蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

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Summary

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。

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Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

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Abstract

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) の薬理学的対象は、人間の健康に非常に重要な多くの病気の進行に貢献する機能不全 GPCR を介したシグナル伝達します。リガンド ・受容体ペア CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)/CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) がんや炎症性疾患の治療のための潜在的なターゲットとして、例えば重要な臨床的関心を調達しています。特に CXCR4 をターゲットし、受容体の機能を阻害する抗体と同様、小分子と見なされる薬理学的に貴重なツールをします。ここでは、フロー フローサイトメトリーを用いた細胞試金 CXCR4 に cxcl 12 バインディングを破棄する化合物 (例えば、小分子) の同定を可能にするを説明します。基本的には、アッセイは、受容体 CXCR4 の自然ケモカイン アゴニスト蛍光に分類された cxcl 12 の固定量とラベルのない化合物の結合のための競争に依存します。したがって、このアッセイで放射能によって分類されたプローブの望ましくない使用は避けます。さらに、生きている細胞は、細胞膜の準備ではなく受容体 (CXCR4) のソースとして使用されます。これによりスループットが向上版のフォーマットにアッセイの容易に適応できます。この試金は CXCR4 ターゲット化合物を識別するために貴重なジェネリック医薬品検出アッセイする示されています。プロトコル可能性がありますに対応できる他の Gpcr 少なくとも蛍光リガンドは利用または生成することができるかどうか。これらの Gpcr の活性化により誘導される細胞内シグナル伝達経路に関する事前の知識は必要ありません。

Introduction

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) はセル表面蛋白質 (例えばペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン) 細胞外リガンドによって活性化することができます、1を処理により多くの生理学的発達を調節します。受容体蛋白質の誘起構造変化が細胞内受容体関連ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαから成る結合を促進するアゴニストは、GPCR 結合ポケットを占めていると、GDP と Gβγサブユニット。解離、下流を開始するさらに G 蛋白質サブユニット (GαGTP と Gβγ) の Gαサブユニット結果に GDP を GTP のそれ以降の exchange はシグナリング経路2,3です。GαGTP が加水分解したとき再会 Gαの GDP と Gβγサブユニット G タンパク質戻るに変換その静止の状態3,4。G タンパク質の異なる種類が存在 (GsG のi/oGq、G12/13) を Gαサブユニット5配列の類似性に基づいて分類されます。すべてのこれらの G タンパク質は受容体活性化する生物学的反応の根底にある定義済みの細胞内シグナル伝達経路を誘発します。受容体活性化後は、GPCR キナーゼ (GRKs) は、β arrestins との相互作用の促進を図る、Gpcr の細胞内の尾をリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達、受容体の脱感作と内面の6の終了に します。Β arrestins、トリガー信号をカスケード G 蛋白質シグナリング7の独立した多分子複合体の一部です。

Gpcr は、治療的介入のほとんどの検証分子標的の中で多くの病因学に貢献する規制を解かれた GPCR を介したシグナル伝達、例えば機能獲得変異受容体遺伝子の受容体の過剰発現が原因人間の病気の8。したがって、Gpcr は製薬業界8,9,10を用いて創薬ターゲットの最も重要なクラスの 1 つを表します。臨床的に関連する GPCR の顕著な例は CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4)、唯一の天然リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)11によって活性化することができます。(HIV-1) ひと免疫不全ウイルス 1 の主要な共受容体として確立された役割のためのエントリ、クラスターの分化 4 (CD4) 抗ウイルス薬ターゲットとして肯定的な T リンパ球12, CXCR4 を調べた最初の感染。さらに骨髄に cxcl 12 CXCR4 相互作用調節保持し幹・前駆細胞のホーミング細胞13。また、がん生物学 (例えば、腫瘍細胞の生存、転移、腫瘍関連血管新生)14の多くの側面でいくつかその他疾患 (例えば、炎症性疾患)15, CXCR4 の関与を考える創薬のための有望なターゲットとして大きな関心を発生します。AMD3100, CXCR4 を標的とする低分子抗 HIV 薬候補16として発見された当初はまだ日付17に記載されている最も強力な CXCR4 アンタゴニストの一つ.その開発と抗ウイルス薬は、しかし、18は中止。現在この分子は、多発性骨髄腫とリンパ腫の患者のための18の治療中に幹細胞動員エージェントとして使用されます。いくつかの他の化学的に無関係な小さな分子や CXCR4 関数をさまざまな効力を抑制する生物学的製剤は、記述されている19をされています。

