Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

Immunology and Infection

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Summary

L'arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.

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Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

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Abstract

Le lipoproteine sono costituenti importanti della busta delle cellule batteriche e potenti attivatori della risposta immunitaria innata dei mammiferi. Nonostante la loro importanza nella fisiologia cellulare e di immunologia, molto resta ancora da scoprire sulle forme di romanzo della lipoproteina, come essi sono sintetizzati e l'effetto delle varie forme su immunità dell'ospite. Per attivare studi approfonditi sulle lipoproteine, questo protocollo descrive un metodo per l'arricchimento della lipoproteina batterica e preparazione del N-terminale triptico lipopeptidi per determinazione strutturale di matrix-assisted laser desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS). Espandendo una consolidata fase di Triton X-114 metodo per l'estrazione della lipoproteina e arricchimento dalla membrana cellulare batterica di partizionamento, il protocollo include ulteriori passaggi per rimuovere i contaminanti non-lipoproteina, aumentano il rendimento della lipoproteina e purezza. Poiché le lipoproteine sono comunemente usate nelle analisi di recettori Toll-like (TLR), è fondamentale innanzitutto caratterizzano la struttura del N-terminale di MALDI-TOF MS. qui, viene presentato un metodo per isolare peptidi idrofobi concentrati arricchiti in N-terminale lipopeptidi adatti per l'analisi diretta di MALDI-TOF MS/MS. lipoproteine che sono stati separati da sodio solfato elettroforesi dodecilica del Gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) sono trasferito ad una membrana di nitrocellulosa, digeriti in situ con tripsina, in sequenza lavata per rimuovere peptidi triptici polar e infine eluito con cloroformio-metanolo. Quando accoppiato con MS dei peptidi trypsinized più polari da soluzioni di lavaggio, questo metodo fornisce la capacità di identificare la lipoproteina e caratterizzano la sua estremità N-terminale in un singolo esperimento. Formazione del complesso di sodio intenzionale può essere impiegato anche come strumento per promuovere più spettri di frammentazione strutturalmente ben informato. In definitiva, arricchimento delle lipoproteine e determinazione delle loro strutture di N-terminale permetterà studi più approfonditi su questa onnipresente classe di proteine batteriche.

Introduction

Lipoproteine batteriche sono caratterizzate da una N-terminale del lipido-modificato cisteina conservato che le ancore il dominio globulare proteina alla superficie della membrana cellulare. Essi sono distribuiti universalmente nei batteri, che costituiscono il 2 e il 5% di tutti i geni cellulari all'interno di un tipico genoma1. Lipoproteine giocano un ruolo critico in un'ampia varietà di processi cellulari, tra cui l'assorbimento di nutrienti, trasduzione del segnale, assemblaggio di complessi proteici e nel mantenimento delle cellule busta integrità strutturale2. Batteri patogeni, lipoproteine servono come fattori di virulenza3,4. Durante un'infezione, riconoscimento del N-terminale lipopeptidi di recettori Toll-like (TLR) 2 incita una risposta immunitaria innata per rimuovere gli agenti patogeni d'invasione. A seconda dello stato di acilazione del N-terminale, le lipoproteine sono generalmente riconosciute da alternativo TLR2 heterodimeric complessi. TLR2-TLR1 riconosce N-acilato lipopeptidi, mentre TLR2-TLR6 lega lipopeptide gratis termini α-amminico. Una volta legato, le vie di segnalazione convergono per indurre la secrezione di citochine proinfiammatorie3,4.

