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同所性同種のモデルラット Suprahepatic 上大静脈再建のため新規磁気吻合法を用いた肝移植

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Medicine

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Summary

Suprahepatic 下大静脈 (グラフト) の再建のままラット同所性肝移植における困難なステップです。この記事で新規磁気吻合法を用いたラットにおけるグラフト再建の手順を追ってプロトコルを示す.

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Yang, L., Lu, J., Wang, Y., Zhang, M., Shi, Y., Wei, S., Liu, P., Wu, Z., Lv, Y., Wu, R. A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction. J. Vis. Exp. (133), e56933, doi:10.3791/56933 (2018).

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Abstract

同所性肝移植 (OLT) のモデルラットは移植研究のために不可欠です。非常に洗練された動物モデルで、急な学習曲線が必要です。門脈 (PV) と infrahepatic 上大静脈 (IHVC) の吻合のためカフ手法の導入は、ラットの移植手順を大幅に簡略化は。ただし、受信者の suprahepatic 上大静脈 (グラフト) の短いの前方壁のためカフ テクニックがグラフト再建に使用する非常に困難です。この分野のほとんどの研究者はまだラット同所性肝移植におけるボトルネックのステップはそれにグラフト再建手縫合手法を使用します。磁気吻合法 (すなわちmagnamosis) は、2 つの磁石との吸引力を使用して 2 つの容器を接続する方法です。私たちの最近の研究は、磁気吻合技術がラットにおけるグラフト再建手縫合法より優れていることを示しています。この記事で新規磁気吻合法を用いたラットにおけるグラフト再建の手順を追ってプロトコルを示す.このモデルでステント法による胆管 (BD) の再建を行った間に、太陽光発電と IHVC の再建が標準カフによる実行されました。肝再動脈化術は実行されませんでした。磁気吻合技術に簡単にグラフト再建を行った、anphepatic 相を大幅短縮します。合理的な学習曲線の後、高度な顕微鏡技術なしも研究者は OLT のこのモデルラットを使用して信頼性が高く、再現性のある結果を生成できます。

Introduction

同所性肝移植 (OLT) のモデルラットは移植研究1,2のために不可欠です。OLT の最初のラットは、李1973年3によって記述されていた。このモデルで全ての船舶は手縫合技術が再建されました。手縫合技術は高度な顕微鏡技術、その利用を大幅に制限する必要があります。それ以来、ラット OLT のプロトコルを元に様々 な変更が報告されています。再建術4 大幅簡体字とは、その中でも、カフ門脈 (太陽光発電) ・鎌田によって 1979 年に報告された infrahepatic 上大静脈 (IHVC) 吻合法はこのモデルから大幅に改善とみなされます.ただし、受信者の suprahepatic 上大静脈 (グラフト) の短いの前方壁のためカフ テクニックがグラフト再建に使用する非常に困難です。この分野のほとんどの研究者はまだラット OLT5,6,7でボトルネック ステップになりますグラフト再建手縫合手法を使用します。

磁気吻合法 (すなわちmagnamosis) は、2 隻または 2 つ磁石8,9,10,11の間の吸引力を使用して他の管状構造物への接続方法です。磁気力は徐々 に圧縮し、強力なステリ吻合12,13に組織を改造します。この圧縮吻合は、人間14,15で効果的な実証されています。我々 はラットのグラフト吻合用磁気リングのペアを設計しています。私たちの最近の研究は、磁気吻合技術がラット OLT16グラフト再建手縫合法より優れていることを示しています。この記事の目的は、新規磁気吻合法を用いたラットにおけるグラフト再建のため詳細なステップバイ ステップのプロトコルを提供することです。