受容体結合メソッドは、関心の GPCR と直接対話する化合物 (例えば、小分子) を識別できるように薬理学の貴重なツールです。結合試験を実行するために、細胞内シグナル伝達のプロパティまたは特定の GPCR の機能に関する知識の必要はありません。これは利点であるためと考えられることができます、それは化合物が受容体の結合を示すことができますがさらに彼らの潜在的な敵対または敵対的活動を評価することによって特徴付けられる必要があることを意味します。この活動は、GPCR 研究の下に関連する薬理学的または生物学的アッセイを使用して評価できます。彼らの活動のプロファイルに依存して、受容体の結合の分子、潜在的になる進化可能性前臨床試験と臨床研究の調査のための新規リード化合物。高親和性受容体に特異結合する分子が腫瘍細胞20生体内非侵襲イメージングのカイネティックスそれらによって例えば治療または診断ツールを生成するための足場として、または可能性としても利用できます。治療21のターゲットを絞った配信のための車。CXCR4 の場合腫瘍細胞の生体内イメージングが既に実証されているラベル CXCR4 ターゲット分子がひと癌異種移植片20,22,23 の視覚化を許可する前記マウスモデルを使用して.

本報告では、小分子と CXCR4 を拘束アゴニスト (cxcl 12) に直接干渉する生物学的製剤の照合することにより競争の結合の試金のための詳しいプロトコルについて述べる。アッセイの原理は蛍光リガンドの固定量間の競争 (cxcl 12AF647テーブルの材料および試薬を参照してください) と受容体タンパク質17,にバインドするための化合物をラベル24. CXCR4 を表現する 1 つのセルにバインドされている標識リガンドから特定の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーで分析しました。ラベルのない小さな分子 cxcl 12AF647と CXCR4 相互作用を混乱させるとき、この蛍光信号を差し引かれます。アッセイは、内生 CXCR4 を表現する非操作の細胞を使用して (すなわち、 Jurkat 細胞)。したがって、細胞膜の準備する必要がない便利な高速、スループットの向上と互換性のある試金になります。蛍光リガンドを利用していますので、放射能を避けます。

Cxcl 12 は CXCR4 の自然のアゴニスト、cxcl 12AF647バインディング アッセイに干渉する低分子化合物は orthosteric 受容体結合部位 (すなわち、結合部位が占め、自然と対話するにはアゴニスト)。Orthosteric 結合部位とは異なる地形的受容体結合部位と通信できる分子が気づかれ場合 cxcl 12 のバインディングには影響しません。例えば、このアッセイでの正と負のアロステリック変調、GPCR アロステリック結合サイト25に作用する分子をターゲットの重要な新たなカテゴリをピックアップされている可能性。さらに、受容体アンタゴニストやアゴニストとして化合物がこのバインディング アッセイ機能を識別されるかどうかは派生できません。その他、薬理学的または機能的受容体関連アッセイで同定された化合物の調査は従って必要となります。これらの試金は (の組み合わせ) を含めることが第二使徒 (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (cAMP))、表現型の検出細胞蛍光または発光ベース法または生物学的アッセイと β アレスチン募集の試金、どちらを調査の下で GPCR の特定信号プロパティによって異なります。したがって、主に本明細書に記載されている競争の結合の試金は、受容体結合能を持つ化合物の詳細な特性評価を有効にする他の細胞に基づく試金で補完する必要がある最初のスクリーニング法として機能します。