Era precedentemente pensato che le lipoproteine da batteri Gram-positivi erano diacylated e quelli da batteri gram-negativi erano triacylated, differendo in assenza o in presenza di un acido grasso ammide-collegato sul residuo di cisteina di N-terminale conservato. Questa ipotesi è stata sostenuta dalla mancanza di sequenza ortologhi nei genomi Gram-positivi a Lnt, il gram-negativi N-acil transferasi che forma triacylated lipoproteine5. Tuttavia, recenti studi hanno rivelato lipoproteina triacylation in Gram-positivi Firmicutes tale mancanza lnt, come pure tre nuove strutture della lipoproteina N-terminale, definiti il peptidil, lyso e N -acetile moduli6,7 ,8. Questi risultati sollevano domande sulle forme possibili della lipoproteina ancora scoperto, insieme a domande fondamentali su come sono fatte queste lipoproteine romanzo e quali finalità fisiologiche o vantaggio impartire le varie forme. Inoltre, dimostrano chiaramente l'impossibilità attuale di genomica per predire la struttura della lipoproteina. Infatti, recentemente abbiamo identificato una nuova classe di transferasi di N-acil lipoproteina, chiamato Lit, da Enterococcus faecalis e bacillo saguaro che rende lyso-modulo lipoproteine9. Questo indica la necessità di verificare sperimentalmente la struttura della lipoproteina, che può essere difficile a causa della loro natura estremamente idrofobica e limitate metodi disponibili per caratterizzare la loro struttura molecolare.

Per facilitare gli studi sull'induzione della lipoproteina della risposta immunitaria ospite, come pure la determinazione strutturale di N-terminale, abbiamo adattato parecchi protocolli precedentemente descritta al fine di purificare le lipoproteine batteriche e preparare il trittico N-terminale lipopeptidi per analisi mediante MALDI-TOF MS6,10,11,12. Le lipoproteine sono arricchite utilizzando una consolidata fase di Triton X-114 (d'ora in poi denominato tensioattivo o TX-114) metodo, con ottimizzazione per rimuovere contaminanti non-lipoproteine e aumentare la resa della lipoproteina di partizionamento. Queste lipoproteine sono adatte per uso diretto in saggi TLR o per ulteriore purificazione da SDS-PAGE. Per MALDI-TOF MS, trasferimento delle lipoproteine di membrana di nitrocellulosa fornisce un'impalcatura per efficiente in situ digestione della tripsina, lavaggio e successiva eluizione dalla superficie della membrana, con conseguente altamente purificato lipopeptidi N-terminale. Nitrocellulosa è stata indicata per facilitare la manipolazione del campione e migliorare la copertura di sequenza per i peptidi altamente idrofobi da proteine integrali di membrana13,14, così come le lipoproteine9,10 . Il metodo ha il vantaggio aggiuntivo di frazionamento peptidi basati su polarità, in modo che soluzioni di lavaggio intermedio possono essere analizzati per identificazione di proteine di alta fiducia simultaneamente con determinazione strutturale di N-terminale in un singolo esperimento . Questo protocollo in modo univoco sodio intenzionale caratteristiche del complesso formazione per promuovere la frammentazione di ioni di padre verso gli ioni dehydroalanyl corso MS/MS, aiutando nella mansione strutturale dello stato N- acilazione. N-terminale è sia la caratteristica più variabile e chiave relazionata al riconoscimento TLR delle lipoproteine. Presi insieme, questo protocollo ha permesso studi intensivi e riproducibili sulle lipoproteine, con le singole fasi di purificazione e determinazione strutturale di MALDI-TOF MS facilmente adattato a seconda l'obiettivo generale dell'esperimento.

