조각 작은 조각의 약 1 m m x 1 m m. 수집으로 니트로 스트립 주사위.
  7. 씻어 갓 50 m m 염화 중 탄산염 (NH4HCO3) 0.5 mL로 두 번 조각의 pH 7.8-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 학년 물에.

4. tryptic 소화, 니트로 막, MALDI 표적, 및 데이터 수집에 증 착에서 Lipopeptide 추출

  1. 50mm NH4HCO3, pH 7.8 HPLC 학년 물에서 trypsin의 20 μ g/mL 해결책의 20 μ에 니트로 조각 resuspend. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각을 완전히 trypsin 솔루션에 포함 되도록 짧게 스핀. 파라핀 필름 증발을 방지 하 고 37 ° c.에 하룻밤 다이제스트를 품 어를 사용 하 여 튜브 뚜껑 커버
  2. 스핀에서 16000 x g 30 s 및 제거 pipetting으로 액체에 대 한 샘플.
    참고:이 단백질 식별 MALDI TOF MS에 의해 나중에 시험 될 수 있다 trypsinized 친수성 펩 티 드를 제거 합니다.
  3. HPLC 학년 물에 0.5 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 50 μ를 추가 합니다. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각 솔루션 적용 되도록 간단히 샘플을 회전 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. Pipetting으로 액체를 제거 합니다.
    주의: TFA는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
  4. HPLC 학년 물에 10% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다.
    주의: 이기는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
  5. HPLC 학년 물에 20% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다.
    참고:이 느슨하게는 니트로에 바인딩된 모든 알맞게 소수 성 펩 티 드를 제거 합니다.
  6. 단단히 바인딩된 lipopeptides elute 갓 만든 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스 클로 프롬-메탄올 (2:1, v/v)에 용 해의 15 μ를 추가 하 고 간헐적으로 vortexing와 실 온에서 10 분 동안 품 어.
    1. 또는 15 μ 클로 프롬-메탄올 elute lipopeptides 나중에 매트릭스와 믹스를 추가 합니다. 2, 5-dihydroxybenzoic 산 (DHB) 등 다른 행렬 특정 lipopeptide 구성에 대 한 불만족 한 결과 가져온 경우 CHCA에 대안으로 시험 되어야 한다.
      주의: 클로 프롬 및 메탄올 흡입 하는 경우에 유해 하다입니다. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
    2. 옵션: 나트륨을 홍보 하기 위해 대형 adduct, 1mm의 최종 농도에 수성 나트륨 탄산염 (NaHCO3)와 클로 프롬-메탄올에 CHCA의 솔루션을 보완.
  7. 간단히 샘플을 회전 합니다. 피 펫와 신중 하 게 새로운 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브에 액체를 전송. 이 솔루션은 N 맨끝 lipopeptides의 대량을 포함 됩니다.
    참고:는 니트로 수 있습니다 부분적으로 또는 완전히 분해 클로 프롬 메탄올 솔루션. 이 부정적인 MS 결과 영향을 주지 않습니다 그리고 lipopeptide 반환을 증가 하는 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. PVDF 막 하지 같은 방식으로 분해 됩니다.
  8. 닦은 강철 MALDI 표적에 CHCA와 eluted lipopeptides의 1 μ를 입금.
    참고: 클로 프롬-메탄올 것입니다 증발 신속 하 게, 결정 CHCA와 lipopeptides 뒤에 남겨두고. Aliquot는 선택적 둘째 1 μ 샘플 농도 높이기 위해 같은 자리에 입금 될 수 있습니다. 클로 프롬-메탄올 대상에 증 착 후 크게 확산 될 수 있습니다와 같은 한다 주의 샘플 대상에 혼합 하지 마십시오. 입금 하 고 각 샘플의 여러 관광 명소를 촬영 하는 것이 좋습니다.
  9. 즉시 질량 분석을 진행 합니다. 특히 자리 포함 되어 있는 경우 두 레이어 샘플의 두 번째 레이어 스팟의 바깥쪽 테두리에는 lipopeptides를 밀어 수 있습니다 lipopeptide 신호, 스팟의 모든 영역을 검사 합니다.
    참고: 권장된 시작 레이저 강도 25%, 비록 그것은 신호를 수집 하 고 적절 한 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 여러 스펙트럼 (20 명 이상 검사)를 합계 하는 강도 증가 하는 데 필요한 있을 수 있습니다. 여기, 스펙트럼 MALDI TOF TOF 악기에 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조) 700-3500 m/z 범위 반사판 긍정적인 이온 검출에 대 한 공장에서 구성 된 악기 방법을 사용 하 여. 악기는 소 혈 청 알 부 민 (BSA) tryptic 펩 티 드 혼합물으로 보정 했다.