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Protocol

プロトコルは、ケアと実験動物の使用のためのガイドラインに従って行われた、実験動物の倫理の西安交通大学、西安、陝西省、中国の委員会によって承認されました。

注: このプロトコルの手順のどれもを手術用顕微鏡の下で行った。

1. 術前準備

  1. デザインと形状の磁気リング (図 1) の
    1. ネオジム-鉄-ホウ素磁気リングのペアを照合することによって磁気吻合デバイスを組み立てます。
    2. それぞれ主要な軸径、短軸径、厚さ 8 mm、5.5 mm、1 mm の 0.5 g の重量とラット グラフトのパラメーターによるとリングをデザインします。
    3. ワイヤ電極切削法による曲線の所望の形状にリング チタン酸化物エアブラシで得られたリングをコートし、500 mg/L 6 h の 55-60 ° C でエチレン酸化物と消毒します。
  2. カフス (図 2)
    1. ポリエチレン管を切断することによって IHVC と PV の吻合のカフを準備します。確実に 5 mm カフ体 2 mm カフ拡張子と長い。
      注: IHVC カフのそれらは、2.6 と 2.8 mm、それぞれありますが、PV カフの内径、外径、1.8 と 2.1 mm です。
  3. ステント (図 2)
    1. 両端に傾斜を生成する長さ 5 mm の切削 24 G 静脈カニューレによって BD の吻合のためのステントを準備します。
  4. 実験動物
    1. ドナーとして 250 280 g と受信者との間の重量を量る男性スプレイグ ラットを使用します。ドナーよりも、受信者が同じ重量またはわずかに重い (< 10 g) であることを確認します。
    2. 食料と水は手術前に回線付き客室の室温制御にラットをしてください。

2. ドナー操作

  1. 注入ブプレノルフィン (0.05 mg/kg 皮下鎮痛剤として操作の前に 1 時間。
  2. イソフルラン吸入によるドナー ラットを麻酔します。5 vol % イソフルラン麻酔および流量 0.6 0.8 で 2 vol % イソフルランの誘導のプレキシ グラス箱に 1.5 L/分の流量で L/円錐分マスク麻酔の維持のため。つま先のピンチと皮膚のピンチを実行することによって麻酔の深さを確認します。
  3. クリーナーの露出を許可する電気シェーバーを使用してラットの腹部の肌全体を剃る。ポビドン ヨード液と対応する皮膚を消毒します。
  4. に沿って部の 3部上 1 cm 拡張するペニスの根本から手術用のはさみを使用して十字切開を介して腹腔内を開くlinea alba、腋窩中線に縦切開の中点から延びる。左に消化管を外在し、湿らせたガーゼでカバーします。
  5. クランプ、止血鉗子を用いた頭に向かって部の 3部を引き出します。肝鎌状間膜、肝周囲の結合織を解剖します。分離し、6-0 絹縫合糸と左下横隔静脈を結紮します。
  6. 胆管にステントを挿入します。
    1. 胃十二指腸静脈が門脈を結合点のすぐ上の BD をクランプし、microforceps を使用して、少しの緊張を維持するために引っ張ります。マイクロはさみで約 5 mm 胆道合流点に近位の前の壁に 1 ミリ長さの"V"切開を行います。
    2. 湾曲した microforceps を用いた胆管の内腔にステントを挿入します。胆管外ステント嘘の少なくとも半分を確認します。
    3. 6-0 シルク縫合糸でステントを保護します。縫合糸の一方の端をカットします。後吻合中に保持するために他の 1 つを保ちます。トランセクト ステント下胆管、胆管ステントから来ることができるかどうかを確認します。
  7. 左腎静脈レベルまでの IHVC を分離します。IHVC の白骨まで綿芽解離により前方と外側の周囲組織から IHVC を解放します。分離し、右副腎静脈と 6-0 シルク縫合糸で右腎静脈を結紮します。
  8. 陰茎背静脈を通して生理食塩水 2 mL で希釈したヘパリンの注入 50 U でラットを heparinize します。
  9. 肝灌流します。
    1. 左腎静脈下腹部大動脈を分離します。22 G のカテーテルを大動脈に挿入します。
    2. 開胸術を実行し、microforceps を使用して胸部下行大動脈のクランプします。
    3. 3 mL/分の速度で輸液ポンプとヘパリン (4 ° C) の 25 U を含む生理食塩水 20 mL で大動脈にカテーテルを通してドナーの肝臓を灌流します。一方で、肝臓の外に流す灌流液を許可するように右腎静脈下大静脈をカットします。
    4. ドナーの肝臓になった青白いとき横隔膜の一部とともにグラフトと左腎静脈レベルで IHVC を縦断面します。
  10. 2 つのマイクロ鉗子で PV を囲む結合組織を解剖します。縛るし、8-0 プロレン縫合糸で幽門静脈を分割します。脾静脈のレベルで太陽光発電を縦断面します。ドナーの肝臓を切除し、冷たい生理食塩水ですすいでください。冷たい生理食塩水では 4 ° C をお風呂の場所