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Protocol

1. 培養細胞のメンテナンス

注: 1 と 2 で説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。

  1. 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコのセルを育てます。
    注: このアッセイで Jurkat 細胞 (すなわち、内生表現 CXCR417ひと白血病細胞の T リンパ球細胞) が使用されます。CXCR4 の細胞表面での発現をフローサイトメトリーによる細胞培養中で評価されるべき。流れ cytometry プロシージャおよび細胞表面の受容体の発現レベル、ただし、このプロトコルの範囲内ではされているを決定する試薬の説明上記17の。
  2. Jurkat 細胞の成長停止の 80-85% に到達するまで合流しましょう。新規フラスコにセルを通過する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。
  3. 新しいコート t75 フラスコ培養用フラスコに完全な新鮮な成長媒体 (RPMI 1640 中, 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン) の 20 mL を追加します。
  4. 小説コート t75 フラスコ培養用フラスコに (細胞懸濁液 25 mL を含んでいる) 元の T75 フラスコから Jurkat 細胞懸濁液 5 mL を追加します。37 ° C、5% CO2加湿インキュベーターで孵化させなさい。

2. cxcl 12、アッセイのバッファー、および Jurkat 細胞の競争の結合の試金のための準備。

  1. ポリソルベート 20 の 0.01% (ボリューム) を添加した純水 (暗闇の中、-80 ° C で保存) 凍結乾燥試薬を溶解することにより cxcl 12AF647 (20 μ G/ml; 参照テーブルの材料および試薬) の原液を準備します。単一のストアは、-80 ° c、光から保護されてこの原液から因数を使用します。
  2. 40 mL HEPES (1 M、20 mM 最終濃度) を追加することにより 200 mL ハンクのバランスのとれた食塩 (HBSS、10 x、フェノールレッドと重炭酸ナトリウム、最終濃度 x 1 なし) にアッセイバッファーを準備します。追加純水 2 l. 追加 4 g (0.2% 重量/容積) ・ ウシ ・血清アルブミン (BSA) の最終的なボリュームを取得して磁気を介して BSA を溶解攪拌。最後に、7.4 (これに水酸化ナトリウムを使用) に pH を調整し、(テーブルの材料および試薬を参照) 0.2 μ m の気孔を通してソリューションをフィルター真空多岐管を使用しています。
    注: このアッセイバッファーはプロトコルのすべての以降の手順で使用されます。
  3. 細胞の生存率と数をカウントします。このため、細胞の懸濁液のサンプルを取るし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈します。
    注: 我々 は日常的に自動化された細胞生存率アナライザーを使用 (テーブルの材料および試薬を参照) さまざまな濃度で細胞を懸濁液を数えることができます。セルがカウントの 1.5 mL の PBS (例えば、 1.9 mL の PBS に 0.1 mL その他の希釈も可能です) に細胞懸濁液 0.5 mL を希釈します。トリパン ブルー色素排除法に基づいて、このメソッドの使用されている前述した26。携帯番号と同様に動作する必要があります可能性を数えるため市販されているいくつかの他のデバイス。
  4. 400 の x g で 5 分間遠心分離 (遠心分離機のタイプの材料および試薬の使用を参照) によって滅菌 50 mL のチューブで細胞 (すなわち、 ~ 24 x の 1 つの完全な 96 ウェル プレートでアッセイを実行する 10 の6セル) の必要な数を収集します。RT。
  5. 細胞ペレットを乱すことがなく上澄みをそっと注ぐ。新鮮なアッセイバッファーを追加 (例えば、 20 mL) と上下に軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。
  6. 室温 5 分 400 x g で再び細胞を遠心分離します。
  7. もう一度、上澄みを離れて注ぎ、5 x 106セル/ml の密度を得るため新鮮なアッセイバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。

3 競争の結合の試金

注: 実際の競争の結合の試金は RT では実行され、非無菌条件の下で実行することができます。

  1. アッセイバッファーで調査中で化合物を希釈 (2.2 参照) 望ましい集中を取得します。いずれか準備初期スクリーニング (例えば10 μ M 最終濃度) の化合物濃度が固定または濃度の連続希釈系列化合物のキャラクタリゼーションの詳細 (例えば1/3、1/4、1/5 希釈系列最終濃度 1 μ M から始まる)。複合ソリューションの 2 倍希釈で試金; 最終的になる覚えておいてください。したがって、濃縮された溶液 x 2 を準備します。
  2. 底板ラウンド クリア 96 ウェルに 100 μ L の混合の解決 (濃縮 2 倍) を分配 (テーブルの材料および試薬を参照) (例えば図 1) を事前に定義された実験的レイアウトによると。
    注: この段階では、正と負のコントロールのサンプルは分析に含まれます。否定的な制御サンプル96-well 版の井戸に化合物の代わりにアッセイバッファーの 100 μ L が追加されます。肯定的な制御サンプルアッセイバッファーがこのステップの間にも追加されます。いくつかの化合物の希釈系列をテストの典型的な実験的レイアウトには、図 1を参照してください。
  3. 細胞懸濁液を 50 μ l 添加 (2.7; を参照してください 106セル × 0.25) マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートに試薬リザーバーから。暗闇の中で常温 15 分間プレートを孵化させなさい。
  4. 50 μ L の蛍光に分類された cxcl 12 を追加 (すなわち、 100 ng/mL 25 ng/mL の最終的な集中、集中 4 x アッセイバッファー cxcl 12AF647の) 96 ウェル プレートの井戸に類似した試薬槽から。暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。
    注:否定的なコントロールのサンプルは、アッセイバッファーを代わりに追加します。したがって、マイナス コントロールのサンプルで検出された蛍光シグナルは蛍光バック グラウンド信号 (図 1 a) に対応します。肯定的な制御サンプルcxcl 12AF647の 50 μ L/ウェルを追加します。肯定的な制御サンプル最大蛍光信号を検出、含まれている化合物と前の孵化によって潜在的な阻害がなかったので (図 1 a) が得られます。
  5. 板の上を反転して削除した小球形にされた細胞から培養上清で 5 分間 400 x g で 96 ウェル プレートを遠心します。組織にプレートを乾燥させます。
  6. マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に試薬リザーバーから新鮮なアッセイバッファー 200 μ L を追加します。すぐに進みます。
  7. 板の上を反転して削除した上清で 400 × g で 5 分間再びプレートを遠心し、再び組織上で乾燥させます。
  8. 軽く 200 μ L の PBS に溶解し 1% パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。この手順では、セルを修正します。
  9. フローサイトメトリーによる蛍光性の定量化とすぐにプロトコルを続行します。

4. フローサイトメトリーによる試料の分析

Cxcl 12AF647ステンドし、執着の細胞をフローサイトメトリーを使用して分析する準備が整いました。流れの cytometers のいくつかの種類を使用できますが、彼らは励起および蛍光検出のための適切なフィルター (すなわち、赤いレーザー、励起 〜 630 nm)、適切なレーザーを装備する必要がある (発光フィルター 〜 660 nm)。彼らは 96-well 版のフォーマットのサンプルを処理できる必要があります。適切な流量フローサイトメトリー デバイスの例としてテーブルの材料および試薬で与えられます。

  1. デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます (テーブルの材料および試薬を参照)。
  2. ドットのしみ形式で可視化すること次の細胞パラメーターを選択: 散布 (FSC)、側方散乱 (SSC) および蛍光 (cxcl 12AF647) 検出チャンネルを転送します。
    注: FSC パラメーターを持つ細胞が差別されるのサイズに基づいて検出された光吸収セルの直径に比例しているので。90 ° の角度で光の散乱を測定、SSC パラメーターは、セルの粒度に関する情報を提供します。
  3. FSC と SSC のパラメーターに基づいて定義された均一な細胞集団のゲートを実行する (例えば、否定的な制御サンプル) 1 つのサンプルを選択します。
    1. この否定的な制御サンプルから流れの cytometer に執着細胞の ~ 100 μ L の自動注入を選択します。オプション「混合」投与前に、を選択し、1.5 μ L/s のサンプル フロー レートを使用します。
    2. 「取得データ」を選択することでこのサンプルを実行このサンプルの FSC と SSC のパラメーターが画面に表示されます。
    3. ソフトウェアのゲーティング ツールを選択します。FSC と SSC ドットのしみの可視化に基づく、事前ゲートで均質かつ実行可能な細胞集団を定義します。これを行うには、これらの 2 つのディメンションに基づくゆく分散単一セル (「イベント」) が含まれる (ソフトウェアのゲーティング ツールを使用して) 多角形を作成します。
      注: ゲーティングの手順は、さらに分析に使用する同種および実行可能なセル人口を定義を目指しています。ゲートは、生菌の大半が FSC と SSC のパラメーターに基づいて均一な細胞集団を形成する仮定に依存します。この手順を実行すると、主細胞の残骸、死んだ細胞、細胞凝集塊をさらに分析から除外することができます。ゲーティング プロセスの図は、図 1 bで与えられます。
  4. 20,000「イベント」(すなわち、単一セル) サンプルあたりを分析するを選択します。
    注: これは、各サンプルでは、定義済みのゲート内にある 20,000 の細胞が最終的に分析することを意味します。各サンプルのデータ集録は、このイベントの数の分析まで続行されます。
  5. 実行 (選択「記録データ」) を開始。流れの cytometry デバイスは各サンプルの平均蛍光強度 (MFI) を記録することによって 1 つのすべてのサンプルを分析します。この MFI は、定義済みのゲート内にある 20,000 のセルに対応する平均蛍光信号に対応します。

5. データの解析

さらに計算を実行するのに各サンプルの得られた MFI を使用します。流れの cytometry データの解析は、(表の材料および試薬を参照)、いくつかの市販のソフトウェア パッケージによって実行できます。

  1. 割合を決定する化合物の前培養の結果、蛍光バインディング信号の抑制は次の数式を適用します。
    Equation 1
    どこ:
    MFIExp (= 化合物処理) 実験の MFI を = サンプル
    MFIPC肯定的な制御の MFI を =
    MFINC = 陰性対照の MFI
  2. 化合物 (すなわち50% によって蛍光結合信号を減らすことができる化合物の濃度) の IC50値を調べるには、次の数式を適用します。
    Equation 2
    どこ:
    ログconc.2 = 50% 未満になる化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制
    ログconc.1 = 50% 以上の化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制
    注: また、高活性化合物の場合大きさのいくつかのログをカバー用量-反応曲線生成できます各テスト化合物濃度に対応する MFI に基づきます。適切なソフトウェアを使用して非線形回帰曲線のあてはめを適用することによって (テーブルの材料および試薬を参照)、IC50値を生成された曲線から推定しことができます。この分析手法の例は、図 3に示します。

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Representative Results

結合の試金の一般的なワークフローは、図 1 aに提示されます。図 1 bと可能なプレート レイアウトを実行する (すなわち、否定的な制御、肯定的な制御と実験的サンプル) 標準的な実験の別のサンプル タイプの得られた流れ cytometry データの種類のイラストが描かれています。96 ウェル プレート形式のアッセイは、図 1で与えられます。ケモカイン受容体 CXCR4 を内生表現 Jurkat 細胞の培養 (すなわち、このアッセイの関心の GPCR)、蛍光に分類された cxcl 12 の増加額でに起因した (すなわち、 cxcl 12AF647) 増加蛍光 (図 2)、CXCR4 をリガンド結合の増加されたレベルを反映してのレベル。Cxcl 12AF647バインディングの受容体特異性を示すためには、確立された、特定の受容体 CXCR4 アンタゴニスト (低分子 AMD3100) が使用されました。Jurkat 細胞が 0.064 ng/mL から 1,000 ng/mL、25 ng/mL cxcl 12AF647 (すなわち、ラベル付きのケモカインの固定量の最終的な集中と孵化によって続いてに至るまで AMD3100 の 1/5 希釈系列でプレインキュベートした最初日常的に使用、試金)。その後、プロトコルに従って、Jurkat 細胞さらに処理されました。Cxcl 12AF647前培養 Jurkat 細胞への一定量の付加の後の蛍光信号 (平均蛍光強度、MFI) は、すべてのサンプルの流フローサイトメトリー解析によって得られました。Jurkat 細胞が AMD3100 の最高濃度と前処理の場合この蛍光信号が完全抑制ほとんど (1000 ng/mL)。この条件下で蛍光の抑制レベルやや Jurkat 細胞の蛍光のレベルに対応するバック グラウンド レベルより上。結論としては、非固有受容体 (を結合の最小限の残存レベルで大きな蛍光信号ウィンドウ (とき陰性対照と比較して) を生成の結合の試金に cxcl 12AF647 25 ng/mL (最終濃度) を適用します。3 a を図)。

この結合の試金は、単一固定濃度でラベル付けされていない化合物のパネルでリガンドをかく乱化合物のスクリーニング、または活性化合物の用量依存的効果を研究するために主に使用されています。後者の場合、目標は、IC50値 (すなわち50% によって結合信号を阻害する化合物の濃度)、化合物の結合能を反映するを取得します。図 3は、小分子 cxcl 12 CXCR4 へのバインディングを中断することのこの結合の試金で得られる流れ cytometry データを使用して、(IC50) の面での抑制の効力を決定する方法を示します。AMD3100 cxcl 12AF647結合用量依存的阻害による、IC50価値は非線型回帰分析を適用することでここに決定されました。この例では、AMD3100 の計算の IC50値は 18.12 ng/mL に対応します。キャンペーンをスクリーニングでランダムに選択された化合物の大半は CXCR4 に cxcl 12AF647のバインディングを禁止してはいけないされるため+ Jurkat 細胞、アクティブでない例化合物もこの研究に含まれていた。ここでは、5 (CCR5)27CC ケモカイン受容体に対する特異的拮抗剤として作用して強力な抗 HIV 1 活動を表わす小さな分子 maraviroc は結合の試金のテストされました。(100 ng/mL をテスト済み最高濃度でさえ、maravoric と Jurkat 細胞を培養後、最大蛍光バインディング シグナルの阻害は検出されなかった図 3 b)。同じ実験では、AMD11070、改良された薬物動態的特性28、AMD3100 に関連別の小分子のシリアル希釈系列が含まれていた。Maraviroc とは異なり 0.0064 から明らかに 100 ng/mL に至るまで AMD11070 から 1/5 希釈系列と用量依存的阻害 cxcl 12AF647バインディング (図 3 b) です。

Figure 1
図 1: ワークフローと得られたデータの種類の図の概要。(A). プロトコルの主な手順は、正と負のコントロール サンプル、および化合物処理サンプルのスキーマ化されています。化合物の前培養と蛍光に分類されたケモカイン (cxcl 12AF647) 添加なしのサンプルは背景 (自動) 蛍光 (陰性対照試料) を決定するのに含まれます。サンプル cxcl 12AF647の固定量の添加ではなく化合物の中古インキュベーションは、アッセイ (肯定的な制御サンプル) の最大結合信号を決定する使用されます。化合物処理のサンプルで細胞がプレインキュベート cxcl 12AF647の固定量の添加前に化合物としました。(B). Jurkat 細胞のフローサイトメトリー分析による平均蛍光結合信号を決定します。すべて (すなわち、 Jurkat 細胞) のイベント分析 (左側のパネル) からゲート細胞亜集団から蛍光信号のみを使用して、詳細な分析 (中央のパネル)。小分子 (例えばAMD3100) と細胞の前培養が蛍光に分類された受容体リガンドの結合を阻害するので、最大結合信号 (右側のパネル、ヒストグラム表現で示す) が低下します。(C). 板レイアウト 96 ウェル プレート形式で競争の結合の試金を実行するとき。1,000 に至る (重複) のシリアル希薄を 1/5 シリーズの六つの異なる化合物 (cpd 1-6) をテストするこの場合、0.32 まで nM nM。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: cxcl 12AF647 Jurkat 細胞への結合です。Jurkat 細胞培養化合物と中古インキュベーションの不在の cxcl 12AF647量が高まる。平均蛍光強度 (MFI、任意の軽い単位で表された) ± SD は示されている (n = 2)。カーブ フィットは、方程式に従う 1 サイト合計バインディング モデルを用いた非線形回帰を用いて行った

Equation 3

Bmax (最大特定のバインディング) と = 18,345;Kd = 92.8 ng/mL;NS(非特異的結合の傾斜) = 2.139;背景332.6 を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: cxcl 12AF647アクティブおよび非アクティブの化合物の結合を阻害します。(A) 用量依存的前 25 ng/mL cxcl 12AF647を添加する前に、AMD3100 の濃度の増加と細胞の孵化によって cxcl 12AF647結合を阻害。注 (MFI; 任意の光単位で表された) の平均蛍光強度を最大に抑制はまだ少し Jurkat 細胞の得られた蛍光バック グラウンド (自動) 上記 (平均 ± SD (n = 3))。可変傾斜 (4 つのパラメーター) によると非線型回帰を使用して曲線のあてはめを行った

Equation 4

ここで斜面は 1.313、計算される IC50 18.12 ng/mL。(B). CXCR4 に cxcl 12AF647バインディングの AMD11070 と maraviroc の用量依存的効果+ Jurkat 細胞 (MFI ± SD (n = 3))。AMD11070 応答用カーブ ・ フィッティングは 1.458 の斜面0.9052 ng/mL の計算 IC50値を同様に行った。Maraviroc 対応フィッティング行われませんでしたこの化合物の活動の欠如を与えられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

結合の試金 (すなわち、飽和結合と動的バインディング実験) の他のタイプと比較して、競争の結合の試金は、スクリーニング目的に最も適しています。確かに、彼らは定額ラベル付き受容体リガンドの結合を妨害する能力の得点でラベルのない化合物、例えば小さい分子の大規模なバッチの評価ができます。標識リガンドよりも他の受容体部位に結合する化合物は、アッセイの検出されないかもしれません。競争の結合実験記載焦点を当ててケモカイン受容体 CXCR4 の特にが、同様に他の Gpcr の可能性が高い競争の結合の試金の設計のための青写真として使用できます。例えば、CXC ケモカイン受容体 7 (CXCR7) は cxcl 12、親和性が高い29,とバインディング cxcl 1230対応の代替の受容体として記述されていた。したがって、競争の結合の試金は CXCR7 結合実験を設定する使用ことができます説明 CXCR4 のとして同じラベル ケモカイン (cxcl 12AF647) が使用されます。CXCR4 と CXCR7 は、一般的な配位子として cxcl 12 を共有するため、特定の受容体結合を評価するために細胞表面の両方の受容体の 1 つだけの表現に使用される携帯電話のモデルで動作することが重要でしょう。我々 の以前の仕事は、Jurkat 細胞が CXCR717の内因性表現を示さないことを実証しています。したがって、ここに記載した CXCR4 のアッセイで CXCR7 へのバインディングとの干渉は除外されています。

競争の結合の試金のいくつかの主要な機能、高速最初のスクリーニング CXCR4 とアゴニスト結合と干渉する小さな分子を識別するためのツールとして使用することができます。アッセイの主な利点の 1 つは興味の受容器を表現する、全体の細胞の使用です。これは、労働集約的な細胞膜の準備の必要性を省略します。また、Jurkat 細胞で検出された蛍光バック グラウンド (自動) の低レベルは、有益です。一緒に蛍光に分類されたプローブの定義された量の添加によって取得した大信号ウィンドウ、良好な信号対バック グラウンド比に貢献します。これはラベルのない化合物により潜在的な結合の阻害の検出を促進します。他 CXCR4 の発現細胞をこの結合の試金の実行に備えて常に彼らは細胞から細胞に異なる場合がありますので、これらのパラメーター (背景の蛍光性、信号ウィンドウ) の評価を先行する勧めします。Jurkat 細胞が内生的長期間にわたって一貫したレベルで CXCR4 を表現、事実便利な携帯電話モデルになります。受容体の発現の同じ一貫したレベルは、固定して transfected セルのクローンを取得ことがあります。対照的に、お勧めしません一時的に transfected セルの使用のため、蛍光強度より少ない応答性細胞アッセイになり、間の一貫性のより広範な分布にその結果実験します。CXCR4 負 Jurkat 細胞が存在しなくなるために、これらの細胞に受容体結合の特異性は前培養確立された特定の受容体拮抗薬 (AMD3100 および AMD11070) で示されました。これらの拮抗薬は、標識リガンド構造的に異なっています。これは、ため、ラベルとラベルの両方の配位子が非特異的結合部位の細胞表面に潜在的に存在するバインディングの競争もライバルとして配位子のラベルのバリエーションを使用する場合に重要です。

細胞のホストから離れてここで説明アッセイのいくつかの他の側面は、他の Gpcr Gpcr を対象とする蛍光に分類されたプローブのための選択肢として開発されているのと同様のアッセイを構築する開始する前に考慮する必要がある放射性。プローブが、現在のみに Gpcr の限られた数が、比較的高価です。また、fluorophores が付いている自然な受容体リガンドの変更特に非常に小さい配位子 (例えばアミン) または小さなペプチド31,の場合、ラベル付けされていない親分子と比較してのバインドのプロパティを変更するか32します。 たとえば、小さな配位子の場合リンカーは通常と区別する必要、ファーマコフォア サイト31を結合受容体の orthosteric へのアクセスを許可するように蛍光します。また、複雑な受容体蛍光プローブの安定性は考慮する必要があります。我々 の経験で 90-120 分 (すなわち、 2 つの連続した 96 ウェル プレートを実行に必要な時間) 後、肯定的な制御井戸の平均蛍光強度通常 ~ 5% 削減のすべての肯定的な制御の井戸のなかに比べると、プレートは、時折外れ値 5 と 10% の間。

また、ラベル付きのリガンドの本質的な活動は重要です。受容体活性化受容体拮抗薬は、受容体に組み込みアクティビティを表示しないに対しラベル アゴニスト可能性を誘発し、結果、受容体の内在化。リガンド-受容体相互作用33の可逆的な性質が損なわれます。可能性を最小限に抑えるため受容体内在化、(ラベルの付いたアゴニスト) の場合標識リガンドと孵化の問題は時間で制限される必要があり、常温または低に優先的に実行する必要があります。実際にはプロシージャを常温で行うことも便利でスクリーニングのプレート フォーマットでの努力との互換性をアッセイになります。最終的に十分なセル (20,000 の細胞は、「単一のイベント、」全セル人口のゲートに基づく; 参照数を保持するアッセイで (例えば250,000/ウェルの 96 ウェル プレート) のサンプルごとのセルの十分な数を使用する必要があります最後に、図 1)流れフローサイトメトリー分析。以下の細胞を使用する困難となるより一貫してこのうち読み取りの信頼性を危うくさせる分析セルの数に到達します。(も) につき 1 サンプルあたり少ない細胞を用いたフローサイトメトリー、サンプルを分析に必要な時間も増加、全体の 96 ウェル プレートを分析する全体的な時間を増やします。これにより、スループットを向上させるが損なわれます。上記の理由によりアッセイの将来の小型化したがってすると可能性があることは簡単でないこと。

一緒に取られて、ラベル付き cxcl 12 CXCR4 にバインドするための一定量を競うことができる小さい分子を識別するスクリーニング ツールとして私たちの研究室で主に使用は競争の結合の試金は、詳細に記載されています。これらのバインディングの研究、関心、受容体結合の物質を識別するために比較的迅速かつ簡単な方法としてです。結合能を持つ化合物の同定はそのものに価値が既に、このタイプの試金は特定の化合物のアクティビティに関する情報を行いません。したがって、さらに検証し、その他の薬理学的および機能的受容体アッセイの潜在的な敵対または敵対的活動を特徴付ける必要なままです。CXCR4 結合の試金 (すなわち抑制をバインドするための低い IC50値を生成する) の高められた活動を示す受容体拮抗薬が比較的実行ことが示されている場合、興味の他の機能によりCXCR4 関連アッセイも17をです。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーンを感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

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References

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