Optimering af den genetiske indarbejdelse af kemiske sonder ind i GPCRs til foto-crosslinking kortlægning og Bioorthogonal kemi i Live pattedyrceller

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En letkøbt fluorescens assay er præsenteret for at evaluere effektiviteten af amino-acyl-tRNA-syntetase/tRNA par indarbejde ikke-kanoniske amino-syre (ncAAs) i proteiner udtrykt i pattedyrsceller. Anvendelsen af ncAAs til at studere G-protein koblede receptorer (GPCRs) er beskrevet, herunder foto-crosslinking kortlægning af bindende websteder og bioorthogonal GPCR mærkning på levende celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den genetiske indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stop codon undertrykkelse er en kraftfuld teknik til at installere kunstige sonder og reaktive fraspaltning på proteiner direkte i den levende celle. Hver ncAA er indarbejdet i en dedikeret ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetase (AARS) par, der importeres til værtsorganismen. Indarbejdelse effektiviteten af forskellige ncAAs kan variere, og være utilfredsstillende i nogle tilfælde. Ortogonale par kan forbedres ved at manipulere med enten de årlige aktivitetsrapporter eller tRNA. Styret evolution af tRNA eller AARS ved hjælp af store biblioteker og død/levende udvælgelsesmetoder er imidlertid ikke muligt i pattedyrsceller. Her præsenteres en letkøbt og robust fluorescens-baseret analyse til at evaluere effektiviteten af ortogonale par i pattedyrsceller. Analysen giver mulighed for screening snesevis til hundredvis af AARS/tRNA varianter med en moderat indsats og inden for en rimelig frist. Brug af denne analyse til at generere nye tRNAer, der væsentligt forbedrer effektiviteten af Pyrrolysin ortogonale system er beskrevet, samt anvendelse af ncAAs til studiet af G-protein koblede receptorer (GPCRs), som udfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, systematisk indarbejder en foto-crosslinking ncAA i hele den ekstracellulære overfladen af en receptor, bindingssteder af forskellige ligander på intakt receptoren er knyttet direkte i den levende celle. Anden, ved at indarbejde sidste generation ncAAs i en GPCR, ultrahurtig katalysator-fri receptor mærkning med et fluorescerende farvestof er demonstreret, som udnytter bioorthogonal stamme-forfremmet inverse Diels elletræ cycloaddition (SPIEDAC) på den levende celle. Som ncAAs kan anvendes generelt på et protein uafhængigt på sin størrelse, er metoden af almen interesse til en række applikationer. Derudover ncAA vedtægter kræver ikke nogen særligt udstyr og udføres nemt i standard biokemi labs.

Introduction

Den genetiske indarbejdelse af kemiske sonder i proteiner er en kraftfuld metode til at lette undersøgelsen af strukturelle og dynamiske aspekter af protein funktion direkte i naturlig forbindelse med den levende celle. I dag, kan hundredvis af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) udstyret med de mest forskelligartede kemiske grupper være site-specifically indarbejdet i proteiner af biosyntesen1,2,3,4. Mellem dem, man finder lysfølsomt ncAAs såsom foto-overfladebehandlingsvæsker5, foto-bur6,7,8,9 og foto-omstillelig aminosyrer10, 11, aminosyrer forsynet med anstrengte alkener og Alkyner for katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer, der transporterer dansyl18, cumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer udstyret med andre biofysiske sonder som godt som med post translationel ændringer1,2,3,4,22,23,24,25.

Den genetiske kodning af en ncAA er aktiveret af en dedikeret amino-acyl-tRNA-syntetase (AARS) parret til en beslægtet suppressor-tRNA, hvilke indlemmer ncAA som svar på en rav stop codon under den regelmæssige ribosomale syntese. ncAARS/tRNA par er konstrueret så den er ortogonale i værtsorganismen, dvs ikke cross-talk med de endogene par. Teknikken er veletableret både i prokaryote og eukaryote værter og let anvendelig til mammale celler. Par ncAA blandes i pattedyrceller er baseret på tre vigtigste ortogonale systemer: det tyrosyl system, der kombinerer TyrRS fra E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (EF TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EFLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 , og archaeask pyrrolysyl system (PylRS/tRNA Pyl par)3, hvorved tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. I almindelighed, er hver ncAA anerkendt af et specialiseret ncAARS. Afhængig af strukturen i ncAA opnås ncAARS via styret evolution af enten TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om nogle synthetases kan acceptere mere end én ncAA.

Ortogonale parret er importeret ind i cellerne ved blot at bruge et plasmid vektor. Mest almindelige og effektiv plasmider er bicistronic og indkode både for syntetase og tRNA danner ortogonale par29. En anden plasmid kodning for protein af rentebærende en rav codon på webstedet udpeget til ændring er co transfected. NcAA er simpelthen tilføjet til celle vækstmedium. Dog bruger forskellige specialiserede grupper ofte forskellige varianter af plasmid konstruktioner selv for indarbejdelse af den samme ncAA. Konstruerer forskellige arrangement af gener i vektor, type af syntetase, codon skik i syntetase gen, promoter skik, variant af tRNA og antallet af tRNA udtryk kassetter. Derudover kan indarbejdelse effektiviteten af forskellige ncAAs variere drastisk på grund af de forskellige synthetases, kvaliteten af tRNA, og andre faktorer30forskellige katalytisk effektivitet. Derfor er det vigtigt at have ved hånden en hurtig og pålidelig metode til at vurdere effektiviteten af en ortogonal par, både til at vælge den mest passende system for en ønskede program og til at udføre nogle optimering trin, der forbedrer samlede protein udtryk udbytter.

Vi har etableret en enkel og robust fluorescens-baseret analyse for at evaluere effektiviteten af ortogonale par29 (figur 1). I analysen, celler er co transfected med plasmid kodning for ortogonale parret sammen med en bicistronic reporter plasmid kodning både til den grønne fluorescerende proteiner forsynet med en rav stop codon på en eftergivende holdning (EGFPTAG) og den mCherry gen. Røde og grønne fluorescens af hele cellelysater læses i separate kanaler på en Pladelæser i en 96-brønd plade. Intensiteten af den grønne fluorescens direkte korrelerer med effektiviteten af rav undertrykkelse, der henviser til, at intensiteten af røde fluorescens giver et direkte estimat af størrelsen af den målte prøve og Transfektion effektivitet. Med hensyn til lignende assays baseret på fluorescens læse assisteret celle sortering (FACS) ud af31,32, analysen giver en øjeblikkelig og omfattende vurdering af protein udtryk i befolkningens hele cellen, som er mere repræsentant for sædvanlige forsøgsbetingelser, og byder på en lettere dataopsamling og behandling med standardsoftwaren. Samlet set er den største fordel af analysen, at et medie til et stort antal prøver kan analyseres parallelt. Ved hjælp af denne analyse, har vi screenet et rationelt designet bibliotek af suppressor-tRNAer til at forbedre effektiviteten af Pyl ortogonale system30. Dette arbejde beskriver forsøgsplan for at udføre denne analyse og vise eksempler på dens anvendelse, herunder optimering af ortogonale parret for indarbejdelse af den foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Amalie) og sammenligning af indarbejdelse effektiviteten af forskellige aminosyrer (figur 2).