3. 移植準備

注: 肝移植の準備のためのすべての手順は、4 ° C で冷たい生理食塩水のお風呂で実行

  1. カフをドナーの IHVC (図 3) に接続します。
    1. そのカフ肝臓に向かって指してカフ拡張子を持つ、IHVC に挿入します。IHVC の後部の壁にカフの拡張機能を配置します。お風呂コンテナー ファイルのクリップを使用して接続されている自体曲線 microforceps でカフの拡張と、IHVC を固定します。
    2. 2 つのマイクロ鉗子によるカフの体の上、IHVC の遠位端を片脚します。
    3. 6-0 絹縫合糸の端を固定します。処理中に、IHVC がねじれていないことを確認します。
  2. ドナーの PV にカフを付ける PV の 3.1 の手順を繰り返します。
  3. 磁気リングをドナーのグラフト (図 4) に接続します。
    1. 4 つの鉗子を介してダイヤフラムを引っ張るし、グラフトをトリムします。
    2. チタン合金マイクロ鉗子を用いた磁気リングを通してグラフトを渡します。
    3. グラフトの遠位端を輪をかけて片脚します。
    4. 6-0 絹縫合糸が付いているリングを固定します。グラフトは、プロセス中にねじれていないことを確認します。
    5. 肝臓の周り余分なダイヤフラムを削除します。
  4. 冷たい通常の生理食塩水のお風呂でドナーの肝臓を浸すし、4 ° C で保存

