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Um modelo do rato de ortotópico transplante hepático, usando uma técnica de anastomose magnético romance para reconstrução de veia Cava Suprahepatic

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Summary

A reconstrução da veia cava suprahepatic (SHVC) continua a ser uma etapa difícil em transplante ortotópico de fígado de rato. Neste artigo, vamos mostrar um protocolo passo a passo para a reconstrução de SHVC em ratos utilizando uma técnica de anastomose magnético romance.

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Yang, L., Lu, J., Wang, Y., Zhang, M., Shi, Y., Wei, S., Liu, P., Wu, Z., Lv, Y., Wu, R. A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction. J. Vis. Exp. (133), e56933, doi:10.3791/56933 (2018).

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Abstract

O modelo do rato de transplante ortotópico de fígado (OLT) é essencial para a pesquisa de transplante. É um modelo animal muito sofisticado e requer uma curva de aprendizagem. A introdução da técnica do manguito para anastomose da veia porta (PV) e infrahepatic veia cava (IHVC) simplificou significativamente o processo de transplante em ratos. No entanto, devido à parede anterior curta da suprahepatic veia cava dos beneficiários (SHVC), a técnica de punho é muito difícil de usar para a reconstrução do SHVC. A maioria dos pesquisadores neste campo ainda usam a técnica de mão-sutura para reconstrução SHVC, que torna a etapa do gargalo em transplante ortotópico de fígado de rato. A técnica de anastomose magnético (ou seja, magnamosis) é um método de conectar dois navios usando a força atrativa entre dois ímãs. Nosso estudo recente demonstrou que a técnica de anastomose magnética é superior à técnica de mão-sutura para reconstrução SHVC em ratos. Neste artigo, vamos mostrar um protocolo passo a passo para a reconstrução de SHVC em ratos utilizando a técnica de anastomose magnético romance. Neste modelo, a reconstrução do PV e IHVC foi realizada pela técnica de manguito padrão, enquanto a reconstrução do ducto biliar (BD) foi realizada por uma técnica de stent. O re-arterialization hepática não foi realizada. A técnica de anastomose magnética facilitou muito reconstrução SHVC e significativamente encurtado a fase anphepatic. Depois de uma curva de aprendizado razoável, até mesmo pesquisadores sem habilidades avançadas microcirúrgicos podem produzir resultados confiáveis e reprodutíveis, usando este modelo do rato de OLT.

Introduction

O modelo do rato de transplante ortotópico de fígado (OLT) é essencial para a pesquisa de transplante1,2. O primeiro rato OLT foi descrito por Lee et al . em 19733. Nesse modelo, todos os navios foram reconstruídos através da técnica de mão-sutura. A técnica de sutura-mão requer conhecimentos avançados de microcirúrgicos, que limita significativamente a sua utilização. Desde então, várias modificações no protocolo original de rato OLT foram relatadas. Entre eles, a técnica de punho para anastomose da veia porta (PV) e relatado por Kamada et al em 1979 infrahepatic veia cava (IHVC) é considerada um grande avanço para este modelo, significativamente simplificado dos procedimentos de reconstrução4 . No entanto, devido à parede anterior curta da suprahepatic veia cava dos beneficiários (SHVC), a técnica de punho é muito difícil de usar para a reconstrução do SHVC. A maioria dos pesquisadores neste campo ainda usam a técnica de mão-sutura para reconstrução SHVC, que torna a etapa gargalo no rato OLT5,6,7.

A técnica de anastomose magnético (ou seja, magnamosis) é um método de conectar dois vasos ou outras estruturas tubulares, usando a força atrativa entre dois ímãs8,9,10,11. A força magnética gradualmente comprime e remodela o tecido em uma anastomose forte, sutureless12,13. Esta anastomose de compressão tem provado para ser eficaz em seres humanos14,15. Nós projetamos um par de anéis magnéticos especificamente para a anastomose do SHVC em ratos. Nosso estudo recente demonstrou que a técnica de anastomose magnética é superior à técnica de sutura-mão para a reconstrução SHVC rato OLT16. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo detalhado, passo a passo para reconstrução SHVC em ratos utilizando a técnica de anastomose magnético romance.

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Protocol

O protocolo foi realizado em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foi aprovado pela Comissão de ética do Animal experimentos de Xian Jiaotong University, Xi ' an, província de Shaanxi, China.

