Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isolerade hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad kan användas som en preklinisk modell för att studera barriärfunktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Förståelse blod - hjärnbarriären funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska strategier som håller löftet att förbättra hjärnan drug delivery, förbättra hjärnans skydd och behandla hjärnan störningar. Dock är att studera funktionen människors blod - hjärnbarriären utmanande. Således finns det en kritisk behovet av lämpliga modeller. I detta avseende representerar hjärnans kapillärer isolerade från mänsklig hjärnvävnad ett unikt verktyg för att studera barriärfunktion som nära mänskliga i vivo situationen som möjligt. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för att isolera kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad på en hög avkastning och med jämn kvalitet och renhet. Kapillärerna är isolerade från färska mänsklig hjärnvävnad med mekaniska homogenisering, täthetlutning centrifugering och filtrering. Efter isoleringen, kan mänskliga hjärnan kapillärerna användas för olika tillämpningar, inklusive läckage analyser, levande cell imaging och immun-baserade analyser för att studera proteinuttryck och funktion, enzymaktivitet eller Intracellulär signalering. Isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna är en unik modell för att belysa reglering av funktionen människors blod - hjärnbarriären. Denna modell kan ge insikter i centrala nervsystemet (CNS) patogenes, vilket kommer att bidra till utvecklingen av terapeutiska strategier för behandling av CNS-sjukdomar.

Introduction

På blod - hjärnbarriären är en väl kontrollerad gränssnitt mellan blod och hjärna som avgör vad går in och kommer ut ur hjärnan. Anatomiskt, endotelceller komponera på blod - hjärnbarriären och bildar ett komplex, kontinuerlig kapillär nätverk. Fysiologiskt, förser detta kapillära nätverk hjärnan med syre och näringsämnen medan samtidigt avyttra koldioxid och metabola restprodukter. Ännu viktigare, stöder bevis att barriären ändringarna bidra till många sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, epilepsi och stroke1,2,3,4,5 , 6 , 7. hjärnan endothelial celler också fungera som ett hinder för behandling genom att blockera drog upptag in i hjärnan, t.ex., kemoterapi av glioblastoma multiforme efter tumör resektion8,9, 10. I detta hänseende isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna representerar en unik ex vivo blod - hjärnbarriären modell som liknar barriär boenden i vivo, vilket möjliggör studier av barriär-funktion och dysfunktion i hälsa och sjukdom. I denna artikel ger vi ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänskliga hjärnan på en konsekvent hög kapillär kvalitet och kapacitet för att studera på blod - hjärnbarriären.

1969, Siakotos et al. Det var först att rapportera isolering av hjärnan kapillärerna från bovin och human hjärnvävnad med täthet lutning centrifugering och glas pärla kolumn separation 11 . Senare, Goldstein et al. 12 förbättrades denna metod genom att lägga till flera filtrering steg för att minska mängden vävnad som behövs för att studera hjärnan kapillärerna isolerade från råtta, samtidigt som den metaboliska aktiviteten av glukos transporter. Sedan dess optimerad forskare kapillär isolering proceduren flera gånger, att förbättra metoden och hjärnan kapillär modellen med varje iteration13,14,15. Exempelvis Pardridge et al. 16 isolerade nötkreatur kapillärer med enzymatisk nedbrytning i stället för mekanisk homogenisering, och sedan passerade senare en kapillär suspension genom en 210 µm mesh-filter och en glas pärla kolumn. Dessa modifieringar förbättrats trypan blå utslagning fläcken av isolerade hjärnan kapillärerna, och således ökade endotelceller livskraft. I början av 1990, Dallaire et al. 17 isolerade nötkreatur och råtta kapillärer som var klara för neuronal kontaminering och underhålls metabolisk aktivitet av γ-glutamyl transpeptidasen (γ-GTase) och alkaliskt fosfatas. I 2000, Miller et al. 18, används isolerade råtta och svin hjärnan kapillärerna i kombination med konfokalmikroskopi Visa ansamling av transport substrat i lumen av kapillärer. Därpå vårt laboratorium har fortsatt att optimera hjärnans kapillära isolering förfarandet och vi har etablerat transport analyser för att fastställa P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, bröstcancer Resistance protein (BCRP)22,23, och flera läkemedelsresistens protein 2 (Mrp2)24 transportverksamhet. I 2004 publicerat vi två rapporter där vi använt isolerade råtta hjärnan kapillärerna för att undersöka olika signalvägar. I Hartz et al. 21, vi fann att den peptid endotelin-1 snabbt och reversibelt reduceras P-gp transportfunktionen i hjärnans kapillärer genom att agera via endotelin B-receptorn (ETB) receptor, kväveoxid syntas (NOS) och proteinkinas C (PKC). I Bauer m.fl. 19, vi visade uttrycket av nukleär receptor pregnane X receptorn (PXR) och visade PXR-modulering av P-gp uttryck och transport funktion i hjärnan kapillärerna. I experiment med transgena humaniserad PXR möss, vi utökat denna linje av forskning och visade i vivo skärpning av barriären av upregulating P-gp-hPXR aktiveringen25. I 2010, Hartz et al. 26 använde denna metod att återställa P-gp proteinuttryck och transportera aktivitet hos transgena mänskliga amyloid prekursor protein (hAPP) möss som överuttrycka hAPP. Dessutom minskade återställa P-gp i hAPP möss signifikant beta-amyloid (Aβ)40och Aβ42hjärnan nivåer.