4. 受信者操作

注: 受信者のラット移植注入のスキーマは図 5に示すです。

  1. 注入ブプレノルフィン (0.05 mg/kg 皮下鎮痛剤として操作の前に 1 時間。イソフルラン吸入によるドナー ラットを麻酔します。5 vol % イソフルラン麻酔および流量 0.6 0.8 で 2 vol % イソフルランの誘導のプレキシ グラス箱に 1.5 L/分の流量で L/円錐分マスク麻酔の維持のため。
  2. ラットの腹部の肌全体を剃る。ポビドン ヨード液と対応する皮膚を消毒します。
  3. 4 cm 正中切開を介して腹腔内を開きます。腹部のリトラクターを配置します。正中線からできるだけ離れて肋骨を引き出します。
  4. クランプ、止血鉗子を用いた頭に向かって部の 3部を引き出します。肝臓の周りの靭帯、結合組織を解剖します。縛るし、肝食道靱帯を分割します。縛るし、8-0 プロレン縫合糸で肝動脈を分割します。
  5. 最初の肝内門脈から肝内胆管を分離します。その部門の下の総胆管周囲 6-0 絹糸を置き、総胆管を結紮します。
  6. 右腎静脈に IHVC を解剖します。縛るし、右副腎静脈を分割します。肝グラフトにストラップを配置します。
  7. IHVC 微小血管クリップで右腎静脈の真上をクランプします。微小血管クリップ幽門静脈レベルで太陽光発電をクランプします。
    1. 肝臓から血液をフラッシュ、ゆっくり PV を通して生理食塩水入りの 2 mL を注入します。以前に配置したストラップを引いて肝臓をドラッグします。Satinsky クランプ付きグラフトと横隔膜の部分をクランプします。
    2. 実質の近くに IHVC と肝門部の PV を縦断面します。Transecting グラフト肝のすぐ上で、肝臓を切除します。受信者の肝臓をすぐに削除します。
  8. 受信者のグラフトに磁気リングを取り付けます。
    1. 磁気リングに受信者の残りのグラフトを挿入します。
    2. Satinsky クランプの磁気吸引力によって磁気リングを修正します。
    3. 容器は、リングの端をカバーするまで、磁気リングをグラフトを片脚します。
  9. ドナー肝移植がんを置き、冷たいぬれたガーゼでカバーします。
  10. 生理食塩水で、ドナーと受信者の SHVCs の内腔を埋めます。空気塞栓を防ぐために徹底的に空気の泡を削除します。グラフト再建を完了するには、磁気力を通して一緒にドナーと受信者のグラフトに埋め込まれた磁性体リングを結合します。
  11. PV を再構築します。
    1. PV のテンションを維持するために 8-0 プロレン縫合糸を引いて受信者の PV の左右分岐管。
    2. 幽門静脈から静脈を完全に公開するための脾静脈にダウン受信者の PV のクランプを移動します。
    3. 受信者の前壁を切開します。PV の内腔を生理食塩水で満たしなさい。
    4. カーブタイプ鉗子とドナーの PV のカフの拡張子を保持します。
    5. 受信者の生食による太陽光発電ルーメンのフラッシュを維持しながら PV にドナーの PV のカフ本体を挿入します。
    6. 6-0 絹糸を結紮、円周で固定します。太陽光発電とグラフトのクランプを外して移植肝臓への血流を再確立します。
  12. IHVC、IHVC を再構築するために 4.11 手順を繰り返します。
  13. ステント法による胆管を再建します。
    1. 受信者の胆管の前方の壁に"V"を切開します。
    2. 受信者 BD の内腔にドナー ステントを挿入し、6-0 周絹糸でそれを修正します。2 胆管を一緒に縫合糸を引き、お互いに近い BD に縫合糸を結ぶ。
    3. 大網組織を胆汁の漏れを防ぐために吻合に折り返します。
  14. 温かい生理食塩水を腹腔内に水を引きます。3-0 非吸収性の外科的縫合連続の二層で腹部切開を閉じる。
  15. すぐに 16 mg/kg セフロキシム (抗生物質)、0.05 mg/kg ブプレノルフィン (鎮痛剤) を皮下注射、術後後管理します。
  16. きれいなケージでラットを配置し、食品を許可する自由水します。
  17. 注入セフロキシム (16 mg/kg)、ブプレノルフィン (0.05 mg/kg 腹腔内 3 日間 12 時間ごと。

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Representative Results

約 10 回試行後グラフト再建のため磁気吻合法正常に事前のトレーニングがなかった者によって習得されました。グラフト再建は、2 分未満を取った。受信者のラットの無肝期は約 10 分です。血栓症、出血または angiostegnosis られなかったグラフト吻合部に 1, 5, 30 日再灌流後に。大静脈栓塞は、移植後 2 週間で行われました。図 6のように、磁性体のリングはそのままされ血流、グラフト吻合を介して特許。移植後の生存率は 95 %1 日目、3 日目で 90% と 85% 日 30 に 7 (図 7)。

Figure 1
図 1:設計 (A) とグラフト吻合のため磁気リングの写真 (B)。
グラフト: suprahepatic 下大静脈。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:袖口と IHVC (A)、(B) 太陽光発電の吻合のためステントと BD (C)。
IHVC: infrahepatic 下大静脈。太陽光発電: 門脈;BD: 胆管。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:IHVC と PV のカフ吻合のスキーマです。カフ (A); IHVC または PV に挿入します。2 microforceps (B) を使用してカフの体の上 IHVC または PV の遠位端を片脚します。6-0 (C) 絹縫合糸の端を確保します。受信者の IHVC または PV (D) にドナーの IHVC または PV のカフ本体を挿入します。
IHVC: infrahepatic 下大静脈。太陽光発電: 門脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:磁気グラフト吻合のスキーマです。チタン合金 microforceps (A); を使用して磁気リングを通してグラフトを渡すエバート リング (B) をグラフトの遠位端6-0 (C) 絹縫合糸が付いているリングを固定します。磁性体リングのカップルは、一緒に磁気力 (D) を通じてのドナーと受信者のグラフトに埋め込まれます。
グラフト: suprahepatic 下大静脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:受信者のラット移植注入のスキーマです。グラフト再建: 磁気吻合;IHVC と太陽光発電の再建: カフ吻合;BD の再建: ステント吻合。HA の復元: は実行されません。
グラフト: suprahepatic 下大静脈。IHVC: infrahepatic 下大静脈。太陽光発電: 門脈;BD: 胆管HA: 肝動脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6:移植後 2 週目にラットの大静脈栓塞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7:移植後生存の代表的な治療法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

肝移植で多くの臨床進行は動物研究に起因することができます。ラット OLT は、臓器保存、移植免疫学、生理学、病理学の研究に広く使われている、よく受け入れられたモデルです。しかし、それは非常に複雑なプロシージャではまた、顕微鏡の高度なスキルが必要です。ラット OLT の手順で多くの改善にもかかわらずグラフト吻合困難なステップに残った。この記事でラット OLT グラフト再建のため新規磁気吻合手法について述べる。この技術の応用は、2 分以内とラット OLT から約 10 分の無肝期グラフト再建のため時間を短縮しました。この手法は、移植研究の大きな意味と考えています。

この磁気吻合手法を用いたグラフト再建の重要なステップは、ドナーと受信者のグラフトに磁性体のリングを付ける。すべての警告を使用して、グラフトをねじったりしないでくださいください。さらに、2 つの磁気リングを接続すると、グラフトにおける気泡の除去されるべき徹底的に。

このテクニックを使用していくつかの制限があります。Fischer 344 ラットなどバッファロー ラットのラットのいくつかの系統がある非常に短いグラフト。そのグラフトに磁気リングを添付することが可能です。したがって、彼らはこの手法に適したはありません。ただし、このテクニック スプレイグ ラットを含むラット、ルイス ・ ラット、茶色ラットのほとんどの系統で、簡単に OLT に適用できます。磁性体リングは磁気共鳴イメージ投射 (MRI) スキャンを妨げることができます。したがって、MRI 検査が実験のために必要な場合は、この磁気吻合法を使用できません。

要約すると、磁気吻合法、簡単かつ高速のグラフト再建ラット可能。合理的な学習曲線の後、高度な顕微鏡技術なしも研究者は OLT のこのモデルラットを使用して信頼性が高く、再現性のある結果を生成できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

この作品は、省の教育革新チーム開発プログラム中国の号からの補助金によって支えられました。IRT16R57)、中国 (第 81470896)、研究の国家自然科学基金の若い才能を募集予定の西安交通大学 (RW) に資金を提供します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Machine Harvard  tabletop Animal anaesthesia
PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System Perlong Medical PLX7000B It is mainly used for the angiography and photography of various operations
Syringe Pump Mindray BeneFusion SP5 intravenous infusion
Isoflurane RWD life Science Co. anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
iohexol Shanghai General Pharmaceutical Co  intravascular contrast media  
heparin sodium injection SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD   prevent the formation of thrombosis 
cefuroxime  Glaxo Operations UK Limited  an antibiotic
buprenorphine  TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd an analgesic
curved microforceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. W40350 surgical tool
hemostatic forceps(straight) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31010 surgical tool
hemostatic forceps(curved) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31020 surgical tool
Satinsky clamp Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC050 surgical tool
needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32010 surgical tool
microneedle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WBA040 surgical tool
notched forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J42010 surgical tool
tissue forceps(with hook) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J41010 surgical tool
tissue scissor Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00040 surgical tool
surgical scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00030 surgical tool
micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. MR-S121T surgical tool
microvessel clips Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC240 surgical tool
straight microforceps(titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC010 surgical tool
curved microforceps  (titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC020 surgical tool

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References

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