Nota: Nenhum dos procedimentos neste protocolo foi realizada sob um microscópio cirúrgico.

1. pré-preparação

  1. O Design e a forma dos anéis magnéticos (Figura 1)
    1. Monte o dispositivo magnético anastomose combinando um par de anéis magnéticos de neodímio-ferro-boro.
    2. Desenha os anéis de acordo com os parâmetros do rato SHVC com um diâmetro de eixo principal, diâmetro de eixo menor, espessura e peso de 8 mm, 5.5 mm, 1 mm, 0,5 g, respectivamente.
    3. Curva os anéis para a forma desejada por uma técnica de corte do arame-eletrodo, revestir os anéis obtidos com um aerógrafo de óxido de titânio e esterilizar com óxido de etileno 500 mg/L em 55-60 ° C por 6 h.
  2. As algemas (Figura 2)
    1. Prepare a braçadeira para anastomose do IHVC e do PV, cortando o tubo de polietileno. Certifique-se de que o corpo da braçadeira é 5 mm comprimento com uma extensão de manguito de 2 mm.
      Nota: Os diâmetros internos e externas da braçadeira PV são 1,8 e 2,1 mm, enquanto os do manguito IHVC são 2.6 e 2.8 mm, respectivamente.
  3. O Stent (Figura 2)
    1. Prepare o stent para anastomose de BD por cânula intravenosa de corte-24G com um comprimento de 5 mm para produzir inclinação em ambas as extremidades.
  4. Animais experimentais
    1. Use ratos Sprague Dawley masculinos com peso entre 250 e 280 g como doadores e receptores. Certifique-se de que o destinatário é o mesmo peso ou ligeiramente mais pesado (< 10 g) do que o doador.
    2. Manter os ratos em quartos climatizados com acesso gratuito à comida e água antes da cirurgia.

2. o doador operação

  1. Injete buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico 1 hora antes da operação.
  2. Anestesia o rato doador por inalação de isoflurano. Uso 5 vol % isoflurano com um caudal de 1,5 L/min em uma caixa de acrílico para a indução da anestesia e 2 vol % isoflurano com um caudal de 0,6-0,8 L/min em um cone de máscara para a manutenção da anestesia. Confirme a profundidade da anestesia, realizando uma pitada de dedo do pé e um beliscão.
  3. Raspe a pele abdominal inteira do rato usando uma máquina de barbear eléctrica para permitir a exposição mais limpa. Desinfecte a pele correspondente com uma solução de iodo-povidona.
  4. Abrir a cavidade abdominal através de uma incisão cruciforme utilizando tesouras cirúrgicas da raiz do pénis estendendo-se até 1 cm acima do xiphisternum ao longo linea alba, estendendo-se do ponto médio da incisão longitudinal à linha claro. Exteriorize o trato gastrointestinal para a esquerda e cubra-o com gaze molhada.
  5. Pinça e puxe o xiphisternum em direção a cabeça usando uma pinça hemostática. Disse o ligamento falcêmicos e os tecidos conectivos ao redor do fígado. Isolar e ligate a veia frênica inferior esquerda com uma sutura de seda 6-0.
  6. Insira o stent no ducto biliar.
    1. Fixar o BD só acima do ponto onde a veia gastroduodenal junta-se a veia porta e puxe-a para manter um pouco de tensão usando um microfórceps. Em seguida, execute uma incisão de "V" de 1 mm de comprimento na parede anterior, cerca de 5 mm proximal da confluência biliar por uma micro tesouras.
    2. Inserir o lúmen do ducto biliar, usando um curva um microfórceps o stent. Certifique-se de pelo menos um meio do stent encontra-se fora do ducto biliar.
    3. Fixe o stent com uma sutura de seda 6-0. Corte uma extremidade da sutura. Manter o outro de prender durante a anastomose mais tarde. Transecto ducto biliar abaixo do stent e certifique-se que a bile pode sair o stent.
  7. Isole o IHVC abaixo do nível da veia renal esquerda. Livre o IHVC anterior e lateral tecidos circundantes por dissecação de broto de algodão até o IHVC é esqueletizado. Separar e ligate a veia supra-renal direita e a veia renal direita com uma sutura de seda 6-0.
  8. Heparinize o rato por injetar 50 U de heparina diluída em 2 mL de solução salina normal na veia dorsal do pênis.
  9. Perfundir o fígado.
    1. Isole a aorta abdominal abaixo da veia renal esquerda. Inserir um cateter 22-G da aorta.
    2. Realizar uma toracotomia, fixar a aorta torácica usando um microfórceps.
    3. Perfundir o fígado através do cateter na aorta com 20 mL de solução salina normal contendo 25 U de heparina (4 ° C) à taxa de 3 mL/min com uma bomba de infusão. Entretanto, corte a veia cava inferior veia renal direita para permitir que a solução de perfusão flua para fora do fígado.
    4. Transecto a SHVC juntamente com parte do diafragma e IHVC ao nível da veia renal esquerda, quando o fígado tornou-se pálida.
  10. Disse o tecido conjuntivo em torno do PV por duas pinças micro. Ligate e dividir as veias pilórica com uma sutura prolene de 8-0. Transecto o PV a nível da veia esplênica. Impostos especiais de consumo do fígado do doador e enxaguá-lo com solução salina normal fria. Lugar em uma solução salina fria do banho 4 ° C.

3. preparação do enxerto

Nota: Todos os procedimentos para a preparação do enxerto hepático são executados em um banho de solução salina frio a 4 ° C.

  1. Anexe um manguito IHVC do doador (Figura 3).
    1. Inserir o IHVC em seu punho com a extensão de punho, apontando para o fígado. Posicione a extensão da braçadeira na parede posterior da IHVC. Fixe a extensão do punho e o IHVC com um microfórceps curvado em si anexado usando um clipe de arquivo para o contêiner de banho.
    2. Evert a extremidade distal do IHVC sobre o corpo da braçadeira usando dois micro fórceps.
    3. Fixe a borda com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se que o IHVC não está torcido durante o processo.
  2. Repita o passo 3.1 sobre o PV para anexar um manguito a PV do doador.
  3. Encaixe um anel magnético SHVC do doador (Figura 4).
    1. Puxar o diafragma através do quatro fórceps e aparar o SHVC.
    2. Passe o SHVC através do anel magnético usando a pinça microliga de titânio.
    3. Evert a extremidade distal do SHVC sobre o anel.
    4. Segure o anel com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se que o SHVC não está torcido durante o processo.
    5. Retire o diafragma em excesso à volta do fígado.
  4. Mergulhe o fígado em um banho de solução salina normal frio e armazenar a 4 ° C.

4. operação destinatário

Nota: O esquema da implantação enxerto no rato destinatário é mostrado na Figura 5.