I de seneste år, ncAA værktøjer har vist sig meget kraftfuld at undersøge strukturelle og funktionelle aspekter af G-protein koblede receptorer (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. i mennesker, GPCRs udgør en stor familie af membranreceptorer (800 medlemmer) og repræsenterer vigtigste mål for terapeutiske lægemidler. Direkte strukturel karakterisering af GPCRs er stadig udfordrende og supplerende biokemiske metoder er meget nødvendige for deres undersøgelse. Vi har været banebrydende brug af foto-crosslinking ncAAs kort GPCR overflader og oplev ligand bindende lommer34. Ved hjælp af vores optimeret system til Azi indbygning, indarbejdet vi systematisk Azi i hele domænet hele juxtamembrane af en GPCR direkte i live pattedyrsceller. Ved UV-bestråling danner Azi en meget reaktive nitrene arter, der kovalent fanger nabo molekyler. Når liganden føjes til systemet, fungerer Azi som en nærhed sonde til at afsløre, hvilke holdninger af receptor kommer tæt på den bundne ligand. På denne måde blev tilstanden bindende neuropeptid hormon Urocortin I (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-releasing-faktor receptor type 1 (CRF1R)33 først afsløret. Sidst, har vi offentliggjort særskilt bindende mønstre af agonister og antagonister på samme receptor38. En lignende fremgangsmåde er blevet anvendt af andre til at afsløre orthosteric og allosteriske bindingssteder andre peptider og lille molekyle ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskript beskriver forsøgsplan anvendes i vores lab for foto-crosslinking kortlægning af GPCR overflader. Metoden er relativt hurtigt, ligetil og kræver ikke nogen særligt udstyr, således at det kan anvendes i standard biokemi labs. Vigtigere er, tilgangen giver et værdifuldt redskab, ikke kun til at identificere ligand bindingssteder hvor 3D strukturelle data er sparsomme, men også at supplere eksisterende i vitro data med oplysninger fra fuldt post-translationally modificerede receptorer i den fysiologiske miljø af den levende celle.

Den seneste udvikling af nye ncAAs indflydelse på de side kæde kemiske grupper egnet til ultrahurtig katalysator-fri bioorthogonal kemi har åbnet op for muligheden for at installere sidste generation fluorophores for super-opløsning imaging i proteiner direkte på de levende celler2,43. Sådanne kemiske ankre omfatter anstrengte cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blandt andre ncAAs husly en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 gruppe. Pladskrævende ncAAs i bioorthogonal kemi indgår med en variant af PylRS normalt betegnes som PylRSAF (med angivelse af mutation Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), samt af andre ad hoc- udviklet sig ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankre reagere med tetrazine reagenser47 via inverse elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition at give høje mærkning udbytter inden for et par minutter43,48. Dog har anvendelsen af denne kraftfulde tilgang til label GPCRs udfordrende på grund af en lav samlede effektivitet af ortogonale ncAA indarbejdelse system. Bruge vores forbedrede Pyl system, har vi for nylig demonstreret højtydende indarbejdelse af sådanne aminosyrer i GPCRs og ultrahurtig GPCR mærkning på overfladen af levende pattedyrceller30. Mærket receptorer var stadig funktionel, som de fysiologisk internaliseret ved aktivering receptor med en agonist. Forsøgsplan for indarbejdelse af bioorthogonal ankre i GPCRs og de følgende mærkning trin er beskrevet her. Udstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grundlæggende skridt mod studiet af GPCR strukturdynamik i den levende celle via avancerede mikroskopi-teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fluorescens-baseret Screening af indarbejdelse effektivitetsfordele (figur 1)

