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Un modelo de rata de Orthotopic trasplante del hígado usando una técnica de Anastomosis magnética novela para la reconstrucción de la Vena Cava suprahepática

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Summary

La reconstrucción de la cava suprahepática (SHVC) sigue siendo un paso difícil en el trasplante orthotopic del hígado de rata. En este artículo, se muestra un protocolo paso a paso para la reconstrucción de SHVC en ratas usando una técnica de anastomosis magnética novela.

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Yang, L., Lu, J., Wang, Y., Zhang, M., Shi, Y., Wei, S., Liu, P., Wu, Z., Lv, Y., Wu, R. A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction. J. Vis. Exp. (133), e56933, doi:10.3791/56933 (2018).

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Abstract

El modelo de la rata del trasplante orthotopic del hígado (OLT) es esencial para la investigación del trasplante. Es un modelo animal muy sofisticado y requiere una curva de aprendizaje. La introducción de la técnica del manguito para la anastomosis de la vena porta (PV) y infrahepatic de la vena cava (IHVC) ha simplificado considerablemente el procedimiento de trasplante en ratas. Sin embargo, debido a la poca pared anterior de suprahepáticas vena cava los destinatarios (SHVC), la técnica del manguito es muy difícil de utilizar para la reconstrucción de la SHVC. Mayoría de los investigadores en este campo todavía utiliza la técnica de sutura de mano para la reconstrucción de SHVC, que hace el paso cuello de botella en el trasplante orthotopic del hígado de rata. La técnica de anastomosis magnética (es decir, magnamosis) es un método de conectar dos vasos con la fuerza de atracción entre dos imanes. Nuestro reciente estudio ha demostrado que la técnica de anastomosis magnética es superior a la técnica de sutura de la mano para reconstrucción SHVC en ratas. En este artículo, se muestra un protocolo paso a paso para la reconstrucción de SHVC en ratas mediante la técnica de anastomosis magnética novela. En este modelo, la reconstrucción de la PV y IHVC se realizó por la técnica de brazalete estándar, mientras que la reconstrucción de la vía biliar (BD) fue realizada por una técnica de stent. No se realizó la arterialización de la hepática. La técnica de anastomosis magnética hace mucho más fácil reconstrucción SHVC y había acortado significativamente la fase anphepatic. Después de una curva de aprendizaje razonable, los investigadores incluso sin conocimientos de microcirugía avanzadas pueden producir resultados fiables y reproducibles mediante este modelo de rata de OLT.

Introduction

El modelo de la rata del trasplante orthotopic del hígado (OLT) es esencial para trasplante investigación1,2. La primera rata OLT fue descrita por Lee et al. en 19733. En ese modelo, todos los buques fueron reconstruidos por la técnica de sutura de la mano. La técnica de sutura de mano requiere técnicas avanzadas de microcirugía, que limita significativamente su utilización. Desde entonces, se han reportado diversas modificaciones del protocolo original de rata OLT. Entre ellos, la técnica del manguito para la anastomosis de la vena porta (PV) y infrahepatic de la vena cava (IHVC) reportado por Kamada et al. en 1979 se considera una mejora importante para este modelo, como simplifica significativamente los procedimientos de reconstrucción4 . Sin embargo, debido a la poca pared anterior de suprahepáticas vena cava los destinatarios (SHVC), la técnica del manguito es muy difícil de utilizar para la reconstrucción de la SHVC. Mayoría de los investigadores en este campo todavía utiliza la técnica de sutura de mano para la reconstrucción de SHVC, que hace el paso cuello de botella en rata OLT5,6,7.

La técnica de anastomosis magnética (es decir, magnamosis) es un método de conectar dos vasos u otras estructuras tubulares con la fuerza de atracción entre dos imanes8,9,10,11. Poco a poco, la fuerza magnética comprime y remodela el tejido en un fuerte, sutureless anastomosis12,13. Esta anastomosis de compresión ha demostrado para ser eficaz en los seres humanos14,15. Hemos diseñado un par de anillos magnéticos específicamente para la anastomosis de la SHVC en ratas. Nuestro reciente estudio ha demostrado que la técnica de anastomosis magnética es superior a la técnica de sutura de la mano para reconstrucción SHVC en rata OLT16. El propósito de este artículo es proporcionar un protocolo detallado, paso a paso para la reconstrucción de SHVC en ratas mediante la técnica de anastomosis magnética novela.

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Protocol

El protocolo se llevó a cabo con arreglo a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fue aprobado por el Comité sobre el ética de Animal experimentos de Xian Universidad Jiaotong, Xi ' an, Shaanxi provincia, China.