  1. Injete buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico 1 hora antes da operação. Anestesia o rato doador por inalação de isoflurano. Uso 5 vol % isoflurano com um caudal de 1,5 L/min em uma caixa de acrílico para a indução da anestesia e 2 vol % isoflurano com um caudal de 0,6-0,8 L/min em um cone de máscara para a manutenção da anestesia.
  2. Raspe a pele abdominal inteira do rato. Desinfecte a pele correspondente com uma solução de iodo-povidona.
  3. Abra a cavidade abdominal através de uma incisão de 4 cm. Coloque os afastadores abdominais. Puxe as costelas tão longe quanto possível da linha média.
  4. Pinça e puxe o xiphisternum em direção a cabeça usando uma pinça hemostática. Disse os tecidos conectivos e ligamentos em torno do fígado. Ligate e dividir o ligamento hepato-esofágica. Ligate e dividir a artéria hepática com uma sutura prolene de 8-0.
  5. Isole o ducto biliar comum, a partir do primeiro portal hepático. Coloque uma sutura de seda 6-0 ao redor do ducto biliar comum, logo abaixo de sua divisão e ligar o ducto biliar comum.
  6. Disse o IHVC até a veia renal direita. Ligate e dividir a veia adrenal direita. Coloque uma cinta no SHVC do fígado.
  7. Prenda o IHVC logo acima da veia renal direita com clipes de microvessel. Grampeie o PV a nível da veia pilórica com clipes de microvessel.
    1. Para liberar o sangue para fora do fígado, lentamente injete 2 mL de solução salina através do PV. Arraste o fígado puxando a correia previamente colocada. Prenda o SHVC e parte do diafragma com uma pinça Satinsky.
    2. Transecto o IHVC perto do parênquima e o PV na porta hepatis. Excisar o fígado por cruza o SHVC logo acima do fígado. Remova o destinatário fígado rapidamente.
  8. Encaixe um anel magnético SHVC do destinatário.
    1. Inserir um anel magnético SHVC restantes do destinatário.
    2. Corrigi o anel magnético em uma pinça Satinsky por atração magnética.
    3. Evert o SHVC sobre o anel magnético até o navio cobre a borda do anel.
  9. Coloque o orthotopically de fígado enxerto doador e cubra-o com uma gaze molhada fria.
  10. Preencha o lúmen do SHVCs do doador e do receptor com solução salina normal. Remova as bolhas de ar cuidadosamente para evitar embolia gasosa. Termine a reconstrução SHVC pelo acoplamento magnéticos anéis incorporados no do dador e do receptor SHVC juntos através da força magnética.
  11. Reconstrua o PV.
    1. Trato de ramo direito e esquerdo do PV do destinatário, puxando uma sutura prolene de 8-0 para manter a tensão de PV.
    2. Deslocar a braçadeira do PV do destinatário para baixo da veia piloro para a veia esplênica para expor a veia totalmente.
    3. Incise a parede anterior do destinatário. Preencha o lúmen do PV com solução salina normal.
    4. Segure a extensão do punho do PV do doador com uma pinça curvada.
    5. Insira o corpo da braçadeira de PV do doador no PV do destinatário ao mesmo tempo manter o lúmen do PV com solução salina normal de lavagem.
    6. Prenda-o com um circunferencial ligadura seda 6-0. Restabelece o fluxo de sangue para o fígado do enxerto, liberando os grampos no PV e SHVC.
  12. Repita a etapa 4.11 sobre o IHVC para reconstruir o IHVC.
  13. Reconstrua o ducto biliar por uma técnica de stent.
    1. Faça uma incisão na parede anterior do canal biliar comum destinatário "V".
    2. Inserir o stent de doador no lúmen do destinatário BD e corrigi-lo com uma sutura circunferencial seda 6-0. Puxe as suturas em dois ductos biliares juntos e amarre as suturas para trazer o BD perto um do outro.
    3. Enrola o tecido omento anastomótico para evitar vazamento de bile.
  14. Irriga a cavidade abdominal com solução salina normal quente. Feche a incisão do abdômen em duas camadas com uma contínua sutura cirúrgica não absorvível 3-0.
  15. Administre cefuroxima 16 mg/kg (um antibiótico) e a buprenorfina (analgésico) de 0,05 mg/kg por via subcutânea após a operação imediatamente.
  16. Coloque o rato em uma gaiola limpa e permitir que a comida e água ad libitum.
  17. Injete cefuroxima (16 mg/kg) e a buprenorfina (0,05 mg/kg) na cavidade abdominal em 12 horas por 3 dias.

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Representative Results

Após cerca de 10 tentativas, a técnica de anastomose magnético para reconstrução SHVC com êxito foi masterizada por um pesquisador que não teve nenhum treinamento prévio microcirúrgico. A reconstrução do SHVC levou menos de 2 min. A fase de anhepatic para os destinatários ratos foi aproximadamente 10 min. Sem trombose, hemorragia ou angiostegnosis foi observada em anastomótico SHVC 1, 5 e 30 dias após a reperfusão. Cavography a veia inferior foi realizada em 2 semanas após o transplante. Como mostrado na Figura 6, os anéis magnéticos estavam intactos, e o fluxo de sangue era patente através da anastomose SHVC. A sobrevida pós-transplante foi 95% no dia 1, no dia 3, de 90% e 85% em dias de 7 a 30 (Figura 7).