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Protocol

1. crescita e lisi delle cellule

  1. Crescere i batteri in 15 mL di brodo di soia triptico (TSB) o simili contenuti multimediali alla fine della fase esponenziale (OD600 di 1.0-1.5). Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, lavare una volta con Tris-buffered saline/EDTA (TBSE) e continuare con protocollo o congelare fino all'utilizzo.
    Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)). Modifica ed espressione della lipoproteina può essere influenzati dalle condizioni di crescita (ad es. acidità, salinità, crescita media) e crescita fase15. Crescita delle cellule può essere scalata come desiderato, ma 15 mL delle cellule è consigliato per un unico preparato delle lipoproteine in eccesso biomassa può diminuire resa della lipoproteina. Una preparazione di 15 mL generalmente produce quantità sufficiente di campione per un carico ottimale di ~ 2-4 corsie su una standard del mini gel di SDS-PAGE.
  2. Risospendere le cellule in 800 μL TBSE con 1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF) e lisozima di 0,5 mg/mL. Trasferire la soluzione in una microcentrifuga filettato a 2,0 mL con tappo a vite e o-ring e incubare per 20 min a 37 ° C.
    Nota: Alcune specie non sono suscettibili alla lisi da lisozima. Un enzima litico appropriato dovrebbe essere sostituito per facilitare la lisi.
  3. Aggiungere perline zirconia/silice di ~ 800 μL 0,1 mm per il tubo e frantumare le cellule agitando alla massima velocità (7.000 giri/min) su un omogeneizzatore per 5 cicli di 30 s ciascuna, con 2 min riposare su ghiaccio tra ciascun ciclo.
  4. Campione di centrifugare a 3000 x g per 5 min a 4 ° C (a pellet perline e ininterrotta delle cellule). Trasferire il surnatante in una provetta di 2,0 mL microcentrifuga nuovo e mantenere il ghiaccio.
  5. Aggiungere 200 μL TBSE per la pallina restante e ritornare l'omogeneizzatore per un ulteriore ciclo. Centrifuga (come sopra) e combinare il surnatante con il surnatante precedente (dovrebbe essere il volume totale di 800-1000 μL).

2. arricchimento delle lipoproteine di TX-114 fase di partizionamento

  1. Completare il surnatante con TX-114 tensioattivo a una concentrazione finale del 2% (vol/vol) aggiungendo un volume uguale di 4% (vol/vol) il tensioattivo in TBSE ghiacciata e incubare in ghiaccio per 1 h, mescolare capovolgendo ogni ~ 15 min.
    Nota: Quando refrigerati, il surnatante e tensioattivo sarà miscibile.
  2. Il tubo di trasferimento a bagnomaria a 37 ° C ed incubare per 10 min per indurre la separazione di fase. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente per mantenere la separazione bi-fasico.
  3. Delicatamente Pipettare fuori la fase acquosa superiore e scartare. Aggiungere TBSE ghiacciata la fase inferiore di tensioattivo per riempire il tubo al suo volume originario e invertire per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 min.
  4. Trasferire la provetta a bagnomaria a 37 ° C ed incubare per 10 min per indurre la separazione di fase, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.
  5. Ripetere i passaggi da 2.3-2.4 ancora una volta per un totale di 3 separazioni. La fase acquosa superiore di rimuovere e scartare.
  6. Rimuovere il pellet di proteine precipitate che si formano nel corso delle estrazioni (visibile nella parte inferiore del tubo), aggiungendo 1 volume di TBSE ghiacciata alla fase di tensioattivo. Centrifugare a 4 ° C a 16.000 x g per 2 min a pellet proteina insolubile.
    Nota: Il campione deve rimanere una sola fase. In caso di separazione di fase, ri-chill campione e centrifugare nuovamente. Il pellet è generalmente composto da agenti inquinanti non-lipoproteina, ma possa essere conservato per ulteriori analisi.
  7. Immediatamente trasferire il surnatante in una provetta di fresco 2,0 mL microcentrifuga contenente 1250 µ l di acetone 100%. Pipettare accuratamente su e giù per lavare il campione dalla punta come sarà viscoso. Mescolare per inversione e incubare per una notte a-20 ° C per precipitare le proteine.
  8. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 20 min a temperatura ambiente a pellet lipoproteine con attenzione all'orientamento del tubo. Lipoproteine formerà una pellicola sottile e bianca lungo la parete esterna del tubo.
  9. Lavare la pallina due volte con 100% di acetone. Decantare acetone e lasciare asciugare il campione di aria.
  10. Aggiungere 20-40 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 o standard Laemmli SDS-PAGE sample buffer16 e Risospendere accuratamente pipettando su e giù contro il muro con le lipoproteine precipitate. Raschiare il lato del tubo con la punta della pipetta per sloggiare le lipoproteine.
    Nota: Le lipoproteine non si dissolvono in tampone Tris, ma piuttosto formano una sospensione.
    1. Memorizzare le lipoproteine a-20 ° C fino all'utilizzo.

3. SDS-PAGE, Electroblotting e colorazione con Ponceau S

  1. Lipoproteine separate da SDS-PAGE utilizzando metodi standard16.
    Nota: La percentuale di acrilammide gel appropriato variano a seconda della sua destinazione d'uso e le dimensioni delle lipoproteine. Qui, E. faecalis lipoproteine sono state separate oltre un 10% gel di Tris-glicina, mentre un gel di Tris-tricine 16,5% è stato utilizzato per la più piccola lipoproteina di e. coli Lpp17.
  2. Trasferire le lipoproteine ad una membrana di nitrocellulosa trasferimento utilizzando una procedura standard electroblotting.
    Nota: È stato eseguito un trasferimento semi-secco utilizzando Bjerrum Schafer-Nielsen buffer più 0,1% SDS a 25 V, 1.3 mA per 15 min18. In alternativa, polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana potrebbe essere utilizzata, tuttavia, come è più idrofobo di nitrocellulosa, esso può ridurre efficiente eluizione di idrofobo lipopeptidi dalla membrana alle fasi successive.
  3. Trasferire la membrana di nitrocellulosa a un contenitore e coprire con la soluzione di Ponceau S (0,2% (w/v) Ponceau S in acido acetico al 5%). Roccia delicatamente per 5 minuti o fino a bande rosso-rosa sono visibili.
  4. Versate la soluzione di Ponceau S e risciacquare con cura la membrana di nitrocellulosa con dH2O per rimuovere l'eccesso di mordente.
    Nota: Tinto Ponceau bande saranno decolorare rapidamente. Se le bande scompaiono, ripetere il processo di colorazione.
  5. Con una lama di rasoio pulita, asportare la banda desiderata e il trasferimento ad un tubo del microcentrifuge. Lavare tre volte con 1 mL di dH2O per decolorare completamente la band.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Archivio sezione asportata ricoperta d'acqua a-20 ° C fino all'utilizzo.
  6. Trasferire la sezione su una superficie pulita e con una lama di rasoio pulita, tagliare a dadini la striscia di nitrocellulosa a pezzetti di circa 1 mm x 1 mm. raccogliere i pezzi in un tubo del microcentrifuge associazione di proteine di basso di 0,5 mL.
  7. Lavare i pezzi due volte con 0,5 mL preparata 50mm di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3), pH 7,8 in acqua di qualità per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

4. triptica digestione, Lipopeptide estrazione dalla membrana di nitrocellulosa, deposizione sul Target MALDI e acquisizione dati

  1. Risospendere pezzi di nitrocellulosa in 20 μL di una soluzione di 20 μg/mL di tripsina in 50mm NH4HCO3, pH 7,8 in acqua di grado HPLC. Vortice di mescolare, poi girare brevemente per garantire che tutti i pezzi sono completamente coperti dalla soluzione di tripsina. Coprire il coperchio del tubo usando pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e incubare digerire una notte a 37 ° C.
  2. Spin il campione a 16.000 x g per 30 s e rimuovere il liquido di pipettaggio.
    Nota: Questo rimuove tripsinizzate idrofiliche peptidi che possono essere esaminati successivamente mediante MALDI-TOF MS per l'identificazione della proteina.
  3. Aggiungere 50 μL di 0,5% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua di grado HPLC. Vortice di mescolare, poi girare il campione brevemente affinché tutti i pezzi sono coperti dalla soluzione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido di pipettaggio.
    Attenzione: TFA è nocivo se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
  4. Ripetere il passaggio 4.3 con 50 μL di 10% acetonitrile in acqua di grado HPLC.
    Attenzione: L'acetonitrile è nocivo se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
  5. Ripetere il passaggio 4.3 con 50 μL di 20% acetonitrile in acqua di grado HPLC.
    Nota: Questa operazione rimuove qualsiasi peptidi moderatamente idrofobi vagamente associati alla nitrocellulosa.
  6. Per eluire il lipopeptidi strettamente associato, aggiungere 15 μL di preparati 10mg/mL α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) matrice disciolto in cloroformio-metanolo (2:1, v/v) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione intermittente.
    1. In alternativa, aggiungere 15 μL cloroformio-metanolo per eluire lipopeptidi e mescolare con matrice in un secondo momento. Altre matrici, come l'acido 2,5-dihydroxybenzoic (DHB), dovrebbero essere testati come alternative al CHCA se si ottengono risultati insoddisfacenti per una composizione particolare lipopeptide.
      Attenzione: Cloroformio e metanolo sono nocivi se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
    2. Opzionale: Sodio di promuovere la formazione del complesso, integrare la soluzione di CHCA in cloroformio-metanolo con bicarbonato di sodio acquoso (NaHCO3) ad una concentrazione finale di 1 mM.
  7. Girare brevemente il campione. Con una pipetta, trasferire con cautela il liquido per un nuovo tubo del microcentrifuge associazione di povera in proteine. Questa soluzione conterrà la maggior parte dei lipopeptidi del N-terminale.
    Nota: La nitrocellulosa può sciogliere parzialmente o completamente nella soluzione di cloroformio-metanolo. Questo non influirà negativamente MS risultati e può essere utilizzato come metodo alternativo per aumentare lipopeptide ritorno. Membrana PVDF non si dissolva nello stesso modo.
  8. Cassetta 1 μL dei lipopeptidi eluiti con CHCA su una destinazione di MALDI in acciaio lucida.
    Nota: Il cloroformio-metanolo evapora rapidamente, lasciando dietro di sé cristallizzato CHCA e lipopeptidi. Un opzionale secondo 1 μL di aliquota possono essere depositati su nello stesso punto per aumentare la concentrazione del campione. Cloroformio-metanolo può diffondersi significativamente dopo la deposizione sul bersaglio e come tale, si dovrebbe prestare attenzione per evitare la miscelazione del campione sul bersaglio. Si consiglia di depositare e sparare i punti multipli di ogni campione.
  9. Procedere immediatamente alla spettrometria di massa. Analizzare tutte le aree dello spot per segnale lipopeptide, soprattutto se lo spot contiene due strati del campione, come il secondo strato può spingere i lipopeptidi al bordo esterno della macchia.
    Nota: Intensità del laser partenza consigliata è 25%, anche se può essere necessario aumentare l'intensità per acquisire segnale e sommare più spettri (20 o più scansioni) per ottenere adeguato rapporto segnale-rumore. Qui, gli spettri sono stati acquisiti su uno strumento di MALDI-TOF-TOF (Vedi la Tabella materiali) utilizzando un metodo predefiniti dello strumento per la rilevazione di ioni positivi di riflettore sopra la gamma di m/z 700-3500. Lo strumento è stato calibrato con una miscela di peptide triptico di albumina di siero bovino (BSA).

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Representative Results

Un disegno schematico del protocollo è fornito nella Figura 1. La frazione arricchita di lipoproteina estratta da Enterococcus faecalis ATCC 19433 da TX-114 è illustrata nella Figura 2. Per confronto, il disegno a strisce della frazione proteica precipitato è anche mostrato. Proteine da questa frazione sono state confermate mediante MALDI-MS per essere altamente abbondanti contaminando proteine diverse da lipoproteine (tabella 1). Gli spettri di massa nella Figura 3 dimostrano il profilo di ion peptide triptico della lipoproteina E. faecalis PnrA che si verifica con i lavaggi successivi del PnrA associato a nitrocellulosa con solventi di crescente polarità (assegnazioni di picco elencate in Tabella 2). La figura 4 Mostra l' N-terminale caratterizzazione strutturale del PnrA come determinato da MALDI-TOF MS/MS, rivelando diagnostica N- acilato dehydroalanyl picchi coerente con la forma di lyso-lipoproteina. Figura 5 illustra l'effetto del sodio del complesso di formazione sulla frammentazione, con lo ione di padre sodiated preferenzialmente frammentazione in favore dello ione di dehydroalanyl - acilato N.