Nota: Ninguno de los procedimientos en el presente Protocolo fue realizada bajo un microscopio quirúrgico.

1. preoperatorio preparación

  1. El diseño y la forma de los anillos magnéticos (figura 1)
    1. Montar el dispositivo de anastomosis magnética haciendo coincidir un par de anillos magnéticos de neodimio-hierro-boro.
    2. Diseño de los anillos de acuerdo a los parámetros de rata SHVC con un diámetro longitudinal, diámetro del eje menor, espesor y peso de 8 mm, 5.5 mm, 1 mm, 0.5 g, respectivamente.
    3. Curva de los anillos en la forma deseada mediante una técnica de corte de alambre-electrodo, cubrir los anillos obtenidos con un aerógrafo de óxido de titanio y esterilizar con óxido de etileno de 500 mg/L a 55-60 ° C por 6 h.
  2. Los pun ¢ os (figura 2)
    1. Prepare el brazalete para la anastomosis de la IHVC y PV cortando el tubo de polietileno. Asegúrese de que el cuerpo de banda es 5 mm largo, con una extensión de la banda de 2 mm.
      Nota: Los diámetros interiores y exteriores de la banda de PV son 1.8 y 2.1 mm, mientras que los de la banda IHVC 2.6 y 2.8 mm, respectivamente.
  3. El Stent (figura 2)
    1. Preparar el stent para la anastomosis de la BD por cánula intravenosa de corte 24-G con una longitud de 5 m m para producir inclinación en ambos extremos.
  4. Animales de experimentación
    1. Utilizar ratas Sprague Dawley macho pesa entre 250 y 280 g como donantes y receptores. Asegúrese de que el destinatario es el mismo peso o un poco más pesado (< 10 g) que el donante.
    2. Mantener las ratas en habitaciones climatizadas con acceso a alimentos y agua antes de la cirugía.

2. donante operación

  1. Inyectar la buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea como analgésico 1 hora antes de la operación.
  2. Anestesiar la rata donante por inhalación isoflurane. Uso 5 vol % isoflurano en un caudal de 1.5 L/min en una caja de plexiglás para la inducción de la anestesia y 2 vol % isoflurano en un caudal de 0.6-0.8 L/min en un cono de máscara para el mantenimiento de la anestesia. Realizando una pizca del dedo del pie y una pizca de piel confirman la profundidad de la anestesia.
  3. Afeitarse la piel abdominal entera de la rata con una afeitadora eléctrica para permitir la exposición limpiador. Desinfectar la piel correspondiente con una solución de povidona-yodo.
  4. Abrir la cavidad abdominal mediante una incisión cruciforme con tijeras quirúrgicas de la raíz del pene a 1 cm por encima de la xiphisternum a lo largo de linea alba, que se extiende desde el punto medio de la incisión longitudinal en la línea midaxillary. Exteriorizar el tracto gastrointestinal a la izquierda y cubrirla con una gasa húmeda.
  5. De la abrazadera y tire xiphisternum hacia la cabeza con una pinza hemostática. Disecan el ligamento falciforme y los tejidos conectivos alrededor del hígado. Aislar y ligar la vena frénica inferior izquierda con una sutura de seda 6-0.
  6. Inserte el stent en el conducto biliar.
    1. Abrazadera BD justo por encima del punto donde la vena gastroduodenal se une a la vena porta y tirar de él para mantener la tensión un poco utilizando un Micro-pinzas. Realizar una incisión de "V" de 1 mm de longitud en la pared anterior cerca de 5 mm proximal a la confluencia biliar por una micro tijeras.
    2. Inserte el stent en el lumen de la vía biliar mediante una curva Micro-pinzas. Asegúrese de que al menos la mitad del stent se encuentra fuera de la vía biliar.
    3. Asegure el stent con una sutura de seda 6-0. Cortar un extremo de la sutura. Mantenga la otra se sostienen durante anastomosis posterior. Transecto de la vía biliar por debajo el stent y asegúrese de que la bilis puede salir el stent.
  7. Aislar el IHVC hasta el nivel de la vena renal izquierda. Libre el IHVC anterior y lateral de los tejidos circundantes por disección de capullo de algodón hasta que la IHVC es esqueleto. Separe y ligar la vena suprarrenal derecha y la vena renal derecha con una sutura de seda 6-0.
  8. Heparinize la rata por vía parenteral 50 U de heparina diluida en 2 mL de solución salina normal a través de la vena dorsal del pene.
  9. Perfusión del hígado.
    1. Aislar la aorta abdominal por debajo de la vena renal izquierda. Insertar un catéter de 22 G en la aorta.
    2. Realizar una toracotomía, abrazadera de la aorta torácica con un Micro-pinzas.
    3. Perfusión del hígado del donante a través del catéter en la aorta con 20 mL de solución salina normal conteniendo 25 U de heparina (4 ° C) a razón de 3 mL/min con una bomba de infusión. Mientras tanto, cortar la vena cava por debajo de la vena renal derecha para permitir la solución de perfusión fluya fuera del hígado.
    4. Transectos SHVC junto con parte del diafragma y IHVC a nivel de la vena renal izquierda cuando el hígado del donante se volvió pálido.
  10. Disecar el tejido conectivo que rodea el PV por dos micro pinzas. Ligar y dividir las venas pilóricas con una sutura de prolene de 8-0. Transecto de la PV en el nivel de la vena esplénica. Suprimir el hígado del donante y enjuague con solución salina normal fría. Lugar en una solución salina fría baño 4 ° C.

3. preparación

Nota: Todos los procedimientos para la preparación del injerto hepático se realizan en un baño salino frío a 4 ° C.

  1. Coloque un puño en IHVC del donante (figura 3).
    1. Introduzca la IHVC en su puño con la extensión de la banda apuntando hacia el hígado. Posición de la extensión de la banda en la pared posterior de IHVC. Fijar la extensión del pun ¢ o y el IHVC con una curva Micro-pinzas sí mismo Unido con un clip de archivo para el depósito del baño.
    2. Evert el extremo distal de la IHVC sobre el cuerpo del pun ¢ o con dos pinzas de micro.
    3. Fijar el borde con una sutura de seda 6-0. Asegúrese de que el IHVC no se tuerza durante el proceso.
  2. Repita el paso 3.1 en el PV para colocar un manguito a PV del donante.
  3. Coloque un anillo magnético para SHVC del donante (figura 4).
    1. Tire de la membrana a través de las cuatro pinzas y recorte el SHVC.
    2. Pasar el SHVC a través del anillo magnético con las pinzas de micro aleación de titanio.
    3. Evert el extremo distal de la SHVC sobre el anillo.
    4. Fije el anillo con una sutura de seda 6-0. Asegúrese de que el SHVC no se tuerza durante el proceso.
    5. Retire el diafragma exceso en el hígado.
  4. Sumerja el hígado del donante en un baño de solución salino normal frío y almacenar a 4 ° C.

4. destinatario operación

Nota: El esquema de la implantación del injerto en la rata receptora se muestra en la figura 5.