  1. Opretholde HEK293 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM; høje glukose, 4 mM glutamin, pyruvat) suppleret med 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO2.
  2. Frø celler dagen før Transfektion.
    1. Frigør cellerne i 5 min ved 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS suppleret med 0,5 mM EDTA. Brug 1 mL Trypsin/EDTA for en 10-cm parabol. Dæmpning med 10 bind af komplette mellemstore og resuspend cellerne af pipettering. Tæl antallet af celler i suspension ved hjælp af en hemocytometer49.
    2. Frø 6,0 x 105 HEK293 celler pr. brønd af 6-godt plader i 2 mL komplet vækstmediet. Forbered så mange brønde som antallet af prøver, og to ekstra brønde for wild-type EGFP og en mock-transfekteret prøve, henholdsvis.
  3. Styre sammenløbet (område besat af celler) under et mikroskop. Transfect celler på ~ 70% confluence ved hjælp af polyethyleneimine (PEI) reagens.
    1. 1 time før Transfektion, tilføje den passende mængde af frisklavede ncAA stamopløsning alle brønde for en endelig ncAA koncentration på 0,25-0,5 mM. Tilføje ncAA alle brønde, herunder vildtype positiv kontrol og mock-transfekteret celler til at forebygge forskelle i fluorescens signaler, der kan være forårsaget af virkningerne af ncAA på cellulære vækst.
      Bemærk: For at forberede stamopløsninger, opløse ncAA til 0,1-0,5 M benytter 0,2-0,5 M NaOH. Nogle ncAAs kan dog kræve indledende oploesning i DMSO og/eller neutralisering af fire bind af 1 M HEPES (pH 7,4) før brug. Almindeligt, anbefaler producenten en protokol til at forberede en stamopløsning.
    2. I et microcentrifuge rør, blandes 1 µg plasmid DNA kodning for ncAARS/tRNA parret skal testes med 1 µg reporter plasmid DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). I separate rør, forberede en identisk Transfektion ved hjælp af EGFP wild-type reference og en mock Transfektion.
      Bemærk: Antal kopier af tRNA kassette indlejret i plasmid kodning for ncAARS/tRNA par afhænger af programmet. For at lette kloning, 1 tRNA kopi kan anbefales når screening forskellige tRNAer, mens 4 kopier anbefales (omend ikke strengt nødvendigt) når enten test forskellige ncAARS eller indarbejdelse af forskellige ncAAs af den samme ortogonale par.
    3. Hver tube indeholder DNA tilføje 100 µL laktat bufferet saltvand (LBS) der indeholder 20 mM sodium lactat på pH 4,0 og 150 mM NaCl. Bland kortvarigt.
    4. Hver tube indeholder DNA i LBS tilføje 6 µL 1 µg/µL PEI i LBS (ratio PEI/DNA = 3/1 w/w) og vortex straks. Der inkuberes ved RT i 10-15 min.
    5. Tag 400 µL celle medium fra hver brønd og føje den til DNA-PEI blanding til at neutralisere pH. Drible DNA blandingen på cellerne.
      Bemærk: DMEM indeholder normalt phenol rød som pH indikator. Under trinnet neutralisering vil farve af blandingen i røret ændre fra gul (sure) til rød (neutral). Selvom danner DNA komplekser i LBS ved sure pH giver den højeste Transfektion udbytter50, kan DNA-PEI komplekser alternativt dannes direkte ved pH 7,4 (for eksempel i serumfrit DMEM). Hvis du bruger DMEM til form DNA komplekser, springe neutralisering trin 1.3.5. Under alle omstændigheder er det afgørende, at ingen serum er til stede i blandingen når danner komplekser.
  4. Høste celler 48 h efter Transfektion.
    1. Opsug mediet og skyl celler med 2 mL pre varmede PBS (37 ° C). Tilføje 800 µL af PBS suppleret med 0,5 mM EDTA og Inkuber i 20 min ved 37 ° C. Frigør og suspendere cellerne af pipettering op og ned.
    2. Overføre cellesuspension til 1,5 mL rør indeholdende 200 µL PBS suppleret med 5 mM MgCl2.
    3. Der centrifugeres i 2 min på 800 x g og supernatanten.
      Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her. I dette tilfælde flash-freeze pellets i flydende N2 og opbevares ved-80 ° C i op til en måned. Bær altid øje beskyttelse beskyttelsesbriller.
  5. Tilføj 100 µL Tris lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA og frisk tilføjet PMSF) til celle pellets, og der inkuberes i isbad i 30 min. At lette lysis, vortex hvert 5 min.
  6. Spin ned celle debris for 10 min. ved 4 ° C og 14.000 x g og overføre 90 µL af supernatanten til sort 96-brønd plader. Foranstaltning EGFP og mCherry fluorescens ved hjælp af en Pladelæser udstyret med et fluorescens-modulet.
    Bemærk: Bruge passende excitations- og filtre for EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) og mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Målte EGFP værdier vil spænder mellem den mindste værdi fra mock-transfekteret celler og en maksimal værdi, som er normalt fremstillet af wild-type EGFP. Tage sig af opsætning af vinduet korrekt måling i instrumentet.
  7. Effektiviteten af ncAA indarbejdelse beregnes som forholdet mellem fluorescens af prøven og fluorescens fremstillet af udtryk for wild-type EGFP. Alle værdier er normaliseret til mCherry fluorescens.
    Equation 1

2. genetiske indarbejdelse af ncAAs i GPCRs for foto-crosslinking kortlægning af Ligand-GPCR interaktioner (figur 3)

  1. Opretholde HEK293T celler i DMEM suppleret med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO2.
  2. Frø celler dagen før Transfektion.
    1. Frigør cellerne i 5 min ved 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS suppleret med 0,5 mM EDTA. Brug 1 mL Trypsin/EDTA for en 10-cm parabol. Dæmpning med 10 bind af komplette mellemstore og resuspend cellerne af pipettering op og ned. Tæl antallet af celler i suspension ved hjælp af en hemocytometer49.
    2. Frø 5,0 x 105 293T celler pr. brønd i 2 mL komplet vækstmediet i 6-godt plader. For hver position skal screenes, forberede 1 godt pr. ligand plus et godt bindende kontrol33,38. En ekstra godt til at være transfekteret med wild-type (wt) receptor kan medtages kontrollere udtrykket niveauet af mutant.
  3. Dagen efter, styre sammenløbet (område besat af celler) under et mikroskop. Transfect celler på ~ 70% confluence ved hjælp af PEI.
    1. 1 time før Transfektion, tilføje Azi i alle pladens huller til en endelig koncentration på 0,5 mM.
      1. Forberede en 0,5 M stamopløsning af Azi. Pr. 6-godt plade, vejer 1,2 mg Azi ind i et rør og opløse den i 15 µL 0,5 M NaOH. Fortynd stamopløsning i 1,2 mL komplet medium og tilføje 200 µL af blandingen i hver brønd.
        Bemærk: Forberede en frisk stamopløsning af Azi til hvert eksperiment. Indeholder gruppe har en kort halveringstid i vandige opløsninger, især på basale pH, og AziRS inkorporerer den intakte, men også den nedbrudte form.
    2. Transfect et samlet beløb på 2 µg DNA pr. brønd: 1 µg plasmid kodning for FLAG-tagged GPCR forsynet med et TAG codon på den ønskede position og 1 µg plasmid kodning for ortogonale parret dedikeret til Amalie (E2AziRS51 og 4 kopier af cognate suppressor-tRNA BstYam)33,38.
      Bemærk: Når herunder en wt sammenligning for at kontrollere udtrykket niveauer, transfect en lavere mængde af plasmid DNA for wt-receptoren. Afhængigt af GPCR, 0,2-0,5 µg af plasmid kodning wt receptor udbytte lignende niveauer som 1,0 µg af mutant plasmid. Transfect det samme beløb af DNA i alle brønde, fylder den manglende DNA med en mock (for eksempel en tom vektor).
    3. Fortsættes som beskrevet i 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 timer efter Transfektion, fortsætte enten med trin 2.4 for foto-crosslinking af ligander eller gå til trin 2,5 til direkte høst og analyse for at kontrollere receptor udtryk.
  4. Foto-crosslinking af en ligand.
    1. Forberede en 1.000 x ligand stamopløsning. Opløse peptid ligand ved en koncentration på 100 µM i DMSO.
      Bemærk: Ligand koncentrationen afhænger dissociationskonstant KD af ligand-GPCR interaktion. En endelig koncentration på 100 x KD er anbefalelsesværdige. Hvis peptid ligand er et salt af trifluoreddikesyre (TFA), overveje vægten af TFA ved beregning af molekylvægt (1 x TFA pr. grundlæggende aminosyre i peptid). Mener også, at peptider i almindelighed hygroskopisk. Undgå gentagen nedfrysning af peptid pulver og aldrig åbner en peptid beholder indtil det ikke har nået stuetemperatur.
    2. Fortynd ligand stamopløsning 1:1,000 i binding buffer bestående af 0,1% BSA, 0,01% Triton-X 100, 5 mM MgCl2 i HEPES dissociation buffer (HDB) indeholder 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM NaCl og 5 mM KCl. Forbered 1 mL per Azi-GPCR mutant. Erstatte celle medium med 1 mL af opløsningen, ligand. Der inkuberes i 10 min. ved RT.
      Bemærk: Justere inkubationstiden for den specifikke GPCR, tegner sig for ligand kinetik og receptor internalisering. Forlænge inkubationstiden forbedrer ikke crosslinking udbytter.
    3. Bestråle prøver i 20 min. i en UV crosslinker på 365 nm med 5 x 8 W-rør og ~ 5 cm afstand til cellerne. Frigør cellerne ved pipettering og overføre dem til en 1,5 mL reaktion tube. Sammenpresse cellerne i 3 min. 800 x g og supernatanten.
    4. Opløses en tablet af protease inhibitor (PI) cocktail i 1 mL 25 mM EDTA/H2O at gøre en 50 x stamopløsning. Alikvot PI lagerfører løsning og opbevar den ved-20 ° C. Fortyndet 50 x stock 1:25 i HDB og resuspend celle pellets i 50 µL af 2 x PI i HDB. Flash-fryser cellerne i flydende Nielsen2.
      Bemærk: Bære øjet beskyttelse beskyttelsesbriller. På dette tidspunkt kan prøver opbevares ved-80 ° C i op til en måned. Fortsæt med trin 2.6.
  5. Direkte celle høst.
    1. Opsug mediet. Tilføje 800 µL af 0,5 mM EDTA i HDB. Der inkuberes i 10 min på RT eller på is.
    2. Frigør cellerne ved pipettering op og ned og overføre dem til en 1,5 mL reaktion tube. Tilføje 200 µL af 5 mM MgCl2 i HDB. Sammenpresse cellerne i 3 min. 800 x g og supernatanten.
    3. Resuspend celle pellets i 50 µL af 2 x PI i HDB og flash fryse i flydende Nielsen2. Bære øjet beskyttelse beskyttelsesbriller.
      Bemærk: På dette tidspunkt kan prøver opbevares ved-80 ° C i op til 1 måned.
  6. Celle lysering.
    1. Optø cellerne i et vandbad ved 37 ° C i 30-45 s og vortex kort. Holde prøver kolde fra nu af. Pellet membraner på 2.500 x g og 4 ° C i 10 min. supernatanten, som indeholder hovedparten af cytosole proteiner.
    2. Resuspend pellets i 50 µL HEPES lysisbuffer indeholdende 50 mM HEPES-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT og frisk tilføjet 2 x PI cocktail. Blandes grundigt. Lyse celler 30 min på is og vortex hvert 5 min.
    3. Spin ned celle debris for 10 min på 14.000 x g og 4 ° C. Straks overføre supernatanten til en frisk reaktion tube.
      Bemærk: Gå videre med analysen lige bortrejst. Lysates kan opbevares ved-20 ° C, dog hver fryse-tø cyklus forringer kvaliteten af resultaterne.
  7. Western blot analyse.
    1. At forberede prøven, tager 3-5 µL lysate og fyld den op til 7 µL med H2O. tilføje 2 µL 1 M DTT og 3 µL 4 x prøvebuffer indeholdende 63 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol og 0,04% bromphenol blå. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    2. Når GPCR er glykosyleret og svag eller udtværet bands er et problem, deglycosylate prøver med PNGase F at øge signal intensitet og skærpe bandene. Bruge 3-5 µL lysate og deglycosylate i en samlet maengde paa 10 µL efter leverandørens protokol. Tilføje 3 µL 4 x prøvebuffer.
      Bemærk: Membranproteiner er ofte glykosyleret i flere steder og stater, som forringer kvaliteten af opløsning i SDS-PAGE analyse. Men gør ikke deglycosylate prøver til analyse af udtryk niveau af Azi-GPCR mutanter ved hjælp af anti-FLAG antistoffer, fordi det er relevant at vurdere del af fuldt glykosyleret, modne receptor på cellens overflade.
    3. Løse prøver via standard SDS-PAGE og duppes overførsel proteiner til en PVDF membran.
      Forsigtighed: Acrylamid er neurotoksiske. Bære handsker og beskyttelse af øjne.
    4. Blokere membran i 1 h i RT eller natten over ved 4 ° C i 5% skummetmælk i TBS-T indeholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl og 0,1% Tween 20.
    5. Sonde membranen med en anti-ligand antistof efterfulgt af den HRP-konjugerede sekundær antistof. Vaske i mellem med TBS-T. For at opdage udtryk niveauet af Azi-GPCR, sonde membran med en kommerciel HRP antistof (Se Tabel af materialer).
    6. Udfører udvidet kemiluminescens (ECL) reaktion ved hjælp af hjemmelavede ECL reagens og registrerer signaler i 5 min. i mørke.

3. ultrahurtig Bioorthogonal mærkning af GPCRs på Live pattedyrceller

Bemærk: Protokollen er optimeret til 4-godt chambered coverslips (godt område = 2,2 cm2). For forskellige godt størrelser skaleres protokollen i overensstemmelse hermed.

  1. Overfladebehandling af objektglas. Gennemføre hele proceduren under en steril hætte.
    1. Forberede en poly-D-lysin hydrobromid (MW = 500-550 kDa) (PDL) stamopløsning ved en koncentration på 1 mg/mL i 50 mM Borat buffer (pH 8,5). Opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder. Ikke fryse.
    2. Fortynd PDL stamopløsning 1:40 i sterile ultra rent vand til en endelig koncentration på 25 µg/mL (brugsopløsning), derefter Opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm sterile filter.
      Bemærk: Brugsopløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 3 måneder.
    3. Fuldt ud dække bunden af hver brønd af mikroskopi dias med 500 µL af PDL brugsopløsning. Inkuber i 20 min. på RT og Opsug PDL brugsopløsning.
      Bemærk: PDL brugsopløsning kan bruges op til tre gange. Hvis løsningen skal genbruges, overføre den anvendte løsning fra til belagte dias til en frisk sterile rør og etiket røret i overensstemmelse hermed. Aldrig blande den genvundne løsning med frisk løsning.
    4. Skyl hver godt 3 x med ~ 700 µl sterilt ultra rent vand og lad tørre i mindst 1 time.
      Bemærk: Det er meget vigtigt at skylle brøndene præcist, som restkoncentrationer af PDL løsning er giftigt for celler. De coatede dias kan bruges straks til mikroskopi eller gemt i op til en uge ved 4 ° C.
  2. Opretholde HEK293T celler i DMEM suppleret med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO2.
  3. Frø celler dagen før Transfektion.
    1. Frigør cellerne i 5 min ved 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS suppleret med 0,5 mM EDTA. Brug 1 mL Trypsin/EDTA for en 10-cm parabol. Dæmpning med 10 bind af komplette mellemstore og resuspend cellerne af pipettering. Tæl antallet af celler i suspension ved hjælp af en hemocytometer49.
    2. Frø 1,0 x 105 HEK293T celler pr. brønd (område 2,2 cm²) i 600 µL farvestof gratis komplet DMEM.
      Bemærk: Imaging formål, er det meget bekvemt at arbejde fra starten i et medium, der ikke indeholder nogen farvestof. Dye gratis DMEM formuleringer er kommercielt tilgængelige.
  4. Styre sammenløbet (område besat af celler) under et mikroskop og transfect celler på ~ 70% confluence ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens.
    1. 1 time før Transfektion, forberede en frisk 100 mM stamopløsning af TCO * K i 0,2 M NaOH og 15% (v/v) DMSO.
    2. Pr. brønd, mix 3 µl af TCO * K stamopløsning med 12 µL 1 M HEPES pH 7,4. Forsigtigt tilføje løsningen brønde for en endelige TCO * K koncentration på 0,5 mM.
    3. Forberede et samlet beløb på 500 ng DNA pr. brønd. I et microcentrifuge rør, fortynde 200 ng af pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng af plasmid kodning for MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonale par (fire kassetter af tRNAM15) og 100 ng af pcDNA3.1_Arrestin3 plasmid i 50 µL medium (farvestof gratis, serumfrit, antibiotikum gratis).
      Bemærk: I almindelighed, er co Transfektion af Arrestin ikke nødvendigt at observere GPCR internalisering. Dog fremskynder Co transfecting Arrestin3 internalisering af CRF1R, som er meget praktisk, når du analyserer internalisering af mange mutanter.
    4. Fortyndes 1,25 µL af lipid-baserede Transfektion reagens (2,5 µL pr. 1 µg DNA) i 50 µL medium (farvestof gratis, serumfrit, antibiotikum gratis) og tilføje løsningen til DNA blanding. Vortex straks og Inkuber 5-10 min. ved RT. Tilføj DNA-lipid komplekser til cellerne.
      Bemærk: Vores erfaring transfekteret morfologi af celler ved hjælp af lipid-baserede Transfektion ser mere fysiologisk i forhold til det af celler transfekteret med PEI. Da PEI giver højere Transfektion effektivitet, bør PEI foretrækkes for downstream applikationer som vestlige skamplet, lipid-baserede Transfektion er et bedre valg til transfect celler for imaging eksperimenter.
  5. 24 timer efter Transfektion, etiket receptor med fluorescerende farvestoffer.
    1. Forberede en 0,5 mM dye-tetrazine stamopløsning i DMSO og en 10 mg/mL af DNA farvning farvestof stamopløsning i ultra-rene H2O.
    2. Overføres 100 µL medium fra hver brønd til en 1,5 mL reaktion tube. Tilføje 1,8 µL af stamopløsningen dye-tetrazine og 0,3 µL DNA farvning farvestof stamopløsning. Overføre det medium, der indeholder farvestoffer tilbage til brønden og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
      Bemærk: Tetrazine-orange-fluorescerende farvestof har en endelig koncentration på 1,5 µM.
    3. Opsug mediet og forsigtigt skyl celler to gange med PBS til at fjerne overskydende af farvestof. Tilføje 600 µL af komplet farvestof gratis vækstmediet forvarmes til 37 ° C.
  6. Fluorescens mikroskopi og receptor internalisering.
    1. Visualisere de mærket receptorer under 63 x (eller lignende) forstørrelse ved hjælp af filtre hensigtsmæssigt for normal god landbrugspraksis (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), orange-fluorescerende farvestof (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) og DNA farvning farvestof (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Tage et billede med hvert filter før aktivering receptoren.
    2. Fremme receptor internalisering bruger 200 nM af Ucn1.
      1. Forberede en 1.000 x Ucn1 stamopløsning af 200 µM i DMSO.
        Bemærk: Afhængigt af opløseligheden af peptid kan du kan forberede bestanden i rent vand eller buffer.
      2. Overføres 100 µL medium fra en brønd til en 1,5 mL reaktion tube og tilføje 0,6 µL af peptid agonist stamopløsning. Overføre den medium tilbage ned i brønden.
      3. Observere internalisering under mikroskop. Tage billeder efter klart påvises forekomst af internalisering (10-15 min til timer, afhængigt af receptor og overekspression af Arrestins) ved hjælp af de filtre, der er nævnt tidligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omridset af fluorescens assay er afbildet i figur 1. Analysen er ansat i tre programmer. I første omgang, er en række tRNA varianter til indbygning af Lys(Boc) af Pyl ortogonale parret screenet. Lys(BOC) er en sterically svarende til Pyl aminosyre. Da Pyl ikke er kommercielt tilgængelige, er Lys(Boc) almindeligt anvendt som en standard substrat for PylRS. De screenede tRNAer er baseret på tRNAPyl. Hver tRNA variant bærer mutationer af enkelt baser eller basepar i sløjfer og stængler rationelt designet til at forbedre tRNA stabilitet og kompatibilitet med den eukaryote translationel maskiner. Alle detaljer om tRNA design er beskrevet i vores seneste arbejde30. Typiske resultater er beskrevet i figur 2A: forskellige tRNAer giver forskellig undertrykkelse effektivitet, hvilket klart afspejles i mængden af målte fluorescens. Biologiske tre små fejllinjer viser, at værdierne er yderst reproducerbare. På andenpladsen, bliver to gen-varianter af E2AziRS26,51, hvilke indlemmer foto-crosslinker p-azido-Phe (Amalie), evalueret. E2AziRS er afledt af E. coli TyrRS. Et gen variant ansat indfødte E. coli codon forbrug, mens andet var codon-optimeret til brug i H. sapiens. Fluorescens analysen viser, at den codon-optimerede variant giver højere protein udbytter (figur 2B). Endelig, iblanding af forskellige aminosyrer for bioorthogonal Klik kemi er sammenlignet (figur 2 c). Alle ncAAs præsenteres her (BCNK, TCO * K og SCOK) er indarbejdet af den samme ortogonale MbPylRSAF/tRNAPyl par. Lys(Z) er også indarbejdet i dette par og blev brugt som en positiv kontrol. For at illustrere pålideligheden af fluorescens assay, blev parallelle ncAA indarbejdelse eksperimenter udført på en GPCR, CRF1R. Western blot analyse blev foretaget til at vurdere GPCR udtryk (figur 2B, C). De samme tendenser observeret med EGFP i fluorescens analysen blev observeret med CRF1R. Navnlig Azi indbygning i CRF1R var meget forbedret når du bruger codon-optimeret E2AziRS gen i forhold til den indfødte gen, viser, at selv en moderat forbedring af 1,5-2-fold for et opløseligt protein (EGFP) Ifølge fluorescens assay kan have en større indvirkning på udtryk niveau af mere udfordrende Membranproteiner (figur 2B). Som generel bemærkning, med hensyn til antallet af tRNA kassetter skal bruges til hver enkelt ansøgning, anbefales kun én tRNA kassette ved screening forskellige tRNAer for at lette kloning procedurer. Når screening enten forskellige ncAARS eller iblanding effektiviteten af forskellige ncAAs af den samme ortogonale par, gentages fire tandem af tRNA kassette er foretrukket at opnå det højeste udbytte ncAA vedtægter.