Figure 1
Figura 1: schema del protocollo. Le lipoproteine sono arricchite da TX-114 fase di partizionamento e possono essere utilizzate direttamente, più comunemente nei saggi TLR o ulteriormente purificate da SDS-PAGE per determinazione strutturale. Le lipoproteine sono trasferite di nitrocellulosa, digerito con tripsina, lavata graduale e il risultante lipopeptidi eluiti con cloroformio-metanolo per l'analisi strutturale mediante MALDI-MS. Le soluzioni di lavaggio di tripsina e nitrocellulosa possono essere salvate per MS analisi e identificazione delle proteine. w /: con; TFA: acido trifluoroacetico; ACN: acetonitrile; CHCA: acido α-ciano-4-idrossicinnamico; opt: facoltativo; MALDI: ionizzazione matrix-assisted laser desorption; MS: spettrometria di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Profilo di TX-114 arricchito di proteine da E. faecalis. Un 10% Tris-glicina SDS-PAGE gel colorati con Coomassie blu (A) e la membrana di nitrocellulosa corrispondente macchiati con Ponceau S (B) rivelare un bendaggio diverso modello tra la frazione di proteina precipitata ("PPT") e purificato lipoproteine ("LP"). Le bande di Coomassie-macchiato indicate sono state asportate e identificate come non-lipoproteine mediante MALDI-MS di peptidi triptici (Vedi tabella 1). PnrA è stato identificato e analizzato mediante il protocollo descritto nel presente documento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: cambiamenti di profilo e abbondanza di ioni con polarità di nitrocellulosa lavare soluzioni. (A) la frazione di tripsina Mostra parecchi frammenti peptidici interni corrispondente la lipoproteina di E. faecalis che PNRA indicato nella Figura 2. Il 10% 20% e (B) (C) acetonitrile lavare frazioni Visualizza cambiamenti nell'intensità del segnale e una diminuzione del numero complessivo dei singoli picchi. (D) la frazione di eluizione finale altamente è arricchita con il lipopeptide N-terminale a m /z 997, contrassegnati da un asterisco (*). Intensità di ogni spettri è normalizzato a (A) per il confronto dell'intensità del segnale. Masse di picchi e sequenze assegnati sono elencati nella tabella 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Banda Proteina ID N. adesione Peso molecolare di est. Conteggio del peptide
1 fattore di allungamento Tu GB | EOL37301.1 | 43.387 15
2 Perossidasi di NADH GB | EOL34572.1 | 49.520 9
3 piruvato deidrogenasi E1component, subunità alfa GB | EOL34709.1 | 41.358 12
4 componente di piruvato deidrogenasi E1, beta unità secondaria GB | EOL34710.1 | 35.373 19
5 Proteina ribosomiale 30s S2 GB | EOL33066.1 | 29.444 16
6 Proteina ribosomiale 30s S3 GB | EOL37312.1 | 24.355 14

Tabella 1: proteine precipitate sono contaminanti non-lipoproteina. Sono state identificate proteine di Trittico digest e MALDI-MS utilizzando standard in gel digestione protocolli19 e sono elencati dall'alto verso il basso nello stesso ordine appaiono sul gel Coomassie nella Figura 2. Ogni proteina è stata identificata con un intervallo di confidenza (C.I.) superiore al 95%.

Numero massimo Massa teorica Posizione di proteina Lol di siti di taglio senza risposta Sequenza del peptide
1 631.3409 170-176 0 GVADAAK
2 675.4035 316-321 1 TKEAVK
3 826.4093 163-169 0 FQAGFEK
4 893.4839 121-128 0 NVVSATFR
5 943.5359 240-247 0 VWVIGVDR
6 1040.5047 188-197 0 YAASFADPAK
7 1200.6331 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 1316.6997 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 1385.7827 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 1432.743 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 1568.7802 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 1672.8289 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 1707.8184 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 1724.8027 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 1797.9228 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 1872.9854 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 1945.9613 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 2240.1345 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 2675.2543 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

Tabella 2: osservate le masse e i corrispondenti peptidi triptici. In silico digestione della tripsina del PnrA E. faecalis (GenBank: EOL37280.1) è stata eseguita utilizzando PeptideMass20,21, permettendo fino a due perso tagliata siti. Le masse teoriche dei picchi osservati su spettri nella Figura 3 sono elencate, con le corrispondenti sequenze peptidiche.