Figure 1
Figura 1 : O projeto (A) e foto (B) do anel magnético para anastomose do SHVC.
SHVC: suprahepatic veia cava.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : As algemas e o stent para anastomose da IHVC (A), PV (B) e BD (C).
IHVC: infrahepatic veia cava; PV: veia; BD: colagogo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema de anastomose manguito do IHVC e do PV. Inserir o IHVC ou o PV em um manguito (A); Evert a extremidade distal do IHVC ou do PV sobre o corpo da braçadeira usando dois um microfórceps (B); Fixe a borda com uma sutura de seda 6-0 (C); Insira o corpo da braçadeira de IHVC ou PV do doador do destinatário IHVC ou PV (D).
IHVC: infrahepatic veia cava; PV: veia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de anastomose magnético da SHVC. Passe o SHVC através de um anel magnético usando o liga de titânio um microfórceps (A); Evert a extremidade distal do SHVC sobre o anel (B); Segure o anel com uma sutura de seda 6-0 (C). Dois anéis magnéticos incorporado do dador e do receptor SHVC juntos através da força magnética (D).
SHVC: suprahepatic veia cava. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Esquema da implantação enxerto no rato destinatário. Reconstrução do SHVC: anastomose magnético; Reconstrução do IHVC e PV: algemar anastomose; Reconstrução de BD: anastomose do stent. Reconstrução do HA: não realizada.
SHVC: suprahepatic veia cava; IHVC: infrahepatic veia cava; PV: veia; BD: colagogo; HA: artéria hepática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Cavography de veia inferior do rato em 2 semanas após o transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Cura de representativa de sobrevivência após o transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Muitos clínicos progride em transplante de fígado pode ser atribuída a estudos com animais. OLT é um modelo bem aceito e amplamente utilizado na pesquisa de preservação de órgãos, transplante de Imunologia, fisiologia e patologia. No entanto, também é um processo muito complicado e requer habilidade microcirúrgica avançada. Apesar de muitas melhorias no procedimento de rato OLT, anastomose SHVC permaneceu uma etapa desafiadora. Neste artigo, descrevemos uma técnica de anastomose magnético romance para a reconstrução SHVC rato OLT. A aplicação desta técnica reduziu o tempo de reconstrução SHVC para menos de 2 min e a fase anhepatic do rato OLT para cerca de 10 min. Acreditamos que esta técnica tem grandes implicações na pesquisa de transplante.

O passo crítico na usando esta técnica de anastomose magnético para a reconstrução do SHVC é anexar os anéis magnéticos para SHVC do doador e do receptor. Todo cuidado deve ser usado para evitar a torção da SHVC. Além disso, ao se conectar os dois anéis magnéticos, bolhas de ar na SHVC devem ser removidas completamente.

Existem algumas limitações no uso desta técnica. Algumas cepas de ratos como Fischer-344 ratos e ratos de búfalo tem um SHVC extremamente curto. É impossível anexar o anel magnético para seu SHVC. Assim, eles não são adequados para esta técnica. No entanto, esta técnica pode ser facilmente aplicada para OLT na maioria das cepas de ratos, incluindo ratos Sprague Dawley, Lewis ratos e ratos de Noruega marrons. Anéis magnéticos podem interferir com o exame de ressonância magnética (MRI). Portanto, esta técnica de anastomose magnético não pode ser usada se um exame de MRI é necessário para o experimento.

Em resumo, a técnica de anastomose magnético possibilita fácil e rápida reconstrução SHVC em ratos. Depois de uma curva de aprendizado razoável, até mesmo pesquisadores sem habilidades avançadas microcirúrgicos podem produzir resultados confiáveis e reprodutíveis, usando este modelo do rato de OLT.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério da educação inovação equipe desenvolvimento programa de China (n. º IRT16R57), Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81470896) e uma investigação financiar para jovens talentos recrutamento planos de Xi'an Jiaotong University (RW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Machine Harvard  tabletop Animal anaesthesia
PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System Perlong Medical PLX7000B It is mainly used for the angiography and photography of various operations
Syringe Pump Mindray BeneFusion SP5 intravenous infusion
Isoflurane RWD life Science Co. anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
iohexol Shanghai General Pharmaceutical Co  intravascular contrast media  
heparin sodium injection SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD   prevent the formation of thrombosis 
cefuroxime  Glaxo Operations UK Limited  an antibiotic
buprenorphine  TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd an analgesic
curved microforceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. W40350 surgical tool
hemostatic forceps(straight) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31010 surgical tool
hemostatic forceps(curved) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31020 surgical tool
Satinsky clamp Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC050 surgical tool
needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32010 surgical tool
microneedle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WBA040 surgical tool
notched forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J42010 surgical tool
tissue forceps(with hook) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J41010 surgical tool
tissue scissor Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00040 surgical tool
surgical scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00030 surgical tool
micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. MR-S121T surgical tool
microvessel clips Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC240 surgical tool
straight microforceps(titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC010 surgical tool
curved microforceps  (titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC020 surgical tool

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References

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