Förutom att studera signalvägar, kan isolerade hjärnan kapillärerna användas för att fastställa förändringar i kapillär permeabilitet som vi kallar kapillär läckage. I synnerhet används Texas Red läckage analysen för att bedöma läckage av den fluorescerande färgämne Texas röd från kapillär lumen över tid och dessa uppgifter används sedan för att analysera läckage. Ökad kapillär läckage jämfört med de från kontroll kapillärer indikera förändringar i den fysiska integriteten av blod - hjärnbarriären2. Detta är värdefullt eftersom det finns många sjukdomstillstånd associerade med barriär störningar, t.ex., epilepsi, multipel skleros, Alzheimers sjukdom och traumatiska hjärnan skada27,28,29, 30. Andra grupper har också använt isolerade kapillärerna att urskilja signalvägar som reglerar proteinuttryck och transportverksamhet proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Slutligen har vi fortsatt att optimera denna metod för isolering av mänskliga hjärnan kapillärerna och, nyligen, visade vi ökat P-gp uttryck på den mänskliga blod - hjärnbarriären hos patienter med epilepsi jämfört med anfallsfria kontroll individer38 . Sammantaget visar dessa utvecklingen att isolerade hjärnan kapillärerna kan tjäna som en mångsidig modell för att studera barriärfunktion.

Olika in vivo ex vivooch in vitro- blod - hjärnbarriären modeller har använts inom grundforskning och industriella drogkontroll, främst med målet att testa narkotika leverans till hjärnan39,40,41 ,42,43,44. Förutom enstaka ex vivo hjärnan kapillärerna inkluderar nuvarande blod - hjärnbarriären modeller i silico modeller, in vitro- cellkultur för isolerade hjärnan kapillära endotelceller eller förevigade cellinjer från olika arter, i vitro kultur av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) som differentieras till hjärnans kapillära endotelceller och mikroflödessystem modeller på ett chip.

I silico modeller är vanligast i läkemedelsutveckling för att välja läkemedelskandidater baserat på förväntade absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) egenskaper. Metoder såsom kvantitativa struktur-boendet relation (QSPR) modeller och modeller för kvantitativa struktur-aktivitetssamband (QSAR) är populära metoder används i high-throughput screening av bibliotek för att förutsäga hjärnan penetration av läkemedelskandidater 45 , 46. dessa modeller är användbara för att skärmen molekyler för penetration barriäregenskaper.

Betz o.a. 47 etablerat enskiktslager av odlade hjärnans kapillära endotelceller som en in vitro- blod - hjärnbarriären modellsystem. In vitro cell kultur modeller använder färsk vävnad eller förevigade endotelceller linjer såsom mänskliga cerebral microvessel endotelceller (hCMECs) kan vara en annan hög genomströmning screeningverktyg för hjärnan penetration eller mekanistiska studier. Men hjärnan kapillära endotelceller kultur modeller saknar fysiologiska skjuvspänningen av blodflödet inuti kapillär lumen är begränsade i övergripande biologiska komplexitet och genomgå förändringar i uttryck och lokalisering av hindret komponenter till exempel åtsittande föreningspunkt proteiner kanaler yta receptorer, transportörer, enzymer och ion48,49,50. Omvänt, endothelial enskiktslager härrör från hPSCs, har låg sackaros permeabilitet jämfört med hCMEC/D3 kulturer och innehålla polariserade uttryck av några blod - hjärnbarriären transportörer, adhesionsmolekyler och åtsittande föreningspunkter51, 52. dock dessa celler är också föremål för ändra egenskaper i kulturen, och systemet måste valideras för dess rekapitulation av i vivo barriär boenden52.

Nyare trender i blod - hjärnbarriären forskning inkluderar utnyttja 3D vävnadsodling system för att skapa konstgjorda kapillärer, använder den orgel-on-chip tekniken för att generera mikroflödessystem enheter, eller utnyttja den ihålig fiber teknik53, 54 , 55. konstgjorda kapillärerna, men har betydligt större diametrar (100 – 200 µm) än hjärnan kapillärerna (3 – 7 µm). Därför liknar den skjuvning styrkor in vitro- inte helt i vivo situationen. Detta behandlas i ”blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrofabricerade enheter, där konstgjorda membran form ”blod” och ”hjärnan” fack och vätskor pumpas genom dessa enheter generera mikroflödessystem skeva styrkor. Likaså har samtidig kulturer av endothelial celler i olika kombinationer med astrocyter och vaskulära glatta muskelceller också använts med ihålig fibertekniken för att återskapa reologiska parametrar närvarande enligt in-vivo -villkor-56 , 57 , 58. det är dock oklart hur väl denna modell återspeglar andra egenskaper för den blood - brain barriären såsom transport, metabolism, signalering och andra. Dessa konstgjorda kapillär och chip modeller är lämpliga för high-throughput screening av droger, men de celler som används för att generera dessa modeller kan också ändras under kultur.

Frysta och fast hjärnan skivor eller primära hjärnans kapillära endotelceller kulturer finns ytterligare modeller som kan användas för attstudera den mänskliga mikrocirkulation5,59,60,61. Till exempel immunohistokemi fast hjärnan vävnad används för att bestämma protein lokalisering och uttryck hos friska jämfört med sjuk vävnad.

Beskrivs ovan, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan utnyttjas för att studera blod - hjärnbarriären funktion förutom vävnad skivor och in vitro- modeller. Begränsningar av denna isolerade kapillär modell är svårigheten att få färska mänsklig hjärnvävnad, avsaknad av astrocyter och nervceller, och en relativt tidskrävande isolering process. En fördel med isolerade hjärnan kapillär modellen är att denna modell liknar i vivo situationen och därför kan användas för att karaktärisera barriärfunktionen och dysfunktion. Ännu viktigare, kan det också användas att urskilja signalering mekanismer med hjälp av en mängd analyser och molekylärbiologiska metoder3,19,62,63.

Vårt laboratorium har tillgång till både färsk och fryst mänsklig hjärnvävnad genom Sanders-brun centrum på åldrande (IRB nr B15-2602-M)64. I detta sammanhang obduktioner följer ett standardprotokoll, hjärnor erhålls i < 4 h, och alla förfaranden överensstämmer med NIH Biospecimen riktlinjer för bästa praxis65. Få detta unika tillgång till mänsklig hjärnvävnad, vi etablerade och optimerad ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad som resulterar i en hög avkastning av intakt, livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna. Två gemensamma slutpunkter av intresse är att bestämma proteinuttryck och aktivitet. I detta sammanhang har vi och andra etablerat olika analyser som kan användas med isolerade hjärnan kapillärerna för att studera proteinuttryck och aktivitetsnivåer. Dessa analyser omfatta Western blotting, enkel Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR), kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR), zymography, transport aktivitet analyser, och Kapillär läckage analyser. Dessa analyser tillåter forskare att studera förändringar i barriärfunktion i mänskliga patologiska förhållanden, bestämma vägar som reglerar proteinuttryck och aktivitet och identifiera farmakologiska mål för behandling av blod - hjärnbarriären är associerad sjukdomar.

Tas tillsammans, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan fungera som en robust och reproducerbart modell av den blod - hjärnbarriären. Särskilt, kan denna modell kombineras med många olika analyser för att fastställa en rad olika slutpunkter att studera barriärfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informationen nedan är baserad på nuvarande säkerhetsstandarder och andra standarder vid University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Som en säkerhetsåtgärd, se institutionens biologisk säkerhetsprogram och den mest aktuella regler och rekommendationer innan du arbetar med mänsklig vävnad.

Varning: Mänsklig vävnad kan vara en källa till blodburna patogener, inklusive humant immunbristvirus (HIV), hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV) och andra. Arbeta med mänsklig vävnad utgör risken för infektion från blodburna patogener. Vissa reglerande och säkerhet överväganden är därför absolut nödvändigt när man arbetar med mänsklig vävnad att skydda laboratoriepersonal. Arbeta med mänsklig vävnad i USA kräver en biosäkerhet nivå 2 laboratorium och säkerhetsföreskrifter samt utbildning i enlighet med NIH avsnitt IV-B-7, OSHA 1970 klausul 5(a)(1) och användarens institutionella biologisk säkerhetsprogram. I allmänhet måste institutionella Biosäkerhetskommittén eller institutionella Review Board godkännande erhållas innan någon forskning på mänskliga material (vävnad, kroppsvätskor). Utbildning krävs för all personal som arbetar med mänskliga material och innehåller grundläggande laboratorium säkerhetsutbildning, t.ex., kemisk hygien och laboratoriesäkerhet, samt särskild utbildning om biologisk säkerhet, farligt avfall och mänskliga blodburna patogener. All personal som arbetar med mänskliga material rekommenderas att få hepatit B vaccinationer, före arbetar med mänskliga material. Personal är skyldiga att bära särskild personlig skyddsutrustning när du arbetar med mänskliga material, t.ex., en bojad labbrock och ett ansikte sköld, och Använd handskar vid alla tidpunkter. Allt arbete utförs i en biosäkerhet skåp (klass 2). All utrustning som kommer i kontakt med mänskliga material och avfall från mänskliga material hanteras på lämpligt sätt för att förhindra förorening eller infektion av personal. All utrustning och ytor rengörs med 10% blekmedel och 75% etanol enligt varje förfarande som inbegriper mänskliga material. Ett spill med mänskliga material måste rengöras omedelbart. Glas är Ånghärdad efter varje användning. Avfall, inklusive ofixerade mänsklig vävnad, är samlade i en märkt biohazard skräppåse och autoklaveras. Sharps samlas i en punktering - och läckagefria behållare märkt som bioriskavfall. Allt avfall från mänskliga material destrueras enligt institutets biologiska säkerhetsföreskrifter.

Obs: Vårt laboratorium får färska frontala cortex prover från avlidna personer via Sanders-brun Center på åldrande (IRB nr B15-2602-M). Inklusionskriterier är: registrering i UK-ADC längsgående obduktion cohort studien och en obduktion intervall (PMI) ≤4 h64. Obduktioner följer ett standardprotokoll och alla förfaranden överensstämmer med NIH Biospecimen riktlinjer för bästa praxis65. En kort PMI på mindre än 4 h är av högsta vikt att garantera kapillär lönsamhet efter isolering. Både färsk och fryst vävnad kan användas. Om frysning är nödvändigt, nymalen erhålls mänsklig hjärnvävnad bör chock-frysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° C. Färska eller tinade vävnad bör lagras i isolering buffert (se nedan) och bearbetas snabbt. Finner vi att 10 g färsk mänsklig vävnad skörd ca 100 mg hjärnan kapillärerna (våtvikt).

1. inställning

  1. Buffert förberedelse
    Obs: Volymen av buffert som behövs beror på mängden vävnad. Alla buffert volymer i följande protokoll baseras på 10 g mänskliga hjärnans cortex vävnad.
    1. L isolering buffert: Använda 1,5 L Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0.9 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2) och komplettera med 5 mM D-glukos (1,35 g ) 1 mM natrium pyruvat (0,165 g). Efter tillsats av glukos och pyruvat, justera till pH 7,4 med natriumhydroxid. Svalna och förvara bufferten till 4 ° C före användning.
    2. Bovint serumalbumin (BSA): Tillsätt 10 g BSA pulver till 1 L isolering buffert till BSA koncentration på 1%. Rör långsamt för att undvika bubblor, justera till pH 7,4 och förvaras vid 4 ° C över natten. Omedelbart före användning, försiktigt rör; Undvik att bilda bubblor för att undvika albumin denaturering.
    3. densitet gradient medium: väg 18 g täthet lutning medium i en glasflaska och tillsätt en magnetiska rör bar. Tillsätt 60 mL isolering buffert och skaka kraftigt i 5 min tills allt pulver är upphängd. Förvara över natten vid 4 ° C att tillåta täthet lutning mediet att upplösa. Rör om 10 minuter precis före användning.
    4. Lagra alla buffertar vid 4 ° C; hålla alla verktyg och buffertar på is under förfarandet för hela isolering. Rör alla buffertar före användning.
  2. Experimentellt ställa in
    1. Montera mortelstöten av Potter-Elvehjem vävnad kvarnen på elektroniska overhead omröraren. Placera Potter-Elvehjem vävnad kvarnen och den Dounce homogenisatorn med mortelstöt på is under huven. Förbereda en 300 µm filter mesh (5 x 5 cm2), vik den till en Kotte, och infoga och bifoga det till en 50 mL falconrör med tejp (figur 1A).
    2. Placera anslutande ringar och cell stam filter (porstorlek: 30 µm) på 50 mL Falcon rör. Förbereda biologiskt farligt avfall väskor. Placera alla nödvändiga utrustning i biosäkerhet skåp (se Tabell för material).

2. hjärnan provberedning

Obs: Figur 1A visar arbetsflödet diagrammet av hela isolering proceduren som beskrivs nedan. Mänsklig hjärnvävnad kan härröra från någon del av hjärnbarken och kan användas färska eller frysta. Fryst hjärnvävnad kan Tinas i rumstemperatur (ingen buffert; ~ 30 min för 10 g). För att uppnå jämförbara resultat, bör hjärnvävnaden erhållas från samma hjärnan region för varje experiment. Detta protokoll är optimerad för fräsch (PMI < 4 h) mänskliga hjärnbarken som inte har varit fryst.

  1. Beredning av mänsklig hjärnvävnad: dokumentera vikten av hjärnvävnaden. Alla nummer i följande protokoll är lämpliga för 10 g färsk mänsklig hjärnvävnad. Placera hjärnvävnaden i ett 100 mm petriskål. Ta försiktigt bort alla hjärnhinnor med pincett. Använd en skalpell för att skära av den vita substansen.
  2. Malning av mänsklig hjärnvävnad: noggrant skära upp hjärnvävnaden och finhacka det med en skalpell. Färs i ca 5 min (2 – 3 mm bitar). Överföra hjärnvävnaden till Potter-Elvehjem vävnad kvarnen. Tillsätt 30 mL isolering buffert.
    Obs: Malet vävnad lappar är svårt att se eftersom hjärnvävnaden förvandlas till mush genom mincing processen.

3. homogenisering

  1. Potter-Elvehjem vävnad grinder (clearance: 150 – 230 µm): homogenisera varje prov med 100 slag med en Homogenisatorer hastighet av 50 rpm. Dokumentera tiden efter 25 slag och den totala tid som behövs för 100 slag. Se tabell 1 för ett föreslagna homogenisering protokoll; den totala tiden för homogenisering 10 g av mänskliga frontala cortex är ca 22 min. Inte rör i luften för att undvika bubblor.
  2. Dounce Homogenisatorer (clearance: 80-130 µm): överföra Homogenatet till en Dounce Homogenisatorer på is. Homogenisera fjädringen med 20 slag (~ 6 s/stroke, totalt ~ 2 min). Undvik bubblor.

4. centrifugering

  1. Fördela hjärnan Homogenatet lika i fyra 50 mL centrifugering rör och dokumentet den totala volymen av Homogenatet. Fördela 50 mL täthet lutning buffert i centrifugering rören (12,5 mL per rör). Använd 10 mL isolering buffert att skölj mortelstöten och Homogenisatorer och fördela i fyra centrifugering rören (~2.5 mL per rör).
  2. Tätt nära Centrifugera rören med lock. Blanda Homogenatet, täthet lutning medium och buffert genom att skaka kraftigt rören. Centrifugera vid 5 800 x g i 15 minuter vid 4 ° C (fast vinkel rotor); Välj en medellång retardation hastighet att hålla pelleten kopplad till röret. Avlägsna supernatanten och återsuspendera varje pellet i 2 mL 1% BSA.

5. filtrering

Obs: För att separera kapillärerna från röda blodkroppar och andra cellfragment, flera filtrering steg är nödvändiga.

  1. 300 µm mesh: efter åter avbryta pelleten, filtrera suspensionen genom den 300 µm mesh. Kapillärerna filtreras genom maskan, medan större fartyg och större hjärna skräp kvar på mesh. Noggrant tvätta mesh med upp till 50 mL 1% BSA. Kassera mesh.
    Obs: Denna filtrering steg rensar kapillär fjädringen från större fartyg eller bitar av hjärnan skräp.
  2. 30 µM cell stam filter
    Obs: Denna filtrering steg skiljer kapillärer från röda blodkroppar och andra hjärnan skräp.
    1. Distribuera kapillär filtratet från steg 6.1 över de fem 30 µm cell stam filter (ca 10 mL av kapillär filtratet per cell stam filter). Kapillärerna hålls tillbaka av filtret, medan röda blodkroppar, andra enstaka celler och små hjärnan skräp passera genom filtret och samlas i filtratet.
    2. Tvätta varje filter med 25 mL av 1% BSA. Därefter, häll alla filtraten över sjätte filtret att öka avkastningen. Tvätta varje filtret med 50 mL 1% BSA; håller cellen stam filter med innehållande kapillärerna och kassera filtratet.

6. kapillär samling

  1. Vänd filtren upp och tvätta kapillärerna med 50 mL 1% BSA för varje filter i 50 mL rör. Försiktigt applicera tryck med Pipettera spets vi rekommenderar att en 5 mL och flytta den över filtret att tvätta bort hjärnan kapillärerna.
  2. Se till att tvätta bort alla hjärnan kapillärerna, särskilt från kanten av filtret. Undvik bubblor eftersom detta försvårar filtreringen och ökar chansen att kapillär förlust.

7. tvättning

  1. Efter att samla kapillärerna, Centrifugera alla prover vid 1500 x g i 3 minuter vid 4 ° C (svängande hink rotor). Avlägsna supernatanten och resuspendera pelleten i ca 3 mL isolering buffert. Kombinera alla återsuspenderade pelletar från ett prov i en 15 mL koniska rör och fyll den med isolering buffert. Centrifugera igen vid 1 500 x g i 3 minuter vid 4 ° C och tvätta två gånger.
  2. Dokumentera kapillär renhet med en Mikroskop (100 X förstoring) och kamera (figur 1B).
    Obs: Hjärnan kapillär avkastningen från 10 g av mänsklig hjärnvävnad är vanligen ca 100 mg. Isolerade hjärnan kapillärerna kan nu användas för experiment, bearbetas (t.ex., lysate, membran isolering), eller vara flash-fryst och lagras vid-80 ° C i frysrör för minst 6 – 12 månader (Undvik flera frysning-tining cykler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isoleringar från mänsklig hjärnvävnad ger en suspension berikad i mänskliga hjärnan kapillärerna (figur 1B) med små mängder av större fartyg, röda blodkroppar, andra enstaka celler och vissa cellfragment. Vissa kapillärer är Grenade, och, i vissa röda blodkroppar är anhållna i de kapillär lumina. Den typiska kapillären har en 3 – 7 µm diameter och är ca 100-200 µm lång med öppet lumen. de flesta kapillär ändarna döljs. Isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna använder konfokalmikroskopi, och avslöja en tubulär, intakt struktur och morfologi. Figur 2A visar en representant överförs ljus bild av en mänsklig hjärna kapillär med en bifogad pericyt och en Röd blodkropp i lumen. Alla av avgöranden beträffande diameter, storlek och morfologi är i enlighet med tidigare rapporter om strukturen av isolerade hjärnan kapillärerna12,17,18. Den isolera mänskliga hjärnan kapillär i figur 2B var immunostained för P-gp (grön) med C219 som primära antikroppen (1 µg/mL); atomkärnor var counterstained med DAPI (1 µg/mL).

Figure 1
Figur 1: flödesschema för kapillär isolering. (A) piktogrammet illustrerar viktiga steg av förfarandet att isolera hjärnan kapillärerna från färska mänsklig vävnad. (B), bilden visar isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna under ett ljusmikroskop direkt efter isolering (100 X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: isolerade mänskliga hjärnan kapillär. (A) A genomlysning bild av en isolerad mänskliga hjärnan kapillär. (B), mikroskopet confocal bild visar en isolerade mänskliga hjärnan kapillär immunostained för P-gp (grönt; C219 1 µg/mL); atomkärnor var counterstained med DAPI (blå; 1 µg/mL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Felsökning densitet centrifugering. Piktogrammet visar beredning efter den täthet lutning centrifugeringen. Det belyser effekterna av för mycket och för lite täthet lutning medium och hur detta påverkar separationen och den resulterande kapillära pelleten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: P-gp proteinuttryck i isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna. Western blot visar starka band för P-gp (1 µg/mL) i isolerade mänskliga kapillärer jämfört med hCMEC\D3 celler. Β-aktin användes som en lastning kontroll (1 µg/µL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: program för isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna. En översikt över de vanligaste tillämpningarna för isolerade hjärnan kapillärerna publicerat i litteraturen. Isolerade kapillärer har använts för: 1) genomik85,86, (2) proteomik3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) funktionell proteomik2,38, och 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Strokes Tid [min]
1 – 25 7-7,5
26 – 50 5 – 5,5
51 – 75 5 – 5,5
76 – 100 5 – 5,5
Total tid: 22 – 24 min

Tabell 1: homogenisering protokollet. Homogenisering protokollet för Potter-Elvehjem vävnad kvarnen att homogenisera 10 g av mänskliga frontala cortex en homogenisering hastighet av 50 rpm. Observera att de första flera slaganfall kräver ytterligare tid för att homogenisera malet vävnaden. Efter denna inledande homogenisering, varje slag är 12 s varaktighet (6 s för nedåtgående rörelse, 6 s för rörelse uppåt). Således, efter inledande homogenisering, 5 linjer kan åstadkommas i 1 min eller 25 linjer i 5 min.

Problemet Möjlig orsak Lösning
Ingen kapillär Pellet (1) Felaktiga Ficoll koncentration (1) justera Ficoll koncentration
(2) Felaktiga centrifugeringsvarvtal (2) justera centrifugeringsvarvtal
(3) Felaktiga acceleration eller retardation hastighet (3) justera acceleration eller retardation hastighet
Låg kapillär avkastning (1) hjärnhinnorna blockerar filtrering steg (1) ta bort alla hjärnhinnorna före filtrering
(2) för många kapillärer förlorade under isolering förfarande (2) beräkna buffert koncentrationen korrekt, skölj pipettspetsar
(3) tvätta kapillärerna av PluriStrainer filter var otillräcklig (3) vänd filter och noggrant inspektera för kapillärerna (använda Mikroskop)
(4) överskjutande bubblor under resuspensions (4) pipett långsamt för att undvika bubblor
Icke-viabla kapillärer (1) utökade postmortala intervall (1) minska intervallet om möjligt eller använda snapin-fryst hjärnor
(2) använda fryst provmaterial för isolering (2) Använd färsk vävnad
(3) tid av isolering förfarande för lång (3) optimera arbetsflöde
(4) utrustning/buffertar hölls inte på is under förfarandet för isolering (4) hålla utrustning och buffertar på is under isoleringen

Tabell 2: Felsökning av vanliga problem. En lista över de vanligaste fel och problem som uppstår under förfarandet för isolering och hur de kan lösas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokolls beskriver isolering av intakt och livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna från färsk vävnad. I detta avsnitt diskuterar vi i detalj följande: 1) ändringar av protokollet, 2) Felsökning av vanliga fel, 3) begränsningar av tekniken, 4) betydelsen av modellen med avseende på befintliga och alternativa blod - hjärnbarriären modeller, och 5). potentiella tillämpningar för isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna.

Protokollet beskrivs här är optimerad för 10 g färsk mänskliga frontala cortex vävnad. Det är dock relativt enkelt att ändra den här proceduren för: 1) mer eller mindre än 10 g vävnad, 2) frysta hjärnvävnad eller 3) hjärnvävnad från en hjärna region än främre hjärnbarken. Först, med mer eller mindre än 10 g hjärnvävnad, volymen som behövs av buffertar kan enkelt skalas upp eller ner till den tillgängliga mängden vävnad. Således, om bara 5 g av hjärnvävnaden är tillgängliga, volymen av buffertar bör minskas med hälften. Andra beskriver vi en kapillär isolering som används frisk hjärnvävnad, men fryst vävnad kan användas om färsk vävnad är otillgänglig38. Tredje, vi använde färsk hjärnvävnaden tagit från främre hjärnbarken, men kapillärer kan isoleras från andra kortikala hjärnregioner om det finns tillräckligt tillgängliga vävnad. Det är också möjligt att isolera kapillärerna från icke-kortikala av hjärnan (t.ex., vit substans), men dessa regioner har en annan cell sammansättning och kapillär densitet 66,67,68. Således använder vävnad från en olika hjärnan region skulle sannolikt kräva protokollet ska justeras (t.ex., buffert volym, gradient medel densitet, centrifugeringsvarvtal eller antal filtrering steg).

Förfarandet för kapillär isolering är medan inte komplexa per se, känslig för små störningar eller ändringar i protokollet. Ändringar kan resultera i en minskad kapillär avkastning eller nedsatt kapillär livskraft. Tabell 2 beskriver de vanligaste fel och problem som påträffas under isoleringen och listor tips för att undvika dessa fel och lösningar för felsökning om de inträffar. Det vanligaste problemet i samband med förfarandet är en låg kapillär avkastning. Förlusten av kapillärer är ofta den kumulativa summan av små förluster vid varje steg och är på grund av små avvikelser över förfarandet. Ett kritiskt steg i vilket en stor mängd kapillärer kan gå förlorade är den densitet centrifugeringen. En felaktig koncentration i bufferten resulterar i en felaktig densitet att separera kapillärerna från cellulära skräp som minskar volymen av kapillär pelleten. Figur 3 visar konsekvenserna av för lite eller för mycket täthet lutning medium i centrifugering steg i förhållande till hjärnan Homogenatet. Justera till rätt koncentration kan lösa detta problem. Observera att centrifugen acceleration och retardation hastighet också kan påverka bildandet av hjärnan kapillär pelleten. Kapillärer kan också förloras under steg 6 – 7 om delen av kapillär materialet fastnar pipettspetsarna. Problemet kan åtgärdas genom att noggrant skölja varje Pipettera tips innan du ändrar den. Under steg 7, tvätta bort kapillärerna från filtret cell stam kan vara ofullständig eller kapillärer kan hålla sig till kanten av filtret. Detta kan undvikas genom att kontrollera filtret under mikroskopet följt av ytterligare tvätt steg. Att förlora kapillärerna under varje steg av förfarandet isolering kan resultera i en försumbar kapillär pellet eller inte tillräckligt kapillär material för vidare bearbetning och experiment.

Isolera hjärnan kapillärerna från färska mänsklig vävnad representerar en unik blod - hjärnbarriären modell som liknar den i vivo situationen. Det finns dock flera begränsningar av tekniken. En utmaning är tillgången på färska mänsklig vävnad. Optimal PMI är ≤4 h, kan hjärnvävnad som samlats vid en betydligt längre PMI inte frisk nog för vissa nedströms tillämpningar. I vissa fall kan det vara svårt att erhålla vävnad belopp som är tillräckligt stora för flera experimentella grupper, därmed begränsar nedströms tillämpningar. Isolera färska kapillärerna från gnagare19, Hundarnas69, bovin42eller svin70 hjärnvävnad kan således vara lämpligare att modellera på blod - hjärnbarriären. Faktorer som avgör variationer i mänsklig hjärnvävnad som ålder, kön, etnicitet, sjukdomstillstånd, medicinering historia, hjärnregionen av prov, och PMI bör beaktas vid tolkningen och publicera data. På experimentell nivå är det viktigt att Observera att isolerade kapillärer innehåller fortfarande pericyter, men astrocytic endfeet tas bort av de förfarande-44. Det måste beaktas att den modell som presenteras här tjänar som ett ex vivo modell av den blood - brain barriären (dvs, kapillära endotelceller) men inte som en modell av neurovaskulära enheten.

Arbeta med någon mänsklig vävnad presenterar alltid en inneboende säkerhetsrisk och forskare måste vidta lämpliga försiktighetsåtgärder under förfarandet isolering för att undvika infektion. Särskilt i USA kräver arbete med mänsklig vävnad utsedda laboratorium utrymme som är BSL 2-certifierad och innehåller en biosäkerhet skåp (klass A2). Dessutom personalen måste använda personlig skyddsutrustning (dvs., labbrock, handskar och ansiktsskydd) och utsett utrustning för arbete med mänsklig vävnad och implementera bioriskavfall avfallshantering. Genomföra dessa säkerhetsåtgärder är tidskrävande, kostnadsintensiv och ökar svårigheten av förfarandet, särskilt för oerfarna laboratoriepersonal.

På blod - hjärnbarriären är starkt bevarad bland organismer med en väldefinierad CNS-71. Modellering av mänskligt blod - hjärnbarriären är svårt eftersom det finns komplexa neurovaskulära koppling bland cellerna i neurovaskulära enheten. En vuxen mänskliga hjärnan har uppskattats till har i genomsnitt cirka 86 miljarder nervceller och det är tänkt att nästan varje neuron har en egen kapillär i närheten för att säkerställa korrekt strömförsörjning med syre och näringsämnen72,73. Kapillära endotelceller utgör den största yta av blod-hjärn-gränssnittet (12 – 18 m2 för en frisk vuxen människa). Åtsittande föreningspunkter utgör ett hinder för ett brett spektrum av pharmacotherapeutics genom att blockera paracellular diffusion av lösta ämnen. Dessutom ett flertal studier beskriva barriär dysfunktion i neurodegenerativa sjukdomar, t.ex., stroke75, epilepsi38,76, Alzheimers sjukdom74, multipel skleros77, och traumatisk hjärnskada skada28,78. Därför är det absolut nödvändigt att upprätta modeller som nära motsvarar den mänskliga blod - hjärnbarriären och möjliggör en bättre förståelse av barriär-funktion vid hälsa och sjukdom.

Finns många i vitro cell kultur modeller av den blood - brain barriären; expert recensioner om ämnet finns i 41,49,51,69,79,80. Kort, båda isolerade nymalen hjärnans kapillära endotelceller för primära kultur och förevigade hjärnans kapillära endotelceller linjer är tillgängliga. Primära kulturer av cerebral microvessel endothelial celler används mestadels från mus, råtta, gris och Ko. Primära cellkulturer är dock arbetsintensiva eftersom celler måste isoleras nymalen. Förevigade hjärnans kapillära endotelceller linjer är tillgängliga från mus, råtta och mänskliga och mindre arbetsintensiva eftersom de kan vara passaged för långsiktig användning. Men har även förevigade cellinjer en gräns på hur ofta de kan vara passaged innan han förlorade sina endotelceller egenskaper. Primära celler såväl som förevigade celler linjer odlas ofta på tallrikar att modellera hjärnan kapillär endotelet och mäta barriär permeabilitet och drug transport över den cell enskiktslager, därmed härma blod-till-hjärnan transport41 ,81,82. Kultur media i dessa modeller kan också ändras eller kompletteras med astrocyter, pericyter eller andra fysiologiskt relevanta faktorer som läger41,83,84.

Fördelen med förevigade cellinjer är deras relativt lätt åtkomst och tillgänglighet. Medan odlade endotelceller kan nå sammanflödet, de förlorar endotelceller boenden som de växer sida vid sida i en enskiktslager. Exempelvis visar odlade hCMECs minskat uttryck av transportörer som P-gp, åtsittande föreningspunkt proteiner och display variabel permeabilitet xenobiotika41. Figur 4 visar en Western blot för P-gp proteinuttryck i hCMEC/D3 celler jämfört med nymalen isolerade mänskliga kapillärer. Trots en 10-faldig lägre mängd av totalprotein är signalen för P-gp starkare i isolerade mänskliga kapillärer jämfört med hCMEC/D3 celler. Detta indikerar att hCMEC/D3 celler förlorat en betydande del av P-gp proteinuttryck i kultur. Dessutom påverkar skillnader i kultur media, miljö och utrustning nyckelåtgärderna barriär integritet, dvsTEER mätningar i Transwell plattan analyser. Vissa av dessa problem kan övervinnas genom att utnyttja den isolera hjärnan kapillär modell som närmare representerar den mänskliga blod - hjärnbarriären i vivo.

Isolerade hjärnan kapillärerna har använts för en rad olika studier, inklusive genomik, proteomik, funktionell proteomik och cellomics studier (figur 5). Dessutom finns många tekniker och metoder för att analysera isolerade hjärnan kapillärerna inom vart och ett av dessa fält. Särskilt kan de experimentella tekniker som visas i figur 5 användas på hjärnan kapillärerna isolerade från ett antal källor, inklusive mänskliga, nötkreatur, gnagare och svin vävnad, vilket kan underlätta translationell forskning. Till exempel Li et al. 85 studerade genomik av den blood - brain barriären använder undertryckande subtraktiv hybridisering av renande mRNA isolerade från råtta hjärnan kapillärerna. Dessutom Ott o.a. 86 använt RT-PCR och qRT-PCR för att studera regleringen av P-gp PXR. Många proteomiska studier använda Western blotting Dot Blot analys87, ELISA88,89, enkel Western analyser3,38,3, immunoprecipitation3, och immunfärgning3,90,91. Att urskilja transportör människohandel i hjärnan endotel, McCaffrey o.a. 92 används subcellulär fraktionering av isolerade hjärnan kapillärerna. Sánchez del Pino et al. 93används isolerade nötkreatur endothelial membranet blåsor för att urskilja transportör läge och transport riktning över på blod - hjärnbarriären. I andra proteomiska studier använde forskarna vätskekromatografi och masspektrometri tandem för att kvantifiera transportör proteiner94,95,96. Funktionella proteomiska studier har använt transportör och läckage analyser2,38. Hartz et al. 2 används zymography för att bestämma enzymaktivitet i isolerade hjärnan kapillärerna. Dessutom har stora cellomic forskning med hjälp av cellodling genererat många endotelceller linjer och modeller av blod - hjärnbarriären82,83,84. Med dessa modeller inkluderar gemensamma analyser används migration analyser97,98, livskraft och toxicitet analyser99och angiogenes analyser98.

Isolerade hjärnan kapillärerna möjliggöra korrekt karakterisering av proteinuttryck och aktivitet och beskrivning av signalering vägar på den blod - hjärnbarriären. Detta beror delvis på kapillär innehållet i hjärnan, vilket är endast ca 1% (v/v). Således kommer använder hela hjärnan Homogenatet eller hjärnan skivor som ett substitut för renat kapillära endotelceller sannolikt resultera i en dålig signal-brus-förhållande24. Dessutom efter isolering är hjärnan kapillärerna lönsamt för minst 6 h (opublicerade data från mus och råtta), som tillåter studier att urskilja specifika signalvägar. Det rekommenderas att inkludera en kontrollgrupp från samma förberedelse.

Representanten och translationella modeller av den blod - hjärnbarriären, såsom isolerade kapillär modellen diskuteras i denna rapport, behövs för att studera barriärfunktion vid hälsa och sjukdom. Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna på en bra avkastning och hög kvalitet som kan fungera som en ex vivo -modell av den blod - hjärnbarriären. Isolerade kapillärer behålla sin ursprungliga struktur och funktion, som gör att använda dem för ett antal efter isolering molekylära, biokemiska, och fysiologiska analyser. Försiktighet bör iakttas vid hantering av mänskliga vävnader stickprov, helst i en BSL 2 eller högre inställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar och bekräftar Dr. Peter Nelson och Sonya Anderson på UK-ADC Brain vävnad Bank för att ge alla mänskliga hjärnan vävnadsprover (NIH bevilja nummer: P30 AG028383 från National Institute on Aging). Vi tackar Matt Hazzard och Tom Dolan, IT-tjänster, akademiska teknik och fakulteten engagemang, University of Kentucky för grafisk assistans. Projektet stöddes av grant nummer 1R01NS079507 från nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (till B.B.) och grant nummer 1R01AG039621 från National Institute on Aging (till A.M.S.H.). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke eller National Institute on Aging. Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45, (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43, (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36, (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41, (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36, (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135, (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18, (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355, (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71, (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4, (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8, (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31, (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34, (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66, (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71, (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66, (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334, (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70, (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77, (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33, (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8, (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55, (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127, (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91, (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29, (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102, (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278, (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34, (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14, (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43, (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253, (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7, (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56, (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13, (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192, (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45, (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9, (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51, (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487, (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330, (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56, (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66, (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10, (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10, (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6, (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11, (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37, (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524, (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30, (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115, (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29, (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6, (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199, (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115, (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12, (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54, (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329, (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53, (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22, (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017, (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35, (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9, (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122, (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270, (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40, (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25, (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2, (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86, (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242, (2), 105-108 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics