Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

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Summary

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

La incorporación genética de aminoácidos no-canónico (ncAAs) vía supresión de codón de parada ámbar es una técnica poderosa para instalar sondas artificiales y partes de reactivos a las proteínas directamente en la célula viva. Cada ncAA se incorpora por un dedicado par ortogonal de (AARS) supresor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetasa que es importado en el organismo del anfitrión. La eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs grandemente puede diferir y ser insatisfactoria en algunos casos. Pares orthogonal pueden mejorarse mediante la manipulación de la AARS o el tRNA. Sin embargo, evolución dirigida de tRNA o AARS con grandes bibliotecas y métodos de selección muertos/vivos no son factibles en células de mamíferos. Aquí, se presenta un análisis basado en la fluorescencia fácil y robusto para evaluar la eficacia de pares orthogonal en células de mamíferos. El ensayo permite detección de decenas a cientos de variantes AARS/ARNt con un esfuerzo moderado y en un plazo razonable. Uso de este ensayo para generar nuevo tRNAs que mejoran significativamente el rendimiento del sistema ortogonal pyrrolysine es descrito, junto con la solicitud de ncAAs al estudio de la proteína G unida a receptores (GPCRs), que son un reto objetos por ncAA mutagénesis. En primer lugar, incorporando sistemáticamente un ncAA foto-reticulación a lo largo de la superficie extracelular de un receptor, sitios de unión de ligandos diferentes en el receptor intacto se asignan directamente en la célula viva. Segundo, mediante la incorporación de última generación ncAAs en un GPCR, ultrarrápido receptor catalizador-libre de etiquetado con un colorante fluorescente se demuestra, que explota bioorthogonal promovido por la tensión inversa del aliso de Diels cicloadición (SPIEDAC) en la célula viva. Como ncAAs puede aplicarse generalmente a cualquier proteína independientemente de su tamaño, el método es de interés general para un número de aplicaciones. Además, la incorporación de la ncAA no requiere ningún equipo especial y se realiza fácilmente en los laboratorios de bioquímica estándar.

Introduction

La incorporación genética de sondas químicas a las proteínas es un método poderoso para facilitar la investigación de los aspectos estructurales y dinámicos de la función de la proteína directamente en el contexto natural de la célula viva. Hoy en día, cientos de no-canónico aminoácidos (ncAAs) equipados con los más dispares grupos químicos pueden site-specifically incorporados a proteínas por biosíntesis1,2,3,4. Entre ellos, uno encuentra ncAAs fotosensibles tales como foto-reticulantes5, Foto enjaulado6,7,8,9 y foto conmutable aminoácidos10, 11, aminoácidos, teniendo tensas alquenos y alquinos para bioorthogonal libre de catalizador química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos con dansilo18, cumarina9,19y21 fluoróforos de prodan20,y aminoácidos equipados con otros sondeos biofísicas como así como con post traslacional modificaciones1,2,3,4,22,23,24,25.

La codificación genética de un ncAA está habilitada por una dedicada amino-acil-tRNA-sintetasa (AARS) junto a un cognado supresor-tRNA, que incorpora la ncAA en respuesta a un codón ámbar durante la síntesis ribosomal regular. pares de ncAARS/tRNA están diseñados para ser ortogonales en el organismo del anfitrión, es decir, no interferencia con los pares endógenos. La técnica está bien establecida tanto en hosts de procariotas y eucariotas y las células fácilmente aplicables a mamíferos. Pares para la incorporación de la ncAA en células de mamífero se basan en tres sistemas ortogonales principales: el sistema de Tirosil, que combina la TyrRS de e. coli26 con un supresor de Tirosil ámbar de B. stearothermophilus27 (CE TyrRS /Bstpar de ñame), la e. coli leucina sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 y el sistema de pyrrolysyl de archaeal (PylRS/tRNA Pyl par)3, por el que el tRNAPyl es un supresor natural de color ámbar. En general, cada ncAA es reconocido por un ncAARS especializado. Dependiendo de la estructura de la ncAA, la ncAARS se obtiene mediante evolución dirigida TyrRS, LeuRS o PylRS, aunque algunos sintetasas pueden aceptar más de un ncAA.

El par orthogonal se importa dentro de las células utilizando simplemente un vector plásmido. Más común y eficientes plásmidos son bicistronic y codifican para la sintetasa y el ARNt formando el par orthogonal29. Un segundo plásmido de codificación para la proteína de interés con un codón ámbar en el sitio señalado para la modificación es co transfected. La ncAA se agrega simplemente al medio de crecimiento de la célula. Sin embargo, diferentes grupos especializados utilizan diversas variantes del plásmido construcciones incluso para la incorporación de la ncAA mismo. Construcciones difieren en el arreglo de los genes en el vector, tipo de la sintetasa, uso del codón en el gene de la ligasa, uso de promotor, variante del tRNA y el número de casetes de expresión tRNA. Por otra parte, la eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs puede variar drásticamente debido a la diferente eficacia catalítica de las sintetasas diferentes, la calidad de los tRNA y otros factores30. Por lo tanto, es importante disponer de un método rápido y confiable para evaluar la eficacia de un par orthogonal, elegir el sistema más adecuado para una aplicación deseada y realizar algunas medidas de optimización que mejoran la expresión de la proteína total rendimientos.

Hemos establecido un análisis simple y robusto basada en fluorescencia, para evaluar la eficiencia de pares orthogonal29 (figura 1). En el ensayo, las células son co transfected con el plásmido de codificación para el par orthogonal, junto con un plásmido de reportero bicistronic de codificación para la proteína verde fluorescente con un codón ámbar en una posición permisiva (EGFPetiqueta) y la mCherry gene. Fluorescencia roja y verde de Lisados celulares se leen en canales separados en un lector de placas en una placa de 96 pocillos. La intensidad de la fluorescencia verde se correlaciona directamente con la eficacia de la supresión de ámbar, mientras que la intensidad de fluorescencia roja da una estimación directa del tamaño de la muestra medida y la eficiencia de transfección. Con respecto a ensayos similares basados en fluorescencia celular asistida clasificación (FACS) leer31,32, el ensayo da una evaluación inmediata y completa de expresión de la proteína en la población de células enteras, que es más representativo de las condiciones experimentales usuales y ofrece una fácil adquisición de datos y procesamiento con software estándar. En general, la principal ventaja del ensayo es que un medio a un gran número de muestras puede analizarse en paralelo. Usando este análisis, hemos defendido una biblioteca racionalmente diseñada de supresor-tRNAs para mejorar la eficiencia de la Pyl sistema ortogonal30. Este trabajo describe el protocolo experimental para realizar este análisis y mostrar ejemplos de su aplicación, incluyendo la optimización del par ortogonal para la incorporación de la foto-reticulación ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) y la comparación de eficacia de la incorporación de aminoácidos diferentes (figura 2).

En los últimos años, herramientas de la ncAA se han demostrado muy potentes para investigar estructurales y aspectos funcionales de la proteína G acoplada a los receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. en los seres humanos, GPCRs forman una gran familia de receptores de membrana (800 miembros) y representan los principales objetivos para las drogas terapéuticas. Caracterización directa de los GPCRs es todavía un reto y métodos bioquímicos complementarios son muy necesarios para su investigación. Hemos sido pionero en el uso de foto-reticulación ncAAs superficies GPCR y descubrir ligando vinculante bolsillos34. Utilizando nuestro sistema optimizado para la incorporación de Azi, incorporamos sistemáticamente Azi en todo el dominio del juxtamembrane entero de un GPCR directamente en células de mamífero vivo. Sobre la irradiación UV, Azi forma una especie de nitrene altamente reactivo que captura covalentemente moléculas vecinas. Cuando el ligando se agrega al sistema, Azi sirve como sonda de proximidad para revelar qué posiciones del receptor se acercan al ligand encuadernado. De esta manera, el modo de unión de la hormona neuropéptido Urocortin tipo I (Ucn1) en el receptor de la clase B GPCR corticotropin-lanzar-factor 1 (CRF1R)33 primero se dio a conocer. Últimamente, hemos revelado patrones de enlace distinto de agonistas y antagonistas sobre el receptor mismo38. Un enfoque similar se ha aplicado por otros orthosteric y sitios de Unión alostérica de otros péptidos y pequeñas moléculas ligandos de otros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito describe el protocolo experimental aplicado en nuestro laboratorio para la foto-reticulación asignación de superficies GPCR. El método es relativamente rápido, sencillo y no requiere ningún equipo especial, por lo que es aplicable en los laboratorios de bioquímica estándar. Lo importante es el enfoque proporciona una herramienta valiosa no sólo para identificar sitios de unión del ligando donde escasean los datos estructurales 3D, pero también para complementar en vitro los datos existentes con información de receptores completamente postraduccional modificados en el entorno fisiológico de la célula viva.

El reciente desarrollo de novela ncAAs cojinete en el lado cadena grupos químicos adecuados para la química ultrarrápida catalizador-libre bioorthogonal ha abierto la posibilidad de instalar fluoróforos de última generación para la proyección de imagen de súper-resolución en proteínas directamente en la vida de las células2,43. Tales anclajes químicos incluyen cyclooctyne filtrada en SCOK14, nonyne de bicyclo [6.1.0] en BCNK12,17y trans-cyclooctenes en TCO * K13,15,17 entre otros ncAAs albergar un norbornene16,17,44 o cyclopropene45,parte de la46 . NcAAs voluminosos para bioorthogonal química se incorporan por una variante de la PylRS generalmente se denota como PylRSAF (indicando que la mutación Y271A y Y349F en PylRS de Methanosarcina M. ), así como por otras ad hoc evolucionado ncAARSs17 , 44. las anclas de bioorthogonal reaccionan con reactivos de tetrazina47 través de cicloadición de Diels-Alder de demanda electrónica inversa para dar altos rendimientos Etiquetadoras dentro de unos minutos43,48. Sin embargo, aplicación de este enfoque poderoso sello GPCRs ha estado desafiando debido a una baja eficiencia global del sistema de incorporación de ncAA ortogonal. Utilizando nuestro sistema mejorado de Pyl, recientemente hemos demostrado alto rendimiento incorporación de tales aminoácidos GPCRs y ultrarrápida etiquetado GPCR en la superficie de células de mamífero vivo30. Receptores etiquetados fueron todavía funcionales, ya que fisiológicamente internalizado al activar el receptor con un agonista. El protocolo experimental para la incorporación de bioorthogonal anclajes en GPCRs y aquí se describen los siguientes pasos de etiquetado. Equipar a GPCRs con fluoróforos brillante pequeño, es el primer paso fundamental para el estudio de la dinámica estructural de GPCR en la célula viva mediante técnicas de microscopía avanzada.

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Protocol

1. fluorescencia basada en la proyección de las eficiencias de incorporación (figura 1)

  1. Mantener las células HEK293 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; alta glucosa, glutamina 4 mM, piruvato) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2.
  2. Las células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células por pocillo de placas de 6 pozos en medio de cultivo completo de 2 mL en semilla 6.0 x 105 HEK293. Preparar tantos pozos como el número de muestras y dos pozos adicionales para la EGFP de tipo salvaje y una muestra de mock-transfected, respectivamente.
  3. Control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio. Transfectar las células en la confluencia de ~ 70% utilizando reactivo polietilamina (PEI).
    1. 1h antes de la transfección, añadir la cantidad apropiada de solución stock de ncAA recién preparada en todos los pocillos para una concentración final de la ncAA de 0.25-0.5 mM. Añadir la ncAA a todos los pozos, incluyendo el control positivo de tipo salvaje y las células transfected mock, para evitar que las diferencias en las señales de fluorescencia que pueden ser causadas por efectos de la ncAA en el crecimiento celular.
      Nota: Para preparar las soluciones madre, disuelve la ncAA a 0.1-0.5 M utilizando 0.2-0.5 M NaOH. Sin embargo, algunos ncAAs requieran inicial solubilidad en DMSO o neutralización por cuatro volúmenes de 1 M HEPES (pH 7,4) antes de su uso. Comúnmente, el fabricante recomienda un protocolo para preparar una solución madre.
    2. En un tubo de microcentrífuga, mezcle 1 μg de plásmido ADN codificación para que el par de ncAARS/tRNA a probar con 1 μg de plásmido reportero ADN (EGFP pcDNA3.0183TAG- mCherry). En tubos separados, preparar una transfección idéntica con la referencia de tipo salvaje EGFP y una transfección falsa.
      Nota: Número de copias del cassette de tRNA en el plásmido de codificación para el par de ncAARS/ARNt depende de la aplicación. Para facilitar la clonación, 1 copia de tRNA se recomienda cribado tRNAs diferentes, mientras que 4 copias se recomiendan (aunque no es estrictamente necesaria) cuando ncAARS diferentes pruebas o la incorporación de ncAAs diferentes por el mismo par orthogonal.
    3. A cada tubo que contiene el ADN añadir 100 μl del lactato solución salina tamponada (LBS) que contiene lactato de sodio 20 mM pH 4.0 y 150 mm NaCl. Mezclar brevemente.
    4. A cada tubo que contiene el ADN en libras añadir 6 μl de 1 μg/μl PEI en libras (relación PEI ADN = 3/1 w/w) y agitar inmediatamente. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
    5. 400 μL de medio celular de cada bien y añadir a la mezcla de ADN-PEI para neutralizar el pH. Gotear la mezcla de ADN en las células.
      Nota: DMEM generalmente contiene rojo de fenol como indicador de pH. Durante la etapa de neutralización del color de la mezcla en el tubo cambiará de amarillo (ácido) a rojo (neutro). Aunque formando los complejos ADN en libras en pH ácido da el más alto de la transfección rendimientos50, complejos ADN-PEI como alternativa se pueden formar directamente a pH 7.4 (por ejemplo en DMEM libre de suero). Si usa DMEM para formar complejos de ADN, omita el paso de la neutralización 1.3.5. En cualquier caso, es esencial que no suero está presente en la mezcla cuando se forman los complejos.
  4. Cosecha de la transfección de células 48 h.
    1. Aspire el medio y enjuague las celdas una vez con 2 mL de PBS precalentado (37 ° C). Añadir 800 μl de PBS suplementado con 0,5 mM EDTA e incubar por 20 min a 37 ° C. Soltar y suspender las células mediante pipeteo arriba y abajo.
    2. Transferir la suspensión a tubos de 1,5 mL conteniendo 200 de μl PBS suplementado con 5 mM de MgCl2.
    3. Centrifugar durante 2 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
      Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. En este caso, flash-congela los pellets en líquido N2 y conservarlo a-80 ° C hasta un mes. Utilice siempre gafas de protección ocular.
  5. Añadir 100 μl de tampón de lisis Tris (50 mM Tris-HCl de pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 1 mM EDTA y PMSF recién agregado) a los pellets de células e incubar en hielo durante 30 minutos. Para facilitar la lisis, vortex cada 5 min.
  6. Desactivación de los restos celulares por 10 min a 4 ° C y 14.000 x g y transferir 90 μl del sobrenadante en negro placas de 96 pocillos. Medida de fluorescencia EGFP y mCherry usando un lector de placa equipado con un módulo de fluorescencia.
    Nota: Utilizar filtros de excitación y de emisión adecuados para la EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) y mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Valores medidos de EGFP desarrollará en un rango entre el valor mínimo Obtenido de células transfectadas falsa y un valor máximo, que se obtiene generalmente de tipo salvaje EGFP. Tenga cuidado de establecer la ventana correcta para la medición en el instrumento.
  7. La eficacia de la incorporación de la ncAA se calcula como el cociente de la fluorescencia de la muestra y la fluorescencia obtenida de expresión de EGFP de tipo salvaje. Todos los valores se normalizan a mCherry fluorescencia.
    Equation 1

2. genética incorporación de ncAAs GPCRs para foto-reticulación mapeo de ligando GPCR interacciones (figura 3)

  1. Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2(v/v).
  2. Células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo arriba y abajo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células por pocillo en medio de cultivo completo de 2 mL en placas de 6 pocillos en semilla 5.0 x 105 293T. Para que cada posición que se proyectarán, preparar 1 bien por ligando más bien por el obligatorio control33,38. Puede incluirse un pozo extra para ser transfectadas con el receptor de tipo salvaje (wt) para verificar el nivel de expresión de los mutantes.
  3. Al día siguiente, control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio. Transfectar células en ~ 70% confluencia con PEI.
    1. 1h antes de la transfección, añadir Azi a todos los pozos a una concentración final de 0,5 mM.
      1. Preparar una solución de 0,5 M de Azi. Por placa de 6 pozos, pesan 1,2 mg Azi en un tubo y disolver en 15 μl 0.5 M NaOH. Diluir la solución en medio completo de 1,2 mL y añadir 200 μL de la mezcla a cada pocillo.
        Nota: Preparar una solución fresca de Azi para cada experimento. La molécula de azida tiene una vida media corta en soluciones acuosas, especialmente en pH básico, y el AziRS incorpora intacto sino también la forma degradada.
    2. Transfectar una cantidad total de ADN de 2 μg por pozo: 1 μg de plásmido de codificación para el GPCR tagged bandera teniendo un codón de etiqueta en la posición deseada y 1 μg de la codificación del plásmido para la pareja ortogonal dedicada a Azi (E2AziRS51 y 4 copias del cognado ARNt supresor BstYam)33,38.
      Nota: Cuando se incluye una comparación de la wt para verificar los niveles de expresión, transfectar una menor cantidad de ADN de plásmido para el receptor wt. Dependiendo de lo GPCR, 0.2-0.5 μg de plásmido codificación el peso del receptor similar rentabilidades como 1,0 μg de plásmido mutante. Transfectar la misma cantidad de ADN en todos los pocillos, llenando el ADN que falta con un mock (por ejemplo un vector vacío).
    3. Proceder como se describe en 1.3.3-1.3.5.
    4. transfección después de 48 horas, proceda con el paso 2.4 para la foto-reticulación de los ligandos o vaya al paso 2.5 para la cosecha directa y análisis para verificar la expresión del receptor.
  4. Foto-reticulación del ligand.
    1. Preparar una solución madre de 1.000 x ligando. Disolver el ligando péptidos en una concentración de 100 μm en DMSO.
      Nota: La concentración de ligando depende de la constante de disociación KD de la interacción de ligando GPCR. Una concentración final de 100 x KD es recomendable. Si el ligando de péptido es una sal de ácido trifluoroacético (TFA), considerar el peso de TFA al calcular el peso molecular (1 x TFA por base del aminoácido en el péptido). Asimismo, considere que los péptidos son en general higroscópico. Evitar congelar repetido de polvo péptido y nunca abra un contenedor de péptido hasta que no alcance temperatura ambiente.
    2. Diluir el ligando solución 1:1,000 en tampón de Unión compuesto por BSA 0.1%, 0.01% Triton-X 100, 5 mM MgCl2 en solución tampón HEPES disociación (HDB) 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES)-HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl y 5 mM KCl. Prepare 1 mL por mutante Azi GPCR. Reemplazar el medio celular con 1 mL de la solución del ligando. Incubar por 10 min a TA.
      Nota: Ajustar el tiempo de incubación para el GPCR específico, responsables de internalización de la cinética y del receptor del ligand. Prolongando el tiempo de incubación no mejora los rendimientos de reticulación.
    3. Irradiar las muestras durante 20 min en un crosslinker UV a 365 nm con 5 x 8 W tubos y ~ 5 cm de distancia a las células. Separar las células mediante pipeteo y transferirlos a un tubo de reacción de 1,5 mL. Sedimenten las células por 3 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
    4. Disolver una tableta de inhibidor de la proteasa (PI) en 1 mL 25 mM EDTA/H2O para hacer una solución madre de 50 x. Alícuota del PI solución de stock y almacenar a-20 ° C. Diluir la acción 50 x 1:25 en HDB y resuspender el pellet celular en 50 μl de 2 x PI en HDB. Flash-congela las células en el líquido N2.
      Nota: Gafas de protección ocular. En este punto, las muestras pueden conservarse a-80 ° C hasta un mes. Continúe con el paso 2.6.
  5. Cosecha directa de la célula.
    1. Aspire el medio. Añadir 800 μl de EDTA 0,5 mM en HDB. Incubar por 10 min a temperatura ambiente o en el hielo.
    2. Separar las células mediante pipeteo arriba y abajo y transferirlos a un tubo de reacción de 1,5 mL. Añadir 200 μL de 5 mM MgCl2 en HDB. Sedimenten las células por 3 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
    3. Resuspender el pellet celular en 50 μl de 2 x PI en HDB y flash freeze en líquido N2. Gafas de protección ocular.
      Nota: En este punto, las muestras pueden almacenarse a-80 ° C durante 1 mes.
  6. Lisis de la célula.
    1. Descongelar las células en un baño de agua a 37 ° C durante 30-45 s y agitar brevemente. Mantener las muestras frías de ahora en adelante. Membranas de pellets a 2.500 x g y 4 ° C durante 10 minutos eliminar el sobrenadante, que contiene la mayor parte de proteínas citosólicas.
    2. Resuspender el pellet en buffer de lisis HEPES 50 μl que contenía 50 mM HEPES-ácido clorhídrico de pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Tritón X-100, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM TDT y recién añadido 2 Cóctel de PI. Mezclar bien. Lyse las células 30 min en hielo y agitar cada 5 min.
    3. Desactivación de los restos celulares por 10 minutos a 14.000 x g a 4 ° C. Inmediatamente transferir el sobrenadante a un tubo de reacción fresca.
      Nota: Proceder con el análisis inmediato. Los lisados pueden almacenarse a-20 ° C, sin embargo, cada ciclo de hielo-deshielo deteriora la calidad de los resultados.
  7. Análisis de Western blot.
    1. Para preparar la muestra, tomar 3-5 μl lisado y llenarlo hasta 7 μl con H2O. Añadir 2 μL 1 M TDT y buffer de muestra 4 x 3 μl que contiene 63 mM Tris-HCl de pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol y bromofenol 0.04% azul. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
    2. Cuando el GPCR es glucosilada y bandas débiles o manchados son un problema, deglycosylate las muestras con PNGasa F para aumentar la intensidad de la señal y afilar las bandas. Utilizar 3-5 μl lisado y deglycosylate en un volumen total de 10 μl, siguiendo el protocolo del proveedor. Agregar 3 μl 4 x el tampón de muestra.
      Nota: Proteínas de membrana son a menudo glicosiladas en varios sitios y Estados, que deteriora la calidad de la resolución en análisis de SDS-PAGE. Sin embargo, no no deglycosylate las muestras para el análisis del nivel de expresión de los mutantes de GPCR Azi usando los anticuerpos de anti-FLAG porque es relevante evaluar la porción de completamente glucosilada, madura del receptor en la superficie celular.
    3. Resolver las muestras via estándar SDS-PAGE y luego transferencia de proteínas a una membrana PVDF.
      PRECAUCIÓN: La acrilamida es neurotóxica. Use guantes y protección para los ojos.
    4. Bloquear la membrana de 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en 5% de leche descremada en TBS-T que contiene 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, NaCl 0,15 M y 0,1% Tween 20.
    5. Sonda de la membrana con un anticuerpo anti-ligando, seguido por el anticuerpo secundario conjugado con HRP. En el medio de lavado con TBS-T. Para detectar el nivel de expresión de lo GPCR Azi, sonda de membrana con un anticuerpo comercial de HRP (véase Tabla de materiales).
    6. Realizar la reacción de quimioluminiscencia mejorada (ECL) utilizando reactivos caseros de ECL y detectar señales de 5 min en la oscuridad.

3. ultrarrápido Bioorthogonal etiquetado de GPCRs en células mamíferas vivas

Nota: El protocolo está optimizado para cubreobjetos cámaras 4 pozos (zona bien = 2,2 cm2). Para tamaños bien distintos, el protocolo debe adaptarse en consecuencia.

  1. Revestimiento de la superficie del portaobjetos. Llevar a cabo todo el procedimiento bajo una campana de estéril.
    1. Preparar un bromhidrato de poly-D-lisina (MW = 500-550 kDa) solución (PDL) en una concentración de 1 mg/mL en tampón de borato de 50 mM (pH 8.5). Almacenar a 4 ° C hasta por 6 meses. No congelar.
    2. Diluir solución stock 1:40 de la PDL en agua ultra puro estéril a una concentración final de 25 μg/mL (solución de trabajo), a continuación, filtrar la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm.
      Nota: La solución de trabajo puede guardarse a 4 ° C hasta por 3 meses.
    3. Cubrir completamente el fondo de cada pozo del portaobjetos de microscopía con 500 μl de solución de trabajo de PDL. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y aspirar la solución de trabajo de PDL.
      Nota: La solución de trabajo de PDL puede usarse hasta tres veces. Si la solución tiene que ser reutilizado, transferir la solución de los portaobjetos recubiertos a un tubo estéril fresco y por consiguiente la etiqueta del tubo. Nunca mezcle la solución reciclada con solución fresca.
    4. Enjuague cada bien 3 x con ~ 700 μl de agua ultra pura estéril y deje secar durante al menos 1 h.
      Nota: Es muy importante lavar los pocillos con precisión, como residuos de la solución PDL son tóxicos para las células. Los portaobjetos recubiertos pueden utilizarse inmediatamente para microscopía o almacenados hasta por una semana a 4 ° C.
  2. Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2(v/v).
  3. Células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células de semilla 1.0 x 105 HEK293T por pozo (área de 2,2 cm²) en 600 μl DMEM completo libre de tinte.
      Nota: Para propósitos de la proyección de imagen, es muy conveniente trabajar desde el principio en un medio que no contiene ningún colorante. Formulaciones de DMEM libres de tinte están comercialmente disponibles.
  4. Control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio y transfectar las células en confluencia de ~ 70% utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos.
    1. 1 h antes de la transfección, prepare una solución fresca de 100 mM de TCO * K en 0,2 M NaOH y DMSO 15% (v/v).
    2. Por pocillo, mezclar 3 μl de la TCO * solución madre de K con 12 μl de pH HEPES de 1 M 7.4. Añadir suavemente la solución a los pozos con un TCO final * concentración de K de 0,5 mM.
    3. Preparar un total de 500 ng de ADN por pozo. En un tubo de microcentrífuga, diluir 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de plásmido de codificación para la MbPylRSAF/tRNA par orthogonalPyl (cuatro cassettes de tRNAM15) y 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plásmido en 50 μl de medio (tinte libre, libre de suero, antibiótico libre).
      Nota: En general, la transfección del Arrestin no es necesaria observar la internalización de GPCR. Sin embargo, Arrestin3 transferencia Co acelera la internalización de la CRF1R, que es muy conveniente cuando se analiza la internalización de los muchos mutantes.
    4. Diluir 1.25 μl de reactivo de transfección basada en lípidos (2,5 μL 1 μg de ADN) en 50 μl de medio (tinte libre, libre de suero, antibiótico libre) y añadir la solución a la mezcla de ADN. Inmediatamente Vortex e incubar 5-10 min en complejos agregar RT. lípidos de ADN a las células.
      Nota: En nuestra experiencia, la morfología de las células transfectadas con transfección basada en lípidos parece más fisiológico en comparación con el de células transfectadas con el PEI. PEI proporciona una mayor eficiencia de transfección, PEI debería prefiere para los usos aguas abajo como el Western blot, considerando que la base de lípidos la transfección es la mejor elección para transfectar las células para experimentos de imagen.
  5. etiqueta de la transfección, la 24 h el receptor con tintes fluorescentes.
    1. Preparar una solución madre del colorante tetrazina 0,5 mM en DMSO y a 10 mg/mL de ADN tinción colorante solución ultra pura de H2O.
    2. Transferir 100 μl de medio de cada bien en un tubo de reacción de 1,5 mL. Agregue 1.8 μl de la solución stock de colorante tetrazina y 0,3 μl del ADN tinción colorante solución. Transferir el medio que contiene los tintes hacia el pozo e incubar 5 min a 37 ° C.
      Nota: Tetrazina-naranja-fluorescente tinte tiene una concentración final de 1,5 μm.
    3. Aspire el medio y lavar suavemente las células dos veces con PBS para eliminar exceso de colorante. Añadir 600 μl de tinte completo medio de crecimiento libre precalentado a 37 ° C.
  6. Internalización de la microscopia y el receptor de la fluorescencia.
    1. Visualizar los receptores etiquetados bajo 63 x (o similar) aumento el uso de filtros apropiados para GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), tinte naranja fluorescente (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) y ADN tinción colorante (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Tome una foto con cada filtro antes de activar el receptor.
    2. Promover la internalización del receptor con 200 nM de Ucn1.
      1. Preparar una solución madre de 1.000 x Ucn1 de 200 μm en DMSO.
        Nota: Dependiendo de la solubilidad del péptido, puede ser capaz de preparar el caldo en agua pura o buffer.
      2. Transferir 100 μl de medio de un pozo en un tubo de reacción de 1,5 mL y añadir 0,6 μl de la solución madre de agonistas de péptidos. Transferencia al medio de nuevo en el pozo.
      3. Observar la internalización en el microscopio. Tomar fotos después de la ocurrencia claramente perceptible de la internalización (10-15 min a horas, según el receptor y la sobreexpresión de Arrestins) usando los filtros mencionados anteriormente.

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Representative Results

El contorno de la prueba de fluorescencia se representa en la figura 1. El ensayo se emplea en tres aplicaciones. En primer lugar, un número de variantes de tRNA para la incorporación de Lys(Boc) por el par de Pyl ortogonal es evaluado. Lys(BOC) es un aminoácido sterically similar a Pyl. Pyl no esté comercialmente disponible, Lys(Boc) se utiliza comúnmente como un substrato estándar para la PylRS. Los tRNAs seleccionados se basan en el tRNAPyl. Cada variante de tRNA lleva mutaciones de bases únicas o pares de bases en los lazos y tallos racionalmente diseñados para mejorar la estabilidad de tRNA y la compatibilidad con la maquinaria traduccional eucariota. Todos los detalles sobre el diseño de tRNA se describen en nuestro reciente trabajo30. Resultados típicos se describen en la figura 2A: diferentes tRNAs dan eficacia supresión diferentes, que se refleja claramente en la cantidad de medida de la fluorescencia. Las barras de error pequeño de triplicados biológicos muestran que los valores son altamente reproducibles. En segundo lugar, dos variantes del gen de la E2AziRS26,51, que incorpora el crosslinker foto p-azido-Phe (Azi), son evaluadas. E2AziRS se deriva de la TyrRS de e. coli . Una variante del gen empleado nativo e. coli uso del codón, mientras que el segundo codón-optimizado para el uso en H. sapiens. El ensayo de fluorescencia muestra que la variante optimizada de codón da mayores rendimientos de proteína (figura 2B). Por último, la tasa de incorporación de diferentes aminoácidos para química del tecleo de bioorthogonal son comparados (figura 2). Todos el ncAAs presentados aquí (BCNK, TCO * K y SCOK) se incorporan por el mismo par de MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonal. Lys(Z) también se incorpora por este par y fue utilizado como control positivo. Para ilustrar la fiabilidad de la prueba de fluorescencia, se realizaron experimentos de incorporación de ncAA paralelo en un GPCR, el CRF1R. Se realizó análisis de Western blot para estimar la expresión GPCR (figura 2B, C). Se observaron las mismas tendencias observadas con EGFP en el análisis de fluorescencia con la CRF1R. En particular, incorporación de Azi en CRF1R muy fue realzada cuando usando el gene del E2AziRS codón optimizado en comparación con el gen nativo, mostrando que incluso una mejora moderada de 1.5-2-fold para una proteína soluble (EGFP) según el ensayo de fluorescencia puede tener un mayor impacto en el nivel de expresión más desafiantes de proteínas de membrana (figura 2B). Como Nota general, con respecto al número de cassettes de tRNA para cada aplicación, solo un cassette de tRNA se recomienda cribado tRNAs diferentes con el fin de facilitar los procedimientos de clonación. Cuando proyección diferentes ncAARS o la eficacia de la incorporación de ncAAs diferentes por el mismo par orthogonal, repeticiones en tándem cuatro de los tRNA cassette son preferidos para lograr los rendimientos más altos de incorporación de la ncAA.

El sistema optimizado para Azi incorporación incluyendo el gene E2AziRS humanizado se desplegó para definir caminos de unión de ligandos diferentes 5 y mapa del bolsillo de unión de la CRF1R: los dos agonistas del péptido Ucn1 y CRF y los tres antagonistas del péptido Ucn1(8-40), CRF (9-41) y dFXCRF(12-41) (figura 3). Mientras que la eficacia de la incorporación de Azi fue demostrada previamente para disminuir al acercarse a la c-terminal de GPCR33,34, nuestro sistema optimizado para la incorporación de Azi permite niveles de expresión comparable de Azi-mutantes con los sitios de etiqueta en diferentes partes del gen GPCR (Figura 4A). Los resultados en la Figura 4B muestran la proyección del lazo extracelular 2 (ECL2) y helix V de CRF1R como una parte representativa del bolsillo ligando. Una banda en el tamaño correcto de la reticulación producto revela que la posición se encuentra en la proximidad del ligando del complejo ligando-receptor, es decir, es parte de la cavidad de encuadernación. Se encontraron múltiples golpes de reticulación con ligandos todos probados, revelar patrones de enlace distinto para el péptido los agonistas y los antagonistas. En particular, el patrón de entrecruzamiento hits proporciona información sobre elementos estructurales del receptor. Un número de golpes sucesivos, como observado en ECL2 (posiciones F260-R263 en combinación con antagonistas) sugiere una región flexible lazo. Un patrón de visitas cada tres o cuatro residuos como encontraron en consejos de helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) hacia una estructura helicoidal. La pantalla puede ampliarse a todos los dominios pertinentes de lo GPCR. Si existe una estructura 3D o un modelo molecular del receptor, se pueden visualizar huellas ligando destacando los éxitos de reticulación para cada ligando (figura 5).

Datos de Western blot (figura 2) y fluorescencia sugieren que TCO * K es la ncAA para la química bioorthogonal que consigue incorporar con la mayor eficiencia por la MbPylRSAF. Diferentes mutantes de PylRS podrían dar un mayor rendimiento de la incorporación de otros haga clic en ncAAs17, pero no fueron probados en este estudio. TCO * K se incorporó a una proteína de fusión CRF1R-EGFP y permitió instalar vía química SPIEDAC (figura 6A) un fluoróforo brillante pequeño en el receptor (Figura 6B). Como una prueba de etiquetado específico, la fluorescencia de la etiqueta debe ser visible solamente en las células que expresan el receptor (células verdes en la Figura 6B) y no en células oscuras, así que proporcionan un control interno negativo en cada experimento. Etiquetado con química ultrarrápida de SPIEDAC los receptores son todavía funcionales. Después de agregar a un agonista del péptido, compartimientos fluorescentes se observaron en el citosol, revelando el proceso fisiológico de la imputación de GPCR (figura 6). Las señales de la EGFP fundida localizada junto con el colorante fluorescente en todo momento, confirmar el etiquetado biorthogonal selectiva de lo GPCR.

Figure 1
Figura 1: ensayo basado en la fluorescencia para evaluar la eficacia de la supresión del codón de parada. Las células HEK293 son co transfected con dos plásmidos en presencia de la ncAA. Un plásmido codifica para la ncAARS deseada y ARNt supresor. El segundo plásmido codifica para el gen EGFP teniendo un codón de parada de la etiqueta en un sitio permisivo junto con un control mCherry. Dos días después de la transfección, la fluorescencia verde y roja de lysates de la célula entera se mide en un lector de placas. Como el EGFP N segmento corriente arriba que del codón de parada (gris) no es fluorescente, el rendimiento de larga duración EGFP (verde) directamente se corresponde con la eficacia de la incorporación de la ncAA, mientras mCherry (rojo) proporciona una referencia independiente para la normalización. El rendimiento del sistema ortogonal viene dada por la relación entre la cantidad de EGFP obtenida vía supresión de codón de parada y la cantidad de EGFP tipo obtenido por la traducción regular (no supresión del ámbar). Se modifica la figura de Serfling, R. & moneda, I; Incorporación de aminoácidos no naturales en las proteínas expresadas en células de mamífero, métodos en enzimología, 2016, 580, 89-107. 29 reproducción fue autorizada por el centro de despacho de Copyright de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Aplicaciones representativas de la prueba de fluorescencia. (A) de tRNAPyl variantes30. Las células HEK293 fueron co transfected con el plásmido reportero y plásmidos que codifican para el par de PylRS/tRNA Mb(una copia tRNA). Las barras representan la fluorescencia relativa de EGFP Obtenido de la incorporación de Lys(Boc) en comparación con el tipo salvaje EGFP. (B) evaluando la influencia de la utilización de codones de los genes ncAARS. (panel izquierdo) Análisis de fluorescencia de células transfectadas con dos variantes de genes diferentes de E2AziRS. (1) uso de codón de e. coli y el gen (2) humanizado. (panel derecho) Mancha blanca /negra occidental análisis de CRF1R95Azi-bandera. El receptor completa es detectado por un anticuerpo anti-FLAG. Actina β fue utilizado como control de carga. (C) evaluar la eficacia de la incorporación de tres ncAAs diseñado para la química bioorthogonal. (panel izquierdo) Estructuras de ncAAs utilizado en este experimento. (1) LysZ, que fue utilizado como control positivo, (2) BCNK, (3) TCO * K y (4) SCOK. (panel central) Análisis de fluorescencia de las células HEK293 transfectadas con un plásmido de codificación para MbPylRSAF y cuatro copias de tRNA15 de (A) para incorporar (1), (2), (3) y (4). (panel derecho) Análisis de un mutante de CRF1R bandera con uno de los cuatro ncAAs en posición 95 mancha blanca /negra occidental. Actina β fue utilizado como control de carga. Panel A fue una adaptación de Serfling, R. et al. Designer tRNAs para la incorporación eficiente de aminoácidos no-canónico por el sistema del pyrrolysine en células de mamífero Ácidos Nucleic res. 46 (1), 1-10 (2018) y se reproducen según Creative Commons Licencia de atribución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representación esquemática de la asignación de foto-reticulación Azi-mediada. Una función de foto-activatable azido (estrella amarilla) se coloca en una posición definida dentro de la base (gris). Cuando el grupo azido se encuentra próximo al ligand encuadernado (rojo), un producto de entrecruzamiento covalente está formado por la irradiación UV (círculo amarillo indica sitio de entrecruzamiento). La incorporación del grupo azido en diferentes posiciones del receptor revela la superficie de unión (violeta) del ligand, que representa la cavidad de encuadernación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Incorporación de Azi en CRF1R para el mapeo de la foto-reticulación del bolsillo de Unión. (A) comparación de los niveles de expresión de mutantes Azi CRF1R de bandera hacia el receptor de tipo salvaje. Los sitios de incorporación Azi se distribuyen en todo el receptor de todo como se indica en la fila superior. Anti-FLAG manchas blancas /negras occidentales de Lisados celulares se muestran. Actina β fue utilizado como control de carga. (B) manchas blancas /negras occidentales sondeado con cualquier anti-CRF o aparecen anticuerpos anti-Ucn1. Los residuos sustituidos por Azi se indican en la fila superior. Las células se incubaron con los ligandos listados a la derecha, seguido por la irradiación UV a 365 nm y lisis. Las muestras se han resuelto 10% SDS-PAGE, deglycosylated con PNGase F y analizadas por Western blot. El complejo ligando-CRF1R de deglycosylated funciona en un aparente MW de 40 kDa33. El ligando no reticulado no es detectado (MW ~ 3-4 kDa). Ambos paneles de este han sido modificados de Seidel, penetración de L. et al. Structural en la activación de un receptor g-proteína-juntado de clase B por hormonas peptídicas en células humanas vivas. Eterna. 6 10.7554/eLife.27711 y se reproducen según la licencia Creative Commons Attribution. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Huellas de péptido agonistas y antagonistas de la clase B GPCR CRF1R. Representación superficial del dominio transmembrana de CRF1R. Posiciones de CRF1R que reticulado se destacan el ligando cuando sustituido por Azi. Huellas de los agonistas de péptidos CRF y Ucn1 destacan en magenta, huellas de los antagonistas CRF (9-41) y Ucn1(8-40) en azul. La huella de la antagonista dFXCRF(12-41) se resalta en naranja. Las siete hélices transmembrana I a VII se indican con números romanos. (A, B) Vistas laterales del bolsillo de unión del plano de la membrana. (C) vista en el bolsillo de unión del lado extracelular de la superior. Reimpreso de Seidel, penetración de L. et al. Structural en la activación de un receptor g-proteína-juntado de clase B por hormonas peptídicas en células humanas vivas. Eterna. 6 10.7554/eLife.27711 y se reproducen según la licencia Creative Commons Attribution. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Etiquetado de SPIEDAC de CRF1R en células vivas. (A) esquema de la reacción de la cicloadición de Diels-Alder promovido por tensión inversa electrónica demanda (SPIEDAC): el grupo trans-cyclo-2-octeno de la ncAA TCO * K reacciona con el grupo de tetrazina relacionado con el fluoróforo Cy3. (B, C) Las células HEK293T expresando CRF1R95TCO * K- EGFP. Imágenes representativas del canal verde, rojo y azul. El tamaño de la barra de escala es 10 μm. (B) las células fueron tratadas con tetrazina-Cy3 (1,5 μm) durante 5 minutos. Sólo las células que expresan el receptor (verde) muestran ocurrencia de etiquetado (rojo). (C) las células fueron tratadas con 200 nM Ucn1 y reflejada después de vesículas intracelulares 15 minutos corresponden al receptor internalizado. Paneles B y C son modificados de Serfling, R. et al. Designer tRNAs para la incorporación eficiente de aminoácidos no-canónico por el sistema del pyrrolysine en células de mamífero Ácido Nucleic res. 1-10 de 46 (1) (2018) (Oxford University Press) y se reproducen según la licencia Creative Commons Attribution. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo describe un ensayo sencillo y fiable para evaluar la eficiencia de pares ortogonales para la incorporación de ncAAs proteínas expresadas en células de mamíferos. La principal ventaja de este método con respecto a ensayos ampliamente utilizados basado en FACS es que permite la realización simultánea y medición de un número mayor de muestras y proporciona datos que se analizan fácilmente utilizando un software normal. La disponibilidad de un método de mediano rendimiento para analizar pares orthogonal en células de mamíferos es muy importante para el desarrollo de nuevos pares ortogonales y la mejora de los existentes. De hecho, no es posible realizar evolución dirigida de pares ortogonales a través de la generación de grandes bibliotecas al azar y selección muertos/vivos en sistemas mamíferos. El ensayo permite que las bibliotecas de investigación de pequeño tamaño (cientos de miembros) invirtiendo un esfuerzo experimental razonable dentro de un tiempo relativamente corto. Por investigación racional diseñado conjuntos de tRNA mediante este análisis, podríamos generar novela tRNAs que aumentar significativamente la eficiencia del sistema pyrrolysine30. La combinación clásica EGFP/mCherry se utiliza para la lectura fluorescente, por el que EGFP sirve como reportero de la eficacia de la incorporación y mCherry como el control interno. El reportero EGFP y el control de mCherry se albergaban en el mismo plásmido pero se encajan en dos cassettes de expresión independiente teniendo dos promotores independientes. De esta manera, mCherry expresión se relaciona con la eficiencia de transfección y recuento de células, pero es independiente de la expresión de EGFP, de modo que la fluorescencia verde medida puede normalizarse a la fluorescencia roja. Esto no es exactamente el caso de otros reporteros construido como un tándem de dos proteínas como EGFP-etiqueta-mCherry7 y iRFP-GFPY39TAG (con iRFP que denota la proteína fluorescente infrarrojo)52. En tales construcciones, ambas proteínas están en la misma transcripción del mRNA. En eucariotas, mRNAs con codones de parada prematuros se someten a vigilancia y degradación por el mecanismo de decaimiento absurdo-mediado (NMD)53. Por lo tanto, la secuencia de la reportera y el control son simultáneamente degradado tanto expresión de dos genes no es estrictamente independiente. Ensayos similares basados en un reportero de luciferasa en lugar de un reportero de fluorescencia han sido descritos por otros54,55. Mientras que luminiscencia enzimática ofrece mayor sensibilidad que las mediciones de la fluorescencia, este último demostró mayor reproducibilidad entre lotes diferentes de la célula.

Sistemas robustos para la incorporación de la ncAA en células de mamíferos son absolutamente necesario cuando se trabaja con exigentes objetivos de proteínas como proteínas de membrana y proteínas abundantes bajas. Aquí hemos mostrado un par orthogonal optimizado para incorporación sólida de la ncAA foto-activatable Azi en GPCRs. El sistema da tasas de incorporación Azi homogéneas a lo largo de todo receptor que permite la asignación sistemática de foto-reticulantes de superficies enteras de GPCR y la identificación de sitios de unión del ligando. Los dos principales puntos de fuerza del método son que diferentes ligandos pueden ser analizadas en el mismo receptor en paralelo y que los datos se derivan del receptor en la célula viva, que complementa la información obtenida de los enfoques en vitro . El método es en principio aplicable a cualquier destino de la proteína y es adecuado también para las topologías de las interacciones proteína-proteína. Por otra parte, el subconjunto identificado de reticulado posiciones más puede ser analizado con reticulación 2D a punta intermoleculares pares de aminoácidos proximal en el complejo asociado33,38. Dichos pares de aminoácidos proporcionan restricciones espaciales que se aplican a en silico experimentos para construir modelos moleculares precisos de la interacción33,38. Desde el punto de vista metódico, vale la pena señalar que deben considerarse sólo positivos resultados de experimentos de entrecruzamiento. Una posición que no reticulación puede verse en el radio crítico de ligando. Falsos negativos pueden ocurrir cuando la mutación introducida por el crosslinker dificulta la interacción nativa, pero también puede ocurrir cuando la molécula de reticulación puntos de ligando, o se apaga por el disolvente o sufre entrecruzamiento intramolecular. Una parte fundamental del método es cómo detectar la ocurrencia de reticulación. En primer lugar, Lisados celulares se resuelven en SDS-PAGE para separar cualquier ligando que no está enlazado covalentemente al receptor. En segundo lugar, el complejo covalente ligando-receptor se detecta mediante Western Blot utilizando un anticuerpo anti-ligando. Para ligandos de péptidos, anticuerpos policlonales de alta afinidad contra el ligando son la opción óptima. Como alternativa, ligandos de péptido pueden equiparse con una etiqueta de la bandera en una posición permisiva, siempre y cuando la etiqueta se hace accesible a los anticuerpos de anti-FLAG a través de un espaciador adecuado. Tags biotina pueden también usarse, aunque los resultados pueden ser difíciles de interpretar debido al fondo por las proteínas endógenas biotinilado. Ligandos de molécula pequeña son generalmente radiactiva, aunque etiquetado etiqueta también puede ser posible56,57. Protocolos para la incorporación de la Azi en GPCRs han sido publicados también por otros57,58,59. Sin embargo, estos protocolos implican el uso de tres plásmidos para incorporación de Azi, que usamos un sistema más simple de dos plásmidos, incluyendo un gen humanizado para E2AziRS, que da mejor resultado con respecto a la no-codón-optimizado uno (figura 2B).

Técnicas de microscopía moderna requieren instalación de fluoróforos muy brillante y eficiente en la proteína de interés, como fluoróforos de proteína genéticamente codificada como la EGFP clásico no son adecuados para aplicaciones de gama alta. Por lo tanto, hay una búsqueda continua de métodos que permiten instalar fluoróforos orgánicos sobre las proteínas, que ha llevado al desarrollo de la presión popular60 y Halo61 etiquetas, entre otros. Sin embargo, estas etiquetas todavía tienen un tamaño de varios kDa, que puede perturbar la función de la proteína diana y deja una gran incertidumbre sobre la posición exacta del fluoróforo. Con un tamaño mínimo de unos pocos aminoácidos, el motivo de tetracysteine representa una alternativa más para el etiquetado más preciso utilizando fluoresceína o resorufin compuestos arsenicales (FlAsH, ReAsH)62,63. Aunque este enfoque ha sido aplicado con éxito también a GPCR estudios64,65,66, requiere pasos de lavado amplio con tioles, sufre a menudo de fondo alta, y en cualquier caso, no permite posicionamiento de la etiqueta con una resolución de solo residuos. En cambio, ncAAs equipados con anclajes de bioorthogonal ofrecen la posibilidad de instalar fluorescentes etiquetas en una solo aminoácido posición, minimizando así el riesgo de interferir con la conformación nativa y la funcionalidad de la proteína diana. NcAAs de última generación para la química de bioorthogonal, como el TCO * K13 aquí, han permitido la proteína etiquetado directamente en células vivas17,43. El método es aplicable a los objetivos de la proteína en la superficie celular, sino también en objetivos intracelulares, que tintes permeable a la célula adecuados están disponibles17,67,68. SPIEDAC química es varios órdenes de magnitud más rápido con respecto a la cepa promueve azido-alquino cicloadición (SPAAC) y trompas de Staudinger Bertozzi en azida anclas2,13. De hecho, se han publicado varios protocolos de GPCR etiquetado en genéticamente había incorporado Azi, pero son aplicables sólo a GPCRs aislado en vitro37,59,69. En cambio, hemos demostrado aquí lisa bioorthogonal etiquetado de GPCRs funcionales en la célula viva. Nuestro protocolo es similar a los protocolos existentes usando la misma química43,48,70, pero nuestro optimizado sistema de incorporación de ncAA amplía el alcance del método a los estudios GPCR. Un paso crítico en el procedimiento experimental es la elección de la posición que se intercambiará con TCO * K, como no todas las posiciones en el receptor son permisivas para un reemplazo o accesible para el tinte fluorescente. Por lo tanto, se deben probar varias posiciones en una pantalla preliminar para encontrar el más adecuado.

En conclusión, esta obra presenta herramientas para la aplicación general de ncAAs, incluida la aplicación a los desafiantes objetivos de proteína como GPCRs. Anticipamos que foto-reticulación asignación y bioorthogonal de etiquetado, hoy en día las principales aplicaciones de ncAAs estudios de GPCR, encontrarán muchas aplicaciones futuras tanto para conocer las topologías de las interacciones de GPCR con ligandos u otras proteínas y estudiar GPCR dinámica estructural en la célula viva.

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Disclosures

Los autores no tienen ninguna conflictos para declarar.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido fundado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en subvenciones CO822/2-1 (programa de Noether del Premio Emmy) y CO822/3-1 a I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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References

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