Den optimeret system til Azi indbygning herunder humaniseret E2AziRS genet blev indsat for at kortlægge den bindende lomme af CRF1R og definere bindende stier af 5 forskellige ligander: de to peptid agonister Ucn1 og CRF, og de tre peptid antagonister Ucn1(8-40), CRF (9-41) og dFXCRF(12-41) (figur 3). Mens effektivitet Azi vedtægter blev tidligere vist sig at nedsætte når man nærmer sig GPCR C-terminus33,34, vores optimeret system for Azi vedtægter giver mulighed for sammenlignelige udtryk niveauer af Azi-mutanter med TAG-sites i forskellige dele af GPCR gen (figur 4A). Resultaterne i figur 4B viser screeningen af den ekstracellulære loop 2 (ECL2) og helix V af CRF1R som en repræsentativ del af ligand-bindende lomme. Et band på den korrekte størrelse af varens crosslinking afslører at positionen ligger i nærheden af ligand ligand-receptor kompleks, dvs det er en del af den bindende lomme. Flere crosslinking hits blev fundet med alle ligander testet, afslører forskellige bindende mønstre for peptid-agonister og antagonister. Navnlig giver mønster af crosslinking hits oplysninger om strukturelle elementer af receptor. En række successive hits, som observerede i ECL2 (stillinger F260-R263 i kombination med antagonister) foreslår en fleksibel loop region. Et mønster af hits hver tre til fire rester som fundet i helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) tips mod en heliske struktur. Skærmen kan udvides til at omfatte alle relevante områder af GPCR. Hvis der findes en 3D struktur eller en molekylær model af receptoren, kan ligand fodspor visualiseres ved at fremhæve crosslinking hits for hver ligand (figur 5).

Både fluorescens og Western blot data (figur 2 c) tyder på, at TCO * K er ncAA i bioorthogonal kemi, der får indarbejdet med den højeste effektivitet af MbPylRSAF. Forskellige PylRS mutanter kan give højere indarbejdelse udbyttet af andre Klik ncAAs17, men de blev ikke testet i denne undersøgelse. TCO * K blev inkorporeret i en CRF1R-EGFP fusion protein og aktiveret installation via SPIEDAC kemi (figur 6A) en lille lyse fluorophore på receptor (fig. 6B). Som et bevis for specifik mærkning, fluorescens af etiketten bør ses kun i celler, der udtrykker receptor (grønne celler i fig. 6B) og ikke i mørke celler, som dermed giver en indre negativ kontrol i hvert forsøg. Receptorer mærket ved hjælp af ultrahurtig SPIEDAC kemi er stadig funktionel. Efter tilsætning af et peptid agonist, blev fluorescerende rum observeret i hele cytosol, afslører den fysiologiske proces af GPCR internalisering (figur 6 c). Signaler af de sammenvoksede EGFP Co lokaliseret med den fluorescerende farvestof på alle tidspunkter, bekræfter den selektive biorthogonal mærkning af GPCR.