Figure 4
Figura 4: MALDI-TOF MS della lipoproteina E. faecalis PnrA. (A) MS padre spettro del m /regione z 997 corrispondente per il lipopeptide N-terminale del PnrA E. faecalis . (B) MS/MS del picco lipopeptide rivela che è la forma di lyso, con la diagnostica N- acilato dehydroalanyl peptide frammento dello ione picco contrassegnato da un asterisco (*). (C)è riportata la struttura chiarita. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione9. R.I.: intensità relativa Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: formazione del complesso di sodio promuove la frammentazione di ioni di padre verso gli ioni di lipopeptide dehydroalanyl. (A) tra gli spettri MALDI-TOF del peptide della lipoproteina Lpp N-terminale e. coli senza (turchese tracce) e con (tracce blue) l'aggiunta di bicarbonato di sodio. Aggiunta di bicarbonato di sodio per la frazione eluita finale comporta un aumento di 22 dalla massa calcolata di lipopeptide il padre. Se confrontato con lo spettro di MS/MS dello ione protonata (B), lo spettro di MS/MS del corrispondente ione sodiated (C) Mostra significativa frammentazione preferenziale verso la N-acil-dehydroalanyl ione attraverso neutro eliminazione della parte di diacylthioglyceryl, contrassegnata da un asterisco (*). La struttura del peptide triptico padre triacylated Lpp N-terminale (D) e la N-acil-dehydroalanyl agli ioni frammento di peptide (E) sono raffigurati. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione9. R.I.: intensità relativa Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo di questo documento descrive due distinte fasi di caratterizzazione della lipoproteina: determinazione di partizionamento e strutturale mediante MALDI-TOF MS di fase di arricchimento di TX-114. Durante l'estrazione di TX-114, ulteriore centrifugazione rimuove contaminanti proteine che precipitano durante questo processo, seguito da precipitazione di acetone per produrre lipoproteine altamente arricchite. Limitando la scala di ogni preparazione a 15 mL vale la pena di cellule, parecchi campioni possono essere facilmente elaborati in parallelo e se lo si desidera, riuniti alla fine del protocollo.

Per l'analisi strutturale di MS, trasferimento delle lipoproteine a nitrocellulosa facilita la digestione della tripsina, lavaggio e successiva eluizione dalla membrana. Nelle nostre mani, questo approccio ha dimostrato di essere preferibile estrazione detergente-mediata da tappi gel di poliacrilammide tradizionali, come le lipoproteine sono associate con la superficie della membrana di nitrocellulosa e non incorporate in poliacrilammide. Associazione della lipoproteina con la superficie di nitrocellulosa previene anche in gran parte il problema comune di adsorbimento non specifico per superfici di contenitore di peptidi idrofobi. Eluizione graduale dei pezzi nitrocellulosa rimuove più idrofiliche, interni peptidi triptici che possono essere analizzate mediante MALDI-TOF MS per ottenere assegnazioni di identificazione della proteina elevata fiducia, mentre il passo di eluizione finale riproducibile produce lipopeptidi concentrata in un piccolo volume che è in gran parte privo di interferenti sali e ioni sopprimendo contaminanti.

Successo analisi MS di una lipoproteina sono soggetta a sua abbondanza, e come tale, le bande più scure dalla membrana Ponceau S-macchiato rischiano di dare i migliori risultati. Tuttavia, è possibile che diverse lipoproteine possono migrare in una singola banda durante la separazione di pagina, che complica lo spettri risultanti. Pertanto, si consiglia vivamente prima identificare la proteina dalla massa del peptide fingerprinting (PMF), che può essere compiuta da raccolta di spettri MS sulla frazione totale tripsina o frazione di lavare o acetonitrile e inserendo le cime risultante in un software come mascotte22. Una volta stabilita la sequenza della proteina, calcola la massa del trittico lipopeptide N-terminale significativamente aiuta nella scelta di quale ione al frammento di MS/MS.

Eterogeneità di esempio aggiuntivi possono derivare da diverse lunghezze di catena acil sulle lipoproteine all'interno di una popolazione e le loro modifiche del N-terminale, entrambi a seconda della fonte batteri6. Mentre la variazione di lunghezza di catena rende per i cluster di picco distintivo su spettri padre, caratterizzati da 14 Da incrementi corrispondenti a gruppi di metilene (- CH2-), può dividere il segnale lipopeptide complessiva e diminuire la sensibilità. È anche probabile che le forme differenti della lipoproteina influenzano arricchimento e frammentazione, anche se abbiamo identificato con successo triacylated, diacylated e lipoproteine di lyso-form utilizzando il protocollo descritto. Allo stesso modo, le variabili moiety peptide delle lipoproteine aggiungono un ulteriore livello di complessità per analisi, indipendentemente dalla loro struttura N-terminale, come una composizione aminoacidica molto idrofili può impedire lipopeptide partizionamento nella fase organica cloroformio utilizzando altri metodi di estrazione8. Trasferimento della lipoproteina a nitrocellulosa aiuterebbe a studiare tali lipopeptidi, come tutte le frazioni di eluizione possono essere analizzate in questo metodo.

Attingendo alla letteratura precedente che coinvolge triacilgliceroli e fosfolipidi23, la formazione del complesso sodio intenzionale può essere utilizzato per promuovere più informativo frammentazione mediante la formazione dei (N-acil)-ioni del peptide dehydroalanyl. Questi ioni caratteristici sono la chiave per assegnazione di struttura, dal momento che lo stato di acilazione del N-terminale è isolato dalle sostituzioni di acil nella parte di gliceril. Formazione del complesso di sodio fornisce una comoda opzione alternativa a zolfo ossidazione con perossido di idrogeno, che ha dimostrato di promuovere anche N-acil-dehydroalanyl peptide frammentazione6,8. Anche se sodio addotti possono show una soppressione totale del segnale dello ione genitore, l'aumento specifico nella frammentazione verso gli ioni dehydroalanyl compensa le intensità dello ione genitore diminuita. Potrebbe essere la pena di esplorare altre matrici e frammentazione di ulteriori complessi per suscitare gli spettri più informativi.

Questo protocollo migliora la fase di TX-114 tradizionale metodo per l'arricchimento della lipoproteina, di partizionamento mentre trasferimento delle lipoproteine pagina separato a membrana di nitrocellulosa facilita la digestione della tripsina e l'eluizione dei lipopeptidi. Analisi MALDI-TOF MS le frazioni triptico o lavare totale consente per l'identificazione di proteine in tandem con determinazione strutturale del N-terminale di MS/MS in un singolo esperimento. Opzionale sodio addotto formazione evidenzia differenze presso il lipopeptide N-terminale attraverso la promozione di frammentazione di ioni più informativo. La capacità di ordinariamente lipoproteine di purificare e caratterizzare il loro N-termini permetterà studi approfonditi sulla lipoproteina come romanzo le forme sono fatte, loro ruolo fisiologico all'interno della busta di cellula batterica e come essi vengono rilevati dal sistema immunitario dei mammiferi sistema.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ricerca nel laboratorio di Meredith è stata sostenuta dai fondi di avvio forniti da Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Ringraziamo il Dr. Tatiana Laremore per consulenza di tecnico esperti e accesso alle apparecchiature presso la Penn State proteomica e funzione di spettrometria di massa, University Park, PA, dove sono state effettuate analisi di spettrometrihe di massa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

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References

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