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Representative Results

프로토콜의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. TX-114 Enterococcus faecalis ATCC 19433에서에서 추출한 단백 농축 분수는 그림 2에 표시 됩니다. 비교를 위해 침전 된 단백질 분수의 밴딩 패턴도 표시 됩니다. 이 분수에서 단백질은 MALDI MS는 매우 풍부한 단백질 (표 1) 이외의 단백질 오염 수에 의해 확인 되었다. 그림 3 에 질량 스펙트럼 입증 증가 극성 (피크 할당 에 나열 된의 용 매와 니트로 바인딩된 PnrA의 연속적인 세척으로 나타나는 PnrA E. faecalis 단백의 tryptic 펩 티 드 이온 프로필 표 2). 그림 4N-PnrA MALDI TOF MS/MS에 의해 하 lyso 단백 형태와 진단 N-acylated dehydroalanyl 봉우리를 공개 결정의 터미널 구조 특성. 그림 5 에서는 나트륨의 영향 N-acylated dehydroalanyl 이온에 찬성 하 여 우선적으로 분할 sodiated 부모 이온 조각화에 adduct.

Figure 1
그림 1: 프로토콜의 도식. 지 단백질 TX-114 단계 분할 하 여 농축 TLR 분석 실험에 직접, 가장 일반적으로 사용 하거나 추가 구조 결정에 대 한 SDS 페이지에 의해 순화 될 수 있습니다. 지 단백질은 니트로, 트립 신, stepwise, 세차와 소화 및 구조 분석을 위한 클로 프롬-메탄올과 MALDI MS에 의해 eluted 결과 lipopeptides로 전송 됩니다. 트립 신 및 니트로 세척 솔루션 단백질 식별 및 MS 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 승:; TFA: trifluoroacetic 산; ACN: 이기; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic 산; 선택: 선택; MALDI: 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화; MS: 질량 분석입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: TX-114의 농축 단백질 E. faecalis에서. 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 물 Coomassie 파란 (A) 과 해당 니트로 막 물 침전 된 단백질 분수 ("PPT")과 정화는 사이 패턴 다른 banding Ponceau S (B) 공개 지 단백질 ("LP")입니다. 표시 된 Coomassie 스테인드 밴드 excised 고 MALDI MS tryptic 펩 티 드 ( 표 1참조)의 비 단백질으로 구분. PnrA 식별 하 고 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분석 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 니트로의 극성 이온 풍요와 프로필 변경 씻어 솔루션. (A) trypsin 부분 여러 내부 펩 티 드 조각 그림 2에 표시 된 PnrA E. faecalis 단백에 해당 표시 됩니다. 10% (B) 20% (C) 이기 씻어 분수 쇼 신호 강도 변화와 개별 봉우리의 전체 수에 있는 감소. (D) 최종 차입 분수에서 N 맨끝 lipopeptide와 풍부한 높은 m /z 997, 별표 (*)로 표시. 각 스펙트럼의 강도 신호 강렬의 비교에 대 한 (A) 로 정규화 됩니다. 봉우리 대중과 할당 된 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

밴드 단백질 ID 승인 번호 표준시 분자량 펩 티 드 수
1 신장 인자 Tu gb | EOL37301.1 | 43,387 15
2 NADH 과산화 효소 gb | EOL34572.1 | 49,520 9
3 pyruvate 효소 E1component, 알파 소 단위 gb | EOL34709.1 | 41,358 12
4 pyruvate 효소 E1 구성 요소, 소 단위 베타 gb | EOL34710.1 | 35,373 19
5 30 대 ribosomal 단백질 S2 gb | EOL33066.1 | 29,444 16
6 30 대 ribosomal 단백질 S3 gb | EOL37312.1 | 24,355 14

표 1: 침전 된 단백질은 단백 비 오염. 단백질 tryptic 다이제스트 및 MALDI MS에 의해 확인 되었다에서 젤 소화 프로토콜19 표준을 사용 하 고 위에서 아래로 Coomassie 젤 그림2에서에 표시 하는 동일한 순서로 나열 됩니다. 각 단백질은으로 신뢰 구간 (C.I.) 95% 이상 확인 되었다.

최대 수 이론적인 질량 단백질 위치 롤 놓친된 컷된 사이트의 펩 티 드 순서
1 631.3409 170-176 0 GVADAAK
2 675.4035 316-321 1 TKEAVK
3 826.4093 163-169 0 FQAGFEK
4 893.4839 121-128 0 NVVSATFR
5 943.5359 240-247 0 VWVIGVDR
6 1040.5047 188-197 0 YAASFADPAK
7 1200.6331 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 1316.6997 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 1385.7827 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 1432.743 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 1568.7802 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 1672.8289 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 1707.8184 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 1724.8027 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 1797.9228 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 1872.9854 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 1945.9613 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 2240.1345 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 2675.2543 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

표 2: 대 중 고 해당 tryptic 펩 티 드. E. faecalis PnrA의 트립 신 소화에서 (은행: EOL37280.1)은 PeptideMass20,21을 사용 하 여 수행, 사이트 컷 최대 2 개의 보고를 허용. 그림 3 에 스펙트럼에서 관찰 하는 봉우리의 이론적인 대 중 해당 펩 티 드 순서에 따라 나열 됩니다.

Figure 4
그림 4: E. faecalis 단백 PnrA의 MALDI TOF MS입니다. (A) 의 부모 MS 스펙트럼은 m / E. faecalis PnrA의 N 맨끝 lipopeptide에 해당 하는 z 997 지역. (B) lipopeptide 피크의 MS/MS는 진단 N-acylated dehydroalanyl 펩 티 드 파편 이온 피크와 별표 (*)로 표시 된 lyso 양식 다는 것을 보여준다. 해명된 구조 (C)표시 됩니다. 이 그림은 이전 게시9에서 수정 되었습니다. 제공 RI: 상대 강도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 나트륨 adduct 형성 촉진 dehydroalanyl lipopeptide 이온으로 부모 이온 조각화. (청록색 흔적) 없이 대장균 단백 Lpp N 맨끝 펩 티 드의 (A) MALDI TOF 스펙트럼과 (블루 트레이스) 탄산수 소 나트륨의 추가. 최종 eluted 분수 나트륨 중 탄산염의 추가 부모 lipopeptide의 계산 된 질량에서 22 다 증가 발생합니다. 해당 sodiated 이온 (C) 의 MS/MS 스펙트럼 표시 N으로 상당한 특혜 조각화 protonated 이온 (B)의 MS/MS 스펙트럼과 비교 했을 때-acyl-중립 통해 dehydroalanyl 이온 별표 (*)로 표시 된 diacylthioglyceryl moiety 제거 부모 triacylated Lpp N 맨끝 tryptic 펩 티 드의 구조 (D)N-acyl-dehydroalanyl 펩 티 드 파편 이온 (E) 표시 됩니다. 이 그림은 이전 게시9에서 수정 되었습니다. 제공 RI: 상대 강도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.

MS 구조 분석용, 니트로 하는 단백질의 양도 트립 신 소화, 세척, 고 막에서 후속 차입을 촉진 한다. 우리의 손에서이 접근은 입증 전통적인 polyacrylamide 젤 플러그에서 세제 중재 추출 하는 것이 좋습니다는 단백질 연관 니트로 막의 표면 그리고 polyacrylamide에 포함 되지. 니트로 표면 단백 협회도 크게 소수 성 펩 티 드에 의해 컨테이너 표면에 일반적인 흡착의 일반적인 문제를 방지할 수 있습니다. 니트로 조각의 stepwise 차입 제거 더 많은 친수성, 내부 tryptic 펩 티 드 MALDI TOF MS 최종 차입 단계 reproducibly 생성 하는 동안 높은 신뢰 단백질 식별 할당을 달성 하 여 분석할 수 있는 크게 간섭 염과 오염 물질을 억제 하는 이온의 무료 작은 볼륨에 집중된 lipopeptides.

단백의 성공적인 MS 분석은 풍요로 움, 그리고 같은, Ponceau S 스테인드 막에서 어두운 밴드는 최상의 결과 줄 것. 그러나, 그것은 여러 단백질 페이지 분리, 결과 스펙트럼을 복잡 하 게 하는 동안 단일 밴드에 마이그레이션할 수 있습니다. 따라서 것이 좋습니다 먼저 단백질 식별 하 지문 (PMF), 펩 티 드 질량을 총 trypsin 분수 또는 어느 이기 세척에 MS 스펙트럼을 수집 하 고 입력으로 결과 봉우리 여 달성 될 수 있다는 마스코트22같은 소프트웨어. 단백질 시퀀스를 확인 선택 MS/MS에 의해 조각 하는 이온에 에이즈 크게 tryptic N 맨끝 lipopeptide의 질량을 계산 합니다.

추가 샘플이 인구와 소스 박테리아6에 따라 모두 그들의 N 맨끝 수정, 지 단백질에 acyl 체인 길이 다양 한에서 발생할 수 있습니다. 부모 스펙트럼, 메 틸 렌 그룹 (-채널2-)에 해당 하는 14 다 증가 의해 특징에 독특한 피크 클러스터 체인 길이에서 변화 하 게 하는 동안 전체 lipopeptide 신호를 분할 하 고 감도 줄일 수 있습니다. Triacylated, diacylated, 및 lyso 형태의 지 단백질 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 성공적으로 확인 했습니다 비록 가능성이 다른 단백 형태의 농축 및 조각화, 영향 이기도 합니다. 마찬가지로, 지 단백질의 다양 한 펩 티 드 moieties 추가 복잡성의 또 다른 수준에 그들의 N 맨끝 구조 분석에 매우 친수성 아미노산 구성 lipopeptide 유기 클로 프롬 단계에 분할 되지 않을 수 있습니다. 다른 추출 방법8을 사용 하 여. 니트로 단백의 이전 것으로 모든 차입 분수가이 방법에서 분석 될 수 있다 같은 lipopeptides, 공부에 도움이 됩니다.

Triacylglycerides 및 인지질23를 포함 하는 이전 문학에서 그리기, 의도적인 나트륨 adduct 형성의 형성을 통해 더 유익한 조각화를 홍보 하는 데 사용 수는 (N-acyl)-dehydroalanyl 펩 티 드 이온. 이러한 특성 이온은 N-말단의 acylation 상태 glyceryl moiety에 acyl 대체 분리 이후 구조를 할당 하는 열쇠. 나트륨 adduct 형성 N촉진을 보여줘 왔다 과산화 수소와 산화 유황을 편리한 대체 옵션을 제공 합니다-acyl-dehydroalanyl 펩 티 드 조각6,8. 비록 나트륨 adducts 저하 부모 이온 강도 대 한 표시 부모 이온 신호, dehydroalanyl 이온으로 조각화에 특정 증가의 전반적인 억제 보상 수 있습니다. 그것은 다른 행렬을 탐구 가치가 있을 수 있습니다 고의 추가 조각화 adducts 가장 유익한 스펙트럼을 유도.

이 프로토콜을 니트로 막에 페이지 구분 지 단백질의 양도 트립 신 소화 및 lipopeptides의 차입을 용이 하 게 하는 동안 단백 농축 방법 분할 전통적인 TX-114 위상 향상. 총 tryptic 또는 세척 분수에 MALDI TOF MS 분석 함께 단일 실험에서 MS/MS에 의해 N-터미널 구조 결정 단백질 식별 수 있습니다. 선택적 나트륨 더 유익한 이온 조각화를 홍보 함으로써 형성 하이라이트 차이 lipopeptide N-말단에 adduct. 정기적으로 단백질 정화 하 고 그들의 N termini 특성화 수 양식을 만들어집니다 어떻게 소설 단백에 대 한 광범위 한 연구, 세균성 세포 봉투 내에서 생리 적 역할 그리고 어떻게 그들은 포유류 면역에서 검색 하면 시스템입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

메러디스 랩에서 연구 비 과학 대학 (펜실베니아 주립 대학)에서 제공 하는 시작 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 전문적인 기술 조언과 펜 스테이트 Proteomics와 질량 분석 핵심 시설, 대학 공원, PA, 대량 spectrometric 분석 수행 된 장비에 대 한 액세스에 대 한 박사 타 Laremore 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

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References

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