  1. Inyectar la buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea como analgésico 1 hora antes de la operación. Anestesiar la rata donante por inhalación isoflurane. Uso 5 vol % isoflurano en un caudal de 1.5 L/min en una caja de plexiglás para la inducción de la anestesia y 2 vol % isoflurano en un caudal de 0.6-0.8 L/min en un cono de máscara para el mantenimiento de la anestesia.
  2. Afeitarse la piel abdominal entera de la rata. Desinfectar la piel correspondiente con una solución de povidona-yodo.
  3. Abrir la cavidad abdominal mediante una incisión de línea media 4 cm. Colocar los retractores abdominales. Tirar de las costillas tan distantes como sea posible de la línea media.
  4. De la abrazadera y tire xiphisternum hacia la cabeza con una pinza hemostática. Diseca los tejidos conectivos y los ligamentos alrededor del hígado. Ligar y dividir el ligamento hepato-esofágica. Ligar y dividir la arteria hepática con una sutura de prolene de 8-0.
  5. Aislar el conducto colédoco desde el primer portal hepático. Colocar una sutura de seda 6-0 en el colédoco justo debajo de su división y ligar el conducto biliar común.
  6. Diseccionar la IHVC hasta la vena renal derecha. Ligar y dividir la vena suprarrenal derecha. Colocar una correa en el SHVC del hígado.
  7. Abrazadera IHVC justo encima de la vena renal derecha con los clips del microvessel. Abrazadera de la PV en el nivel de la vena pilórica con los clips del microvessel.
    1. Para eliminar la sangre fuera del hígado, inyecte lentamente 2 mL de solución salina normal a través de la PV. Arrastre hacia abajo el hígado tirando de la correa previamente colocada. Sujete la parte del diafragma y SHVC con una pinza de Satinsky.
    2. Transecto IHVC cerca el parénquima y el PV en los hepatis del porta. Suprimir el hígado por transecting SHVC justo por encima del hígado. Retirar el hígado receptor rápidamente.
  8. Coloque un anillo magnético para SHVC del destinatario.
    1. Inserte un anillo magnético el SHVC restantes del destinatario.
    2. Fijar el anillo magnético en una pinza de Satinsky por atracción magnética.
    3. Evert el SHVC sobre el anillo magnético hasta que la embarcación cubre el borde del anillo.
  9. Coloque el donante del injerto hepático orthotopically y cubrirla con una gasa húmeda fría.
  10. Llenar la luz del SHVCs del donante y el recipiente con solución salina normal. Elimine las burbujas de aire a fin de evitar embolias. Para terminar la reconstrucción SHVC, acoplamiento de los anillos magnéticos encajados SHVC del donante y del receptor juntos a través de fuerza magnética.
  11. Reconstruir la PV.
    1. Tracto de la rama derecha e izquierda del picovoltio del destinatario tirando una sutura de prolene de 8-0 para mantener la tensión de la PV.
    2. Mover la abrazadera del picovoltio del destinatario abajo de la vena del píloro a la vena esplénica para exponer la vena totalmente.
    3. Haga una incisión en la pared anterior del destinatario. Llenar el lumen de la PV con solución salina normal.
    4. Sujete la extensión del pun ¢ o del picovoltio del donante con un fórceps curvo.
    5. Inserte el cuerpo del pun ¢ o del donante PV PV del destinatario mientras mantenga la luz de la PV con solución salina normal de lavado.
    6. Asegúrelo con un circunferencial ligadura de seda 6-0. Restablecer el flujo sanguíneo hacia el hígado del injerto soltando las abrazaderas en el PV y SHVC.
  12. Repita el paso 4.11 en la IHVC para reconstruir el IHVC.
  13. Reconstruir la vía biliar mediante una técnica de stent.
    1. Haga una incisión en forma de "V" en la pared anterior del colédoco receptor.
    2. Introducir el stent de donantes en el lumen del recipiente BD y fijar con una sutura circunferencial seda 6-0. Reunir las suturas en las dos vías biliares y atar las suturas para llevar la BD cerca uno del otro.
    3. Abrigo tejido de epiplón en el sitio de la anastomosis para evitar fuga de bilis.
  14. Irrigar la cavidad abdominal con solución salina normal tibia. Cerrar la incisión del abdomen en dos capas con una continua sutura quirúrgica no absorbible 3-0.
  15. Administrar cefuroxima (un antibiótico) de 16 mg/kg y 0,05 mg/kg de buprenorfina (un analgésico) por inyección subcutánea después de la operación inmediatamente.
  16. Colocar la rata en una jaula limpia y permita que la comida y agua ad libitum.
  17. Inyecte la cefuroxima (16 mg/kg) y buprenorfina (0,05 mg/kg) en la cavidad abdominal cada 12 horas durante 3 días.

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Representative Results

Después de unos 10 intentos, la técnica de anastomosis magnética para reconstrucción SHVC fue dominada con éxito por un investigador que previa capacitación microquirúrgica. La reconstrucción de la SHVC llevo menos de 2 min. La fase anhepatic para las ratas destinatarias era aproximadamente 10 minutos. No hay trombosis, hemorragia o angiostegnosis se observó en el sitio anastomótico SHVC en 1, 5 y 30 días después de la reperfusión. La cavography de la vena inferior fue realizado a las 2 semanas después del trasplante. Como se muestra en la figura 6, los anillos magnéticos estaban intactos, y el flujo de sangre era patente a través de la anastomosis SHVC. La tasa de supervivencia después del trasplante fue 95% en el día 1, día 3, el 90% y 85% en los días 7 y 30 (figura 7).

Figure 1
Figura 1 : El diseño (A) y (B) foto del anillo magnético para la anastomosis de la SHVC.
SHVC: suprahepática de la vena cava.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Los pun ¢ os y el stent para la anastomosis de la IHVC (A) PV (B) y (C).
IHVC: infrahepatic de la vena cava; PV: la vena porta; BD: vía biliar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema de la anastomosis del pun ¢ o del IHVC y PV. Inserte el IHVC o PV en un puño (A); Evert el extremo distal de la IHVC o PV sobre el cuerpo del manguito mediante dos microfórceps (B); Fijar el borde con una sutura de seda 6-0 (C); Inserte el cuerpo del pun ¢ o de IHVC o PV del donante en el receptor IHVC o PV (D).
IHVC: infrahepatic de la vena cava; PV: la vena porta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de la anastomosis magnética de la SHVC. Pasar el SHVC a través de un anillo magnético usando la aleación de titanio Micro-pinzas (A); Evert el extremo distal de la SHVC sobre el anillo (B); Fije el anillo con una sutura de seda 6-0 (C). Par anillos magnéticos incrustados en del donante y del receptor SHVC juntos a través de fuerza magnética (D).
SHVC: suprahepática de la vena cava. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Esquema de la implantación del injerto en la rata receptora. Reconstrucción de la SHVC: anastomosis magnética; Reconstrucción de la IHVC y PV: pun ¢ o anastomosis; Reconstrucción de la BD: stent anastomosis. Reconstrucción de la HA: no realizado.
SHVC: suprahepática de la vena cava; IHVC: infrahepatic de la vena cava; PV: la vena porta; BD: vía biliar; HA: la arteria hepática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Cavography de la vena inferior de la rata a las 2 semanas después del trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Curación de representante de supervivencia después del trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Muchos avances clínicas en trasplante hepático se pueden atribuir a los estudios en animales. Rata OLT es un modelo bien aceptado y ampliamente utilizado en la investigación de preservación de órgano, trasplante de Inmunología, fisiología y patología. Sin embargo, también es un procedimiento muy complicado y requiere habilidad microsurgical avanzada. A pesar de muchas mejoras en el procedimiento de rata OLT, la anastomosis SHVC mantuvo un paso desafiante. En este artículo describimos una técnica de anastomosis magnética novela para reconstrucción SHVC en rata OLT. La aplicación de esta técnica redujo el tiempo para la reconstrucción de SHVC a menos de 2 min y la fase anhepatic de rata OLT a aproximadamente 10 minutos. Creemos que esta técnica tiene grandes implicaciones en la investigación del trasplante.

El paso crítico en el uso de esta técnica de anastomosis magnética para la reconstrucción de la SHVC es sujetar los anillos magnéticos a SHVC del donante y del receptor. Cada debe tener precaución para evitar que se enrosque la SHVC. Por otra parte, al conectar los dos anillos magnéticos, burbujas de aire en el SHVC deben eliminarse completamente.

Existen algunas limitaciones en el uso de esta técnica. Algunas cepas de ratas como las ratas Fischer-344 ratas Buffalo tienen un SHVC extremadamente corto. Es imposible colocar el anillo magnético para su SHVC. Por lo tanto, no son adecuados para esta técnica. Sin embargo, esta técnica puede ser fácilmente aplicada para OLT en la mayoría de las cepas de ratas como ratas Sprague Dawley, ratas Lewis y marrón ratas de Noruega. Anillos magnéticos pueden interferir con la exploración de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). Por lo tanto, no puede utilizarse esta técnica de anastomosis magnética si un examen de MRI es necesario para el experimento.

En Resumen, la técnica de anastomosis magnética permite fácil y rápida reconstrucción SHVC en ratas. Después de una curva de aprendizaje razonable, los investigadores incluso sin conocimientos de microcirugía avanzadas pueden producir resultados fiables y reproducibles mediante este modelo de rata de OLT.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de educación innovación equipo desarrollo programa de China (Nº IRT16R57), Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 81470896) y una investigación del fondo para jóvenes talento contratar planes de Xian Jiaotong University (RW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Machine Harvard  tabletop Animal anaesthesia
PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System Perlong Medical PLX7000B It is mainly used for the angiography and photography of various operations
Syringe Pump Mindray BeneFusion SP5 intravenous infusion
Isoflurane RWD life Science Co. anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
iohexol Shanghai General Pharmaceutical Co  intravascular contrast media  
heparin sodium injection SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD   prevent the formation of thrombosis 
cefuroxime  Glaxo Operations UK Limited  an antibiotic
buprenorphine  TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd an analgesic
curved microforceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. W40350 surgical tool
hemostatic forceps(straight) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31010 surgical tool
hemostatic forceps(curved) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31020 surgical tool
Satinsky clamp Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC050 surgical tool
needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32010 surgical tool
microneedle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WBA040 surgical tool
notched forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J42010 surgical tool
tissue forceps(with hook) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J41010 surgical tool
tissue scissor Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00040 surgical tool
surgical scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00030 surgical tool
micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. MR-S121T surgical tool
microvessel clips Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC240 surgical tool
straight microforceps(titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC010 surgical tool
curved microforceps  (titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC020 surgical tool

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