Figure 1
Figur 1: fluorescens-baseret analyse til at evaluere effektiviteten af stop-codon undertrykkelse. HEK293 celler er co transfected med to plasmider i overværelse af ncAA. Et plasmid koder for den ønskede ncAARS og suppressor-tRNA. Den anden plasmid koder for EGFP-genet bærer en TAG stop codon på en eftergivende websted sammen med en mCherry kontrol. To dage efter Transfektion, de grønne og røde fluorescens af hele cellelysater er målt i en pladelæseren. Som EGFP N-segmentet opstrøms stop codon (grey) ikke er fluorescerende, udbyttet af fuld længde EGFP (grøn) direkte korrelerer til effektiviteten af ncAA indarbejdelse, mens mCherry (rød) giver en uafhængig henvisning til normalisering. Ortogonale systemets effektivitet er givet ved forholdet mellem mængden af EGFP opnås via stop codon undertrykkelse og mængden af vildtype EGFP opnået ved regelmæssig oversættelse (ingen rav suppression). Tallet er ændret fra Serfling, R. & Coin, jeg; Indarbejdelse af unaturlige aminosyrer i proteiner udtrykt i pattedyrceller, metoder i Enzymology, 2016, 580, 89-107. 29 reproduktion har tilladt Copyright Clearance centrum af Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative anvendelser af fluorescens assay. (A) Screening af tRNAPyl varianter30. HEK293 celler var Co transfected med reporter plasmid og plasmider kodning for MbPylRS/tRNA par (en kopiere tRNA). Søjler repræsenterer den relative fluorescens af EGFP fremstillet af indarbejdelse af Lys(Boc) i forhold til wild-type EGFP. (B) vurdering af indflydelsen fra codon-forbrug for ncAARS gener. (venstre panel) Fluorescens assay af celler transfekteret med to forskellige gen-varianter af E2AziRS. (1) codon skik fra E. coli og (2) humaniseret genet. (højre panel) Western blot analyse af CRF1R95Azi-FLAG. Fuld længde receptoren er opdaget af en anti-FLAG antistof. Aktin β blev brugt som lastning kontrol. (C) evaluering af indarbejdelse effektiviteten af tre ncAAs beregnet til bioorthogonal kemi. (venstre panel) Strukturer af ncAAs bruges i dette eksperiment. (1) LysZ, som blev anvendt som positiv kontrol, (2) BCNK, (3) TCO * K og (4) SCOK. (centrale panel) Fluorescens analysen af HEK293 celler transfekteret med et plasmid kodning for MbPylRSAF og fire kopier af tRNA15 fra (A) for at indarbejde (1), (2), (3) og (4). (højre panel) Western blot analyse af en CRF1R-FLAG mutant forsynet med en af de fire ncAAs på position 95. Aktin β blev brugt som lastning kontrol. Panel A var tilpasset fra Serfling, R. et al. Designer tRNAer for effektiv inddragelse af ikke-kanoniske aminosyrer af Pyrrolysin systemet i pattedyrceller nukleinsyrer Res. 46 (1), 1-10 (2018) og er gengivet efter Creative Commons Attribution license. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Skematisk fremstilling af Azi-medieret foto-crosslinking kortlægning. En foto-activatable azido funktion (gul stjerne) er placeret i en defineret position inden for receptor (grå). Når gruppen azido er placeret proksimalt for den bundne ligand (red), en kovalent crosslinking produkt er dannet ved UV-bestråling (gul cirkel angiver crosslinking websted). Indarbejdelse af azido gruppen i forskellige positioner af receptor afslører bindende overflade (lilla) af ligand, som repræsenterer bindende lomme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Indarbejdelse af Azi i hele CRF1R for foto-crosslinking kortlægning af bindende lomme. (A) sammenligning af udtryk niveauer af Azi-CRF1R-FLAG mutanter mod vildtype receptor. Azi indarbejdelse websteder er fordelt i hele den hele receptor som angivet i den øverste række. Anti-FLAG Western blotting af hele cellelysater er vist. Aktin β blev brugt som lastning kontrol. (B) Western blotting aftestede med enten anti-CRF eller anti-Ucn1 antistoffer er vist. Restkoncentrationer erstattet af Azi angives i den øverste række. Cellerne blev inkuberet med ligander vises til højre, fulgt af UV-bestråling på 365 nm og lysering. Prøverne blev løst på 10% SDS-PAGE, deglycosylated ved hjælp af PNGase F og analyseret af Western blotting. Deglycosylated ligand-CRF1R kompleks kører på en tilsyneladende MW ~ 40 kDa33. Ikke-crosslinked ligand er ikke opdaget (MW ~ 3-4 kDa). Begge paneler af denne figur er blevet ændret fra Seidel, L. et al. Structural indblik i aktivering af en klasse B G-protein-koblet receptor af peptid hormoner i levende menneskeceller. Clivet. 6 10.7554/eLife.27711 og er gengivet efter Creative Commons Attribution license. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Fodspor af peptid agonister og antagonister på klasse B GPCR CRF1R. Overflade repræsentation af de CRF1R transmembrane domæne. Positioner af CRF1R at crosslinked ligand når erstattes af Azi er fremhævet. Fodspor af peptid agonister CRF og Ucn1 er fremhævet i magenta, fodspor af antagonister CRF (9-41) og Ucn1(8-40) i blå. Fodaftryk af antagonist dFXCRF(12-41) er fremhævet i orange. De syv transmembrane helices I-VII angives med romertal. (A, B) Side udsigt over bindende lomme fra membran flyet. (C) Top view i den bindende lomme fra den ekstracellulære side. Genoptrykt fra Seidel, L. et al. Structural indblik i aktivering af en klasse B G-protein-koblet receptor af peptid hormoner i levende menneskeceller. Clivet. 6 10.7554/eLife.27711 og er gengivet efter Creative Commons Attribution license. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : SPIEDAC mærkning af CRF1R på levende celler. (A) reaktion ordning af stamme-forfremmet inverse elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition (SPIEDAC): den trans-cyclo-2-octen gruppe af ncAA TCO * K reagerer med gruppen tetrazine knyttet til fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T celler, der udtrykker CRF1R95TCO * K- EGFP. Repræsentative billeder af de grønne, røde og blå kanal. Skalalinjen fylder 10 µm. (B) celler blev behandlet med tetrazine-Cy3 (1,5 µM) i 5 min. Kun celler, der udtrykker den receptor (grøn) viser forekomsten af mærkning (rød). (C) celler blev behandlet med 200 nM Ucn1 og afbildet efter 15 min. intracellulære vesikler svarer til internaliseret receptor. Paneler B og C er ændret fra Serfling, R. et al. Designer tRNAer for effektiv inddragelse af ikke-kanoniske aminosyrer af Pyrrolysin systemet i pattedyrceller Nukleinsyre Res. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) og er gengivet efter Creative Commons Attribution license. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskriver en simpel og pålidelig analyse til at vurdere effektiviteten af ortogonale par til indbygning af ncAAs i proteiner udtrykt i pattedyrsceller. Den største fordel ved denne metode i forbindelse med udbredte assays baseret på FACS er at det giver mulighed for samtidige forberedelse og måling af et større antal prøver, og indeholder data, der er let analyseret ved hjælp af en almindelig software. Tilgængeligheden af en medium-overførselshastighed metode til at analysere ortogonale par i pattedyrceller er meget vigtigt for udviklingen af nye ortogonale par og forbedring af de eksisterende. Ja, det er ikke muligt at udføre styret udvikling af ortogonale par via generation af store tilfældige biblioteker og død/levende udvalg i pattedyr systemer. Analysen kan screening lille størrelse biblioteker (hundredvis af medlemmer) ved at investere et rimeligt eksperimentelle forsøg inden for relativt kort tid. Ved screening rationelt designet tRNA sæt via denne analyse, kunne vi skabe roman tRNAer, der væsentligt øge effektiviteten af Pyrrolysin system30. Den klassiske kombination EGFP/mCherry bruges til de fluorescerende udlæsning, hvorved EGFP tjener som reporter indarbejdelse effektivitet og mCherry som intern kontrol. EGFP reporter og kontrolelementet mCherry er næret i det samme plasmid men er indlejret i to separate udtryk kassetter forsynet med to uafhængige initiativtagere. På denne måde mCherry udtryk vedrører Transfektion effektivitet og celletal, men er uafhængig af EGFP udtryk, så at den målte grønne fluorescens kan normaliseres til den røde fluorescens. Dette er ikke ligefrem tilfældet med andre journalister, bygget som en tandem af de to proteiner som EGFP-TAG-mCherry7 og iRFP-NGLY39TAG (med iRFP betegner den infrarøde fluorescerende proteiner)52. I sådanne konstruktioner er begge proteiner på samme mRNA afskriften. I eukaryoter underkastes mRNAs forsynet med for tidligt stop kodon overvågning og nedbrydning af nonsens-medieret nedbrydning (NMD) mekanisme53. Derfor, både sekvens af reporter og kontrol er samtidig forringet og udtryk for de to gener er ikke strengt uafhængig. Lignende assays baseret på en luciferase reporter i stedet for et fluorescens reporter har været beskrevet af andre54,55. Mens enzymatisk luminescence tilbyder højere følsomhed end fluorescens målinger, viste sidstnævnte højere reproducerbarhed mellem forskellige celle partier.

Robuste systemer til ncAA indbygning i pattedyrceller er absolut nødvendige, når arbejder med krævende protein mål som Membranproteiner og lav rigelige proteiner. Vi har vist her en optimeret ortogonale par for robust indarbejdelse af foto-activatable ncAA Azi i GPCRs. Systemet giver homogene Azi indarbejdelse priser i hele den hele receptor, der giver mulighed for systematiske foto-crosslinking kortlægning af hele GPCR overflader og identifikation af ligand bindingssteder. De to vigtigste punkter i styrken af metoden er at forskellige ligander kan analyseres på de samme receptor parallelt og at dataene er afledt af receptor i den levende celle, der supplerer oplysningerne fra in vitro- metoder. Metoden er i princippet gældende til enhver protein mål og er passende også at kortlægge topologier af protein-protein interaktioner. Den identificerede delmængde af crosslinked positioner kan desuden yderligere analyseres med 2D crosslinking til pin-punkts intermolekylære par af proksimale aminosyrer i de tilknyttede komplekse33,38. Sådanne aminosyre par give rumlige begrænsninger, der er anvendt i siliciummangan forsøg at bygge præcise molekylære modeller af interaktion33,38. Fra et metodisk synspunkt er det værd at bemærke, at kun positive resultater fra crosslinking eksperimenter bør overvejes. En holdning, der gjorde ikke bitmapgenkendelse kan stadig være inden for den kritiske radius fra liganden. Falske negativer kan opstå, når den mutation, der er indført ved crosslinker hæmmer den indfødte interaktion, men kan også opstå, når crosslinking gruppe enten peger væk fra ligand, eller er slukket af opløsningsmidlet eller gennemgår intramolekylære crosslinking. En afgørende del af metoden er hvordan man kan opdage forekomsten af crosslinking. Først og fremmest er hele cellelysater løst på SDS-PAGE til at adskille en ligand, der ikke er kovalent bundet til receptoren. For det andet er kovalente ligand-receptor komplekset opdaget via Western blotting ved hjælp af et anti-ligand antistof. For peptid ligander er høj-affinitet polyklonale antistoffer rejst mod liganden det optimale valg. Som alternativ, kan peptid ligander være udstyret med et FLAG-tag på en eftergivende holdning, forudsat tag er gjort tilgængelige for anti-FLAG antistof gennem en passende spacer. Biotin tags kan også bruges, selv om resultaterne kan være vanskelige at fortolke på grund af baggrunden af endogene biotinylated proteiner. Lille molekyle ligander er normalt radiolabeled, selv om tag-mærkning kan også være muligt56,57. Protokoller til Azi indbygning i GPCRs har været udgivet også af andre57,58,59. Men disse protokoller indebærer brug af tre plasmider til Azi iblandingen, der henviser til, at vi bruger en enklere to-plasmid system, herunder en humaniseret genet for E2AziRS, som giver bedre resultat med hensyn til den ikke-codon-optimerede en (figur 2B).

Moderne mikroskopi-teknikker kræver installation af meget lyse og effektiv fluorophores ind i protein af interesse, som genetisk kodet protein fluorophores såsom den klassiske EGFP ikke er egnet til high-end applikationer. Derfor er der en kontinuerlig søgning af metoder, der aktiverer installeres økologisk fluorophores ind på proteiner, som har ført til udviklingen af den populære SNAP60 og Halo61 tags, mellem andre. Disse tags har dog stadig en størrelse på flere kDa, som kan forurolige funktion af target proteinet og efterlade en hel stor usikkerhed om den nøjagtige placering af fluorophore. Med en minimal størrelse på et par aminosyrer repræsenterer tetracysteine motiv et mindre alternativ til mere præcise mærkning ved hjælp af fluorescein eller resorufin arsenical forbindelser (FlAsH, ReAsH)62,63. Selv om denne fremgangsmåde er anvendt med stor succes også GPCR undersøgelser64,65,66, det kræver omfattende vask trin med dithioler, det lider ofte af høj baggrund, og under alle omstændigheder det tillader ikke positionering etiket med enkelt rest opløsning. I stedet, ncAAs udstyret med bioorthogonal ankre giver mulighed for at installere fluorescerende etiketter på en enkelt aminosyre holdning, hvilket minimerer risikoen for at blande sig med de indfødte kropsbygning og funktionalitet af target proteinet. Sidste generation ncAAs til bioorthogonal kemi, som TCO * K13 ansat her, har aktiveret protein mærkning direkte på levende celler17,43. Metoden er anvendelig til protein mål på cellens overflade, men også på intracellulære mål, forudsat at passende celle-gennemtrængelige farvestoffer er tilgængelige17,67,68. SPIEDAC kemi er flere størrelsesordener hurtigere i forhold til stamme-fremmet azido-alkyn cycloaddition (SPAAC) og Staudinger Bertozzi ligations på indeholder forankrer2,13. Faktisk har flere protokoller udkommet for GPCR mærkning på genetisk indarbejdet Azi, men de gælder kun for isolerede GPCRs in vitro-37,59,69. I stedet, vi har vist her glat bioorthogonal mærkning af funktionelle GPCRs på den levende celle. Vores protokol svarer til eksisterende protokoller ved hjælp af den samme kemi43,48,70, men vores optimeret ncAA indarbejdelse system udvider anvendelsesområdet for metoden til GPCR undersøgelser. Et kritisk trin i forsøgsmetoden er valget af holdning, der udveksles med TCO * K, som ikke alle positioner inden for receptoren er enten eftergivende for en udskiftning eller tilgængelige for de fluorescerende farvestof. Derfor afprøves flere positioner i en indledende skærm til at finde den bedst egnede en.

Afslutningsvis, præsenterer dette arbejde værktøjer til generel anvendelse af ncAAs, herunder anvendelse til udfordrende protein mål såsom GPCRs. Vi forventer, at foto-crosslinking kortlægning og bioorthogonal mærkning i dag de vigtigste anvendelser af ncAAs til GPCR undersøgelser, vil finde mange fremtidige applikationer både til at afsløre topologier GPCR interaktioner med ligander eller andre proteiner og studere GPCR strukturelle dynamik i den levende celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke nogen konflikter til at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet grundlagt af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskud CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844, (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38, (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7, (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126, (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132, (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134, (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136, (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128, (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13, (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4, (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134, (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128, (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135, (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131, (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4, (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131, (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13, (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136, (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30, (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3, (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10, (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155, (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117, (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7, (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292, (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289, (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10, (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32, (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49, (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5, (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136, (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283, (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19, (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3, (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2, (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531, (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531, (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137, (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22, (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics